Summary
El presente protocolo describe la inducción de autofagia en el cuerpo graso larvario de Drosophila melanogaster a través del agotamiento de nutrientes y analiza los cambios en la autofagia utilizando cepas de moscas transgénicas.
Abstract
La autofagia es un proceso de autodigestión celular. Entrega carga a los lisosomas para su degradación en respuesta a diversas tensiones, incluida la inanición. El mal funcionamiento de la autofagia se asocia con el envejecimiento y múltiples enfermedades humanas. La maquinaria de autofagia está altamente conservada, desde la levadura hasta los humanos. El cuerpo graso larval de Drosophila melanogaster, un análogo para el hígado de vertebrados y el tejido adiposo, proporciona un modelo único para monitorear la autofagia in vivo. La autofagia puede ser fácilmente inducida por la falta de nutrientes en el cuerpo de grasa larval. La mayoría de los genes relacionados con la autofagia se conservan en Drosophila. Se han desarrollado muchas cepas de moscas transgénicas que expresan marcadores de autofagia marcados, lo que facilita el monitoreo de diferentes pasos en el proceso de autofagia. El análisis clonal permite una comparación cercana de los marcadores de autofagia en células con diferentes genotipos en la misma pieza de tejido. El protocolo actual detalla los procedimientos para (1) generar clones somáticos en el cuerpo graso de la larva, (2) inducir la autofagia a través de la inanición de aminoácidos y (3) diseccionar el cuerpo graso de la larva, con el objetivo de crear un modelo para analizar las diferencias en la autofagia utilizando un marcador autofagosómico (GFP-Atg8a) y análisis clonal.
Introduction
La autofagia es un proceso de "autoalimentación" inducido por diversas tensiones, incluida la inanición de aminoácidos1. La macroautofagia (en adelante autofagia) es el tipo de autofagia mejor estudiado y desempeña un papel insustituible en el mantenimiento de la homeostasis celular2. El mal funcionamiento de la autofagia está asociado con varias enfermedades humanas3. Además, algunos genes relacionados con la autofagia son dianas potenciales para el tratamiento de diversas enfermedades4.
La autofagia está regulada de una manera altamente sofisticada5. Tras la inanición, las membranas de aislamiento secuestran materiales citoplasmáticos para formar autofagosomas de doble membrana6. Los autofagosomas luego se fusionan con endosomas y lisosomas para formar anfisomas y autolisosomas. Con la ayuda de enzimas hidrolíticas lisosomales, los contenidos citoplasmáticos engullidos se degradan y los nutrientes se reciclan7.
La autofagia es un proceso evolutivamente conservado8. Drosophila melanogaster es un gran modelo para estudiar el proceso de autofagia in vivo. La inanición de aminoácidos induce fácilmente la autofagia en el tejido corporal graso de la mosca, un análogo del hígado humano y el tejido adiposo9. Los defectos en la autofagia interrumpen los distintos patrones de puncta de varias proteínas relacionadas con la autofagia, como Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 y p62, entre otras10. Por lo tanto, el análisis de los patrones de estos marcadores de autofagia ayudará a discernir la aparición de defectos de autofagia y el paso de autofagia defectuosa. Por ejemplo, la proteína similar a la ubiquitina Atg8 es el marcador de autofagia más utilizado11. En Drosophila melanogaster, se han desarrollado con éxito cepas transgénicas con una proteína verde fluorescente (GFP) Atg8a12. GFP-Atg8a se difunde en el citosol y los núcleos de las células alimentadas. Tras la inanición, GFP-Atg8a es procesada y modificada por fosfatidiletanolamina (PE) y forma puncta, que marca las membranas de aislamiento y los autofagosomas completamente desarrollados13,14. A través de la microscopía de fluorescencia directa, la inducción de autofagia puede ser fácilmente observada como un aumento en la formación de GFP-Atg8 puncta15. Atg8a punto no se formaría en respuesta a la inanición en presencia de un defecto de iniciación de la autofagia. Como GFP-Atg8a puede ser enfriado y digerido por el bajo pH en los autolisosomas, GFP-Atg8a puncta puede aumentar en número si la autofagia se bloquea en las últimas etapas16.
Como la autofagia es altamente sensible a la disponibilidad nutricional17, ligeras diferencias en las condiciones de cultivo a menudo conducen a variaciones en los fenotipos. Por lo tanto, el análisis clonal, un método que analiza células mutantes versus células de control de tipo salvaje en el mismo tejido, tiene una gran ventaja en la disección de defectos de autofagia18. Aprovechando la recombinación específica del sitio mediada por el objetivo de reconocimiento flippasa / flippase (FLP / FRT) entre cromosomas homólogos, las moscas que transportan tejidos en mosaico se hacen fácilmente19,20. Las células de tipo salvaje que rodean a las células mutantes forman un control interno perfecto para evitar diferencias individuales21.
El presente estudio describe cómo inducir la autofagia por inanición de aminoácidos y generar tejidos corporales de grasa en mosaico que expresan GFP-Atg8a. Estos protocolos se pueden utilizar para analizar las diferencias en la autofagia entre clones mutantes.
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Protocol
1. Cruce de Drosophila y puesta de huevos
- Introducir 3 moscas adultas macho (genotipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) y 15 hembras (genotipo y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) (ver Tabla de materiales) en un vial de cultivo (con harina de maíz/melaza/agar Drosophila media estándar a 25 °C) para su apareamiento.
NOTA: Se deben configurar múltiples viales de cultivo de la misma cruz para asegurar suficientes larvas para experimentos adicionales. La cepa de mosca macho con genotipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a lleva un sitio FRT en el cromosoma X cerca del centrómero (FRT19A). También expresa FLP en caso de choque térmico a 37 °C. Un transgén con expresión ubicua de RFP se inserta en el cromosoma X. GFP-Atg8a se expresa bajo el control de cgGal4 en el cuerpo graso larvario22. La cepa de mosca hembra con genotipo y ' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP porta una mutación letal (Mu) y FRT19A en el cromosoma X. El esquema de cruce detallado se muestra en la Figura 1. - Para la puesta de huevos, transfiera las moscas a un nuevo vial de cultivo. A las 48 h después de la introducción, toque el vial de "apareamiento" hasta que las moscas estén aturdidas y deslícese sobre el medio en la base del vial.
- Desenchufe el vial de "apareamiento" y cúbrale la boca con un vial invertido desenchufado con medios frescos (vial de cultivo fresco). Luego, transfiera las moscas al vial de cultivo fresco volteando y golpeando los viales.
- Tapar el vial de cultivo fresco (con las moscas transferidas) y desechar el vial de cultivo viejo. Coloque este vial de cultivo fresco en una incubadora a 25 °C para la puesta de huevos en el medio fresco.
NOTA: Precalentar los viales de cultivo fresco a 25 °C durante 15 minutos antes del proceso de transferencia de moscas ayudará a las moscas a adaptarse rápidamente al nuevo entorno y acelerará la puesta de huevos.
- Retire las moscas después de 6 h de puesta de huevos. Si es necesario repetir los experimentos, transfiera estas moscas a otro vial de cultivo (como se describe en el paso 1.2). De lo contrario, deseche las moscas vertiéndolas en un matraz que contenga 75% de etanol).
- Incubar el vial con embriones en un baño maría a 37 °C durante 1 h para inducir la expresión de FLP. Posteriormente, colóquelos en una incubadora a 25 °C y permita que los embriones continúen desarrollándose.
NOTA: La formación exitosa de clones mutantes se puede confirmar posteriormente a través de imágenes. La ausencia de señales RFP marca los clones mutantes.
- Incubar el vial con embriones en un baño maría a 37 °C durante 1 h para inducir la expresión de FLP. Posteriormente, colóquelos en una incubadora a 25 °C y permita que los embriones continúen desarrollándose.
2. La inanición de aminoácidos induce autofagia
- Usando una espátula de laboratorio, saque los medios que contienen las larvas en desarrollo en una placa de Petri 75 h después de la puesta de huevos. Agregue 3 ml de 1x PBS al plato y separe suavemente los medios de cultivo y las larvas con pinzas largas. Seleccione de 10 a 15 larvas tempranas del tercer estadio.
NOTA: Las larvas tempranas del tercer estadio deben elegirse cuidadosamente. La etapa de desarrollo de las larvas es crítica para el éxito de este protocolo. Debido a la duración restringida de la puesta de huevos, se espera que la mayoría de las larvas en el vial de cultivo estén en la etapa temprana del tercer estadio a las 75 h de incubación. Sin embargo, diferentes recetas de medios de cultivo pueden conducir a variaciones en el momento del desarrollo de las larvas. Los criterios para distinguir las larvas tempranas del tercer estadio son la longitud del cuerpo, la presencia de espiráculos anteriores y posteriores, así como los ganchos mandibulares del aparato bucal23. - Llene los pocillos de una placa puntual de depresión de vidrio de 9 pocillos (consulte la Tabla de materiales) con 1x PBS. Coloque las larvas separadas del tercer estadio en los pozos usando pinzas largas y lave bien las larvas para eliminar todos los residuos de medios.
- Tome 5 ml de solución de sacarosa al 20% (en 1x PBS) en un vial vacío y coloque las larvas limpias del tercer estadio en esta solución usando fórceps largos. Incubar este vial en una incubadora a 25 °C durante 6 h antes de cosecharlos para la disección.
NOTA: La solución de sacarosa al 20% (en 1x PBS) sirve como medio de inanición deficiente en aminoácidos.
3. Disección de larvas del tercer estadio y procesamiento de muestras de tejido
- Afile dos pares de pinzas #5 (ver Tabla de materiales) uniformemente en ambos lados con una piedra de afilar.
- Agregue 400 μL de 1x PBS en cada pocillo de la placa puntual de depresión de vidrio de 9 pocillos y transfiera las larvas a los pocillos con pinzas largas. Coloque una larva en un pozo con el lado dorsal (el lado con la tráquea) hacia arriba.
- Agarre la cutícula de la larva con dos pinzas # 5 en el medio del tronco larval y abra suavemente las cutículas. Los cuerpos grasos expuestos, junto con otros tejidos internos larvales, todavía estarán unidos a la carcasa de la larva. Tire lo suficiente para exponer los órganos internos tanto como sea posible. Repita este paso para todas las larvas.
NOTA: Cada larva tiene dos grandes pedazos de cuerpo gordo a lo largo del tronco del cuerpo. El tejido corporal graso es una monocapa blanca, opaca y plana que se puede distinguir fácilmente bajo el microscopio de disección24.
- Agarre la cutícula de la larva con dos pinzas # 5 en el medio del tronco larval y abra suavemente las cutículas. Los cuerpos grasos expuestos, junto con otros tejidos internos larvales, todavía estarán unidos a la carcasa de la larva. Tire lo suficiente para exponer los órganos internos tanto como sea posible. Repita este paso para todas las larvas.
- Transfiera la canal larvaria a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4%. Incubar durante 30 min a 25 °C sin agitar los tubos.
PRECAUCIÓN: El PFA al 4% es tóxico. Use guantes y máscaras para protegerse.
NOTA: Se recomienda preparar PFA al 4% en 1x tampón PBS. El polvo de PFA no se disuelve en 1x PBS al instante. Por lo tanto, la mezcla debe incubarse a 65 °C en una incubadora durante la noche o agitarse intermitentemente durante 45 min a 25 °C. - Después de 30 minutos de incubación de la canal con PFA al 4%, pipetear la solución de PFA, agregar 500 μL de 1x PBS en el tubo y agitar suavemente el tubo en un rotador plano durante 10 minutos antes de desechar la solución 1x PBS (repetir 3x).
- Usando fórceps largos, transfiera la canal larval fija y lavada a un pocillo en la placa de 9 depresiones llena de 1x PBS. Usando pinzas # 5, elimine todos los tejidos corporales no grasos.
- Use pinzas # 5 para montar las piezas del cuerpo gordo en un portaobjetos de microscopio utilizando glicerol al 80% como medio de montaje y coloque un cubreobjetos en la parte superior.
NOTA: Antes de montar, verifique el pH del glicerol al 80% (usando papeles de pH, pH = 7 es óptimo) para proteger la señal GFP. Los medios de montaje (consulte la Tabla de materiales) con DAPI en glicerol al 80% ayudarán a obtener imágenes de los núcleos de las células corporales grasas. Estos portaobjetos son estables durante 1 semana cuando se almacenan en la oscuridad a 4 °C.
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Representative Results
En condiciones de alimentación, la proteína similar a la ubiquitina marcada con GFP, GFP-Atg8a, se difunde dentro de las células. Al morir de hambre, forma puntos verdes y etiqueta los autofagosomas. Una vez que los autofagosomas se fusionan con los lisosomas, la GFP se apaga en los autolisosomas ácidos y los puntos verdes desaparecen. Si no se induce la autofagia o se acelera la maduración del autofagosoma, se espera que el número de GFP puncta sea bajo. Sin embargo, si la fusión entre los autofagosomas y los lisosomas se bloquea o el pH del autolisosoma se vuelve básico, se espera que el número y/o tamaño de GFP puncta sea alto.
En el protocolo presentado aquí, el sistema FLP / FRT induce la recombinación mitótica y genera tejidos con células de tipo salvaje y mutantes. Mientras que las celdas de tipo salvaje expresan RFP, las células mutantes carecen de expresión RFP. La expresión de RFP en todas las células del cuerpo graso indicaría que la recombinación mitótica mediada por FLP / FRT no se indujo con éxito o que la mutación es letal para las células. En este último caso (es decir, si la mutación es letal celular), se espera que el cuerpo graso larvario tenga unas pocas células con señales de RFP de mayor nivel que las células circundantes.
En la Figura 2, GFP-Atg8a (verde) formó puntos en células de tipo salvaje (rojo), lo que implica que la autofagia fue inducida con éxito. En los clones mutantes (RFP negativo), el patrón de GFP-Atg8a puncta fue diferente al de las células de tipo salvaje circundantes, lo que sugiere defectos de autofagia. Se detectaron muy pocos puntos GFP-ATG8a en clones mutantes Mu1 (Figura 2B), lo que indica que la autofagia se bloqueó en las etapas de inicio o la maduración acelerada del autolisosomal. El número y el tamaño de GFP-Atg8a puncta aumentaron considerablemente en los clones mutantes de Mu2 (Figura 2C), lo que sugiere defectos de fusión autofagosoma-lisosoma o acidificación autolisosómica. Se requieren más experimentos para distinguir estas posibilidades. Además, es necesario cuantificar los tamaños y el número de puntos para determinar si las diferencias observadas son estadísticamente significativas.
Figura 1: Representación esquemática de los procedimientos experimentales para el seguimiento del marcador de autofagia GFP-Atg8a en un cuerpo de grasa larval en mosaico portador de clones mutantes. Se muestra el esquema de cruce para generar moscas que expresan GFP-Atg8a en los tejidos corporales grasos de las larvas y portan clones mutantes (una cepa con una mutación puntual letal [Mu] en el cromosoma X sirve como ejemplo). Después del choque térmico a 37 °C durante 1 h para activar la expresión de FLP, las células mutantes homocigotas con expresión de GFP-Atg8a pueden generarse en el y' w* Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / + cuerpo de grasa larval. La autofagia se induce en el cuerpo graso incubando las larvas en una solución de sacarosa al 20% durante 6 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los patrones de GFP-Atg8a puncta en los clones Mu1 y Mu2 difirieron de los de los clones de control. Mu1 y Mu2 son dos mutantes letales independientes en el cromosoma X. Isogenizadas y' w*, las moscas FRT19A sirven como control. Se analizaron los patrones de GFP-Atg8a (verde) en los cuerpos de grasa larvaria de mosaico de control, Mu1 o Mu2. Los clones mutantes (o clones de control) fueron marcados negativamente por RFP (rojo). (A) En los clones de control (RFP negativo), los patrones de GFP-Atg8a puncta fueron similares a los de las células RFP positivas circundantes. (B) En clones mutantes Mu1 (RFP negativo), los puntos GFP-Atg8a se redujeron considerablemente. (C) En los clones mutantes Mu2 (RFP negativo), se incrementó el número y el tamaño de GFP-Atg8a puncta. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El presente protocolo describe los métodos para (1) generar moscas portadoras de clones mutantes en los cuerpos grasos larvales, (2) inducir la autofagia a través de la inanición de aminoácidos y (3) diseccionar los cuerpos grasos de las larvas. Para generar clones con éxito en los cuerpos grasos larvales, los siguientes pasos críticos deben llevarse a cabo diligentemente. (1) Sincronizar el choque térmico con precisión es crucial porque la recombinación mitótica solo ocurre cuando el tejido está experimentando mitosis, y (2) tanto la temperatura como la duración del choque térmico son críticas para inducir la expresión de FLP. Se recomienda un baño maría estándar de 37 °C durante 1 h de choque térmico. Teniendo en cuenta la mayor posibilidad de muerte embrionaria / larvaria durante el choque térmico y la inanición, se deben establecer múltiples cruces para la generación de muestras de tejido suficientes para la obtención de imágenes.
Además, algunos pasos pueden necesitar ser modificados teniendo en cuenta las condiciones reales de cultivo. Por ejemplo, las diferencias en el medio ambiente y los medios de cultivo de Drosophila entre los laboratorios pueden afectar las tasas de crecimiento de las larvas. Por lo tanto, el tiempo de desarrollo requerido para que los embriones alcancen la etapa temprana del tercer estadio y la duración de la inanición larval (cultivo en sacarosa al 20% para inducir la autofagia) pueden necesitar ser estandarizados en cada laboratorio por separado.
GFP-Atg8a es el marcador más utilizado para determinar la autofagia. Sin embargo, los cambios en el patrón de puntos GFP-Atg8a no logran identificar el defecto exacto de la autofagia o el paso afectado directamente. Por lo tanto, se deben analizar múltiples marcadores para interpretar dichos datos con precisión. El protocolo aquí presentado puede ser adaptado para otras proteínas relacionadas con la autofagia con sus respectivas cepas transgénicas25. Múltiples marcadores marcados con diferentes proteínas fluorescentes (como la proteína de fluorescencia azul [BFP]) se pueden analizar simultáneamente para dilucidar los procesos de iniciación o fusión. La modificación controlada de la autofagia, utilizando sustancias químicas26 o interferencia de ARN de genes críticos27, puede combinarse con el enfoque actual para dilucidar aún más los mecanismos de autofagia. Además, el análisis de marcadores proteicos endógenos de autofagia (mediante el uso de inmunohistoquímica) en tejidos mosaicos es importante para confirmar los fenotipos28.
Aunque la autofagia fue reconocida originalmente como un proceso aleatorio y no selectivo, la creciente evidencia indica que puede ser selectiva y degrada selectivamente orgánulos citoplasmáticos como las mitocondrias y el retículo endoplásmico, entre otros29. Además, el procedimiento descrito aquí se puede aplicar para explorar la autofagia selectiva. Por ejemplo, la mitofagia se puede monitorear en cuerpos de grasa de mosca uniendo proteínas fluorescentes (como Keima o etiquetas tándem GFP-RFP) a una secuencia de orientación mitocondrial30.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Estamos agradecidos con THFC y BDSC por proporcionar las cepas de mosca. El Dr. Tong Chao cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32030027, 91754103, 92157201) y fondos de investigación fundamental para las universidades centrales. Agradecemos a la instalación central en el Instituto de Ciencias de la Vida (LSI) por proporcionar servicios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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