Summary
Detta protokoll beskriver induktionen av autofagi i Drosophila melanogaster larvfettkropp via näringsutarmning och analyserar förändringar i autofagi med hjälp av transgena flugstammar.
Abstract
Autofagi är en cellulär självförtunningsprocess. Det levererar last till lysosomerna för nedbrytning som svar på olika påfrestningar, inklusive svält. Fel på autofagi är förknippad med åldrande och flera mänskliga sjukdomar. Autofagi-maskineriet är mycket bevarat - från jäst till människor. Larvfettkroppen hos Drosophila melanogaster, en analog för lever och fettvävnad hos ryggradsdjur, ger en unik modell för övervakning av autofagi in vivo. Autofagi kan lätt induceras av näringshushållning i larvfettkroppen. De flesta autofagirelaterade gener bevaras i Drosophila. Många transgena flugstammar som uttrycker märkta autofagimarkörer har utvecklats, vilket underlättar övervakningen av olika steg i autofagiprocessen. Den klonala analysen möjliggör en nära jämförelse av autofagimarkörer i celler med olika genotyper i samma vävnadsbit. Det nuvarande protokollet beskriver procedurer för (1) generering av somatiska kloner i larvfettkroppen, (2) inducering av autofagi via aminosyrasvält och (3) dissekering av larvfettkroppen, som syftar till att skapa en modell för att analysera skillnader i autofagi med hjälp av en autofagosommarkör (GFP-Atg8a) och klonanalys.
Introduction
Autofagi är en "självätande" process inducerad av olika påfrestningar, inklusive aminosyrasvält1. Makroautofagi (nedan kallad autofagi) är den mest välstuderade typen av autofagi och spelar en oersättlig roll för att upprätthålla cellulär homeostas2. Fel på autofagi är förknippad med flera mänskliga sjukdomar3. Dessutom är vissa autofagirelaterade gener potentiella mål för behandling av olika sjukdomar4.
Autofagi regleras på ett mycket sofistikerat sätt5. Vid svält binder isoleringsmembranen cytoplasmatiska material för att bilda dubbelmembranerade autofagosomer6. Autofagosomer smälter sedan samman med endosomer och lysosomer för att bilda amfisomer och autolysosomer. Med hjälp av lysosomala hydrolytiska enzymer bryts det uppslukade cytoplasmatiska innehållet ned och näringsämnena återvinns7.
Autofagi är en evolutionärt bevarad process8. Drosophila melanogaster är en utmärkt modell för att studera autofagiprocessen in vivo. Aminosyrasvält inducerar lätt autofagi i flygfettkroppsvävnad, en analog av mänsklig lever och fettvävnad9. Defekter i autofagi stör de distinkta punctamönstren hos flera autofagirelaterade proteiner, såsom Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 och p62, bland annat10. Därför kommer analys av mönstren för dessa autofagimarkörer att hjälpa till att urskilja förekomsten av autofagidefekter och det defekta autofagisteget. Till exempel är det ubiquitinliknande proteinet Atg8 den vanligaste autofagimarkören11. I Drosophila melanogaster har transgena stammar med ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt Atg8a framgångsrikt utvecklats12. GFP-Atg8a diffunderas i cytosolen och kärnorna i de matade cellerna. Vid svält bearbetas och modifieras GFP-Atg8a av fosfatidyletanolamin (PE) och bildar puncta, som märker isoleringsmembranen och fullt utvecklade autofagosomer13,14. Genom direkt fluorescensmikroskopi kan autofagiinduktionen lätt observeras som en ökning av GFP-Atg8 puncta-bildning15. Atg8a puncta skulle inte bildas som svar på svält i närvaro av en autofagiinitieringsdefekt. Eftersom GFP-Atg8a kan släckas och smältas av det låga pH-värdet i autolysosomer kan GFP-Atg8a puncta öka i antal om autofagi blockeras i sena stadier16.
Eftersom autofagi är mycket känslig för näringstillgänglighet17, leder små skillnader i odlingsförhållanden ofta till variationer i fenotyper. Därför har klonanalys, en metod som analyserar mutanta celler kontra kontrollceller av vildtyp i samma vävnad, en stor fördel vid dissekering av autofagidefekter18. Genom att utnyttja flippas/flippase recognition target (FLP/FRT)-medierad platsspecifik rekombination mellan homologa kromosomer, görs flugor som bär mosaikvävnader lätt19,20. Vildtypscellerna som omger mutantcellerna bildar en perfekt intern kontroll för att undvika individuella skillnader21.
Den aktuella studien beskriver hur man inducerar autofagi genom aminosyrasvält och genererar GFP-Atg8a-uttryckande mosaikfettkroppsvävnader. Dessa protokoll kan användas för att analysera skillnader i autofagi mellan mutanta kloner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila korsning och äggläggning
- Introducera 3 hanar ( genotyp hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) och 15 honor (genotyp y' w* Mu FRT19A/FM7, Kr GFP ) vuxna flugor (se materialförteckning) i en injektionsflaska med odling (med standard majsmjöl/melass/agar Drosophila media vid 25 °C) för parning.
OBS: Flera odlingsflaskor med samma korsning måste sättas upp för att säkerställa tillräckligt med larver för ytterligare experiment. Hanflugstammen med genotyp hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a bär ett FRT-ställe vid X-kromosomen nära centromeren (FRT19A). Den uttrycker också FLP vid värmechock vid 37 °C. En transgen med allestädes närvarande RFP-uttryck sätts in på X-kromosomen. GFP-Atg8a uttrycks under kontroll av cgGal4 i larvfettkroppen22. Den kvinnliga flugstammen med genotyp y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP bär en dödlig mutation (Mu) och FRT19A på X-kromosomen. Den detaljerade korsningsplanen visas i figur 1. - För äggläggning, överför flugorna till en ny odlingsflaska. Vid 48 timmar efter introduktionen, knacka på "parningsflaskan" tills flugorna är bedövade och släpp ner på media vid basen av injektionsflaskan.
- Koppla ur injektionsflaskan med "parning" och täck dess mun med en urkopplad inverterad injektionsflaska med färskt medium (injektionsflaska med färsk kultur). Överför sedan flugorna till den färska odlingsflaskan genom att vända och knacka på flaskorna.
- Sätt i den färska odlingsflaskan (med de överförda flugorna) och kassera den gamla kulturflaskan. Placera denna injektionsflaska med färsk kultur i en 25 °C inkubator för äggläggning på färska medier.
OBS: Förvärmning av de färska odlingsflaskorna till 25 ° C i 15 minuter före flygöverföringsprocessen hjälper flugorna att snabbt anpassa sig till den nya miljön och påskynda äggläggningen.
- Ta bort flugorna efter 6 timmars äggläggning. Om experimenten behöver upprepas, överför dessa flugor till en annan odlingsflaska (enligt beskrivningen i steg 1.2). Annars kassera flugorna genom att dumpa dem i en kolv som innehåller 75% etanol).
- Inkubera injektionsflaskan med embryon i ett 37 °C vattenbad i 1 timme för att inducera FLP-uttryck. Placera dem därefter i en 25 °C inkubator och låt embryona fortsätta att utvecklas.
OBS: Den framgångsrika bildningen av mutanta kloner kan bekräftas senare genom avbildning. Frånvaron av RFP-signaler markerar mutantklonerna.
- Inkubera injektionsflaskan med embryon i ett 37 °C vattenbad i 1 timme för att inducera FLP-uttryck. Placera dem därefter i en 25 °C inkubator och låt embryona fortsätta att utvecklas.
2. Aminosyrasvält inducerar autofagi
- Använd en laboratoriespatel, skopa ut mediet som innehåller de utvecklande larverna i en petriskål 75 timmar efter äggläggning. Tillsätt 3 ml 1x PBS i skålen och separera försiktigt odlingsmediet och larverna med långa pincett. Välj 10 till 15 tidiga tredje instar larver.
OBS: Tidiga tredje instar larver måste väljas noggrant. Larvernas utvecklingsstadium är avgörande för detta protokolls framgång. På grund av den begränsade äggläggningstiden förväntas de flesta larver i odlingsflaskan vara i det tidiga tredje instarstadiet vid 75 timmars inkubation. Olika recept på odlingsmedier kan dock leda till variationer i larvernas utvecklingstid. Kriterierna för att skilja tidiga tredje instarlarver är kroppslängden, närvaron av främre och bakre spirakler, liksom de mandibulära krokarna i munapparaten23. - Fyll brunnarna på en 9-brunns glasfördjupningsplatta (se materialtabell) med 1x PBS. Placera de separerade tredje instarlarverna i brunnarna med långa pincett och tvätta larverna noggrant för att avlägsna alla medierester.
- Ta 5 ml 20% sackaros (i 1x PBS) lösning i en tom injektionsflaska och placera de rena tredje instarlarverna i denna lösning med långa pincett. Inkubera injektionsflaskan i en 25 °C inkubator i 6 timmar innan de skördas för dissektion.
OBS: 20% sackaroslösningen (i 1x PBS) fungerar som aminosyrabristsvältmedium.
3. Tredje instar larver dissektion och provvävnadsbearbetning
- Slipa två par #5 pincett (se materialtabell) jämnt på båda sidor med en slipsten.
- Tillsätt 400 μL 1x PBS i varje brunn på 9-brunnsglasfördjupningsplattan och överför larverna till brunnarna med långa pincett. Placera en larva i en brunn med dorsalsidan (sidan med luftstrupen) uppåt.
- Ta tag i larvens nagelband med två #5 pincett i mitten av larvstammen och riv försiktigt upp nagelbanden. De exponerade fettkropparna, tillsammans med andra larvala inre vävnader, kommer fortfarande att fästas vid larvens slaktkropp. Dra tillräckligt för att exponera de inre organen så mycket som möjligt. Upprepa detta steg för alla larver.
OBS: Varje larv har två stora bitar av fet kropp längs kroppsstammen. Fet kroppsvävnad är ett vitt, ogenomskinligt och platt monolager som lätt kan särskiljas under dissektionsmikroskopet24.
- Ta tag i larvens nagelband med två #5 pincett i mitten av larvstammen och riv försiktigt upp nagelbanden. De exponerade fettkropparna, tillsammans med andra larvala inre vävnader, kommer fortfarande att fästas vid larvens slaktkropp. Dra tillräckligt för att exponera de inre organen så mycket som möjligt. Upprepa detta steg för alla larver.
- Överför larvkroppen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA). Inkubera i 30 minuter vid 25 °C utan att skaka rören.
VARNING: 4% PFA är giftigt. Använd handskar och masker för skydd.
OBS: Beredning av 4% PFA i 1x PBS-buffert rekommenderas. PFA-pulver löses inte upp i 1x PBS direkt. Blandningen måste därför inkuberas vid 65 °C i en inkubator över natten eller skakas intermittent i 45 minuter vid 25 °C. - Efter 30 minuters inkubation av slaktkroppen med 4% PFA, pipettera ut PFA-lösningen, tillsätt 500 μL 1x PBS i röret och skaka försiktigt röret på en platt rotator i 10 minuter innan du kasserar 1x PBS-lösningen (upprepa 3x).
- Använd långa pincett, överför den fasta och tvättade larvkroppen till en brunn i 9-fördjupningsplattan fylld med 1x PBS. Använd # 5 pincett, ta bort alla fettfria kroppsvävnader.
- Använd # 5 pincett för att montera bitarna av fettkroppen på ett mikroskopglas med 80% glycerol som monteringsmedium och lägg ett täckglas ovanpå.
OBS: Innan montering, kontrollera pH för 80% glycerol (med pH-papper, pH = 7 är optimalt) för att skydda GFP-signalen. Monteringsmedia (se materialförteckning) med DAPI i 80% glycerol hjälper till att avbilda kärnorna i fettkroppsceller. Dessa glas är stabila i 1 vecka när de förvaras i mörker vid 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under utfodringsförhållanden diffunderas det GFP-märkta ubiquitinliknande proteinet, GFP-Atg8a, inuti cellerna. Vid svält bildar den grön puncta och märker autofagosomer. När autofagosomer smälter samman med lysosomer släcks GFP i de sura autolysosomerna och den gröna puncta försvinner. Om autofagi inte induceras eller autofagosommognaden accelereras förväntas antalet GFP-puncta vara lågt. Men om fusionen mellan autofagosomer och lysosomer blockeras eller autolysosomens pH blir grundläggande, förväntas antalet och/eller storleken på GFP-puncta vara högt.
I protokollet som presenteras här inducerar FLP / FRT-systemet mitotisk rekombination och genererar vävnader med både vildtyp och mutanta celler. Medan vildtypscellerna uttrycker RFP, saknar mutantcellerna RFP-uttryck. Uttrycket av RFP i alla fettkroppsceller skulle indikera att FLP / FRT-medierad mitotisk rekombination inte inducerades framgångsrikt eller att mutationen är celldödlig. I det senare fallet (dvs om mutationen är celldödlig) förväntas larvfettkroppen ha några celler med högre RFP-signaler än de omgivande cellerna.
I figur 2 bildade GFP-Atg8a (grön) puncta i vildtypsceller (röd), vilket innebär att autofagi framgångsrikt inducerades. I de muterade klonerna (RFP-negativa) var mönstret för GFP-Atg8a puncta annorlunda än det i de omgivande vildtypscellerna, vilket tyder på autofagidefekter. Mycket få GFP-ATG8a puncta detekterades i Mu1-mutanta kloner (figur 2B), vilket indikerar att autofagi blockerades vid initieringsstegen eller accelererade autolysosommognad. Antalet och storleken på GFP-Atg8a puncta ökade kraftigt i Mu2-mutantkloner (figur 2C), vilket tyder på autofagosom-lysosomfusion eller autolysosomförsurningsdefekter. Ytterligare experiment krävs för att skilja dessa möjligheter. Dessutom måste storleken och antalet puncta kvantifieras för att avgöra om de observerade skillnaderna är statistiskt signifikanta.
Figur 1: Schematisk representation av experimentella metoder för övervakning av autofagimarkören GFP-Atg8a i en mosaiklarvfettkropp som bär mutanta kloner. Korsningsschemat för att generera flugor som uttrycker GFP-Atg8a i larvfettkroppsvävnaderna och bär mutanta kloner visas (en stam med en dödlig punktmutation [Mu] på X-kromosomen fungerar som ett exempel). Efter värmechock vid 37 °C i 1 timme för att aktivera FLP-uttryck kan de homozygota mutanta cellerna med GFP-Atg8a-uttryck genereras i y' w* Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / + larvfettkropp. Autofagi induceras i fettkroppen genom att inkubera larverna i 20% sackaroslösning i 6 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mönstren för GFP-Atg8a puncta i Mu1- och Mu2-kloner skilde sig från dem i kontrollklonerna. Mu1 och Mu2 är två oberoende dödliga mutanter på X-kromosomen. Isogenized y 'w *, FRT19A flugor fungerar som en kontroll. GFP-Atg8a (gröna) mönster analyserades i kontroll-, Mu1- eller Mu2-mosaiklarvfettkropparna. De muterade klonerna (eller kontrollklonerna) markerades negativt av RFP (röd). (A) I kontrollklonerna (RFP-negativa) liknade mönstren för GFP-Atg8a puncta dem i de omgivande RFP-positiva cellerna. (B) I Mu1-mutantkloner (RFP-negativa) reducerades GFP-Atg8a puncta kraftigt. (C) I Mu2-mutantkloner (RFP-negativa) ökades antalet och storleken på GFP-Atg8a puncta. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver metoderna för att (1) generera flugor som bär mutanta kloner i larvfettkropparna, (2) inducera autofagi genom aminosyrasvält och (3) dissekera larvfettkropparna. För att generera kloner framgångsrikt i larvfettkropparna måste följande kritiska steg utföras noggrant. (1) Timing av värmechocken exakt är avgörande eftersom mitotisk rekombination endast sker när vävnaden genomgår mitos, och (2) både värmechocktemperatur och varaktighet är avgörande för att inducera FLP-uttryck. Ett standard 37 ° C vattenbad för 1 h värmechock rekommenderas. Med tanke på den ökade risken för embryonal/larvdöd under värmechock och svält måste flera korsningar inrättas för tillräcklig vävnadsprovgenerering för avbildning.
Dessutom kan vissa steg behöva ändras med tanke på de faktiska odlingsförhållandena. Till exempel kan skillnaderna i miljö och Drosophila odlingsmedia mellan laboratorier påverka larvernas tillväxthastighet. Därför kan den utvecklingstid som krävs för embryon att nå det tidiga tredje instarstadiet och varaktigheten av larvsvält (odling i 20% sackaros för att inducera autofagi) behöva standardiseras i varje laboratorium separat.
GFP-Atg8a är den vanligaste markören för att bestämma autofagi. Förändringarna i GFP-Atg8a puncta-mönstret kan dock inte identifiera den exakta autofagidefekten eller det drabbade steget direkt. Därför måste flera markörer analyseras för att tolka sådana data exakt. Protokollet som presenteras här kan anpassas för andra autofagirelaterade proteiner med deras respektive transgena stammar25. Flera markörer märkta med olika fluorescerande proteiner (såsom blåfluorescensprotein [BFP]) kan analyseras samtidigt för att belysa initierings- eller fusionsprocesserna. Kontrollerad autofagimodifiering, med hjälp av kemikalier26 eller RNA-interferens av kritiska gener27, kan kombineras med det nuvarande tillvägagångssättet för att ytterligare belysa autofagimekanismer. Dessutom är analys av endogena proteinmarkörer för autofagi (genom att använda immunohistokemi) i mosaikvävnader viktigt för att bekräfta fenotyperna28.
Även om autofagi ursprungligen erkändes som en slumpmässig, icke-selektiv process, indikerar ökande bevis att det kan vara selektivt och selektivt försämrar cytoplasmatiska organeller såsom mitokondrier och endoplasmatisk retikulum, bland annat29. Vidare kan proceduren som beskrivs här tillämpas för att utforska selektiv autofagi. Till exempel kan mitofagi övervakas i flugfettkroppar genom att fästa fluorescerande proteiner (såsom Keima eller GFP-RFP tandemtaggar) till en mitokondriell målsekvens30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för att THFC och BDSC tillhandahåller flugstammarna. Dr. Tong Chao stöds av National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) och grundforskningsmedel för de centrala universiteten. Vi tackar core facility i Life Sciences Institute (LSI) för att tillhandahålla tjänster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B.
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al.
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A.
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P.
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
