Summary
本议定书建议使用改进的非接触技术在兔子中创建动静脉瘘。该技术涉及颈总动脉和颈外静脉的左右吻合，而无需解剖静脉周围组织或切断动脉。
Abstract
吻合口狭窄是一个具有挑战性的问题，通常会导致不成熟并降低动静脉瘘 （AVF） 的通畅性。手术过程中静脉和动脉损伤和血流动力学变化可导致内膜增生，导致并联吻合口狭窄。为了减少手术过程中对静脉和动脉的损伤，本研究提出了一种新的改进的AVF构建非接触技术（MNTT），可以降低并列吻合口狭窄的发生率并改善AVF通畅性。为了揭示MNTT的血流动力学变化和机制，本研究提出了使用该技术的AVF程序。尽管该程序在技术上具有挑战性，但经过充分培训后，程序成功率为94.4%。最终，34 只兔子中有 13 只在手术后 4 周出现了功能性 AVF，导致 38.2% 的 AVF 通畅率。然而，在4周时，生存率为86.1%。超声检查显示通过AVF吻合口的活跃血流。此外，在吻合口附近的静脉和动脉中观察到螺旋层流，表明该技术可以改善AVF的血流动力学。组织学观察显示，AVF吻合口处未见明显的静脉内膜增生，而吻合口近端颈外静脉（EJV）未观察到显著的内膜增生。该技术将提高对使用MNTT进行AVF构建的机制的理解，并为AVF构建中手术方法的进一步优化提供技术支持。
Introduction
动静脉瘘 （AVF） 的构建在临床实践中广泛用于接受维持性血液透析 （MHD） 的患者，与动静脉移植 （AVG） 或隧道式囊导管 （TCC） 相比，它具有更高的通畅性和更少的并发症1，2。虽然AVF是血管通路的首选模式，但它并不完美，并且具有固有的局限性。1 年原发性 AVF 通畅率仅为 60%-65%，许多失败发生在近吻合口区域3，4，5。
在传统的手术方法中，血管会经历不同程度的损伤，最终影响AVF的成熟。新的手术方式，例如Hörer等人提出的非接触技术（NTT）（补充图1）6和Sadaghianloo等人提出的桡动脉移位和再植入术（RADAR）7，8和Bai等人9，旨在降低并列吻合口狭窄的发生率，并通过修改手术技术来改善瘘管通畅。虽然RADAR的效果优于NTT，但RADAR观察到流入动脉狭窄更为突出。为了进一步减少手术过程中对静脉和动脉的伤害，2021 年，提出了一种新的改进的无接触技术 （MNTT），通过保留头静脉周围的静脉组织而不切割桡动脉来创建放射性头颅 AVF（补充图 1 和补充图 2）。初步结果显示初级通畅性增加，吻合口狭窄减少，无动脉狭窄10，11。
考虑到目前缺乏使用MNTT的AVF动物模型，并进一步探索MNTT在AVF手术中的机制，本研究引入了使用MNTT的颈总动脉（CCA）-颈外静脉（EJV）AVF手术。
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Protocol
使用实验动物的实验程序得到了南京医科大学实验动物福利伦理委员会的批准。本研究使用10个月大的新西兰兔子（男女;体重，3.18±0.24公斤）。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 动物制备
- 将盐酸替他明和盐酸唑拉西泮（3mg/kg）混合静脉注射至耳边静脉，后肢肌肉肌内注射sumianxin II（0.02mL/kg）（见 材料表），麻醉兔子。
注意：大约1-3分钟后，麻醉效果稳定下来。在进行之前，应通过捏住颈部后面的皮肤并观察角膜反射来检查麻醉水平。如果需要，可在手术期间加入盐酸替他明、盐酸唑拉西泮（0.5mg/kg）和苏米安辛II（0.01mL/kg）。 - 将兔子仰卧放在固定的桌子上（见 材料表），并用绑带绑住四肢和门牙。
- 使用电动剃须刀剃除颈部和上胸部，并通过动物脱毛膏去除毛发（见 材料表）。
- 通过高压灭菌手术设备并用聚维酮碘溶液清洁手术区域，在手术过程中保持无菌条件。
2. 皮肤切口
- 将兔子的头朝向外科医生。
- 使用手术剪刀或手术刀刀片在下颌骨和胸锁关节之间做一个~3厘米的纵向切口。
3. 颈外静脉（EJV）的准备
- 暴露切口，并确定正确的EJV。确保 EJV 及其血管周围组织清晰可见且未解剖。
注意：EJV显示倒“Y”型，靠近内侧颈的分支需要吻合。 - 沿着垂直于EJV的方向制作一个血管夹可以通过的隧道（见 材料表）。确保隧道两侧的开口与 EJV 之间的距离为 >1 厘米。
- 沿隧道放置血管夹。
- 使用相同的方法在远端 EJV 上创建另一个隧道（与步骤 3.2 中相同）。
注意：确保两个隧道之间的距离为≥2厘米。 - 沿隧道应用4-0缝合线（见 材料表）和血管夹以控制血流（图1A）。
4.解剖和准备颈总动脉（CCA）
- 使用镊子（ 材料表）探查气管外侧和胸锁乳突肌内侧的CCA。
注意：CCA具有搏动感，与颈神经平行。 - 将CCA直接解剖至约2厘米的长度。
注意：避免在深动脉过程中损伤迷走神经及其分支。 - 在需要时在CCA周围放置4-0缝合线以控制血流。
- 尽可能远端和近端应用血管钳夹（见 材料表）（图1B）。
5. 准备吻合术
- 对于静脉切开术和吻合术，使用显微剪刀（见 材料表）从周围组织中解剖EJV的内部（4毫米长）。
- 在静脉中间用显微剪刀做一个4毫米长的纵向切口。用肝素溶液（100 IU / mL）冲洗静脉以防止血栓形成。
- 使用锋利的刀片和显微剪刀在动脉前壁上做一个约4毫米的纵向切口。用 100 IU/mL 肝素溶液冲洗动脉，直到血管中没有血液。
6. 左右吻合术
- 将 EJV 和 CCA 拉得尽可能紧密。
- 将昆林技术12 应用于 CCA 和 EJV 的侧对侧吻合术，使用 8-0不可吸收的缝合线（见 材料表）。首先缝合血管的后壁（图1C），然后缝合血管的前壁。
注意：由于兔子的EJV壁很薄，因此在手术过程中应小心，以防止对血管的损害，以免以后损害吻合口的通畅性。在血管吻合过程中，必须反复使用肝素溶液（100 IU/mL）冲洗管腔，以防止血栓形成。
7.血管钳夹移除和静脉结扎
- 依次移除 CCA 的远端血管钳夹、EJV 的近端血管钳夹和 CCA 的近端血管钳夹。观察通过吻合口的活跃血流。
- 使用之前放置的 4-0 缝合线结扎 EJV 的远端。取下 EJV 的远端血管钳夹。
- 取下放置在CCA周围的缝合线（图1D）。
8. 皮肤闭合和术后护理
- 在确保手术区域没有明显出血后，使用中断缝合线（4-0）关闭颈部皮肤。
- 将兔子放在笼子里，直到它完全恢复。通常，这需要 30-45 分钟。
注意：在不完全或延迟恢复的情况下，应注意确保兔子不会因手术区域出血而经历血流动力学休克。如果需要，术后给予苏米安新II（0.01mL/kg）。
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Representative Results
该技术成功应用的结果是兔颈中的专利AVF。本研究采用以下标准来评价成功与否：（1）血管吻合完成后，可触摸AVF静脉震颤，可闻血管杂音;（2）AVF建立4周后，可通过彩色多普勒超声测量通过内瘘吻合口的活性血流;（3）AVF建立4周后，苏木精-伊红（H&E）染色显示AVF吻合处有明显的静脉内膜增生。
这项研究总共包括36只健康的新西兰兔子。总共有 34 只兔子使用 MNTT 立即获得了成功的 AVF。三只兔子术后出血明显，一只因失血死亡。剩下的两只兔子需要压缩止血来止血。此外，四只兔子在手术后死亡，常见症状包括打喷嚏、咳嗽、流鼻涕、厌食和腹泻。最后，31只兔子存活下来，13只在手术后4周出现功能性AVF。存活率为86.1%（图2）。
手术后4周使用彩色多普勒超声（CDU）评估AVF，以确认通畅性，定义为通过AVF吻合的活跃血流（图3）。此外，在吻合口附近的静脉和动脉处均观察到螺旋层流（图3）。就对侧颈上AVF与正常血管之间的超声参数而言，EJV的直径和PSV与CCA的直径存在显着差异（表1）。
AVF在手术后4周获得并切片。对所有获得的切片进行H&E染色。在AVF吻合部位观察到明显的静脉内膜增生（图4），而在吻合口的近端EJV处没有观察到明显的内膜增生（图4）。
图1：使用MNTT在兔子中创建的CCA-EJV AVF 。 （A）沿着垂直于EJV的方向建造了两条隧道。（B） 共同国家评估已动员起来。（C）利用昆林的技术，对CCA和EJV进行了左右吻合术。（D）结扎EJV的远端，通过近端可见血流不畅。缩写：CCA = 颈总动脉;EJV = 颈外静脉;AVF = 动静脉瘘;MNTT = 改进的无接触技术。 请点击此处查看此图的大图。
图2：兔子的存活曲线。 一只兔子在手术后因失血而立即死亡。其余4只兔子分别在手术后第3、7、10、26天死亡。最后，31只兔子在手术后4周存活。 请点击此处查看此图的大图。
图3：AVF的CDU评估图谱。 （A）CCA显示单向低阻力血流谱，正常三相血流丢失，收缩期峰扩大，舒张血流量丰富。（B）EJV显示动脉样低阻力血流谱，PSV增加，光谱扩大。（C）通过AVF吻合口的活跃血流。（D）在EJV流出道中观察到螺旋层流。缩写：AVF = 动静脉瘘;CCA = 颈总动脉;EJV = 颈外静脉;PSV = 收缩压峰值速度。请点击此处查看此图的大图。
图4：手术后4周观察兔子的AVF形态（H&E染色）。 （A）未观察到具有专利AVF的CCA的显着内膜增生。（B）AVF未闭吻合部位的EJV弹性膜严重破坏，伴有明显的内膜增生。在弹性膜的内侧清晰可见厚增生的纤维组织，弹性纤维减少和破碎。（C）吻合口近端EJV无明显内膜增生，AVF未闭。这显示出完整的弹性膜和细长的波浪状弹性纤维。缩写：AVF = 动静脉瘘;CCA = 颈总动脉;EJV = 颈外静脉。放大倍率：200倍。 请点击此处查看此图的大图。
| 群 | 颈外静脉 | 颈总动脉 | ||
| 直径（毫米） | PSV （厘米/秒） | 直径（毫米） | PSV （厘米/秒） | |
| AVF | 7.21 ± 1.55 | 79.64 ± 39.31 | 3.06 ± 0.32 | 59.38 ± 32.25 |
| 普通血管 | 3.13 ± 0.66 | 9.21 ± 2.77 | 2.17 ± 0.41 | 39.02 ± 11.56 |
| t | 5.413 | 3.996 | 3.779 | 1.329 |
| P | 0.001 | 0.004 | 0.005 | 0.22 |
表1：家兔对侧颈部AVF与正常血管之间的超声参数比较（n = 5）。 缩写：PSV = 收缩压峰值速度。 t检验用于数据分析。当 P 值为 <0.05 时，两组之间的比较具有统计显著性。
补充图1：AVF手术中血管吻合模式示意图。 （A）传统的AVF手术。（B） 使用 NTT 创建的 AVF。（C） 使用 MNTT 创建的 AVF。缩写：AVF = 动静脉瘘;NTT = 非接触技术;MNTT = 改进的无接触技术。 请点击此处下载此文件。
补充图2：使用MNTT的功能性端到端吻合AVF。 缩写：AVF = 动静脉瘘;MNTT = 改进的无接触技术。 请点击此处下载此文件。
补充图3：使用传统技术创建的AVF的兔子模型。 （A）从静脉周围组织中解剖EJV。（B） EJV和CCA被合并。（C）利用昆林的技术，对CCA和EJV进行了左右吻合术。（D）EJV的远端结扎，并且明显有血流通过近端。缩写：CCA = 颈总动脉;EJV = 颈外静脉;AVF = 动静脉瘘。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
目前，有几种动物模型可用于AVF。其中，猪、羊、狗多用作大型动物模型13、14、15。使用的小动物模型包括兔子，大鼠和小鼠16，17，18。本研究使用了新西兰兔。新西兰兔在EJV周围有丰富的静脉周围组织，有利于MNTT方法的研究。使用新西兰兔的优点包括手术简单、喂养方便、成本低。然而，在研究血流动力学时，大型动物模型比兔子模型有好处。
这项研究提出了一种独特的CCA-EJV AVF程序，使用MNTT，无需解剖静脉周围组织或切断动脉。用于产生AVF的功能性端对侧吻合术19，20是通过侧对侧动静脉吻合术，然后结扎远端EJV来完成的。与传统技术（补充图3）相比，使用MNTT产生AVF更充分地保存了静脉周围组织。动静脉血管吻合术中，由于保留了静脉周围组织，拉动静脉周围组织可以更充分地暴露静脉壁，有利于血管吻合。
在超声检查中，在吻合口附近的静脉和动脉中观察到螺旋层流，表明MNTT可能具有更有利的血流动力学，这可能是通畅和成熟率优异的原因21，22。组织学观察显示，AVF吻合口处有明显的静脉内膜增生，而吻合口近端EJV处未见明显的内膜增生。这一发现可能与这种手术技术或螺旋层流改善并联吻合口狭窄有关。
遇到的常见问题及建议
鉴于EJV的壁很薄，在吻合血管时必须轻柔的操作，以防止对EJV的损害。由于EJV周围的组织得以保留，因此可以在吻合过程中将其拉动以展开血管并使其更有利于缝合。然而，EJV周围组织的保存是令人烦恼的。静脉切开术后，鉴于血液从静脉血管流出，血管塌陷并导致EJV回缩。在EJV吻合术期间，必须使用微血管镊子拉动EJV的周围组织并完全暴露静脉壁。此外，如果动脉和静脉之间的距离很长，则应允许CCA有足够的自由长度，以确保两者彼此靠近，从而促进吻合。安 8-0无菌血管缝合用于血管吻合，以减少对血管的损伤。
技术限制
静脉的准备仍然需要沿着隧道进行隧道和夹紧，这种操作会导致静脉损伤。在进行动脉和静脉侧向吻合术之前，拉动动脉和静脉可能导致血管损伤。由于38.2%的通畅率低于其他AVF型号23，24，因此有必要进一步改善AVF手术后兔子的护理和检测。
该技术的应用
为了进一步研究MNTT和相关血流动力学的机制，需要进行病理，分子和基因组研究来验证该技术。
结论
本研究使用MNTT方法成功创建了CCA-EJV AVF。手术简单，重现性好，成功率高，具有进一步研究MNTT在AVF手术中的应用潜力。
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Disclosures
作者与该程序中使用的药物和材料没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了苏州市科技计划项目（SYS2020077）、苏州高新区医疗卫生科技计划项目（2020z001）、苏州市科技发展计划项目-医疗健康科技创新项目（SYK2021030）、南京医科大学科技发展基金项目（NMUB20210253）、苏州市科技局基础研究应用项目的资助 （编号：SYSD2019205、编号：SYS2020119）、江苏省中医药科技发展计划项目（编号：MS2021098）、教育部产学合作办学项目（编号202102242003）、江苏省第六届“333高层次人才培养”项目、苏州市科技城医院2022年院级预研基金项目（SZKJCYY2022014）、苏州市“科教兴卫”青年科技项目 （KJXW2022086）.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Depilatory | Fuzhou Feijing Biotechnology Co., Ltd. | PH1877 | |
| Curved hemostatic forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZH131R/RN | |
| Dissecting forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZDO25R/RN | |
| electrical razor | Shenbao Technology Co., Ltd | PGC-660 | |
| Fixed Table | Zhenhua Biomedical Instrument Co., Ltd | ZH-DSB019 | |
| Halsey needleholder | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZM208R/RN | |
| Heparin Dodium Injection | Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd. | H32020612 | |
| Medical gauze dressing | Nanchang Kangjie medical hygiene products Co., Ltd | 20172640135 | |
| Micro forceops | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZD275RN/T | |
| Micro needle holder forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF2618RB/T | |
| Micro scissors | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF022T | |
| Non-silk sutures 4-0 | Kollsut Medical Instrument Co., Ltd. | NMB020RRCN26C075-1 | |
| Non-absorbable sutures 8-0 (double needle) | Yangzhou Yuankang Medical Instrument Co., Ltd. | 10299023602 | |
| Povidone iodine solution | Shanghai Likang Disinfection High-tech Co., Ltd. | 310512 | |
| Rinse needle | Jiangsu Tonghui Medical Instrument Co., Ltd | 20180039 | |
| scalpel handle | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | J11030 | |
| Sharp blade | Suzhou Medical Products Factory Co., Ltd. | TY21232001 | |
| Sodium Chloride Injection (100 mL) | Guangdong Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | B21K0904 | |
| Sugical Scissors | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZC120R/RN | |
| Sumianxin II | Jilin Dunhua Shengda Animal Pharmaceutical Co., Ltd. | 20180801 | |
| Syringe with needle?5 mL) | BD medical devices (Shanghai) Co., Ltd | 2006116 | |
| Tiletamine Hydrochloride and Zolazepam Hydrochloride for Injection | Virbac Pet Health, France | 83888204 | |
| Triangle needle | Hangzhou Huawei medical supplies Co., Ltd | 7X17 | |
| Vascular clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF220RN | |
| New Zealand rabbits | Suzhou Huqiao Biological Co., Ltd. | SCXK2020-0001 |
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