Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تطوير وتقييم نموذج الفئران لعيوب الغضروف كاملة السماكة

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64475
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 1, 5, 1, 3, 1, 1
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

ينشئ هذا البروتوكول نموذجا لعيوب الغضروف كاملة السماكة (FTCD) عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ للفئران وقياس سلوك الألم اللاحق والتغيرات النسيجية المرضية.

Abstract

عيوب الغضروف في مفصل الركبة الناجمة عن الصدمة هي إصابة رياضية شائعة في المفصل في العيادة ، وتؤدي هذه العيوب إلى آلام المفاصل ، وضعف الحركة ، وفي النهاية هشاشة العظام في الركبة (kOA). ومع ذلك ، هناك القليل من العلاج الفعال لعيوب الغضروف أو حتى kOA. النماذج الحيوانية مهمة لتطوير الأدوية العلاجية ، لكن النماذج الحالية لعيوب الغضاريف غير مرضية. أنشأ هذا العمل نموذجا لعيوب الغضروف كاملة السماكة (FTCD) عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ للفئران ، وتم استخدام سلوك الألم اللاحق والتغيرات النسيجية المرضية كتجارب قراءة. بعد الجراحة ، تم تخفيض عتبة الانسحاب الميكانيكي ، وفقدت الخلايا الغضروفية في الموقع المصاب ، وزاد تعبير مصفوفة ميتالوبروتيناز MMP13 ، وانخفض تعبير الكولاجين من النوع الثاني ، بما يتفق مع التغيرات المرضية التي لوحظت في عيوب الغضروف البشري. هذه المنهجية سهلة وبسيطة في الأداء وتمكن من المراقبة الإجمالية فور الإصابة. علاوة على ذلك ، يمكن لهذا النموذج أن يحاكي بنجاح عيوب الغضروف السريرية ، وبالتالي توفير منصة لدراسة العملية المرضية لعيوب الغضروف وتطوير الأدوية العلاجية المقابلة.

Introduction

الغضروف المفصلي هو نسيج شديد التمايز وكثيف يتكون من الخلايا الغضروفيةوالمصفوفة خارج الخلية 1. الطبقة السطحية للغضروف المفصلي هي شكل من أشكال الغضروف الزجاجي ، الذي يتميز بسطح أملس ، واحتكاك منخفض ، وقوة ومرونة جيدة ، وتحمل ممتاز للإجهاد الميكانيكي2. تتكون المصفوفة خارج الخلية من الكولاجين البروتيني والماء ، والكولاجين من النوع الثاني هو المكون الهيكلي الرئيسي للكولاجين ، حيث يمثل حوالي 90٪ من إجمالي الكولاجين3. نظرا لعدم وجود أوعية دموية أو أعصاب في أنسجة الغضاريف ، فإنه يفتقر إلى القدرة على الإصلاح الذاتي بعد الإصابة4. لذلك ، كانت عيوب الغضروف الناجمة عن الصدمة دائما مرضا مشتركا مستعصيا في العيادات. بالإضافة إلى ذلك ، يميل هذا المرض المشترك إلى إصابة الشباب ، ومعدل الإصابة العالمي آخذ في الارتفاع 5,6. مفصل الركبة هو الموقع الأكثر شيوعا لعيوب الغضروف ، والعيوب هنا مصحوبة بألم المفاصل ، وضعف المفاصل ، وتنكس الغضروف المفصلي ، مما يؤدي في النهاية إلى هشاشة العظام في الركبة (kOA) 7. عيوب الغضروف في مفصل الركبة تجلب أعباء اقتصادية وفسيولوجية للمرضى وتؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى8. يشكل هذا المرض تحديا سريريا كبيرا وعاجلا مع عدم وجود حلول وشيكة. حاليا ، الجراحة هي الدعامة الأساسية لعلاج عيوب الغضروف ، لكن نتائجها على المدى الطويل لا تزال غير مرضية9.

تؤدي عيوب الغضروف السريرية في النهاية إلى kOA ، وبالتالي ، تستخدم النماذج الحيوانية kOA بشكل شائع للدراسة المرضية لعيوب الغضروف وتطوير الأدوية. يعد إنشاء نماذج حيوانية أمرا مهما لفهم العملية الفيزيولوجية المرضية لإصلاح عيوب الغضروف ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة تجديد الغضروف والتغيير بين الغضروف الليفي والغضروف الزجاجي10. ومع ذلك ، فإن النماذج الحيوانية الشائعة الاستخدام kOA ، مثل النماذج الجراحية لقطع الرباط الصليبي الأمامي (ACLT) ، وزعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي (DMM) ، واستئصال المبيض (OVX) ، و Hulth ، عادة ما تحتاج إلى نمذجة طويلة الأجل وتسمح فقط بالتقييمات المرضية والألم ، مما يشكل قيودا على كفاءة تطوير الأدوية11. إلى جانب النماذج الجراحية ، تؤدي النماذج الكيميائية ، مثل أحادي يودوأسيتات (MIA) وحقن غراء ، أيضا إلى عيوب في الغضروف ، ولكن لا يمكن إدارة درجة العيب بشكل جيد ، والظروف بعيدة عن الواقع السريري11. الاصطدام هو نهج آخر لنمذجة عيوب الغضروف في الحيوانات الكبيرة ، ولكن هذه الطريقة تعتمد على استخدام أدوات محددة ونادرا ما يتم تطبيقها12.

باختصار ، نماذج kOA الحالية ليست مثالية لدراسة التسبب في عيوب الغضروف أو تطوير أدوية جديدة ، وهناك حاجة إلى نموذج محدد وموحد لعيوب الغضروف. أنشأت هذه الدراسة نموذجا لعيوب الغضروف كاملة السماكة (FTCD) عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ في الفئران. تم إجراء الملاحظة الإجمالية واختبارات سلوك الألم والتحليل النسيجي المرضي لتقييم النموذج. على عكس النماذج الحيوانية الأخرى من kOA ، فإن هذا النموذج له تأثير ضئيل على الحالة العامة للفئران. يمكن الوصول إلى نهج النمذجة هذا ، ويمكن إدارته بشكل جيد ، ويدعم فهم التقدم من عيوب الغضروف إلى kOA وتطوير علاجات فعالة. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لاختبار العلاجات التي تمنع kOA عن طريق شفاء العيوب في المفاصل قبل التهاب المفاصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة المعايير والأخلاقيات الطبية بجامعة تشجيانغ للطب الصيني التقليدي ، والتي تتوافق مع التشريعات الصينية بشأن استخدام ورعاية المختبر. في الدراسة الحالية ، تم استخدام ذكور الفئران Sprague-Dawley (SD) البالغة من العمر 6 أسابيع والتي تزن 150-180 جم. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. إنشاء نموذج عيوب الغضروف كاملة السماكة في الفئران

  1. بعد 1 أسبوع من التأقلم مع البيئة الجديدة ، قسم الفئران بشكل عشوائي ومتساو إلى مجموعتين (ن = 8 فئران / مجموعة). ستخضع الفئران في المجموعة الوهمية للجراحة الوهمية ، بينما ستخضع الفئران في المجموعة النموذجية للجراحة التجريبية التي تنطوي على حفر ثقوب في أخدود الفخذ.
    ملاحظة: يجب تغطية كل قفص بحشوات معقمة من كوز الذرة (انظر جدول المواد) لحماية أصابع الفئران.
  2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) من الصوديوم بنتوباربيتال (40 ملغم / كغم). ثم اضغط برفق على أصابع الفئران لتأكيد التخدير الكافي. استخدم مرهما بيطريا على عيون الفئران لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    ملاحظة: يجب إجراء جراحة الحيوانات في غرفة عمليات مخصصة باستخدام أدوات جراحية معقمة. يجب على المشغلين ارتداء معاطف المختبر النظيفة وأقنعة الوجه وأغطية الرأس والقفازات المعقمة أثناء الجراحة. ضع ضمادات معقمة على منطقة الجراحة وعقم جميع المعدات قبل الاستخدام. توفير الدعم الحراري طوال العملية.
  3. ضع الفئران على طاولة العمليات في وضع ضعيف ، وحلق الأطراف الخلفية اليسرى واليمنى ، ونظف منطقة مفصل الركبة بالصابون الجراحي ، متبوعا بمحلول بوفيدون اليود المطهر بالتناوب والكحول ثلاث مرات في ظل ظروف معقمة. ضع ستارة معقمة فوق الجرذ ، وكشف مفصل الركبة المطهر فقط.
  4. قم بعمل شق 1 سم بشفرة مشرط (رقم 11) في منتصف مفصل ركبة الفئران من أعلى إلى أسفل ، واقطع كبسولة المفصل ووتر الفخذ الفخذي على طول الحافة الإنسية للرضفة بعد التشريح السطحي.
    ملاحظة: يتم توصيل وتر الفخذ رباعي الرؤوس بالرضفة واللقمة الفخذية أثناء ثني مفصل الركبة13. الأخدود الذي يظهر في كبسولة المفصل هو أخدود عظم الفخذ ، وتشكل اللقمة الفخذية البعيدة اللقمات الإنسية والجانبية.
  5. أدر الرضفة إلى الخارج ، وقم بثني الساق والشظية بزاوية 90 درجة لكشف تروقعة اللقمة الفخذية بالكامل. استخدم مثقاب ثقب دائري بقطر 1.6 مم (انظر جدول المواد) عموديا على سطح الغضروف عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان لعمل عيب غضروفي كامل السماكة في أخدود القوقعة الفخذي بعمق 0.1 مم.
    ملاحظة: استخدم المحلول الملحي بشكل متقطع لتقليل الصدمات الحرارية للأنسجة العظمية المحيطة أثناء إجراء الحفر.
  6. امسح موقع الجراحة بكرات قطنية مبللة بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ ، واستبدل الرضفة ، واحتفظ بالركبة في وضع التمديد ، وقم بخياطة الشق طبقة تلو الأخرى بخيوط غير قابلة للامتصاص 4-0 (انظر جدول المواد).
    1. ضع الحيوانات على منصات التدفئة مع راقد القص ، ومراقبتها حتى تستيقظ ، ثم إعادتها إلى أقفاصها. حقن البوبرينورفين (0.05 ملغ/كغ) تحت الجلد كل 8 ساعات ثلاث مرات بعد العملية لتخفيف الآلام.
  7. اختبر السلوك المرتبط بالألم لجميع الفئران في 3 أيام و 10 أيام و 17 يوما بعد الجراحة ، كما هو موضح في القسم 2.

2. عتبة السحب الميكانيكية (MWT)

ملاحظة: تم قياس MWT للأخمص الخلفي الثنائي للفئران بواسطة طريقة قياس ألم خيوط فون فرايالكلاسيكية 14.

  1. ضع الجرذ في حجرة بلاستيكية واحدة (17 سم × 11 سم × 13 سم) على منصة شبكية سلكية (انظر جدول المواد) ، وضع قاعدة الشبكة السلكية 50 سم فوق الطاولة. قم بقياس MWT بعد 30 دقيقة من التكيف.
  2. اضغط على خيوط فون فراي (انظر جدول المواد) بشكل عمودي على السطح الأخمصي للمخلب الخلفي لكل فأر ، وثني الفرشاة لمدة 2 ثانية تقريبا ، وتجنب الجزء السميك من مركز المخلب الخلفي.
  3. قم بزيادة وزن التحفيز تدريجيا من أدنى 4 جم حتى تحدث استجابة إيجابية (انسحاب مخلب أو لعق مخلب).
    ملاحظة: يجب أن تكون الفترة الفاصلة بين كل تحفيز أكثر من 1 دقيقة. يتم تعريف MWT على أنه ثلاث استجابات إيجابية في خمسة محفزات. سجل وزن التحفيز بالجرام.
  4. احسب القيم المتوسطة للمجموعات الوهمية والنموذجية وفقا للحد الأدنى المسجل لوزن التحفيز بالجرام.

3. التحليل النسيجي المرضي والمناعي الكيميائي

  1. في 17 و 56 يوما بعد الجراحة ، قم بتخدير الفئران ب 40 مجم / كجم من الصوديوم الخماسي (IP) ، والتضحية بجميع الفئران عن طريق سحب الدم من القلب. عزل الركبتين عن طريق قطع العظام في منتصف عظم الفخذ ومنتصف الساق ، وتشريح الأنسجة العضلية المحيطة. إزالة مفاصل الركبة للتحليل النسيجي.
  2. ثبت مفاصل الركبة في 20 مل من محلول بارافورمالدهايد 10٪ لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة الكلس منها باستخدام 20 مل من محلول EDTA بنسبة 10٪ في شاكر مداري لمدة 8 أسابيع عند 4 درجات مئوية. قم بتغيير حل EDTA كل يوم.
  3. قم بقص مفصل الركبة ليناسب حجم صندوق التضمين. قم بتضمين مفاصل الركبة المجففة في 100٪ بارافين15.
  4. ضع مفاصل الركبة المضمنة بالبارافين على حامل الميكروتوم ، واضبط الزاوية ، وقم بقص عينة البارافين بشفرة حتى يصبح السطح مسطحا.
  5. اضبط سمك شرائح البارافين على 3 ميكرومتر ، وقم بتسطيح الشرائح في حمام مائي عند 40 درجة مئوية.
  6. ألصق الشرائح على شرائح زجاجية ، وضعها في آلة خبز 45 درجة مئوية (انظر جدول المواد) حتى تجف ، وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  7. إزالة الشمع والإماهة: قم بإزالة الشمع من الشرائح في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، ثم ضع الشرائح على التوالي في 100٪ زيلين (ثلاث مرات) ، و 100٪ إيثانول (مرتين) ، و 95٪ إيثانول ، و 80٪ إيثانول ، و 75٪ إيثانول لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  8. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E)
    1. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    2. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 0.5٪ هيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا هيماتوكسيلين على أسطح الشرائح.
    3. اغمر الشرائح في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 3 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    4. انقع الشرائح في 1٪ من ماء الأمونيا لمدة 10 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    5. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام eosin (انظر جدول المواد) لمدة 1 دقيقة ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا يوزين على أسطح الشريحة.
    6. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
    7. أضف قطرة من الراتنج المحايد (انظر جدول المواد) إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.
  9. سافرانين O / فاست فرين (SO) تلطيخ
    1. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    2. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 0.05٪ Fast Green (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا Fast Green على سطح الشرائح.
    3. اغمر الشرائح في محلول حمض الخليك 1٪ لمدة 10 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    4. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 2.5٪ SO (انظر جدول المواد) لمدة دقيقتين ، ثم اغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا SO على أسطح الشرائح.
    5. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
    6. أضف قطرة من الراتنج المحايد إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.
  10. تلطيخ التولويدين الأزرق (TB)
    1. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    2. اغمر الشرائح في محلول 1٪ TB (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا زرقاء تولويدين على سطح الشرائح.
    3. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
    4. أضف قطرة من الراتنج المحايد إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.
  11. تلطيخ ماسون
    1. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    2. أضف محلول بوين (انظر جدول المواد) بالتنقيط إلى الشرائح ، وقم بتلطيخها عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، واغسلها بالماء المقطر المزدوج حتى يختفي اللون الأصفر على سطح الشرائح.
    3. قم بتلطيخ الشرائح باللون الأزرق السيليستيت (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا زرقاء سيليستيت على أسطح الشرائح.
    4. قم بتلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا هيماتوكسيلين على أسطح الشرائح.
    5. اغمر الشرائح في الإيثانول الحمضي لمدة 5 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    6. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام Ponceau fuchsin (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا Ponceau fuchsin على أسطح الشرائح.
    7. اغمر الشرائح في حمض الفوسفوموليبديك (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق ، ثم اغمسها في محلول السل لمدة 5 دقائق ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج حتى لا يكون هناك بقايا سل على سطح الشرائح.
    8. اغمر الشرائح في محلول حمضي ضعيف لمدة دقيقتين ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين.
    9. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة 1 دقيقة في كل مرة.
    10. أضف قطرة من الراتنج المحايد إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.
  12. راقب جميع الشرائح تحت المجهر في بيئة مزدوجة التعمية لتحديد درجة تنكس الغضروف المفصلي وفقا لنظام تسجيل مانكين16.
  13. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    1. قم بإزالة الشمع وإعادة ترطيب الشرائح بشكل روتيني ، واغسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة.
    2. اغمر الشرائح في محلول سترات الصوديوم ، وضع الشرائح في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لإصلاح المستضد. اغسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 3 دقائق لكل منها.
    3. اغمر الشرائح في محلول Triton X-100 بنسبة 0.3٪ لمدة 10 دقائق ، واغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    4. منع نشاط البيروكسيديز الداخلي عن طريق إضافة محلول H 2 O23٪ في الميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    5. احتضن الأقسام بمصل الماعز بنسبة 5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع أي ارتباط غير محدد. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    6. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة ب PBS (anti-col1 ، 1:50 ؛ anti-col3 ، 1:50 ؛ anti-col2 ، 1: 100 ؛ و anti-MMP13 ، 1: 100 ؛ انظر جدول المواد) إلى كل شريحة ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    7. احتضن كل شريحة ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف (1: 100) (الماعز المضاد للأرانب أو الماعز المضاد للفأر ، انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    8. أضف 100 ميكرولتر من 3 ، 3 '-ديامينوبنزيدين (DAB ، انظر جدول المواد) حل العمل لكل شريحة.
    9. مراقبة وتسجيل وقت ظهور اللون البني تحت المجهر ؛ يحول التفاعل الكروموجيني مواقع الخاتمة إلى اللونالبني 17. عالج بقية العينات بنفس وقت رد الفعل المسجل.
    10. بعد أن تتحول الشرائح إلى اللون البني ، اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    11. أعد تلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    12. اغمر الشرائح في حمض الهيدروكلوريك لمدة 3 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    13. انقع الشرائح في 1٪ من ماء الأمونيا لمدة 10 ثوان ، واغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة.
    14. اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ زيلين (ثلاث مرات) على التوالي لمدة دقيقة واحدة في كل مرة.
    15. أضف قطرة من الراتنج المحايد إلى كل شريحة ، وأغلقها بغطاء غطاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا العمل ، تم إنشاء نموذج الفئران من FTCD عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ trochlear والكشف عن سلوك الألم اللاحق والتغيرات النسيجية. كما هو موضح في الشكل 1 ، بعد 3 أيام من النمذجة ، مقارنة بالمجموعة الوهمية ، انخفض MWT للفئران في المجموعة النموذجية بشكل كبير ، مما يشير إلى فرط التألم الناجم عن FTCD. بعد 17 يوما من النمذجة ، ظلت عتبة الانسحاب الميكانيكية للفئران في مجموعة النموذج عند مستوى منخفض ، مما يشير إلى أن حساسية الألم يمكن أن تستمر 17 يوما على الأقل. أظهرت نتائج التلوين النسيجي المرضي أنه في المجموعة الوهمية ، كان هيكل الغضروف المفصلي واضحا ، وكان سطح الغضروف سليما ، وتم توزيع الخلايا الغضروفية بالتساوي ، وتم التعبير عن الكولاجين من النوع الثاني بشكل كبير. على العكس من ذلك ، في المجموعة النموذجية ، شكل سطح الغضروف اكتئابا ، وفقدت الخلايا الغضروفية ، وزاد التعبير عن مصفوفة ميتالوبروتيناز MMP13 ، وانخفض التعبير عن الكولاجين من النوع الثاني (الشكل 2 والشكل 3).

Figure 1
الشكل 1: تطور MWT بعد عيوب الغضروف. تم تقييم عتبات السحب الميكانيكية للمخالب الخلفية بعد إحداث عيوب الغضروف. ن = 8 فئران / مجموعة. يتم عرض القيم كمتوسط ± SEM. ** P < 0.01 مقابل المجموعة الوهمية ، ***P < 0.001 مقابل المجموعة الوهمية. تم إجراء اختبار t للطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الملاحظة النسيجية المرضية (تلطيخ HE، SO، TB، و Masson) وتسجيل مانكين لمفاصل ركبة الفئران في اليوم 17 بعد علاج عيوب الغضروف. (أ) صور نسيجية تمثيلية لفأر FTCD. تشير الأسهم السوداء إلى عيوب الغضروف. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) التحليل الإحصائي لحروق هشاشة العظام في المجموعات الوهمية والنموذجية. ن = 6 فئران / مجموعة. يتم عرض القيم كمتوسط ± SEM. ***P < 0.001 مقابل المجموعة الوهمية. تم إجراء اختبار t للطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الملاحظة المناعية الكيميائية للتعبير عن Col1 و Col3 و Col2 و MMP13 والبقع السلبية في غضروف الفئران في اليوم 17. صور نسيجية تمثيلية لفأر FTCD. تشير الأسهم السوداء إلى عيوب الغضروف. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: صور تمثيلية لإحداث عيوب غضروفية كاملة السماكة عن طريق الحفر في أخدود القوقعة الفخذي للفئران. (أ) فأر الشام. (ب) نموذج الجرذ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: التقييم النسيجي الذي يظهر الحشو الكامل لعيوب الغضروف كاملة السماكة في الفئران. (أ) صورة تمثيلية في اليوم 17. (ب) صورة تمثيلية في اليوم ٥٦. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه الدراسة نموذجا حيوانيا لمحاكاة عيوب الغضروف السريرية عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ للفئران (الشكل التكميلي 1). بعد إصابة الغضروف ، يتم تعزيز استثارة أو استجابة مستقبلات الألم المحيطية ، مما قد يؤدي إلى انخفاض في عتبة الألم وتعزيز الاستجابة للتحفيز18. في الدراسات قبل السريرية ، تسببت نمذجة عيوب الغضروف في أنواع مختلفة من الحيوانات دائما في الألم19. أظهرت الأبحاث السريرية أيضا أن درجات مقياس الألم التناظري البصري (VAS) للمرضى الذين يعانون من إصابات الغضروف أقل بكثير من تلك الخاصة بالأفراد الأصحاء20. استخدمنا نموذج FTCD لاختبار تأثير علاج FTCD ، وأظهرت النتائج أن الانخفاض في MWT لم يكن عابرا ، ولم يتعافى MWT بسرعة خلال فترة زمنية قصيرة. بعد فترة من العلاج ، كان MWT في مجموعة النموذج لا يزال كبيرا ، بينما تم إعفاء مجموعة العلاج (البيانات غير معروضة). يتم تقييم الفعالية السريرية بشكل عام على أساس دورة شهر 1 من العلاج ، لذلك حتى لو حدث الشفاء بعد بضعة أشهر ، فإنه لا يؤثر على التطبيق التجريبي لهذا النموذج. علاوة على ذلك ، تم تطبيق التلوين المرضي والكيمياء المناعية لمراقبة عيوب سطح الغضروف وإثبات إنشاء FTCD.

تتميز هذه الطريقة لنمذجة FTCD بالمزايا التالية: (1) العملية السهلة والبسيطة. (2) وقت النمذجة القصير ؛ (3) نسبة النجاح العالية ؛ و (4) وجود تقدم مرئي من خلال الملاحظة الإجمالية. على عكس النماذج الحيوانية الأخرى ، يمكن توحيد هذا النموذج. من السهل التحكم في عمق الحفر وقطر نموذج FTCD ، وهو أمر مفيد لتوحيد نموذج FTCD ويزيد من قابليته للتكرار. ثانيا ، قطر ثقب الحفر هو عامل رئيسي يحدد كفاءة الإصلاح. يمكن للعيوب العظمية الغضروفية التي يبلغ قطرها 1.4 مم أن تتعافى تلقائيا ، مما يؤدي إلى الفشل في التقييم المناسب للعلاجات العلاجية21. للتغلب على أوجه القصور هذه وتحقيق التوحيد القياسي ، أجريت تجارب أولية ، وتقرر أن عيوب الغضروف لن يتم إصلاحها تلقائيا لمدة تصل إلى 17 يوما بعد الجراحة إذا تم إجراء جراحة FTCD على سطح الغضروف المفصلي مع ثقوب حفر قطرها 1.6 مم. بمرور الوقت ، يظهر FTCD الناجم عن الحفر إصلاح الغضروف ، ويتم إصلاح الغضروف المعيب إلى حد كبير بعد 8 أسابيع من الجراحة (الشكل التكميلي 2). من حيث التطبيقات ، لا يمكن استخدام هذا النموذج فقط لدراسة عيوب الغضروف التي تسببها kOA ولكن أيضا لدراسة عيوب الغضروف الرضحية ، وهي هشاشة العظامبعد الصدمة 22. يشكل الغضروف الذي تم إصلاحه ذاتيا دائما غضروفا ليفيا بدلا من الغضروف الزجاجي في الموقع المصاب ، وقد يكون هذا النموذج مناسبا أيضا لدراسة التسبب في تليف الغضروف وعلاجه23.

من حيث قيود هذا النموذج ، تم اختيار الفئران غير الناضجة ، حيث تميل عيوب الغضروف الناجمة عن الصدمة في الممارسة السريرية إلى الحدوث عند الشباب. ومع ذلك ، في الفئران غير الناضجة في مرحلة نمو الهيكل العظمي ، يكون الغضروف أرق من الفئران الناضجة ، مما قد يؤثر على نتائج التجربة24. أظهرت الأبحاث السابقة أن قدرة الخلايا الجذعية على التجدد بعد تلف الغضروف تقل في الفئران البالغة مقارنة بالفئران اليافعة25. اخترنا فئران عمرها 6 أسابيع للتجربة ، ويمكن أيضا استخدام هذه الفئران لمراقبة آليات إصلاح الخلايا الجذعية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الآثار العلاجية في الفئران البالغة من العمر 6 أسابيع أكثر وضوحا من الفئران البالغة (البيانات غير معروضة). نحتاج أيضا إلى نمذجة FTCD في الفئران الأكبر سنا ، ويمكن التكهن بأن الإصلاح قد يكون أبطأ في الفئران المسنة بسبب انخفاض قدرة تجديد الخلايا الجذعية. أظهرت الأبحاث أن الغضروف المفصلي المحيط بعيوب العظم الغضروفي يمتلك نشاطا تقويضيا ، وأن التعبير عن IL-1β و FGF2 واضطراب في توازن FGFr1 / FGFr3 مهمان في بدء عملية مرض التهاب المفاصل المبكر21. ومع ذلك ، لا يزال نموذج FTCD يعاني من قيود في تقييم إصلاح العيوب قبل التهاب المفاصل. ومن القيود الأخرى لهذه الدراسة عدم قياس MWTs بعد 17 يوما من النمذجة.

في الختام ، سيكون هذا النموذج نموذجا حيوانيا مثاليا وموحدا لمحاكاة عيوب الغضروف عن طريق حفر ثقوب في أخدود الفخذ للفئران. لا يحاكي هذا النموذج حدوث وتطور FTCD السريري فحسب ، بل يوفر أيضا نموذجا حيوانيا موثوقا به لتقييم العلاجات العلاجية ضد FTCD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة تشجيانغ للعلوم الطبيعية (رقم المنحة LQ20H270009) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 82074464 و 82104890) ، ومؤسسة تشجيانغ للعلوم الطبية الصينية التقليدية (أرقام المنح 2020ZA039 و 2020ZA096 و 2022ZB137) ومشروع علوم وتكنولوجيا الصحة الطبية التابع للجنة الصحة بمقاطعة تشجيانغ (رقم المنحة 2016KYA196).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3, 3 '-diaminobenzidine   Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9019 The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody Novus NB600-594 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody Abcam (UK) 34712 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody Novus NB600-408 Primary antibody for IHC
Bouin solution Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Celestite blue Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Corncob paddings   Xiaohe Technology Co., Ltd  Bedding for animal 
Eosin Sigma-Aldrich 861006 The dye for HE staining
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9002 Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9001 Secondary antibody for IHC
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3163 The dye for HE staining
Masson Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Microdrill Rwd Life Science Co., Ltd 78001 Equipment for surgery
MMP13 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) 69926 Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center Thermo Fisher Scientific (USA) EC 350 Produce paraffin blocks
Neutral resin Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9555 Seal for IHC
Nonabsorbable suture Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. 4-0 Equipment for surgery
Pentobarbital sodium  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. WBBTN5G Anesthetized animal
phosphomolybdic acid  Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes Thermo Fisher Scientific (USA) HM325 Precise paraffin sections
Safranin-O Sigma-Aldrich S2255 The dye for SO staining
Scalpel blade Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. 11 Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x) Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. HK1222 Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats  Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. SD Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr Sakura (Japan) Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89640 The dye for TB staining
Von Frey filament UGO Basile (Italy)  37450-275 Equipment for MWT assay
Wire mesh platform  Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. Equipment for MWT assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Tags

الطب ، العدد 195 ، عيوب الغضروف كاملة السماكة ، هشاشة العظام ، النموذج الحيواني ، آلام هشاشة العظام ، الفئران
تطوير وتقييم نموذج الفئران لعيوب الغضروف كاملة السماكة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y.,… More

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y., Chen, Z., Fan, M., Yu, G., Zhou, L., Guo, L., Shan, L., Bao, H. Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (195), e64475, doi:10.3791/64475 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter