Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Udvikling og evaluering af en rottemodel af bruskfejl i fuld tykkelse

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64475
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 1, 5, 1, 3, 1, 1
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol etablerer en model for bruskdefekter i fuld tykkelse (FTCD) ved at bore huller i lårbenets trochlear rille hos rotter og måle den efterfølgende smerteadfærd og histopatologiske ændringer.

Abstract

Bruskdefekter i knæleddet forårsaget af traumer er en almindelig sportsledsskade i klinikken, og disse defekter resulterer i ledsmerter, nedsat bevægelse og til sidst knæartrose (kOA). Men, der er lidt effektiv behandling for brusk defekter eller endda kOA. Dyremodeller er vigtige for udvikling af terapeutiske lægemidler, men de eksisterende modeller for bruskdefekter er utilfredsstillende. Dette arbejde etablerede en fuldtykkelse bruskdefekt (FTCD) model ved at bore huller i lårbenet trochlear rille af rotter, og den efterfølgende smerteadfærd og histopatologiske ændringer blev brugt som udlæsningsforsøg. Efter operationen blev den mekaniske tilbagetrækningstærskel reduceret, chondrocytter på det skadede sted gik tabt, matrixmetalloproteinase MMP13-ekspression blev øget, og type II kollagenekspression faldt i overensstemmelse med de patologiske ændringer, der blev observeret i humane bruskdefekter. Denne metode er nem og enkel at udføre og muliggør grov observation umiddelbart efter skaden. Desuden kan denne model med succes efterligne kliniske bruskdefekter og dermed give en platform til at studere den patologiske proces af bruskdefekter og udvikle tilsvarende terapeutiske lægemidler.

Introduction

Ledbrusk er et stærkt differentieret og tæt væv bestående af chondrocytter og ekstracellulær matrix1. Overfladelaget af ledbrusk er en form for hyalinbrusk, som har en glat overflade, lav friktion, god styrke og elasticitet og fremragende mekanisk stresstolerance2. Den ekstracellulære matrix omfatter kollagenproteoglycan og vand, og type II kollagen er den vigtigste strukturelle komponent i kollagen, da det tegner sig for ca. 90% af det samlede kollagen3. Da der ikke findes blodkar eller nerver i bruskvæv, mangler det evnen til selvreparation efter skade4. Derfor har bruskdefekter forårsaget af traumer altid været en uhåndterlig ledsygdom i klinikker; Derudover har denne ledsygdom tendens til at ramme unge mennesker, og den globale forekomst er stigende 5,6. Knæleddet er det mest almindelige sted for bruskdefekter, og defekter her ledsages af ledsmerter, leddysfunktion og ledbruskdegeneration, hvilket i sidste ende fører til knæartrose (kOA)7. Bruskfejl i knæleddet medfører økonomiske og fysiologiske byrder for patienterne og påvirker patienternes livskvalitetalvorligt 8. Denne sygdom udgør en stor og presserende klinisk udfordring uden forestående løsninger. I øjeblikket er kirurgi grundpillen i behandlingen af bruskdefekter, men dets langsigtede resultat forbliver utilfredsstillende9.

Kliniske bruskdefekter fører i sidste ende til kOA, og derfor anvendes kOA dyremodeller almindeligvis til patologisk undersøgelse af bruskdefekter og lægemiddeludvikling. Etableringen af dyremodeller er vigtig for at forstå den patofysiologiske proces med reparation af bruskdefekter, som kan bruges til at observere bruskregenerering og ændringen mellem fibrocartilage og hyalinbrusk10. Imidlertid har almindeligt anvendte kOA dyremodeller, såsom kirurgiske modeller af forreste korsbåndstranssektion (ACLT), destabilisering af den mediale menisk (DMM), ovariektomi (OVX) og Hulth, normalt brug for langsigtet modellering og tillader kun patologiske og smerteevalueringer, hvilket udgør begrænsninger for effektiviteten af lægemiddeludvikling11. Udover de kirurgiske modeller resulterer kemiske modeller, såsom monoiodoacetat (MIA) og papaininjektion, også i bruskdefekter, men graden af defekten kan ikke styres godt, og betingelserne er langt fra den kliniske virkelighed11. Kollision er en anden tilgang til modelbruskdefekter hos større dyr, men denne metode afhænger af brugen af specifikke instrumenter og anvendes sjældent12.

Sammenfattende er de eksisterende kOA-modeller ikke ideelle til at studere patogenesen af bruskdefekter eller udvikle nye lægemidler, og der er behov for en specifik og standardiseret model for bruskdefekter. Denne undersøgelse etablerede en model med bruskdefekter i fuld tykkelse (FTCD) ved at bore huller i lårbenets trochlear rille hos rotter. Grov observation, smerteadfærdstest og histopatologisk analyse blev udført til modelevaluering. I modsætning til andre dyremodeller af kOA har denne model ringe effekt på rotternes generelle tilstand. Denne modelleringsmetode er tilgængelig, kan styres godt og understøtter forståelsen af progression fra bruskdefekter til kOA og udviklingen af effektiv terapi. Denne model kan også bruges til test af terapier, der forhindrer kOA ved at helbrede defekter i præ-osteoartritiske led.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøgene blev godkendt af Medical Standards and Ethics Committee ved Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, som er i overensstemmelse med Kinas lovgivning om brug og pleje af forsøgsdyr. I denne undersøgelse blev der anvendt 6 uger gamle hanrotter af Sprague-Dawley (SD), der vejer 150-180 g. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabellen).

1. Etablering af en model for bruskfejl i fuld tykkelse hos rotter

  1. Efter 1 uges akklimatisering til det nye miljø opdeles rotterne tilfældigt og ligeligt i to grupper (n = 8 rotter/gruppe). Rotterne i sham-gruppen vil have skinoperationen, mens rotterne i modelgruppen vil have den eksperimentelle kirurgi, der involverer boring af huller i lårbenets trochlear rille.
    BEMÆRK: Hvert bur skal være dækket af sterile majskolbepolstringer (se materialetabellen) for at beskytte rotternes tæer.
  2. Bedøv rotterne ved en intraperitoneal injektion (i.p.) af pentobarbitalnatrium (40 mg / kg). Tryk derefter forsigtigt på rotternes tæer for at bekræfte tilstrækkelig bedøvelse. Brug en dyrlægesalve på rotternes øjne for at forhindre tørhed under anæstesi.
    BEMÆRK: Dyreoperationen skal udføres på en dedikeret operationsstue ved hjælp af autoklaverede kirurgiske instrumenter. Operatørerne skal bære rene laboratoriefrakker, ansigtsmasker, hovedbeklædninger og sterile handsker under operationen. Placer sterile puder over det kirurgiske område og steriliser alt udstyr før brug. Giv termisk støtte under hele proceduren.
  3. Placer rotten på operationsbordet i liggende stilling, barber venstre og højre bagben, og rengør knæledsområdet med kirurgisk sæbe efterfulgt af skiftevis antiseptisk povidon-jodopløsning og alkohol tre gange under sterile forhold. Placer et sterilt gardin over rotten, og udsæt kun det desinficerede knæled.
  4. Lav et snit på 1 cm med et skalpelblad (nummer 11) midt i rotteknæleddet fra top til bund, og skær ledkapslen og quadriceps femoris-senen langs patellaens mediale kant efter den overfladiske dissektion.
    BEMÆRK: quadriceps femoris-senen er fastgjort til patella og til lårbenskondylen under bøjningen af knæleddet13. Rillen, der ses i ledkapslen, er lårbenets trochlear rille, og den distale lårbenskondyle danner de mediale og laterale kondyler.
  5. Drej knæskallen udad, og bøj skinnebenet og fibula i en 90 ° vinkel for fuldt ud at udsætte trochlea af lårbenskondylen. Brug et cirkulært bor med en diameter på 1,6 mm (se materialetabellen) lodret til bruskoverfladen ved 4.000 o / min i 10 s for at lave en bruskfejl i fuld tykkelse i lårbenets trochlear rille med en dybde på 0,1 mm.
    BEMÆRK: Brug saltvand intermitterende for at minimere termisk traume til det omgivende knoglevæv under boreproceduren.
  6. Tør det kirurgiske sted af med bomuldskugler gennemblødt i en 0,9% saltopløsning, udskift patellaen, hold knæet i en forlængelsesposition og sutur snittet lag for lag med ikke-absorberbare 4-0 suturer (se materialetabel).
    1. Placer dyrene på varmepuder med bryst liggende, overvåg dem, indtil de vågner op, og returner dem derefter til deres bur. Injicer buprenorphin (0,05 mg/kg) subkutant hver 8. time tre gange efter smertelindringen.
  7. Test smerterelateret adfærd hos alle rotterne 3 dage, 10 dage og 17 dage efter operationen, som beskrevet i punkt 2.

2. Tærskelværdi for mekanisk tilbagetrækning (MWT)

BEMÆRK: MWT for den bilaterale bageste plantar af rotter blev målt ved den klassiske von Frey filament smertemålingsmetode14.

  1. Placer rotten i et enkelt plastkammer (17 cm x 11 cm x 13 cm) på en trådnetplatform (se materialetabellen), og placer trådnetbasen 50 cm over et bord. Mål MWT efter 30 minutters tilpasning.
  2. Tryk von Frey-filamentet (se materialetabellen) vinkelret på plantaroverfladen på hver rottes bagpote, og bøj børsten i ca. 2 sekunder, undgå den tykkeste del af midten af bagpoten.
  3. Forøg gradvist stimulusvægten fra de laveste 4 g, indtil der opstår et positivt svar (poteudtagning eller poteslikning).
    BEMÆRK: Intervallet mellem hver stimulering skal være mere end 1 min. MWT defineres som tre positive reaktioner i fem stimuleringer; Optag stimulusvægten i gram.
  4. Beregn middelværdierne for sham- og modelgrupperne i henhold til den registrerede minimale stimulusvægt i gram.

3. Histopatologisk og immunhistokemisk analyse

  1. 17 og 56 dage efter operationen bedøves rotterne med et pentobarbitalnatrium på 40 mg/kg (i.p.) og ofrer alle rotterne ved at trække blod ud af hjertet. Isoler knæene ved at skære knoglen i midten af lårbenet og midten af skinnebenet, og dissekere det omgivende muskelvæv. Fjern knæleddene til histologisk analyse.
  2. Knæleddene fastgøres i 20 ml 10% paraformaldehydopløsning i 48 timer ved stuetemperatur, og afkalkes derefter med 20 ml 10% EDTA-opløsning i en orbitalryster i 8 uger ved 4 °C. Skift EDTA-løsningen hver dag.
  3. Trim knæleddet, så det passer til størrelsen på indlejringsboksen. Indlejr de dehydrerede knæled i 100% paraffin15.
  4. Placer de paraffinindlejrede knæled på holderen af et mikrotom, juster vinklen, og trim paraffinprøven med et blad, indtil overfladen er flad.
  5. Paraffinskivernes tykkelse indstilles til 3 μm, og skiverne flades i vandbad ved 40 °C.
  6. Sæt skiverne på glasskinner, læg dem i en 45 °C bagemaskine (se materialetabellen), indtil de er tørre, og opbevar dem ved stuetemperatur.
  7. Afvoksning og rehydrering: Afvoks skiverne i en ovn ved 60 ° C i 4 timer, og læg derefter skiverne successivt i 100% xylen (tre gange), 100% ethanol (to gange), 95% ethanol, 80% ethanol og 75% ethanol i 5 minutter hver gang.
  8. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning
    1. Afvoks, rehydrer og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    2. Plet skiverne med 0,5% hæmatoxylin (se materialetabel) i 3 minutter, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er hæmatoxylinrester på skiveoverfladerne.
    3. Dyp skiverne i 1% saltsyrealkohol i 3 sekunder, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    4. Læg skiverne i blød i 1% ammoniakvand i 10 sekunder, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    5. Plet skiverne med eosin (se tabel over materialer) i 1 min, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er nogen eosinrester på skiveoverfladerne.
    6. Dyp skiverne i 95% ethanol, 100% ethanol og 100% xylen (tre gange) successivt i 1 min hver gang.
    7. Tilsæt en dråbe neutral harpiks (se tabel over materialer) til hver skive, og forsegl den med en dækseddel.
  9. Safranin O/Fast Freen (SO) farvning
    1. Afvoks, rehydrer og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    2. Plet skiverne med 0,05% Fast Green (se materialetabellen) i 3 min, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er Fast Green-rester på overfladen af skiverne.
    3. Dyp skiverne i 1% eddikesyreopløsning i 10 s, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    4. Plet skiverne med 2,5% SO (se materialetabel) i 2 min, og vask derefter skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er SO-rester på skiveoverfladerne.
    5. Dyp skiverne i 95% ethanol, 100% ethanol og 100% xylen (tre gange) successivt i 1 min hver gang.
    6. Tilsæt en dråbe neutral harpiks til hver skive, og forsegl den med en dækseddel.
  10. Toluidinblå (TB) farvning
    1. Afvoks, rehydrer og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    2. Dyp skiverne i 1% TB opløsning (se materialetabellen) i 2 minutter, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er toluidinblå rester på overfladen af skiverne.
    3. Dyp skiverne i 95% ethanol, 100% ethanol og 100% xylen (tre gange) successivt i 1 min hver gang.
    4. Tilsæt en dråbe neutral harpiks til hver skive, og forsegl den med en dækseddel.
  11. Masson farvning
    1. Afvoks, rehydrer og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    2. Tilsæt Bouin-opløsning (se materialetabellen) dråbevis til skiverne, pletter dem ved 37 ° C i 2 timer, og vask dem med dobbeltdestilleret vand, indtil den gule farve på overfladen af skiverne forsvinder.
    3. Plet skiverne med celestitblå (se materialetabellen) i 3 min, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er rester af celestitblåt på skiveoverfladerne.
    4. Plet skiverne med hæmatoxylin i 3 min, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er hæmatoxylinrester på skiveoverfladerne.
    5. Dyp skiverne i sur ethanol i 5 sekunder, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    6. Plet skiverne med Ponceau fuchsin (se materialetabellen) i 10 min, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er nogen Ponceau fuchsinrester på skiveoverfladerne.
    7. Dyp skiverne i phosphomolybdicsyre (se materialetabellen) i 10 min, nedsænk dem derefter i TB-opløsning i 5 min, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand, indtil der ikke er TB-rester på overfladen af skiverne.
    8. Dyp skiverne i en svag syreopløsning i 2 min, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    9. Dyp skiverne i 95% ethanol, 100% ethanol og 100% xylen (tre gange) successivt i 1 min hver gang.
    10. Tilsæt en dråbe neutral harpiks til hver skive, og forsegl den med en dækseddel.
  12. Overhold alle skiverne under et mikroskop i en dobbeltblind indstilling for at bestemme graden af ledbruskdegeneration i henhold til Mankins scoringssystem16.
  13. Immunhistokemi
    1. Afvoks og rehydrer skiverne rutinemæssigt, og vask skiverne med PBS i 2 min.
    2. Nedsænk skiverne i natriumcitratopløsning, og læg skiverne i en ovn ved 60 °C i 4 timer for at reparere antigenet. Vask skiverne med PBS tre gange i 3 min hver.
    3. Nedsænk skiverne i en 0,3% Triton X-100 opløsning i 10 min, og vask skiverne to gange med PBS i 3 min hver gang.
    4. Bloker den endogene peroxidaseaktivitet ved at tilsætte en 3% H2O2-opløsning i methanol ved stuetemperatur i 30 minutter. Vask skiverne to gange med PBS i 3 min hver gang.
    5. Inkuber sektionerne med 5% gedeserum i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur for at blokere enhver ikke-specifik binding. Vask skiverne to gange med PBS i 3 min hver gang.
    6. Der tilsættes 100 μL PBS-fortyndede primære antistoffer (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; og anti-MMP13, 1:100; se materialetabellen) til hver skive, og de inkuberes natten over ved 4 °C. Vask skiverne to gange med PBS i 3 min hver gang.
    7. Hver skive inkuberes med 100 μL PBS-fortyndet (1:100) sekundært antistof (gedeantikanin eller gedeantimus, se materialetabellen) ved stuetemperatur i 20 minutter. Vask skiverne to gange med PBS i 3 min hver gang.
    8. Der tilsættes 100 μL 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB, se materialetabellen) arbejdsløsning til hver skive.
    9. Overhold og registrer udseendetiden for en brun farve under et mikroskop; Den kromogene reaktion gør epitopstederne brune17. Resten af prøverne behandles med samme registrerede reaktionstid.
    10. Når skiverne er blevet brune, vaskes skiverne to gange med dobbeltdestilleret vand i 3 minutter hver gang.
    11. Plet skiverne igen med hæmatoxylin i 1 min, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    12. Dyp skiverne i saltsyre i 3 sekunder, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    13. Læg skiverne i blød i 1% ammoniakvand i 10 sekunder, og vask skiverne med dobbeltdestilleret vand i 2 min.
    14. Dyp skiverne i 95% ethanol, 100% ethanol og 100% xylen (tre gange) successivt i 1 min hver gang.
    15. Tilsæt en dråbe neutral harpiks til hver skive, og forsegl den med en dækseddel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette arbejde blev en rottemodel af FTCD etableret ved at bore huller i lårbenets trochleære rille og detektere den efterfølgende smerteadfærd og histopatologiske ændringer. Som vist i figur 1 blev MWT hos rotter i modelgruppen signifikant reduceret 3 dage efter modellering sammenlignet med skingruppen, hvilket tyder på hyperalgesi forårsaget af FTCD. 17 dage efter modellering forblev den mekaniske tilbagetrækningstærskel for rotterne i modelgruppen på et lavt niveau, hvilket indikerer, at smertesensibiliseringen kunne vare mindst 17 dage. De histopatologiske farvningsresultater viste, at ledbruskens struktur i shamgruppen var klar, bruskoverfladen var intakt, chondrocytterne var jævnt fordelt, og type II-kollagen blev stærkt udtrykt. Tværtimod dannede bruskoverfladen i modelgruppen en depression, chondrocytterne gik tabt, ekspressionen af matrixmetalloproteinase MMP13 steg, og ekspressionen af type II-kollagen faldt (figur 2 og figur 3).

Figure 1
Figur 1: Udvikling af MWT efter bruskdefekter. Mekaniske tilbagetrækningstærskler for bagpoterne blev vurderet, efter at bruskfejl blev induceret. n = 8 rotter/gruppe. Værdier præsenteres som middelværdi ± SEM. **P < 0,01 versus falsk gruppe, ***P < 0,001 versus falsk gruppe. En studerendes t-test blev udført. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Histopatologisk observation (HE, SO, TB og Masson-farvning) og Mankins scoring af rottens knæled på dag 17 efter behandlingen af bruskdefekter . (A) Repræsentative histologiske billeder af en FTCD-rotte. De sorte pile angiver bruskfejlene. Skalabjælke = 200 μm. (B) Statistisk analyse af slidgigtscoringer i sham- og modelgrupperne. n = 6 rotter/gruppe. Værdier præsenteres som middelværdi ± SEM. ***P < 0,001 versus falsk gruppe. En studerendes t-test blev udført. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Immunohistokemisk observation af ekspressionen af Col1, Col3, Col2 og MMP13 og negativ farvning i rottebrusk på dag 17. Repræsentative histologiske billeder af en FTCD-rotte. De sorte pile angiver bruskfejlene. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Repræsentative billeder af inducering af bruskfejl i fuld tykkelse ved boring i rottelårbenets trochlear rille. (A) Falsk rotte. (B) Model rotte. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Histologisk vurdering, der viser fuldstændig fyldning af bruskfejl i fuld tykkelse hos rotter. (A) Et repræsentativt billede på dag 17. (B) Et repræsentativt billede på dag 56. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne undersøgelse beskriver en dyremodel til efterligning af kliniske bruskdefekter ved at bore huller i lårbenets trochlear rille hos rotter (supplerende figur 1). Efter bruskskade forbedres excitabiliteten eller lydhørheden hos perifere nociceptorer, hvilket kan resultere i et fald i smertetærsklen og forbedringen af lydhørhed over for stimulering18. I prækliniske undersøgelser har modellering af bruskdefekter hos forskellige dyrearter altid forårsaget smerte19. Klinisk forskning har også vist, at smertevisuel analog skala (VAS) score for patienter med bruskskader er signifikant lavere end hos raske individer20. Vi brugte FTCD-modellen til at teste effekten af FTCD-behandlingen, og resultaterne viste, at faldet i MWT ikke var forbigående, og MWT kom sig ikke hurtigt inden for kort tid. Efter en behandlingsperiode var MWT i modelgruppen stadig signifikant, mens behandlingsgruppen var lettet (data ikke vist). Klinisk effekt vurderes generelt ud fra et behandlingsforløb på 1 måned, så selvom genopretning sker efter et par måneder, påvirker det ikke den eksperimentelle anvendelse af denne model. Desuden blev patologisk farvning og immunhistokemi anvendt til at observere bruskoverfladedefekter og demonstrere etableringen af FTCD.

Denne metode til model FTCD har følgende fordele: (1) den nemme og enkle betjening; (2) den korte modelleringstid (3) den høje succesrate og (4) tilstedeværelsen af synlig progression via grov observation. I modsætning til andre dyremodeller kan denne model standardiseres. Boredybden og diameteren på FTCD-modellen er let at kontrollere, hvilket er gavnligt for standardisering af FTCD-modellen og øger dens repeterbarhed. For det andet er borehullets diameter en nøglefaktor, der bestemmer reparationseffektiviteten. Osteokondrale defekter med en diameter på 1,4 mm kan selvgenoprette spontant, hvilket fører til svigt i den passende evaluering af terapeutiske behandlinger21. For at overvinde disse mangler og opnå standardisering blev der udført indledende eksperimenter, og det blev fastslået, at bruskfejlene ikke spontant ville reparere op til 17 dage efter operationen, hvis FTCD-operationen blev udført på ledbruskoverfladen med borehuller på 1,6 mm i diameter. Over tid viser FTCD forårsaget af boring bruskreparation, og den defekte brusk repareres stort set 8 uger efter operationen (supplerende figur 2). Med hensyn til anvendelser kunne denne model ikke kun bruges til at studere bruskdefekter forårsaget af kOA, men også til at studere traumatiske bruskdefekter, nemlig posttraumatisk slidgigt22. Selvrepareret brusk danner altid fibrocartilage snarere end hyalinbrusk på det skadede sted, og denne model kan også være egnet til at studere patogenesen og behandlingen af bruskfibrose23.

Med hensyn til begrænsningerne i denne model blev umodne rotter valgt, da bruskdefekter forårsaget af traumer i klinisk praksis har tendens til at forekomme hos unge. Hos umodne rotter på skeletudviklingsstadiet er brusken imidlertid tyndere end brusk hos modne rotter, hvilket kan påvirke resultaterne af forsøget24. Tidligere forskning har vist, at stamcellers evne til at regenerere efter bruskskader er reduceret hos voksne mus sammenlignet med unge mus25. Vi udvalgte 6 uger gamle rotter til forsøget, og disse rotter kunne også bruges til at observere mekanismerne for stamcellereparation; Derudover er den terapeutiske virkning hos 6 uger gamle rotter mere udtalt end hos voksne rotter (data ikke vist). Vi er også nødt til at modellere FTCD i ældre rotter, og det kan spekuleres i, at reparation kan være langsommere hos ældre rotter på grund af en nedsat stamcelleregenerativ kapacitet. Forskning har vist, at ledbrusk omkring osteokondrale defekter besidder katabolisk aktivitet, og ekspressionen af IL-1β og FGF2 og en forstyrrelse i FGFr1 / FGFr3 balancen er vigtige for at indlede processen med tidlig osteoartritisk sygdom21. FTCD-modellen har dog stadig begrænsninger i evalueringen af reparation af præ-osteoartritiske defekter. En anden begrænsning af denne undersøgelse var manglen på måling af MWT'er efter 17 dages modellering.

Afslutningsvis ville denne model være en ideel og standardiseret dyremodel til efterligning af bruskdefekter ved at bore huller i lårbenets trochlear rille hos rotter. Denne model efterligner ikke kun forekomsten og udviklingen af klinisk FTCD, men giver også en pålidelig dyremodel til evaluering af terapeutiske behandlinger mod FTCD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af Zhejiang Natural Science Foundation (bevillingsnummer LQ20H270009), Natural Science Foundation of China (bevillingsnumre 82074464 og 82104890), Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (bevillingsnumre 2020ZA039, 2020ZA096 og 2022ZB137) og Medical Health Science and Technology Project fra Zhejiang Provincial Health Commission (bevillingsnummer 2016KYA196).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3, 3 '-diaminobenzidine   Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9019 The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody Novus NB600-594 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody Abcam (UK) 34712 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody Novus NB600-408 Primary antibody for IHC
Bouin solution Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Celestite blue Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Corncob paddings   Xiaohe Technology Co., Ltd  Bedding for animal 
Eosin Sigma-Aldrich 861006 The dye for HE staining
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9002 Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9001 Secondary antibody for IHC
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3163 The dye for HE staining
Masson Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Microdrill Rwd Life Science Co., Ltd 78001 Equipment for surgery
MMP13 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) 69926 Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center Thermo Fisher Scientific (USA) EC 350 Produce paraffin blocks
Neutral resin Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9555 Seal for IHC
Nonabsorbable suture Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. 4-0 Equipment for surgery
Pentobarbital sodium  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. WBBTN5G Anesthetized animal
phosphomolybdic acid  Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes Thermo Fisher Scientific (USA) HM325 Precise paraffin sections
Safranin-O Sigma-Aldrich S2255 The dye for SO staining
Scalpel blade Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. 11 Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x) Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. HK1222 Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats  Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. SD Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr Sakura (Japan) Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89640 The dye for TB staining
Von Frey filament UGO Basile (Italy)  37450-275 Equipment for MWT assay
Wire mesh platform  Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. Equipment for MWT assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Tags

Medicin udgave 195 Bruskfejl i fuld tykkelse slidgigt dyremodel slidgigtsmerter rotter
Udvikling og evaluering af en rottemodel af bruskfejl i fuld tykkelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y.,… More

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y., Chen, Z., Fan, M., Yu, G., Zhou, L., Guo, L., Shan, L., Bao, H. Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (195), e64475, doi:10.3791/64475 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter