Summary
이 프로토콜은 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫고 후속 통증 행동 및 조직병리학적 변화를 측정하여 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 설정합니다.
Abstract
외상으로 인한 무릎 관절의 연골 결손은 클리닉에서 흔히 볼 수 있는 스포츠 관절 손상이며, 이러한 결손은 관절 통증, 운동 장애, 그리고 결국 무릎 골관절염(kOA)을 초래합니다. 그러나 연골 결손이나 kOA에 대한 효과적인 치료법은 거의 없습니다. 동물 모델은 치료제 개발에 중요하지만 연골 결손에 대한 기존 모델은 만족스럽지 못하다. 이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 확립하고 후속 통증 행동과 조직병리학적 변화를 판독 실험으로 사용했습니다. 수술 후, 기계적 금단 역치가 감소하고, 손상된 부위의 연골 세포가 손실되고, 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP13 발현이 증가하고, II형 콜라겐 발현이 감소하여, 인간 연골 결함에서 관찰된 병리학적 변화와 일치한다. 이 방법론은 수행하기 쉽고 간단하며 부상 직후 육안적인 관찰이 가능합니다. 또한, 이 모델은 임상적 연골 결함을 성공적으로 모방할 수 있으므로 연골 결함의 병리학적 과정을 연구하고 해당 치료 약물을 개발하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
관절 연골은 연골 세포와 세포 외 기질1로 구성된 고도로 분화되고 조밀 한 조직입니다. 관절 연골의 표층은 유리질 연골의 한 형태로, 표면이 매끄럽고 마찰이 적으며 강도와 탄성이 좋으며 기계적 응력 내성이 우수합니다2. 세포외 기질은 콜라겐 프로테오글리칸과 물을 포함하며, 타입 II 콜라겐은 전체 콜라겐3의 약 90%를 차지하기 때문에 콜라겐의 주요 구조 성분이다. 연골 조직에는 혈관이나 신경이 존재하지 않기 때문에 손상 후 자가 복구 능력이 부족합니다4. 따라서 외상으로 인한 연골 결손은 항상 클리닉에서 다루기 힘든 관절 질환이었습니다. 또한, 이 관절 질환은 젊은이들을 공격하는 경향이 있으며 전 세계적으로 발병률이 증가하고 있습니다 5,6. 무릎 관절은 연골 결손의 가장 흔한 부위이며, 여기서 결손은 관절 통증, 관절 기능 장애 및 관절 연골 변성을 동반하여 결국 무릎 골관절염(kOA)으로 이어집니다7. 무릎 관절의 연골 결손은 환자에게 경제적, 생리적 부담을 주고 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미친다8. 이 질병은 임박한 해결책이 없는 중대하고 시급한 임상적 문제를 제기합니다. 현재 수술은 연골 결손 치료의 중심이지만 장기적인 결과는 여전히 만족스럽지 않다9.
임상적 연골 결손은 결국 kOA를 유발하고, 따라서, kOA 동물 모델은 연골 결손의 병리학적 연구 및 약물 개발에 통상적으로 사용된다. 동물모델의 확립은 연골 결손 복구의 병태생리학적 과정을 이해하는 데 중요하며, 이는 연골 재생 및 섬유연골과 유리질 연골 사이의 변화를 관찰하는 데 사용할 수 있다10. 그러나, 전방십자인대 절개술(ACLT), 내측 반월판의 불안정화(DMM), 난소절제술(OVX) 및 헐스(Hulth)와 같이 일반적으로 사용되는 kOA 동물 모델은 일반적으로 장기 모델링이 필요하고 병리학적 및 통증 평가만 허용하므로 약물 개발의 효율성에 한계가 있다11. 수술 모델 외에도 모노요오드아세테이트(monoiodoacetate, MIA) 및 파파인 주사와 같은 화학적 모델도 연골 결손을 초래하지만, 결손의 정도를 잘 관리할 수 없고, 임상 현실과는 거리가 멀다11. 충돌(Collision)은 큰 동물의 연골 결손을 모델링하는 또 다른 접근법이지만, 이 방법은 특정 기구의 사용에 따라 달라지며 거의 적용되지 않는다12.
요약하면, 기존의 kOA 모델은 연골 결손의 병인을 연구하거나 신약을 개발하는 데 이상적이지 않으며, 연골 결손의 특이적이고 표준화된 모델이 필요합니다. 이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 확립했습니다. 모델 평가를 위해 육안 관찰, 통증 행동 테스트 및 조직병리학적 분석을 수행했습니다. kOA의 다른 동물 모델과 달리 이 모델은 쥐의 일반적인 상태에 거의 영향을 미치지 않습니다. 이 모델링 접근법은 접근 가능하고 잘 관리 할 수 있으며 연골 결함에서 kOA로의 진행에 대한 이해와 효과적인 치료법 개발을 지원합니다. 이 모델은 또한 골관절염 전 관절의 결함을 치유하여 kOA를 예방하는 치료법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
동물 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리에 관한 중국 법률을 준수하는 절강 중의과 대학의 의료 표준 및 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 체중 150-180g의 6주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트를 사용했습니다. 동물을 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조).
1. 랫트의 전층 연골 결손 모델 구축
- 새로운 환경에 1주일 동안 순응한 후 쥐를 무작위로 균등하게 두 그룹(n = 8마리/그룹)으로 나눕니다. 가짜 그룹의 쥐는 가짜 수술을 받고 모델 그룹의 쥐는 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫는 실험적 수술을 받게 됩니다.
알림: 각 케이지는 쥐의 발가락을 보호하기 위해 멸균된 옥수수 속대 패딩( 재료 표 참조)으로 덮어야 합니다. - 펜토바르비탈 나트륨(40mg/kg)의 복강내 주사(ip)로 쥐를 마취합니다. 그런 다음 쥐의 발가락을 부드럽게 눌러 적절한 마취를 확인합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 수의사 연고를 사용하십시오.
참고: 동물 수술은 오토클레이브 수술 기구를 사용하여 전용 수술실에서 수행해야 합니다. 작업자는 수술 중에 깨끗한 실험실 코트, 안면 마스크, 머리 덮개 및 멸균 장갑을 착용해야 합니다. 수술 부위에 멸균 패드를 놓고 사용하기 전에 모든 장비를 멸균하십시오. 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공합니다. - 쥐를 앙와위 자세로 수술대에 놓고 좌우 뒷다리를 면도하고 수술 용 비누로 무릎 관절 부위를 닦은 다음 멸균 상태에서 방부제 포비돈 요오드 용액과 알코올을 세 번 번갈아 가며 닦습니다. 쥐 위에 멸균 드레이프를 놓고 소독된 무릎 관절만 노출시킵니다.
- 쥐 무릎관절 중앙에 메스날(11번)로 위에서 아래로 1cm 절개를 하고, 표재성 절개 후 슬개골 내측 가장자리를 따라 관절낭과 대퇴사두근 힘줄을 자른다.
참고: 대퇴사두근 힘줄은 무릎 관절13의 굴곡 동안 슬개골과 대퇴골과에 부착됩니다. 관절낭에서 볼 수 있는 홈은 대퇴골 활차 홈이고 원위 대퇴골 과두는 내측 및 외측 과두를 형성합니다. - 슬개골을 바깥쪽으로 돌리고 경골과 비골을 90° 각도로 구부려 대퇴골 과두의 활차가 완전히 노출되도록 합니다. 직경 1.6mm의 원형 드릴 비트( 재료 표 참조)를 4,000rpm에서 10초 동안 연골 표면에 수직으로 사용하여 깊이 0.1mm의 대퇴골 활차 홈에 하나의 전층 연골 결함을 만듭니다.
알림: 드릴링 절차 중 주변 뼈 조직에 대한 열 외상을 최소화하기 위해 식염수를 간헐적으로 사용하십시오. - 0.9% 생리식염수에 적신 면봉으로 수술 부위를 닦고, 슬개골을 교체하고, 무릎을 신전 위치에 유지하고, 비흡수성 4-0 봉합사로 절개 부위를 층별로 봉합합니다( 재료 표 참조).
- 흉골 누운 상태로 가열 패드에 동물을 놓고 깨어날 때까지 모니터링 한 다음 새장으로 되돌립니다. 통증 완화를 위해 수술 후 8시간마다 3회 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 피하 주사합니다.
- 섹션 2에 설명된 대로 수술 후 3일, 10일 및 17일에 모든 쥐의 통증 관련 행동을 테스트합니다.
2. 기계적 인출 임계값(MWT)
참고: 쥐의 양측 후발바닥의 MWT는 고전적인 von Frey 필라멘트 통증 측정 방법14에 의해 측정되었습니다.
- 철망 플랫폼 ( 재료 표 참조)의 단일 플라스틱 챔버 (17cm x 11cm x 13cm)에 쥐를 놓고 철망 받침대를 테이블 위 50cm에 놓습니다. 적응 30분 후 MWT를 측정합니다.
- 폰 프레이 필라멘트 ( 재료 표 참조)를 각 쥐의 뒷발의 발바닥 표면에 수직으로 누르고 뒷발 중앙의 가장 두꺼운 부분을 피하면서 약 2 초 동안 브러시를 구부립니다.
- 긍정적인 반응(발 철수 또는 발 핥기)이 발생할 때까지 자극 가중치를 가장 낮은 4g에서 점차적으로 늘립니다.
알림: 각 자극 사이의 간격은 1분 이상이어야 합니다. MWT는 5가지 자극에서 3가지 긍정적인 반응으로 정의됩니다. 자극 가중치를 그램 단위로 기록합니다. - 기록된 최소 자극 가중치(그램)에 따라 가짜 및 모델 그룹의 평균값을 계산합니다.
3. 조직병리학적 및 면역조직화학적 분석
- 수술 후 17일과 56일에 40mg/kg 펜토바르비탈 나트륨(i.p.)으로 쥐를 마취시키고 심장에서 혈액을 빼내어 모든 쥐를 희생시킵니다. 대퇴골 중간과 경골 중앙의 뼈를 절단하여 무릎을 분리하고 주변 근육 조직을 해부합니다. 조직 학적 분석을 위해 무릎 관절을 제거하십시오.
- 무릎 관절을 실온에서 48시간 동안 10% 파라포름알데히드 용액 20mL에 고정한 다음, 4°C에서 8주 동안 오비탈 쉐이커에서 10% EDTA 용액 20mL로 석회질을 제거합니다. EDTA 솔루션을 매일 교체하십시오.
- 임베딩 상자의 크기에 맞게 무릎 관절을 다듬습니다. 탈수된 무릎 관절을 100% 파라핀15에 삽입합니다.
- 파라핀이 내장된 무릎 관절을 마이크로톰 홀더에 놓고 각도를 조정한 다음 표면이 평평해질 때까지 칼날로 파라핀 샘플을 다듬습니다.
- 파라핀 슬라이스의 두께를 3 μm로 설정하고, 슬라이스를 40°C의 수조에서 평탄화시킨다.
- 슬라이스를 유리 슬라이드에 붙이고 건조될 때까지 45°C 베이킹 기계( 재료 표 참조)에 넣고 실온에서 보관합니다.
- 탈랍 및 재수화: 슬라이스를 60°C의 오븐에서 4시간 동안 탈왁스한 다음 슬라이스를 100% 자일렌(3회), 100% 에탄올(2회), 95% 에탄올, 80% 에탄올 및 75% 에탄올에 각각 5분 동안 연속적으로 넣습니다.
- 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
- 왁스를 제거하고 수분을 보충한 다음 이중 증류수로 2분 동안 씻습니다.
- 0.5% 헤마톡실린( 재료 표 참조)으로 슬라이스를 3분 동안 염색하고 슬라이스 표면에 헤마톡실린 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 세척합니다.
- 슬라이스를 1 % 염산 알코올에 3 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
- 슬라이스를 1 % 암모니아수에 10 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
- 슬라이스를 에오신( 재료 표 참조)으로 1분 동안 염색하고 슬라이스 표면에 에오신 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻습니다.
- 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담급니다.
- 각 조각에 중성 수지 한 방울( 재료 표 참조)을 추가하고 커버슬립으로 밀봉합니다.
- Safranin O/Fast Freen(SO) 염색
- 왁스를 제거하고 수분을 보충한 다음 이중 증류수로 2분 동안 씻습니다.
- 0.05% Fast Green( 재료 표 참조)으로 3분 동안 슬라이스를 염색하고 슬라이스 표면에 Fast Green 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻습니다.
- 슬라이스를 1 % 아세트산 용액에 10 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
- 슬라이스를 2.5% SO( 재료 표 참조)로 2분 동안 염색한 다음 슬라이스 표면에 SO 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 세척합니다.
- 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담급니다.
- 각 조각에 중성 수지 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
- 톨루이딘 블루(TB) 염색
- 왁스를 제거하고 수분을 보충한 다음 이중 증류수로 2분 동안 씻습니다.
- 슬라이스를 1% TB 용액( 재료 표 참조)에 2분 동안 담그고 슬라이스 표면에 톨루이딘 블루 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 세척합니다.
- 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담급니다.
- 각 조각에 중성 수지 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
- Masson 염색
- 왁스를 제거하고 수분을 보충한 다음 이중 증류수로 2분 동안 씻습니다.
- Bouin 용액( 재료 표 참조)을 슬라이스에 적가하고 37°C에서 2시간 동안 염색한 다음 슬라이스 표면의 노란색이 사라질 때까지 이중 증류수로 세척합니다.
- 슬라이스를 셀레스타이트 블루( 재료 표 참조)로 3분 동안 염색하고 슬라이스 표면에 셀레스타이트 블루 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻습니다.
- 3분 동안 헤마톡실린으로 슬라이스를 염색하고 슬라이스 표면에 헤마톡실린 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 세척합니다.
- 슬라이스를 산성 에탄올에 5 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
- Ponceau fuchsin( 재료 표 참조)으로 슬라이스를 10분 동안 염색하고 슬라이스 표면에 Ponceau 푹신 잔류물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻습니다.
- 슬라이스를 포스 포 몰리브덴산 ( 재료 표 참조)에 10 분 동안 담근 다음 5 분 동안 TB 용액에 담그고 슬라이스 표면에 TB 잔류 물이 없을 때까지 이중 증류수로 슬라이스를 씻으십시오.
- 슬라이스를 약산성 용액에 2 분 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
- 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담그십시오.
- 각 조각에 중성 수지 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
- 이중 맹검 설정에서 현미경으로 모든 슬라이스를 관찰하여 Mankin의 스코어링 시스템16에 따라 관절 연골 변성의 정도를 결정합니다.
- 면역조직화학
- 슬라이스를 정기적으로 탈랍 및 재수화하고 PBS로 슬라이스를 2분 동안 세척합니다.
- 슬라이스를 시트르산 나트륨 용액에 담그고 슬라이스를 60°C의 오븐에 4시간 동안 넣어 항원을 복구합니다. PBS로 슬라이스를 각각 3분 동안 세 번 씻습니다.
- 슬라이스를 0.3% 트리톤 X-100 용액에 10분 동안 담그고 매번 3분 동안 PBS로 슬라이스를 두 번 세척합니다.
- 메탄올에 3%H2O2용액을 첨가하여 30분 동안 내인성 퍼옥시다아제 활성을 차단한다. 슬라이스를 PBS로 매번 3분 동안 두 번 씻습니다.
- 절편을 실온에서 30분 동안 PBS 중의 5% 염소 혈청과 함께 인큐베이션하여 임의의 비특이적 결합을 차단한다. 슬라이스를 PBS로 매번 3분 동안 두 번 씻습니다.
- PBS 희석된 1차 항체(anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; and anti-MMP13, 1:100; the Table of Materials)를 각 슬라이스에 첨가하고, 4°C에서 밤새 배양한다. 슬라이스를 PBS로 매번 3분 동안 두 번 씻습니다.
- 각 슬라이스를 PBS 희석(1:100) 2차 항체(염소 항토끼 또는 염소 항-마우스, 재료 표 참조) 100μL와 함께 실온에서 20분 동안 배양합니다. 슬라이스를 PBS로 매번 3분 동안 두 번 씻습니다.
- 100 μL의 3, 3'-diaminobenzidine (DAB, 재료 표 참조) 작업 용액을 각 슬라이스에 추가합니다.
- 현미경으로 갈색의 출현 시간을 관찰하고 기록합니다. 발색 반응은 에피토프 부위를 갈색으로 만듭니다17. 나머지 샘플을 동일한 기록된 반응 시간으로 처리합니다.
- 조각이 갈색으로 변한 후 매번 이중 증류수로 3분 동안 두 번 씻습니다.
- 슬라이스를 헤마톡실린으로 1분 동안 다시 염색하고 이중 증류수로 슬라이스를 2분 동안 세척합니다.
- 슬라이스를 염산에 3 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
- 슬라이스를 1 % 암모니아수에 10 초 동안 담그고 슬라이스를 이중 증류수로 2 분 동안 씻으십시오.
- 슬라이스를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일렌(3회)에 매번 1분 동안 연속적으로 담급니다.
- 각 조각에 중성 수지 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
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Representative Results
본 연구에서는 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫고 후속 통증 거동과 조직병리학적 변화를 감지하여 FTCD의 쥐 모델을 확립하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 모델링 3일 후, 모조군에 비해 모델군에서 랫트의 MWT가 현저히 감소하여 FTCD에 의한 통각과민을 시사한다. 모델링 후 17일째에, 모델 그룹에 있는 쥐의 기계적 금단 역치는 낮은 수준으로 유지되었고, 이는 통증 감작이 적어도 17일 동안 지속될 수 있음을 나타낸다. 조직병리학적 염색 결과, 가짜 그룹에서 관절 연골의 구조가 깨끗하고, 연골 표면이 손상되지 않았으며, 연골 세포가 고르게 분포되어 있었고, II형 콜라겐이 높게 발현된 것으로 나타났다. 반대로, 모델 그룹에서, 연골 표면은 함몰을 형성하고, 연골 세포는 손실되었고, 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP13의 발현은 증가하고, 유형 II 콜라겐의 발현은 감소하였다(도 2 및 도 3).
그림 1: 연골 결손 후 MWT 발생. 뒷발의 기계적 금단 역치는 연골 결손이 유도된 후 평가되었습니다. n = 8 쥐/그룹. 값은 SEM± 평균으로 표시됩니다. **P < 0.01 대 가짜 그룹, ***P < 0.001 대 가짜 그룹. 학생의 t-검정이 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 연골 결손 치료 후 17일째 쥐 무릎 관절의 조직병리학적 관찰(HE, SO, TB 및 Masson 염색) 및 Mankin의 점수. (A) FTCD 쥐의 대표적인 조직학적 사진. 검은색 화살표는 연골 결함을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm. (B) 가짜 및 모델 그룹의 골관절염 소열의 통계 분석. n = 6 쥐/그룹. 값은 SEM± 평균으로 표시됩니다. ***P < 0.001 대 가짜 그룹. 학생의 t-검정이 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 17일째에 쥐 연골에서 Col1, Col3, Col2 및 MMP13의 발현 및 음성 염색의 면역조직화학적 관찰. FTCD 쥐의 대표적인 조직학적 사진. 검은색 화살표는 연골 결함을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 전층 연골 결손을 유도한 대표적인 사진. (A) 가짜 쥐. (B) 모델 쥐. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 래트에서 전층 연골 결손의 완전한 충전을 보여주는 조직학적 평가. (A) 17일째의 대표 이미지. (B) 56일째의 대표 이미지. 스케일 바 = 200 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 임상적 연골 결함을 모방하는 동물 모델을 설명합니다(보충 그림 1). 연골 손상 후, 말초 통각 수용체의 흥분성 또는 반응성이 향상되고, 이는 통증 역치의 감소와 자극에 대한 반응성의 향상을 가져올 수 있다18. 전임상 연구에서, 다양한 동물 종의 연골 결함 모델링은 항상 통증을 유발했다19. 임상 연구에 따르면 연골 손상 환자의 통증 시각 아날로그 척도(VAS) 점수는 건강한 사람보다 현저히 낮았다20. FTCD 처리 효과를 테스트하기 위해 FTCD 모델을 사용했으며, 그 결과 MWT의 감소가 일시적이지 않고 단기간 내에 빠르게 회복되지 않는 것으로 나타났습니다. 치료 기간 후, 모델 그룹의 MWT는 여전히 유의한 반면, 치료 그룹은 완화되었다 (데이터는 표시되지 않음). 임상적 효능은 일반적으로 1개월의 치료 과정을 기준으로 평가되므로 몇 개월 후에 회복이 일어나더라도 이 모델의 실험적 적용에는 영향을 미치지 않습니다. 또한, 병리학적 염색 및 면역조직화학을 적용하여 연골 표면 결함을 관찰하고 FTCD의 확립을 입증했습니다.
FTCD를 모델링하는 이 방법은 다음과 같은 장점이 있습니다: (1) 쉽고 간단한 조작; (2) 짧은 모델링 시간; (3) 높은 성공률; (4) 총체적 관찰을 통한 가시적 진행의 존재. 다른 동물 모델과 달리 이 모델은 표준화할 수 있습니다. FTCD 모델의 드릴링 깊이와 직경은 제어하기 쉽기 때문에 FTCD 모델을 표준화하는 데 유리하고 반복성을 높입니다. 둘째, 드릴링 구멍의 직경은 수리 효율을 결정하는 핵심 요소입니다. 직경 1.4mm의 골연골 결손은 저절로 회복될 수 있으며, 이는 치료적 처치의 적절한 평가에 실패로 이어진다21. 이러한 단점을 극복하고 표준화를 이루기 위해 예비실험을 진행하였으며, 직경 1.6mm의 드릴 구멍으로 관절 연골 표면에 FTCD 수술을 시행할 경우 수술 후 17일까지 연골 결손이 저절로 회복되지 않는 것으로 확인되었습니다. 시간이 지남에 따라 드릴링으로 인한 FTCD는 연골 복구를 나타내며 결함 연골은 수술 후 8주까지 대부분 복구됩니다(보충 그림 2). 응용 측면에서 이 모델은 kOA로 인한 연골 결함을 연구하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 외상성 연골 결함, 즉 외상 후 골관절염을 연구하는 데에도 사용할 수 있다22. 자가 복구 연골은 항상 손상 부위에 유리질 연골이 아닌 섬유연골을 형성하며, 이 모델은 연골 섬유증의 발병기전 및 치료를 연구하는 데에도 적합할 수 있다23.
이 모델의 한계 측면에서, 임상 실습에서 외상으로 인한 연골 결손이 젊은 사람들에게서 발생하는 경향이 있기 때문에 미성숙 쥐가 선택되었습니다. 그러나 골격 발달 단계의 미성숙 쥐에서는 성숙한 쥐보다 연골이 얇아서 실험 결과에 영향을 미칠 수 있다24. 이전 연구에서는 어린 생쥐에 비해 성체 생쥐에서 연골 손상 후 줄기 세포의 재생 능력이 감소하는 것으로 나타났다25. 우리는 실험을 위해 6 주 된 쥐를 선택했으며,이 쥐는 줄기 세포 복구 메커니즘을 관찰하는 데에도 사용될 수 있습니다. 또한, 6주령 쥐의 치료 효과는 성인 쥐보다 더 두드러진다(데이터는 표시되지 않음). 우리는 또한 나이가 많은 쥐에서 FTCD를 모델링 할 필요가 있으며, 줄기 세포 재생 능력이 감소하여 노화 된 쥐에서 복구가 느려질 수 있다고 추측 할 수 있습니다. 연구에 따르면 골연골 결손을 둘러싼 관절 연골은 이화 작용을 하며, IL-1β 및 FGF2의 발현과 FGFr1/FGFr3 균형의 교란은 초기 골관절염 질환의 진행을 시작하는 데 중요하다고 한다21. 그러나 FTCD 모델은 골관절염 전 결손 복구를 평가하는 데 여전히 한계가 있습니다. 이 연구의 또 다른 한계는 모델링 17일 후 MWT를 측정하지 못했다는 것입니다.
결론적으로, 이 모델은 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 연골 결함을 모방하기 위한 이상적이고 표준화된 동물 모델이 될 것입니다. 이 모델은 임상 FTCD의 발생 및 발달을 모방할 뿐만 아니라 FTCD에 대한 치료적 치료를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 동물 모델을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 절강 자연 과학 재단(보조금 번호 LQ20H270009), 중국 자연 과학 재단(보조금 번호 82074464 및 82104890), 절강 중국 전통 의학 재단(보조금 번호 2020ZA039, 2020ZA096 및 2022ZB137) 및 절강성 보건 위원회의 의료 보건 과학 및 기술 프로젝트(보조금 번호 2016KYA196).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
References
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