이 프로토콜은 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫고 후속 통증 행동 및 조직병리학적 변화를 측정하여 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 설정합니다.
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방법 논문
전층 연골 결손의 쥐 모델 개발 및 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
외상으로 인한 무릎 관절의 연골 결손은 클리닉에서 흔히 볼 수 있는 스포츠 관절 손상이며, 이러한 결손은 관절 통증, 운동 장애, 그리고 결국 무릎 골관절염(kOA)을 초래합니다. 그러나 연골 결손이나 kOA에 대한 효과적인 치료법은 거의 없습니다. 동물 모델은 치료제 개발에 중요하지만 연골 결손에 대한 기존 모델은 만족스럽지 못하다. 이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 확립하고 후속 통증 행동과 조직병리학적 변화를 판독 실험으로 사용했습니다. 수술 후, 기계적 금단 역치가 감소하고, 손상된 부위의 연골 세포가 손실되고, 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP13 발현이 증가하고, II형 콜라겐 발현이 감소하여, 인간 연골 결함에서 관찰된 병리학적 변화와 일치한다. 이 방법론은 수행하기 쉽고 간단하며 부상 직후 육안적인 관찰이 가능합니다. 또한, 이 모델은 임상적 연골 결함을 성공적으로 모방할 수 있으므로 연골 결함의 병리학적 과정을 연구하고 해당 치료 약물을 개발하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
서론
관절 연골은 연골 세포와 세포 외 기질1로 구성된 고도로 분화되고 조밀 한 조직입니다. 관절 연골의 표층은 유리질 연골의 한 형태로, 표면이 매끄럽고 마찰이 적으며 강도와 탄성이 좋으며 기계적 응력 내성이 우수합니다2. 세포외 기질은 콜라겐 프로테오글리칸과 물을 포함하며, 타입 II 콜라겐은 전체 콜라겐3의 약 90%를 차지하기 때문에 콜라겐의 주요 구조 성분이다. 연골 조직에는 혈관이나 신경이 존재하지 않기 때문에 손상 후 자가 복구 능력이 부족합니다4. 따라서 외상으로 인한 연골 결손은 항상 클리닉에서 다루기 힘든 관절 질환이었습니다. 또한, 이 관절 질환은 젊은이들을 공격하는 경향이 있으며 전 세계적으로 발병률이 증가하고 있습니다 5,6. 무릎 관절은 연골 결손의 가장 흔한 부위이며, 여기서 결손은 관절 통증, 관절 기능 장애 및 관절 연골 변성을 동반하여 결국 무릎 골관절염(kOA)으로 이어집니다7. 무릎 관절의 연골 결손은 환자에게 경제적, 생리적 부담을 주고 환자의 ....
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프로토콜
동물 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리에 관한 중국 법률을 준수하는 절강 중의과 대학의 의료 표준 및 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 체중 150-180g의 6주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트를 사용했습니다. 동물을 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조).
1. 랫트의 전층 연골 결손 모델 구축
- 새로운 환경에 1주일 동안 순응한 후 쥐를 무작위로 균등하게 두 그룹(n = 8마리/그룹)으로 나눕니다. 가짜 그룹의 쥐는 가짜 수술을 받고 모델 그룹의 쥐는 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫는 실험적 수술을 받게 됩니다.
알림: 각 케이지는 쥐의 발가락을 보호하기 위해 멸균된 옥수수 속대 패딩( 재료 표 참조)으로 덮어야 합니다. - 펜토바르비탈 나트륨(40mg/kg)의 복강내 주사(ip)로 쥐를 마취합니다. 그런 다음 쥐의 발가락을 부드럽게 눌러 적절한 마취를 확인합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 수의사 연고를 사용하십시오.
참고: 동물 수술은 오토클레이브 수술 기구를 사용하여 전용 수술실에서 수행해야 합니다. 작업자는 수술 중에 깨끗한 실험실 코트, 안....
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결과
본 연구에서는 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫고 후속 통증 거동과 조직병리학적 변화를 감지하여 FTCD의 쥐 모델을 확립하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 모델링 3일 후, 모조군에 비해 모델군에서 랫트의 MWT가 현저히 감소하여 FTCD에 의한 통각과민을 시사한다. 모델링 후 17일째에, 모델 그룹에 있는 쥐의 기계적 금단 역치는 낮은 수준으로 유지되었고, 이는 통증 감작이 적어도 17일 동안 지속될 수 있음을 나타낸다. 조직병리학적 염색 결과, 가짜 그룹에서 관절 연골의 구조가 깨끗하고, 연골 표면이 손상되지 않았으며, 연골 세포가 고르게 분포되어 있었고, II형 콜라겐이 높게 발현된 것으로 나타났다. 반대로, 모델 그룹에서, 연골 표면은 함몰을 형성하고, 연골 세포는 손실되었고, 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP13의 발현은 증가하고, 유형 II 콜라겐의 발현은 감소하였다(도 2 및
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토론
이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 임상적 연골 결함을 모방하는 동물 모델을 설명합니다(보충 그림 1). 연골 손상 후, 말초 통각 수용체의 흥분성 또는 반응성이 향상되고, 이는 통증 역치의 감소와 자극에 대한 반응성의 향상을 가져올 수 있다18. 전임상 연구에서, 다양한 동물 종의 연골 결함 모델링은 항상 통증을 유발했다19. 임상 연구에 따르면 연골 손상 환자의 통증 시각 아날로그 척도(VAS) 점수는 건강한 사람보다 현저히 낮았다20. FTCD 처리 효과를 테스트하기 위해 FTCD 모델을 사용했으며, 그 결과 MWT의 감소가 일시적이지 않고 단기간 내에 빠르게 회복되지 않는 것으로 나타났습니다. 치료 기간 후, 모델 그룹의 MWT는 여전히 유의한 반면, 치료 그룹은 완화되었다 (데이터는 표시되지 않음). 임상적 효능은 일반적으.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 절강 자연 과학 재단(보조금 번호 LQ20H270009), 중국 자연 과학 재단(보조금 번호 82074464 및 82104890), 절강 중국 전통 의학 재단(보조금 번호 2020ZA039, 2020ZA096 및 2022ZB137) 및 절강성 보건 위원회의 의료 보건 과학 및 기술 프로젝트(보조금 번호 2016KYA196).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3, 3'- 디아 미노 벤지딘 | 항저우 Zhengbo 생명공학 Co., 주식 회사. | ZLI-9019 | IHC 염색용 염료 |
| Anti-Collagen III 항체 | Novus | NB600-594 | IHC |
| Anti-Collagen II 항체 | Abcam (UK) | 34712 | |
| IHC Anti-Collagen I 항체 | Novus | NB600-408 | 용 1차 항체 |
| Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | Masson 염색 용 염료 | |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | Masson 염색 |
| 옥수수 속대 패딩용 염료 | Xiaohe Technology Co., Ltd | 동물용 침구 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | HE 염색용 염료 |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | SO 염색용 |
| 염료 염소 항마우스 항체 | ZSGQ-BIO(중국 베이징) | PV-9002 | 용 2차 항체 |
| ZSGQ-BIO(중국 베이징) | PV-9001 | 용 2차 항체 | |
| Sigma-Aldrich | H3163 | HE 염색용 염료 | |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | Masson 염색용 염료 |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | 수술용 장비 |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | |
| 모듈식 조직 임베딩 센터 | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | 파라핀 블록 |
| 생산 중성 수지 | Hangzhou Zhengbo 공급자:Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | IHC |
| 비흡수성 봉합사 | 씰, 항저우 Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 4-0 | 수술 장비 |
| 펜토바르비탈 나트륨 | 항저우 Zhengbo 생명공학 Co., 주식 회사. | WBBTN5G | 마취 동물 |
| 포스포몰리브딕산 | 상해 Yuanye 기술 Co., 주식 회사. | R20381 | Masson 염색 염료 |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | Masson 염색 용 염료 |
| 로터리 및 슬라이딩 마이크로 톰 | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | 정밀 파라핀 섹션 |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | SO |
| 염색 메스 블레이드 | 용 염료 Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | 수술 장비 |
| 구연산나트륨 용액 (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | IHC |
| Sprague Dawley (SD) 쥐 | 상하이 슬레이크 실험 동물 Co., Ltd. | SD | 실험 동물 |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (일본) | 진공 침투 프로세서 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | 결핵 염색 |
| 염료 Von Frey 필라멘트 | UGO Basile (이탈리아) | 37450-275 | MWT 분석 |
| 와이어 메쉬 플랫폼용 장비 | 상하이 Yuyan 악기 Co., Ltd. | MWT 분석용 장비 |
참고문헌
- Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
- Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions.
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재인쇄 및 허가
