Summary
Nous présentons un protocole étape par étape pour l’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC) et des CSH à court terme (ST-HSC) à l’aide du système rapporteur Hoxb5.
Abstract
La capacité d’auto-renouvellement et le potentiel de différenciation multi-lignée sont généralement considérés comme les caractéristiques déterminantes des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Cependant, de nombreuses études ont suggéré qu’une hétérogénéité fonctionnelle existe dans le compartiment HSC. Des analyses récentes de cellules uniques ont rapporté des clones de CSH avec des destins cellulaires différents dans le compartiment des CSH, appelés clones de CSH biaisés. Les mécanismes sous-jacents aux résultats hétérogènes ou peu reproductibles sont peu compris, notamment en ce qui concerne la durée de l’auto-renouvellement lorsque des fractions de CSH purifiées sont transplantées par immunomarquage classique. Par conséquent, l’établissement d’une méthode d’isolation reproductible pour les CSH à long terme (CSH-LT) et les CSH à court terme (CSS-ST), définies par la durée de leur auto-renouvellement, est crucial pour surmonter ce problème. En utilisant un dépistage non biaisé en plusieurs étapes, nous avons identifié un facteur de transcription, Hoxb5, qui pourrait être un marqueur exclusif des CSL-LT dans le système hématopoïétique de la souris. Sur la base de cette découverte, nous avons établi une lignée de souris rapporteures Hoxb5 et isolé avec succès les LT-HSC et les ST-HSC. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolation des LT-HSC et des ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5 . Cette méthode d’isolement aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes d’auto-renouvellement et la base biologique d’une telle hétérogénéité dans le compartiment HSC.
Introduction
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui possèdent une capacité d’auto-renouvellement et de multipotence, résident au sommet de la hiérarchie hématopoïétique 1,2. En 1988, Weissman et ses collègues ont démontré pour la première fois que l’isolement des CSH de souris pouvait être réalisé en utilisant la cytométriede flux 3. Par la suite, une fraction définie par une combinaison de marqueurs de surface cellulaire, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, a été signalée comme contenant toutes les CSH chez les souris 4,5,6,7,8.
Les CSH définies immunophénotypiquement (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) (ci-après, les CSHp) étaient auparavant considérées comme fonctionnellement homogènes. Cependant, des analyses récentes sur une seule cellule ont révélé que les CSHp présentent toujours une hétérogénéité en ce qui concerne leur capacité d’auto-renouvellement 9,10 et leur multipotence11,12. Plus précisément, deux populations semblent exister dans la fraction des CSHp en ce qui concerne leur capacité d’auto-renouvellement : les cellules souches hématopoïétiques à long terme (CSH-LT), qui ont une capacité d’auto-renouvellement continue, et les cellules souches hématopoïétiques à court terme (CSS-ST), qui ont une capacité d’auto-renouvellement transitoire 9,10.
À ce jour, les mécanismes moléculaires de la capacité d’auto-renouvellement qui distinguent les CSL-LT et les CST-ST restent mal compris. Il est crucial d’isoler les deux populations cellulaires en fonction de leurs capacités d’auto-renouvellement et de découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents. Plusieurs systèmes rapporteurs ont également été introduits pour purifier les LT-HSC13,14,15; cependant, la pureté LT-HSC définie par chaque système rapporteur est variable, et la purification exclusive LT-HSC n’a pas été atteinte à ce jour.
Par conséquent, le développement d’un système d’isolation pour les CSL-LT et les CSS-ST accélérera la recherche sur la capacité d’auto-renouvellement dans la fraction des CSHp. Dans l’isolement des CSH-LT et des CSS-ST, une étude utilisant un criblage non biaisé en plusieurs étapes a identifié un seul gène, Hoxb5, qui est exprimé de manière hétérogène dans la fraction16 des CSp. De plus, l’analyse de la moelle osseuse des souris rapporteures Hoxb5 a révélé qu’environ 20% à 25% de la fraction pHSC est constituée de cellulesPos Hoxb5. Un test de transplantation compétitif utilisant des CSp Hoxb5 pos et des CSp négatives Hoxb5 a révélé que seuls les CSp Hoxb5 pos possèdent une capacité d’auto-renouvellement à long terme, tandis que les CSPp Hoxb5neg perdent leur capacité d’auto-renouvellement en peu de temps, ce qui indique que Hoxb5 identifie les CSH-LT dans la fraction16 des CSPp.
Ici, nous démontrons un protocole étape par étape pour isoler les LT-HSC et les ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5 . De plus, nous présentons un test de transplantation compétitif pour évaluer la capacité d’auto-renouvellement des CSp Hoxb5pos/neg (Figure 1). Ce système de rapporteur Hoxb5 nous permet d’isoler de manière prospective les LT-HSC et les ST-HSC et contribue à la compréhension des caractéristiques spécifiques aux LT-HSC.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Préconditionnement des souris receveuses
- Préparer les souris congéniques C57BL/6 mâles âgées de 8 à 10 semaines comme souris receveuses. Le nombre de souris receveuses dépend du protocole expérimental. Nous préparons généralement 10 à 20 souris pour chaque condition.
- Nourrissez les souris avec de l’eau stérilisée additionnée d’enrofloxacine (170 mg/L). Comme les souris receveuses irradiées sont très sensibles à l’infection, gardez les cages aussi propres que possible.
REMARQUE: La supplémentation en antibiotiques commence 24 heures avant l’irradiation et se poursuit pendant 3 semaines après la transplantation pour éviter les infections.
- Nourrissez les souris avec de l’eau stérilisée additionnée d’enrofloxacine (170 mg/L). Comme les souris receveuses irradiées sont très sensibles à l’infection, gardez les cages aussi propres que possible.
- Irradiation corporelle totale
- L’irradiation corporelle totale détruit les cellules de moelle osseuse receveuses pour assurer la greffe des cellules donneuses. Transférer les souris receveuses dans une cage d’irradiation. Irradier mortellement les souris receveuses avec une dose unique de 8,7 Gy à 12-16 h avant la transplantation.
REMARQUE : La dose de rayonnement et le temps peuvent varier selon l’équipement. La dose de rayonnement létale doit être confirmée par l’irradiateur et la souche de souris du chercheur. - Remettez-les dans leurs cages après l’irradiation corporelle totale.
- L’irradiation corporelle totale détruit les cellules de moelle osseuse receveuses pour assurer la greffe des cellules donneuses. Transférer les souris receveuses dans une cage d’irradiation. Irradier mortellement les souris receveuses avec une dose unique de 8,7 Gy à 12-16 h avant la transplantation.
2. Prélèvement des cellules de moelle osseuse du donneur
- Préparer une souris Hoxb5-tri-mCherry mâle âgée de 12 semaines et euthanasier la souris par exposition au CO2 suivie d’une luxation cervicale ou en utilisant des méthodes approuvées par le comité local d’éthique animale.
Remarque : Le volume de réactif par souris est décrit dans les étapes suivantes. - Dans des conditions stériles, retirez la peau et exposez les os (fémur, tibia, bassin, humérus). Coupez les principaux muscles et prenez les os (fémur, tibia, bassin, humérus) de la souris. Placez-les dans des boîtes de culture cellulaire stériles avec du PBS glacé sans Ca 2+ et Mg2+.
- Coupez les muscles et les tissus fibreux des os à l’aide d’une pince à épiler, de petits ciseaux et de lingettes pour éviter la contamination. Veillez à ne pas casser les os lors de cette étape. Jetez tous les os cassés afin de maintenir la stérilité.
- Stérilisez un mortier et un pilon avec de l’éthanol à 70% (EtOH) et laissez-les sécher complètement. Équilibrer avec un tampon de coloration cellulaire (PBS libre de Ca 2+ et Mg2+ complété par 2% de FBS inactivé par la chaleur, 2 mM d’EDTA, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).
- Mettez les os dans le mortier et ajoutez 3 mL de tampon de coloration cellulaire. Écrasez les os avec le pilon. Désagrégez les amas de cellules par pipetage doux et transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube de 50 mL.
- Répétez l’étape 2.5 jusqu’à ce que la solution devienne claire. Habituellement, trois fois suffisent.
3. Séparation des cellules c-kit+ par tri magnétique
- Coloration d’anticorps pour le tri magnétique
- Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de coloration cellulaire. Ajouter 10 μL d’IgG de rat (5 mg/mL) pour réduire la liaison aux anticorps non spécifiques, et pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette P1 000. Incuber sur la glace pendant 15 min.
- Ajouter l’anticorps c-Kit (clone 2B8) à une concentration de 4 μg/mL et mélanger avec une pipette P1 000. Incuber sur la glace pendant 15 min.
- Ajouter 5 mL de tampon de coloration cellulaire et bien mélanger. Centrifuger les échantillons à 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon de coloration cellulaire.
- Ajouter 35 μL de microbilles anti-APC pour enrichir les cellules c-Kit+ et mélanger avec une pipette P1,000. Incuber sur la glace pendant 15 min.
- Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de coloration cellulaire.
- Tri magnétique des cellules c-Kit+
- Suivez les instructions du fabricant pour trier les cellules. En bref, amorcez une colonne de tri magnétique avec 3 mL de tampon de coloration cellulaire. Filtrer l’échantillon (1 mL) à travers une passoire à cellules de 40 μm et charger l’échantillon sur la colonne de tri magnétique.
- Laver en ajoutant trois fois 3 ml de tampon de coloration cellulaire. Ajoutez le tampon de coloration de cellule uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide.
- Placez la colonne de tri magnétique sur un tube glacé de 15 ml et ajoutez 5 ml de tampon de coloration cellulaire. Rincez les cellules en poussant fermement le piston dans la colonne. Gardez le flux sur la glace.
REMARQUE: En cas de perte accidentelle de l’échantillon, nous conservons le flux jusqu’à la fin de l’expérience.
4. Coloration des cellules souches hématopoïétiques
- Centrifuger l’échantillon préparé à l’étape 3.2.3 à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
- Ajouter l’anticorps CD34 (clone RAM34) à une concentration de 50 μg/mL à la pastille et incuber sur de la glace pendant 60 min.
NOTE: La préparation des cellules de support pendant la première heure d’incubation avec CD34 est recommandée pour raccourcir le temps de traitement. - Préparer le mélange principal d’anticorps conformément au tableau 1. Ajouter 100 μL du mélange principal à l’échantillon et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. L’anticorps de l’antigène CD34 (clone; RAM34) nécessite 90 min pour une coloration suffisante.
- Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger l’échantillon à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Ajouter la streptavidine-BUV737 à une concentration de 3 μg/mL à la pastille et incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger l’échantillon à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 400 μL de tampon de coloration cellulaire. Conservez l’échantillon sur la glace.
5. Préparation des cellules de soutien
- Préparer une souris congénique CD45.1+ CD45.2+ âgée de 12 semaines; Idéalement, cela devrait avoir le même âge que la souris donneuse. Euthanasier la souris par exposition au CO2 suivie d’une luxation cervicale ou en utilisant des méthodes approuvées par le comité local d’éthique animale.
REMARQUE : Dans l’exemple fourni, des souris congéniques CD45.1+ CD45.2+ ont été élevées en interne par croisement B6. Souris congéniques CD45.1 avec souris C57BL/6J16. - Dans des conditions stériles, prenez à la fois des fémurs et des tibias, et placez-les dans des boîtes de culture cellulaire stériles avec du PBS glacé sans Ca 2+ et Mg2+. Coupez les muscles et les tissus fibreux des os à l’aide d’une pince à épiler et de petits ciseaux.
- Coupez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants et stériles. Utilisez une aiguille de 23 G et une seringue de 5 mL remplie d’un tampon de suspension cellulaire glacé (PBS sans Ca 2+ et Mg2+ complété par du FBS inactivé à 2 %, de la pénicilline 100 U/mL et de la streptomycine à 100 μg/mL) pour rincer la moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire stérile avec tampon de suspension cellulaire. Désagrégez les amas de cellules par pipetage doux.
- Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine à cellules de 40 μm à l’aide d’une pipette P1 000. Compter le numéro cellulaire de la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et préparer une suspension cellulaire de moelle osseuse contenant 1 x 106 cellules/mL.
- Transférer 200 μL de la suspension cellulaire de moelle osseuse (2 x 105 cellules) dans une plaque à fond rond à 96 puits. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation.
REMARQUE: Les plaques à fond rond sont recommandées pour faciliter la collecte des cellules.
6. Tri Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSC
- Configuration du point de contrôle
- Transférer 400 μL de l’échantillon préparé à l’étape 4.5 dans un tube à essai en polystyrène à fond rond muni d’un capuchon à pression de crépine cellulaire de 35 μm. Préparer le réactif de coloration des cellules mortes et l’ajouter à l’échantillon avant l’analyse conformément aux instructions du fabricant.
- Allumez un flowcytomètre et démarrez le logiciel d’analyse conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, appuyez sur Charger et acquérez les données.
REMARQUE: Un cytomètre en flux équipé de cinq lasers et d’une buse de 70 μm est recommandé pour améliorer la pureté des cellules triées. - Après avoir exclu les doublets, les cellules mortes et les cellules de lignée positive, la fraction Lineage−c-Kit+Sca-1+. Ensuite, sortez la fraction Flk2+. Ensuite, grille Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSCs dans la fraction CD150+CD34−/faible (Figure 2). Effectuer une compensation pour le chevauchement spectral dans la première expérience.
REMARQUE: Les cellules Hoxb5 positives devraient représenter 20% à 25% de la fraction Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/faibleFlk2−.
- Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSC tri
- Préparez un tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL contenant 600 μL de PBS sans Ca 2+ et Mg2+ complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur.
- Placez le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL sur un dispositif de collecte de tri et triez lesCSPp Hoxb5 pos ou Hoxb5neg dans le tube de 1,5 mL en utilisant la stratégie de contrôle définie à l’étape 6.1.3. Dans le premier tri, utilisez le rendement du mode de précision de tri.
- Placer la plaque à 96 puits avec les cellules de support préparées à l’étape 5.5 sur l’étape de l’unité de dépôt de cellules automatisées (ACDU). Placer le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL préparé à l’étape 6.2.2 sur l’orifice de chargement d’un cytomètre en flux.
- Triez lespoints de vente Hoxb5 ou Hoxb5neg pHSC dans une plaque de 96 puits avec les cellules de support en utilisant la stratégie de contrôle définie à l’étape 6.1.3. Triez 10Hoxb5 pos ou Hoxb5neg pHSC pour tester leurs capacités d’auto-renouvellement.
NOTE: Un double tri est recommandé pour améliorer la pureté. Dans le deuxième tri, utilisez la pureté comme mode de précision de tri recommandé. - En règle générale, 500 à 1 000 CSp Hoxb5pos et 1 500 à 4 000 HCp Neg5 sont récoltés après double tri. Procéder aux procédures de transplantation dès que possible après le tri HSC pour améliorer la viabilité cellulaire (idéalement dans les 1-2 heures).
7. Transplantation
- Déposer sur de la glace la plaque de 96 puits triée au CSH préparée à l’étape 6.2.4. Manipulez la plaque de 96 puits triée par HSC dans des conditions stériles, idéalement dans une hotte cellulaire.
- Anesthésier une souris receveuse avec de l’isoflurane à 2% dans une chambre d’induction d’anesthésie gazeuse. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, retirez-le et placez-le sur le côté. Pour assurer une anesthésie suffisante, confirmez l’absence de mouvement en réponse à un stimulus nocif.
- Après la confirmation de l’anesthésie appropriée, effectuez une injection rétro-orbitaire dès que possible pour empêcher la souris de reprendre conscience. L’injection rétro-orbitale prend moins de 30 s.
REMARQUE: Comme le temps d’injection est court, nous terminons la procédure sans appliquer de pommade ophtalmique dans les yeux. Cependant, si la procédure prend plus de temps, nous recommandons l’utilisation d’une pommade ophtalmique. - Pipeter doucement les cellules dans la plaque de 96 puits triée HSC pour les mélanger. Prélever les cellules donneuses dans la plaque de tri à l’aide d’une seringue à insuline de 30 G et les injecter dans le plexus veineux rétro-orbitaire des souris receveuses. Le volume injectable recommandé est de ≤200 μL.
- Observez jusqu’à ce que les souris soient conscientes et se déplacent dans une cage propre. Remettez-les dans leurs cages après avoir confirmé leur rétablissement.
8. Analyse du sang périphérique
- Prélever 50 μL de sang périphérique dans la veine de la queue et le remettre en suspension avec 100 μL de PBS sans Ca 2+- et Mg2+ avec 2 mM d’EDTA. Transférer tous les échantillons dans une plaque de 96 puits. Centrifuger à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.
- Ajouter 200 μL de tampon de lyse des globules rouges et incuber sur de la glace pendant 3 min. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant. Répétez une fois de plus.
- Ajouter 200 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.
- Préparer le mélange principal d’anticorps conformément au tableau 2. Ajouter 50 μL de mélange principal d’anticorps et incuber sur de la glace pendant 30 minutes.
- Ajouter 150 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.
- Ajouter 200 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant. Remettez en suspension dans 200 μL de tampon de coloration cellulaire et ajoutez le réactif de coloration des cellules mortes avant l’analyse conformément aux instructions du fabricant.
- Analyser le chimérisme du sang périphérique à l’aide d’un cytomètre en flux comme décrit précédemment16. Prélever du sang à 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines et 16 semaines après la transplantation pour suivre la reconstitution multi-lignée. Des diagrammes de cytométrie en flux représentatifs sont fournis à la figure 3.
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Representative Results
Auparavant, la capacité d’auto-renouvellement était mesurée à l’aide de tests de transplantation compétitifs, dans lesquels on pensait que les CSH du donneur ne conservaient leur capacité d’auto-renouvellement que si des cellules de donneurs multi-lignées dans le sang périphérique du receveur sont observées17. De plus, plusieurs rapports définissent les CSH-LT comme des cellules qui continuent à produire des cellules sanguines périphériques plusieurs mois après la deuxième greffe de moelle osseuse10,18. Par conséquent, afin de comparer leurs capacités d’auto-renouvellement, 10Hoxb5 pos ou Hoxb5neg pHSCs isolés de souris rapporteures Hoxb5 ont été transplantés dans des souris receveuses primaires irradiées létalement avec 2 x 105 cellules de moelle osseuse entières. Puis, 16 semaines après la greffe primaire, 1 x 107 cellules de moelle osseuse isolées des souris receveuses primaires ont été transplantées chez des souris receveuses secondaires irradiées létalement afin d’évaluer la capacité d’auto-renouvellement à long terme (figure 1). La figure 2 montre des tracés de cytométrie en flux représentatifs de l’analyse de la moelle osseuse des souris Hoxb5-tri-mCherry. Environ 20% à 25% des cellules de la fraction pHSC définie par Lineage−c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34− / loFlk2 − étaient des pHSC Hoxb5pos, qui ne représentent que 0,001% à 0,00125% de la moelle osseuse de souris. La figure 3 montre des diagrammes de cytométrie en flux représentatifs de l’analyse du sang périphérique chez les souris receveuses. Les souris donneuses CD45.2 (souris Hoxb5-tri-mCherry), les cellules de soutien CD45.1/CD45.2 et les souris receveuses CD45.1 ont été préparées, respectivement, à analyser séparément les cellules donneuses, de soutien et receveuses.
La figure 4 montre les analyses de sang périphérique chez les souris receveuses à 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines et 16 semaines après la transplantation pour confirmer le chimérisme du donneur. Ces analyses ont révélé que, bien que Hoxb5 pos et Hoxb5neg pHSCs présentent un chimérisme de donneur similaire 4 semaines après la transplantation, une hématopoïèse continue n’a été observée que chez les receveurs de CSPp Hoxb5pos (Figure 4A,B). D’autre part, les CSH Hoxb5neg ont commencé à perdre la capacité de produire des cellules hématopoïétiques 8 semaines après la transplantation (Figure 4A,B). Dans l’analyse de transplantation secondaire, seuls les receveurs de CSPp Hoxb5pos présentaient une hématopoïèse robuste (figure 5A,B). En revanche, les cellules de donneurs ont été à peine observées chez les souris receveuses de CSPp Hoxb5neg, ce qui suggère que les CSPp Hoxb5neg perdent leur capacité d’auto-renouvellement dans les 16 semaines suivant la transplantation chez les souris receveuses primaires. Ces données démontrent que l’expression de Hoxb5 peut être utilisée comme marqueur spécifique pour les LT-HSC.
Figure 1 : Schéma expérimental pour les essais de reconstitution hématopoïétique à long terme. Les souris receveuses ont été irradiées mortellement et transplantées de manière compétitive avec 10 CSH et 2 x 105 cellules de moelle osseuse entières (cellules de soutien). Pour les greffes secondaires, 1 x 107 cellules de moelle osseuse entières ont été transférées des souris receveuses primaires. Abréviations : PB = sang périphérique; WBM = moelle osseuse entière. Ce chiffre a été modifié à partir de Chen et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stratégie de contrôle pour le tri despoints de vente Hoxb5 et des CSHnégative Hoxb5. Cytométrie de flux représentative pour isoler les CSp LKS, Flk2−, pHSC, Hoxb5pos et Hoxb5neg après exclusion des doublets et des cellules mortes. Les valeurs indiquent le pourcentage de chaque fraction ± s.d. (n = 3). Les lignées comprennent B220, CD3ε, CD4, CD8a, Gr-1 et Ter-119. Ce chiffre a été modifié à partir de Chen et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Tracés FACS représentatifs du sang périphérique chez une souris receveuse. Schéma de déclenchement pour identifier les cellules sanguines périphériques (cellule NK, granulocytes, monocytes et cellules B) chez une souris receveuse après exclusion des doublets et des cellules mortes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Chimérisme chez les souris receveuses après la primotransplantation. (A) Pourcentage de chimérisme à 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines et 16 semaines chez les receveurs primaires recevant 10 CSPp Hoxb5neg (n = 9), Hoxb5lo (n = 13) ou Hoxb5hi (n = 18). Chaque colonne représente une souris individuelle. La fraction Hoxb5hi a été définie comme le top 5% de l’expression de Hoxb5 et les autres comme la fractionHoxb5 lo. (B) La contribution moyenne de la lignée du donneur dans 10 greffes primaires de cellules. Les barres d’erreur indiquent le s.d. Ce chiffre a été modifié à partir de Chen et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Chimérisme chez les souris receveuses après la transplantation secondaire. (A) Pourcentage de chimérisme à 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines et 16 semaines après la greffe secondaire de moelle osseuse entière. (B) Chimérisme individuel du donneur par lignée chez les receveurs secondaires de moelle osseuse entière. Chaque ligne représente une souris individuelle. Ce chiffre a été modifié à partir de Chen et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Anticorps | Clone | Concentration | Fluorochromes |
| Flk-2 | A2-F10 | 4 μg/mL | PerCP/eFlour710 |
| CD150 | TC15-12F12.2 | 4 μg/mL | BV421 |
| CD11b | M1/70 | 4 μg/mL | BV711 |
| Sca-1 | D7 | 4 μg/mL | BUV395 |
| CD16/32 | 93 | 4 μg/mL | A-700 |
| DC127 | A7R34 | 4 μg/mL | A-700 |
| CD3ε | 145-2C11 | 10 μg/mL | Biotine |
| CD4 | GK1.5 | 10 μg/mL | Biotine |
| CD8a | 53-6.7 | 10 μg/mL | Biotine |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 10 μg/mL | Biotine |
| B220 | RA3-6B2 | 10 μg/mL | Biotine |
| Ter119 | TER119 | 10 μg/mL | Biotine |
Tableau 1 : Mélange principal d’anticorps pour la coloration des cellules souches hématopoïétiques.
| Anticorps | Clone | Concentration | Fluorochromes |
| CD45.1 | R20 | 1 μg/mL | FITC |
| CD45.2 | 104 | 1 μg/mL | PE |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 2,5 μg/mL | A700 |
| NK1.1 | PK136 | 1 μg/mL | PerCP-Cyanine5.5 |
| CD11b | M1/70 | 1 μg/mL | BUV395 |
| CD3ε | 145-2C11 | 1 μg/mL | BV421 |
| TCRβ | N° H57-597 | 1 μg/mL | BV421 |
| B220 | RA3-6B2 | 1 μg/mL | BV786 |
Tableau 2 : Mélange principal d’anticorps pour la coloration des cellules sanguines périphériques.
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Discussion
Traditionnellement, les CSH définies par marqueurs de surface cellulaire ont été préparées pour étudier les fonctions des CSH, telles que la capacité d’auto-renouvellement et la multipuissance 19,20,21. Cependant, la fraction de CSH définie immunophénotypiquement (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contient deux populations distinctes de CSH : les CSH-LT et les CSH-ST 9,10. Par conséquent, l’analyse spécifique des CSH de bonne foi, les CSH-LT, n’a pas encore été réalisée. En conséquence, une méthode d’isolation des CSH-LT utilisant le système rapporteur Hoxb5 profitera considérablement à la recherche des mécanismes moléculaires de la capacité d’auto-renouvellement.
Ici, nous discuterons des étapes critiques de ce protocole. Tout d’abord, les étapes 1 à 7 doivent être complétées sans interruption. Ces étapes prennent généralement 9 à 12 h, et il est important de maintenir les échantillons à 4 °C tout au long de ces procédures, autant que possible, afin de maintenir la viabilité de l’échantillon. Ensuite, environ 1 x 108 cellules de moelle osseuse sont prélevées sur une souris. Ainsi, nous devons utiliser un volume suffisant d’anticorps afin de reproduire la performance de coloration. De plus, l’anticorps de l’antigène CD34 (clone; RAM34) nécessite 90 min pour une coloration suffisante, tandis que 30 min suffisent pour les autres anticorps. Deuxièmement, l’irradiation provoque généralement une pancytopénie chez les souris receveuses. Si les neutrophiles dérivés du receveur persistent chez de nombreuses souris receveuses, cela indique que la dose de rayonnement était insuffisante. Dans un tel cas, l’optimisation de la dose de rayonnement est recommandée. Troisièmement, si la plupart des souris meurent peu de temps après la transplantation, il y a deux explications possibles: un nombre insuffisant de cellules de soutien ou une injection rétro-orbitale infructueuse.
Pendant des décennies, il a été controversé de savoir si la fraction HSC de bonne foi était homogène ou hétérogène22,23,24. Dans cette étude, les souris receveuses qui ont reçu la greffe de Hoxb5pos pHSC présentaient différentes chimères donneuses et différents modèles de différenciation (Figure 4A), indiquant que cette fraction pourrait être hétérogène. Cependant, ces fluctuations pourraient être causées à la fois par l’utilisation de cellules de moelle osseuse non purifiées comme cellules de soutien et par les différentes radiosensibilités des souris individuelles25.
En résumé, nous avons démontré un protocole étape par étape pour l’isolation des LT-HSC et des ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5. À ce jour, la détection des CSH-LT a dépendu du test de transplantation compétitif, qui nécessite plus de 8 mois. En revanche, le système de rapporteur Hoxb5 nous permet d’identifier prospectivement les LT-HSC et les ST-HSC et de les utiliser pour diverses analyses fonctionnelles. Les figures 4 et 5 montrent également que le niveau d’expression de Hoxb5 semble être corrélé avec le degré de chimérisme du donneur chez la deuxième souris receveuse. De plus, en tirant parti du système de rapporteur Hoxb5, nous avons précédemment révélé que les CSL-LT et les CST-ST fonctionnent de manière complémentaire pour la reconstitution hématopoïétique continue après une greffe de cellules souches hématopoïétiques26. De plus, nous avons démontré que l’expression exogène de Hoxb5 pouvait partiellement inverser le destin cellulaire des ST-HSC à celui des LT-HSC, indiquant que la présence ou l’absence de Hoxb5 explique l’hétérogénéité de la capacité d’auto-renouvellement dans la fraction27 des CSH définie par marqueur de surface cellulaire.
En plus de ces résultats, l’isolement prospectif des LT-HSC nous permet d’analyser les LT-HSC dans diverses conditions physiologiques, telles que le vieillissement, l’inflammation, etc. Ces analyses faciliteront grandement la compréhension des fonctions des CSL-LT.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts associé à cette étude.
Acknowledgments
Nous remercions Hiroshi Kiyonari pour les soins aux animaux et pour avoir fourni des souris receveuses à RIKEN BDR, ainsi que Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka et Masaki Miyahashi pour la gestion du laboratoire à l’Université de Kobe. Les auteurs apprécient également grandement le soutien continu apporté à ce travail. Masanori Miyanishi a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) Numéros de subvention KAKENHI JP17K07407 et JP20H03268, la Fondation Mochida Memorial pour la recherche médicale et pharmaceutique, la Fondation des sciences de la vie du Japon, la Fondation scientifique Takeda, la Fondation Astellas pour la recherche sur les troubles métaboliques et AMED-PRIME, AMED sous le numéro de subvention JP18gm6110020. Taro Sakamaki est soutenu par les numéros de subvention JP21K20669 et JP22K16334 de JSPS KAKENHI et a été soutenu par le programme de base à noyau JSPS et le programme d’associé de recherche junior RIKEN. Katsuyuki Nishi a été soutenu par JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
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