Summary
우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
자가 재생 능력과 다중 계통 분화 잠재력은 일반적으로 조혈 줄기 세포(HSC)의 정의 특성으로 간주됩니다. 그러나 많은 연구에서 HSC 구획에 기능적 이질성이 존재한다고 제안했습니다. 최근의 단일 세포 분석에서는 HSC 구획 내에서 서로 다른 세포 운명을 가진 HSC 클론이 보고되었으며, 이를 편향된 HSC 클론이라고 합니다. 이질적이거나 재현성이 낮은 결과의 기본 메커니즘은 거의 이해되지 않았으며, 특히 정제된 HSC 분획을 기존 면역염색에 의해 이식할 때 자가 재생 길이와 관련하여 거의 이해되지 않았습니다. 따라서 장기 HSC(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)에 대한 재현 가능한 격리 방법을 확립하는 것이 이 문제를 극복하는 데 중요합니다. 편향되지 않은 다단계 스크리닝을 사용하여 마우스 조혈 시스템에서 LT-HSC의 배타적 마커일 수 있는 전사 인자인 Hoxb5를 확인했습니다. 이 발견을 바탕으로 Hoxb5 리포터 마우스 라인을 구축하고 LT-HSC 및 ST-HSC를 성공적으로 분리했습니다. 여기에서는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 LT-HSC 및 ST-HSC를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 분리 방법은 연구자들이 자가 재생 메커니즘과 HSC 구획의 이러한 이질성에 대한 생물학적 기초를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
조혈모세포(HSC)는 자가재생 능력과 분화능을 지니고 있으며, 조혈 계층의 정점에 위치한다 1,2. 1988년 Weissman과 동료들은 유세포 분석을 사용하여 마우스 HSC의 분리를 달성할 수 있음을 처음으로 입증했습니다3. 그 후, 세포 표면 마커의 조합에 의해 정의된 분획인 Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−는 마우스 4,5,6,7,8에서 모든 HSC를 포함하는 것으로 보고되었습니다.
면역표현형으로 정의된 (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC(이하 pHSC)는 이전에 기능적으로 동질적인 것으로 간주되었습니다. 그러나 최근의 단일 세포 분석에 따르면 pHSC는 자가 재생 능력9,10 및 다분화성11,12와 관련하여 여전히 이질성을 나타냅니다. 특히, pHSC 분획에는 자가 재생 능력과 관련하여 두 가지 집단이 존재하는 것으로 보입니다: 지속적인 자가 재생 능력을 가진 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC)와 일시적인 자가 재생 능력을 갖는 단기 조혈 줄기 세포(ST-HSC) 9,10.
현재까지 LT-HSC와 ST-HSC를 구별하는 자가 재생 능력의 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 자가 재생 능력에 따라 두 세포 집단을 분리하고 기본 분자 메커니즘을 발견하는 것이 중요합니다. LT-HSC13,14,15를 정제하기 위해 여러 리포터 시스템도 도입되었습니다. 그러나 각 리포터 시스템에서 정의한 LT-HSC 순도는 가변적이며 현재까지 독점적인 LT-HSC 정제가 달성되지 않았습니다.
따라서 LT-HSC 및 ST-HSC에 대한 격리 시스템을 개발하면 pHSC 부분의 자가 재생 용량에 관한 연구가 가속화될 것입니다. LT-HSC와 ST-HSC의 분리에서 다단계 편향되지 않은 스크리닝을 사용한 연구에서는 pHSC 분획16에서 이질적으로 발현되는 단일 유전자 Hoxb5를 확인했습니다. 또한, Hoxb5 리포터 마우스의 골수 분석은 pHSC 분획의 약 20%-25%가 Hoxb5 pos 세포로 구성되어 있음을 밝혀냈다. Hoxb5pos pHSC 및 Hoxb5 neg pHSC를 사용한 경쟁적 이식 분석에서 Hoxb5pos pHSC만이 장기 자가 재생 능력을 갖는 반면 Hoxb5neg pHSC는 단기간 내에 자가 재생 능력을 상실하는 것으로 나타났으며, 이는 Hoxb5가 pHSC 분획16에서 LT-HSC를 식별함을 나타냅니다.
여기에서는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 LT-HSC와 ST-HSC를 분리하는 단계별 프로토콜을 시연합니다. 또한 Hoxb5pos/neg pHSC의 자가 재생 능력을 평가하기 위한 경쟁력 있는 이식 분석을 제시합니다(그림 1). 이 Hoxb5 리포터 시스템을 통해 LT-HSC와 ST-HSC를 전향적으로 분리할 수 있으며 LT-HSC 특정 특성을 이해하는 데 기여합니다.
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Protocol
기술된 모든 동물 실험은 RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research의 승인을 받았습니다.
1. 수용자 마우스의 전처리
- 8-10주령의 수컷 C57BL/6 동종 마우스를 수용 마우스로 준비합니다. 수용 마우스의 수는 실험 프로토콜에 따라 다릅니다. 우리는 일반적으로 각 조건에 대해 10-20마리의 마우스를 준비합니다.
- 생쥐에게 enrofloxacin (170 mg / L)이 보충 된 멸균 된 물을 먹이십시오. 방사선 조사를 받은 수혜자 마우스는 감염에 매우 취약하므로 케이지를 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오.
참고: 항생제 보충은 방사선 조사 24시간 전에 시작하여 감염을 피하기 위해 이식 후 3주 동안 계속됩니다.
- 생쥐에게 enrofloxacin (170 mg / L)이 보충 된 멸균 된 물을 먹이십시오. 방사선 조사를 받은 수혜자 마우스는 감염에 매우 취약하므로 케이지를 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오.
- 전신 조사
- 전신 방사선 조사는 수혜자 골수 세포를 파괴하여 기증자 세포의 생착을 보장합니다. 수용자 마우스를 방사선 조사 케이지로 옮깁니다. 이식 전 12-16 시간에 8.7 Gy의 단일 용량으로 수용자 마우스를 치명적으로 조사하십시오.
알림: 방사선량과 시간은 장비에 따라 다를 수 있습니다. 치사량은 연구자의 방사선 조사기와 마우스 균주로 확인해야 합니다. - 전신 조사 후 새장으로 돌려 보내십시오.
- 전신 방사선 조사는 수혜자 골수 세포를 파괴하여 기증자 세포의 생착을 보장합니다. 수용자 마우스를 방사선 조사 케이지로 옮깁니다. 이식 전 12-16 시간에 8.7 Gy의 단일 용량으로 수용자 마우스를 치명적으로 조사하십시오.
2. 기증자 골수 세포 수집
- 생후 12주령의 수컷 Hoxb5-tri-mCherry 마우스를 준비하고,CO2 노출에 이어 자궁경부 탈구에 의해 또는 지역 동물 윤리 위원회에 의해 승인된 방법을 사용하여 마우스를 안락사시킨다.
참고: 마우스당 시약 부피는 다음 단계에 설명되어 있습니다. - 무균 상태에서 피부를 제거하고 뼈 (대퇴골, 경골, 골반, 상완골)를 노출시킵니다. 주요 근육을 자르고 마우스에서 뼈 (대퇴골, 경골, 골반, 상완골)를 가져옵니다. Ca 2+- 및 Mg2+가 없는 얼음처럼 차가운 PBS가 포함된 멸균 세포 배양 접시에 넣습니다.
- 오염을 방지하기 위해 핀셋, 작은 가위, 물티슈를 사용하여 뼈에서 근육과 섬유 조직을 다듬습니다. 이 단계에서 뼈가 부러지지 않도록 주의하십시오. 불임 상태를 유지하기 위해 부러진 뼈는 버리십시오.
- 절구와 유봉을 70 % 에탄올 (EtOH)로 소독하고 완전히 건조시킵니다. 세포 염색 완충액(2% 열 비활성화 FBS, 2mM EDTA, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 Ca 2+- 및 Mg2+-free PBS)으로 평형을 이룹니다.
- 뼈를 박격포에 넣고 세포 염색 완충액 3mL를 추가합니다. 유봉으로 뼈를 부수십시오. 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 분해하고 100μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 해결책이 명확해질 때까지 2.5 단계를 반복하십시오. 일반적으로 세 번이면 충분합니다.
3. 자기 선별에 의한 c-kit+ 세포 분리
- 마그네틱 선별을 위한 항체 염색
- 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 1 mL의 세포 염색 완충액에 재현탁시킨다. 비특이적 항체 결합을 줄이기 위해 10μL의 rat-IgG(5mg/mL)를 추가하고 P1,000 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫합니다. 얼음에서 15분 동안 배양합니다.
- c-Kit 항체(클론 2B8)를 4μg/mL 농도로 추가하고 P1,000 피펫과 혼합합니다. 얼음에서 15분 동안 배양합니다.
- 세포 염색 완충액 5mL를 넣고 잘 섞는다. 시료를 400 x g, 4°C, 5분에서 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 500 μL의 세포 염색 완충액에 재현탁시킨다.
- 35μL의 항-APC 마이크로비드를 추가하여 c-Kit+ 세포를 농축하고 P1,000 피펫과 혼합합니다. 얼음에서 15분 동안 배양합니다.
- 4-5 mL의 cell-staining buffer를 추가합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 1 mL의 세포 염색 완충액에 재현탁시킨다.
- c-Kit+ 셀을 자기적으로 분류
- 제조업체의 지침에 따라 셀을 정렬합니다. 간단히 말해서, 마그네틱 분류 컬럼을 3mL의 세포 염색 완충액으로 프라이밍합니다. 40μm 셀 스트레이너를 통해 시료(1mL)를 여과하고 시료를 자기 선별 컬럼에 로드합니다.
- 세포 염색 완충액 3 mL를 가하여 3회 세척한다. 컬럼 저장소가 비어 있는 경우에만 세포 염색 버퍼를 추가합니다.
- 얼음처럼 차가운 15mL 튜브 위에 마그네틱 선별 컬럼을 놓고 5mL의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 세포를 씻어냅니다. 얼음 위에 흐름을 유지하십시오.
참고: 우발적인 샘플 손실의 경우 실험이 끝날 때까지 흐름을 유지합니다.
4. 조혈모세포 염색
- 단계 3.2.3에서 제조된 시료를 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡인합니다.
- CD34 항체(클론 RAM34)를 50μg/mL 농도로 펠릿에 넣고 얼음에서 60분 동안 배양합니다.
참고: CD34로 배양한 첫 시간 동안 지지 세포를 준비하는 것은 처리 시간을 단축하는 것이 좋습니다. - 표 1에 따라 항체 마스터 믹스를 준비한다. 마스터 믹스 100μL를 샘플에 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. CD34 항원에 대한 항체(clone; RAM34)는 충분한 염색을 위해 90분이 필요합니다.
- 4-5 mL의 세포 염색 완충액을 첨가한다. 시료를 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인합니다. 펠릿에 3μg/mL 농도의 스트렙타비딘-BUV737을 첨가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
- 4-5 mL의 세포 염색 완충액을 첨가한다. 시료를 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 400 μL의 세포 염색 완충액에 재현탁시킨다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
5. 세포 준비 지원
- 12주령의 CD45.1+ CD45.2+ 선천성 마우스를 준비하고; 이상적으로는 기증자 마우스와 같은 나이여야 합니다. CO2 노출에 이어 자궁경부 탈구에 의해 또는 지역 동물 윤리 위원회에 의해 승인된 방법을 사용하여 마우스를 안락사시킨다.
참고: 제공된 예에서, CD45.1+ CD45.2+ 선천성 마우스는 B6을 교배하여 사내에서 사육되었습니다. CD45.1 선천성 마우스와 C57BL/6J 마우스16. - 무균 상태에서 대퇴골과 경골을 모두 채취하여 Ca 2+- 및 Mg2+가 없는 얼음처럼 차가운 PBS가 포함된 멸균 세포 배양 접시에 넣습니다. 핀셋과 작은 가위를 사용하여 뼈에서 근육과 섬유 조직을 다듬습니다.
- 날카롭고 멸균 된 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자릅니다. 23G 바늘과 얼음처럼 차가운 세포 현탁액 완충액(2% 열 비활성화 FBS, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 Ca 2+- 및 Mg2+-free PBS)으로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 세포 현탁액 완충액이 있는 멸균 세포 배양 접시로 씻어냅니다. 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 분해합니다.
- P1,000 피펫을 사용하여 40μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액의 세포 수를 세고 1 x 106 cells/mL를 포함하는 골수 세포 현탁액을 준비합니다.
- 200 μL의 골수 세포 현탁액(2 x 105 세포)을 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮깁니다. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
알림: 쉬운 세포 수집을 위해 둥근 바닥 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.
6. Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC 정렬
- 게이팅 설정
- 4.5단계에서 준비한 샘플 400μL를 35μm 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관으로 옮깁니다. 죽은 세포 염색 시약을 준비하고 제조업체의 지침에 따라 분석하기 전에 샘플에 추가합니다.
- 유세포 분석기를 켜고 제조업체의 지침에 따라 분석 소프트웨어를 시작합니다. 그런 다음 로드를 누르고 데이터를 수집합니다.
참고: 분류된 세포의 순도를 높이기 위해 5개의 레이저와 70μm 노즐이 장착된 유세포 분석기를 사용하는 것이 좋습니다. - 이중선, 죽은 세포 및 계통 양성 세포를 제외 한 후 Lineage-c-Kit+Sca-1+ 분획을 게이트합니다. 다음으로 Flk2+ 분수를 게이트아웃합니다. 그런 다음 CD150+CD34-/저 분획에서 Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC를 게이트합니다(그림 2). 첫 번째 실험에서 스펙트럼 중첩에 대한 보상을 수행합니다.
참고: Hoxb5 양성 세포는 Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34-/lowFlk2- 분획의 20%-25%를 차지할 것으로 예상됩니다.
- Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC 정렬
- 10% 열 비활성화 FBS가 보충된 600μL의Ca2+- 및 Mg2+ -free PBS가 있는 1.5mL 저단백질 결합 튜브를 준비합니다.
- 정렬 수집 장치에 1.5mL 저단백질 결합 튜브를 설정하고 6.1.3단계에서 설정한 게이팅 전략을 사용하여 Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC를 1.5mL 튜브로 정렬합니다. 첫 번째 정렬에서는 정렬 정밀도 모드의 출력량을 사용합니다.
- 단계 5.5에서 제조된 지지세포가 있는 96웰 플레이트를 자동 세포 증착 장치(ACDU) 스테이지에 세팅한다. 단계 6.2.2에서 제조한 1.5 mL 저단백질 결합 튜브를 유세포 분석기의 로딩 포트에 세팅한다.
- Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC를 6.1.3단계에서 설정된 게이팅 전략을 사용하여 지지 세포가 있는 96웰 플레이트로 분류합니다. 10개의 Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC를 정렬하여 자가 재생 능력을 테스트합니다.
알림: 순도를 높이기 위해 이중 분류하는 것이 좋습니다. 두 번째 정렬에서는 순도를 권장 정렬 정밀도 모드로 사용합니다. - 전형적으로, 500-1,000 Hoxb5pos pHSC 및 1,500-4,000 Hoxb5neg pHSC는 이중 분류 후에 수확된다. 세포 생존율을 향상시키기 위해 HSC 분류 후 가능한 한 빨리 이식 절차를 진행하십시오(이상적으로는 1-2시간 이내).
7. 이식
- 단계 6.2.4에서 준비한 HSC 분류된 96웰 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. HSC로 분류된 96웰 플레이트를 무균 상태, 이상적으로는 셀 후드에서 취급합니다.
- 가스 마취 유도 챔버에서 2% 이소플루란으로 수용자 마우스를 마취합니다. 동물이 완전히 마취되면 제거하고 옆으로 눕힙니다. 충분한 마취를 보장하려면 유해한 자극에 반응하여 움직임이 없는지 확인하십시오.
- 적절한 마취를 확인한 후 마우스가 의식을 회복하지 못하도록 가능한 한 빨리 안와 주사를 시행하십시오. 역궤도 주입은 30초 미만이 소요됩니다.
참고: 주입 시간이 짧기 때문에 눈에 안과용 연고를 바르지 않고 시술을 마칩니다. 그러나 시술 시간이 오래 걸리면 안과 용 연고를 사용하는 것이 좋습니다. - HSC로 분류된 96웰 플레이트의 세포를 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 30G 인슐린 주사기를 사용하여 분류 플레이트에 기증자 세포를 수집하고 수용자 마우스의 안와 후 정맥 신경총에 주입합니다. 권장 주사 용량은 ≤200μL입니다.
- 생쥐가 의식을 잃고 깨끗한 새장에서 움직일 때까지 관찰하십시오. 회복을 확인한 후 새장으로 돌려 보내십시오.
8. 말초 혈액 분석
- 꼬리 정맥에서 말초 혈액 50μL를 수집하고 100μL의 Ca 2+- 및 Mg2+가 없는 PBS와 2mM EDTA로 재현탁합니다. 모든 샘플을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버린다.
- 적혈구 용해 완충액 200μL를 넣고 얼음에서 3분 동안 배양합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 한 번 더 반복하십시오.
- 200 μL의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 표 2에 따라 항체 마스터 믹스를 준비한다. 항체 마스터 믹스 50μL를 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
- 150 μL의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 200 μL의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 200 μL의 세포 염색 완충액에 재현탁하고, 제조사의 지시에 따라 분석하기 전에 죽은 세포 염색 시약을 첨가한다.
- 앞서 설명한 바와 같이 유세포 분석기를 사용하여 말초 혈액 키메라를 분석한다16. 이식 후 4주, 8주, 12주, 16주에 혈액을 채취하여 다계통 재구성을 따릅니다. 대표적인 유세포 분석 플롯은 그림 3에 나와 있습니다.
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Representative Results
이전에는 경쟁적 이식 분석을 사용하여 자가 재생 능력을 측정했는데, 이 분석에서 기증자 HSC는 수혜자 말초 혈액에서 다중 계통 기증자 세포가 관찰되는 경우에만 자가 재생 능력을 유지하는 것으로 생각되었다17. 또한, 몇몇 보고서에서는 LT-HSC를 두 번째 골수 이식 후 몇 개월 후에 말초 혈액 세포를 계속 생산하는 세포로 정의하고 있다10,18. 따라서, 이들의 자가 재생 능력을 비교하기 위해, Hoxb5리포터 마우스로부터 분리된 10개의 Hoxb5 pos 또는 Hoxb5 neg pHSC를 2 x 105개의 전체 골수 세포로 치사적으로 조사된 1차 수용자 마우스에 이식하였다. 이어서, 1차 이식 16주 후, 1차 수용자 마우스로부터 분리된 1 x 107개의 골수 세포를 치사 조사된 2차 수용자 마우스에 이식하여 장기 자가 재생 능력을 평가하였다(도 1). 도 2는 Hoxb5-tri-mCherry 마우스의 골수 분석의 대표적인 유세포 분석 플롯을 나타낸다. Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34-/loFlk2-에 의해 정의된 pHSC 분획의 세포 중 약 20%-25%는 Hoxb5pos pHSC였으며, 이는 마우스 골수의 0.001%-0.00125%에 불과합니다. 도 3은 수용자 마우스에서 분석된 말초 혈액의 대표적인 유세포 분석 플롯을 나타낸다. CD45.2 공여 마우스(Hoxb5-tri-mCherry mice), CD45.1/CD45.2 지지 세포 및 CD45.1 수용자 마우스를 각각 준비하여 공여자 세포, 지지체 세포 및 수용자 세포를 별도로 분석하였다.
도 4는 기증자 키메라를 확인하기 위해 이식 후 4주, 8주, 12주 및 16주에 수용자 마우스의 말초 혈액 분석을 보여준다. 이러한 분석은 Hoxb5 pos 및 Hoxb5neg pHSC가 이식 4주 후에 유사한 기증자 키메라를 나타내지만 Hoxb5pos pHSC 수혜자에서만 지속적인 조혈이 관찰되었음을 보여주었습니다(그림 4A, B). 반면, Hoxb5neg HSC는 이식 후 8주 후에 조혈 세포를 생산하는 능력을 잃기 시작했습니다(그림 4A, B). 2차 이식 분석에서 Hoxb5pos pHSC 수혜자만이 강력한 조혈을 나타냈습니다(그림 5A,B). 대조적으로, Hoxb5neg pHSC 수용자 마우스에서는 공여자 세포가 거의 관찰되지 않았으며, 이는 Hoxb5neg pHSC가 1차 수용자 마우스에서 이식 후 16주 이내에 자가 재생 능력을 상실함을 시사합니다. 이들 데이터는 Hoxb5 발현이 LT-HSC에 대한 특이적 마커로서 사용될 수 있음을 입증한다.
그림 1: 장기 조혈 재구성 분석에 대한 실험 개략도. 수용 마우스를 치사적으로 조사하고 10 HSC와 2 x 105 전체 골수 세포 (지지 세포)로 경쟁적으로 이식했습니다. 2차 이식의 경우, 1 x 107 개의 전체 골수 세포를 1차 수용자 마우스로부터 이식하였다. 약어: PB = 말초 혈액; WBM = 전체 골수. 이 수치는 Chen et al.16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Hoxb5 pos 및 Hoxb5neg pHSC를 정렬하기 위한 게이팅 전략. 이중항 및 사멸 세포를 배제한 후 LKS, Flk2-, pHSC, Hoxb5pos 및 Hoxb5neg pHSC를 분리하기 위한 대표적인 유세포 분석 게이팅. 값은 s.d.(n = 3)± 각 분수의 백분율을 나타냅니다. 계통에는 B220, CD3ε, CD4, CD8a, Gr-1 및 Ter-119가 포함됩니다. 이 수치는 Chen et al.16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 수용자 마우스의 말초 혈액에 대한 대표적인 FACS 플롯. 이중항 및 사세포를 배제한 후 수용자 마우스에서 말초혈액세포(NK cell, granulocyte, monocyte, T cell, and B cell)를 동정하기 위한 게이팅 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 1차 이식 후 수용자 마우스의 키메라증. (A) 10 Hoxb5neg(n = 9), Hoxb5lo(n = 13) 또는 Hoxb5hi(n = 18) pHSC를 받은 1차 수혜자의 4주, 8주, 12주 및 16주에서의 키메라즘 비율. 각 열은 개별 마우스를 나타냅니다. Hoxb5hi 분획은 Hoxb5 발현의 상위 5%로 정의되고 나머지는 Hoxb5lo 분획으로 정의되었습니다. (B) 10개의 세포 1차 이식에서 평균 기증자 혈통 기여도. 오차 막대는 s.d.를 나타냅니다. 이 수치는 Chen et al.16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 2차 이식 후 수용자 마우스에서의 키메라증. (A) 전체 골수 2차 이식 후 4주, 8주, 12주 및 16주째의 키메라증 비율. (B) 전체 골수 2차 수혜자의 혈통에 의한 개별 기증자 키메라. 각 줄은 개별 마우스를 나타냅니다. 이 수치는 Chen et al.16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항체 | 클론 | 농도 | 형광색소 |
| Flk-2 시리즈 | A2-F10 | 4 μg/mL | 퍼CP/e밀가루710 |
| CD150 시리즈 | TC15-12F12.2 시리즈 | 4 μg/mL | BV421 시리즈 |
| CD11b입니다 | M1/70 시리즈 | 4 μg/mL | BV711 시리즈 |
| 스카-1 | D7 | 4 μg/mL | BUV395 시리즈 |
| CD16/32 | 93 | 4 μg/mL | A-700 시리즈 |
| CD127 | A7R34 (영문) | 4 μg/mL | A-700 시리즈 |
| CD3ε | 145-2C11 | 10μg/mL | 비오 틴 |
| CD4 (영어) | GK1.5 (영어) | 10μg/mL | 비오 틴 |
| CD8a | 53-6.7 | 10μg/mL | 비오 틴 |
| Gr-1 시리즈 | RB6-8C5 시리즈 | 10μg/mL | 비오 틴 |
| 나220 | RA3-6B2 시리즈 | 10μg/mL | 비오 틴 |
| 테르119 | TER119 (영어) | 10μg/mL | 비오 틴 |
표 1: 조혈모세포 염색을 위한 항체 마스터 믹스.
| 항체 | 클론 | 농도 | 형광색소 |
| CD45.1 | 대답 20 | 1 μg/mL | 핏 |
| CD45.2 | 104 | 1 μg/mL | 체육 |
| Gr-1 시리즈 | RB6-8C5 시리즈 | 2.5μg/mL | A700 시리즈 |
| 엔케이1.1 | PK136 시리즈 | 1 μg/mL | 퍼CP-시아닌5.5 |
| CD11b입니다 | M1/70 시리즈 | 1 μg/mL | BUV395 시리즈 |
| CD3ε | 145-2C11 | 1 μg/mL | BV421 시리즈 |
| TCRβ | H57-597 | 1 μg/mL | BV421 시리즈 |
| 나220 | RA3-6B2 시리즈 | 1 μg/mL | BV786 시리즈 |
표 2: 말초 혈액 세포 염색을 위한 항체 마스터 믹스.
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Discussion
전통적으로, 세포 표면 마커로 정의된 HSC는 자가 재생 능력 및 다능성과 같은 HSC의 기능을 연구하기 위해 준비되었다 19,20,21. 그러나 면역 표현형으로 정의된 (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lo Flk2−) HSC 분획에는 LT-HSC 및 ST-HSC의 두 가지 개별 HSC 집단이 포함됩니다 9,10. 따라서 선의의 HSC, LT-HSC의 구체적인 분석은 아직 이루어지지 않았습니다. 따라서 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하는 LT-HSC의 분리 방법은 자가 재생 능력의 분자 메커니즘을 찾는 데 상당한 도움이 될 것입니다.
여기에서는 이 프로토콜의 중요한 단계에 대해 설명합니다. 먼저 1단계부터 7단계까지 중단 없이 완료해야 합니다. 이러한 단계는 일반적으로 9-12시간이 소요되며, 샘플 생존력을 유지하기 위해 이러한 절차 전반에 걸쳐 샘플을 가능한 한 많이 4°C로 유지하는 것이 중요합니다. 다음으로, 대략 1 x 108 개의 골수 세포가 마우스로부터 수확된다. 따라서 염색 성능을 재현하기 위해서는 충분한 양의 항체를 사용해야 합니다. 또한, 상기 CD34 항원에 대한 항체(clone; RAM34)는 충분한 염색을 위해 90분이 필요하지만 다른 항체의 경우 30분이면 충분합니다. 둘째, 방사선 조사는 일반적으로 수용자 마우스에서 범혈구감소증을 유발합니다. 수용자 유래 호중구가 많은 수용자 마우스에서 지속되는 경우, 이는 방사선량이 불충분하다는 것을 나타낸다. 이러한 경우 방사선량을 최적화하는 것이 좋습니다. 셋째, 대부분의 마우스가 이식 직후 사망하는 경우, 두 가지 가능한 설명이 있습니다 : 부적절한지지 세포 수 또는 실패한 역궤도 주사.
수십 년 동안 선의의 HSC 분획이 균질한지 이질적인지에 대해서는 논란이 있어 왔습니다22,23,24. 이 연구에서 Hoxb5pos pHSC 이식을 받은 수용자 마우스는 서로 다른 기증자 키메라 및 분화 패턴을 나타냈으며(그림 4A), 이는 이 부분이 이질적일 수 있음을 나타냅니다. 그러나, 이러한 변동은 정제되지 않은 골수 세포를 지지 세포로 사용하는 것과 개별 생쥐의 상이한 방사선 민감성으로 인해 발생할 수 있다25.
요약하면, Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 LT-HSC 및 ST-HSC를 분리하기 위한 단계별 프로토콜을 시연했습니다. 현재까지 LT-HSC의 검출은 8개월 이상이 필요한 경쟁 이식 분석에 의존해 왔습니다. 대조적으로, Hoxb5 리포터 시스템을 사용하면 LT-HSC와 ST-HSC를 전향적으로 식별하고 다양한 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 도 4 및 도 5는 또한 Hoxb5 발현 수준이 제2 수용자 마우스에서 공여자 키메라증의 정도와 상관관계가 있는 것으로 보인다는 것을 보여준다. 또한, Hoxb5 리포터 시스템을 활용하여 LT-HSC와 ST-HSC가 조혈모세포 이식 후 지속적인 조혈 재구성을 위해 상호 보완적인 방식으로 작용한다는 것을 이전에 밝혔습니다26. 또한, 우리는 외인성 Hoxb5 발현이 ST-HSC의 세포 운명을 LT-HSC의 세포 운명으로 부분적으로 역전시킬 수 있음을 입증했으며, 이는 Hoxb5의 존재 또는 부재가 세포 표면 마커 정의 HSC 분획27에서 자가 재생 능력의 이질성을 설명함을 나타냅니다.
이러한 결과 외에도 LT-HSC의 전향적 분리를 통해 노화, 염증 등과 같은 다양한 생리적 조건에서 LT-HSC를 분석할 수 있습니다. 이러한 분석은 LT-HSC의 기능에 대한 이해를 크게 촉진할 것입니다.
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Disclosures
저자는 이 연구와 관련된 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
동물 관리와 RIKEN BDR의 수혜 마우스를 제공한 키요나리 히로시, 고베 대학의 실험실 관리를 위해 오가 히토미, 나가사카 카요코, 미야하시 마사키에게 감사드립니다. 저자는 또한 이 작업에 대한 지속적인 지원에 크게 감사드립니다. 미야니시 마사노리는 일본 과학 진흥 협회 (JSPS) KAKENHI 보조금 번호 JP17K07407 및 JP20H03268, 모치다 의료 및 제약 연구 재단, 일본 생명 과학 재단, 다케다 과학 재단, 아스텔라스 대사 장애 연구 재단 및 AMED-PRIME, AMED의 지원을 받았습니다. 허가 번호 JP18gm6110020. Taro Sakamaki는 JSPS KAKENHI 보조금 번호 JP21K20669 및 JP22K16334의 지원을 받았으며 JSPS Core-to-Core 프로그램 및 RIKEN Junior Research Associate Program. 니시 카츠유키는 JSPS 보조금 번호 KAKENHI JP18J13408의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
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