Summary
हम होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके दीर्घकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एलटी-एचएससी) और अल्पकालिक एचएससी (एसटी-एचएससी) के अलगाव के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
स्व-नवीकरण क्षमता और बहु-वंश भेदभाव क्षमता को आमतौर पर हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) की परिभाषित विशेषताओं के रूप में माना जाता है। हालांकि, कई अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि एचएससी डिब्बे में कार्यात्मक विषमता मौजूद है। हाल के एकल-सेल विश्लेषणों ने एचएससी डिब्बे के भीतर विभिन्न सेल भाग्य के साथ एचएससी क्लोन की सूचना दी है, जिन्हें पक्षपाती एचएससी क्लोन के रूप में जाना जाता है। विषम या खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के अंतर्निहित तंत्र को बहुत कम समझा जाता है, विशेष रूप से आत्म-नवीकरण की लंबाई के बारे में जब शुद्ध एचएससी अंशों को पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा प्रत्यारोपित किया जाता है। इसलिए, दीर्घकालिक एचएससी (एलटी-एचएससी) और अल्पकालिक एचएससी (एसटी-एचएससी) के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव विधि स्थापित करना, उनके आत्म-नवीकरण की लंबाई से परिभाषित, इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए महत्वपूर्ण है। निष्पक्ष बहु-चरण स्क्रीनिंग का उपयोग करते हुए, हमने एक प्रतिलेखन कारक, होक्सबी 5 की पहचान की, जो माउस हेमटोपोइएटिक सिस्टम में एलटी-एचएससी का एक विशेष मार्कर हो सकता है। इस खोज के आधार पर, हमने एक होक्सबी 5 रिपोर्टर माउस लाइन स्थापित की और सफलतापूर्वक एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी को अलग किया। यहां हम होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह अलगाव विधि शोधकर्ताओं को एचएससी डिब्बे में इस तरह की विषमता के लिए आत्म-नवीकरण और जैविक आधार के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगी।
Introduction
हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी), जिनके पास आत्म-नवीकरण क्षमता और बहुशक्ति है, हेमटोपोइएटिक पदानुक्रम 1,2 के शीर्ष पर रहते हैं। 1988 में, वीसमैन और सहयोगियों ने पहली बार प्रदर्शित किया कि फ्लो साइटोमेट्री3 का उपयोग करके माउस एचएससी का अलगाव हासिल किया जा सकता है। इसके बाद, सेल सतह मार्करों के संयोजन द्वारा परिभाषित एक अंश, वंश-सी-किट + एससीए -1 + सीडी 150 + सीडी 34 −/ लोएफएलके 2−, चूहों में सभी एचएससी 4,5,6,7,8 होने की सूचना दी गई थी।
इम्यूनोफेनोटाइपिक रूप से परिभाषित (वंश-सी-किट + एससीए -1 + सीडी 150 + सीडी 34−/ लोएफएलके 2−) एचएससी (इसके बाद, पीएचएससी) को पहले कार्यात्मक रूप से सजातीय माना जाता था। हालांकि, हाल ही में एकल-सेल विश्लेषण से पता चला है कि पीएचएससी अभी भी अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता 9,10 और बहुशक्ति11,12 के संबंध में विषमता प्रदर्शित करते हैं। विशेष रूप से, उनकी आत्म-नवीकरण क्षमता के संबंध में पीएचएससी अंश में दो आबादी मौजूद प्रतीत होती है: दीर्घकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एलटी-एचएससी), जिनमें निरंतर आत्म-नवीकरण क्षमता होती है, और अल्पकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एसटी-एचएससी), जिनमें क्षणिक आत्म-नवीकरण क्षमता 9,10 होती है।
आज तक, एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी को अलग करने वाले आत्म-नवीकरण क्षमता के आणविक तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है। दोनों सेल आबादी को उनकी आत्म-नवीकरण क्षमताओं के आधार पर अलग करना और अंतर्निहित आणविक तंत्र की खोज करना महत्वपूर्ण है। एलटी-एचएससी13,14,15 को शुद्ध करने के लिए कई रिपोर्टर सिस्टम भी पेश किए गए हैं; हालांकि, प्रत्येक रिपोर्टर सिस्टम द्वारा परिभाषित एलटी-एचएससी शुद्धता परिवर्तनशील है, और अनन्य एलटी-एचएससी शुद्धिकरण आज तक हासिल नहीं किया गया है।
इसलिए, एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी के लिए एक अलगाव प्रणाली विकसित करने से पीएचएससी अंश में आत्म-नवीकरण क्षमता के बारे में अनुसंधान में तेजी आएगी। एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी के अलगाव में, बहु-चरण, निष्पक्ष स्क्रीनिंग का उपयोग करके एक अध्ययन ने एक एकल जीन, होक्सबी 5 की पहचान की, जो पीएचएससी अंश16 में विषम रूप से व्यक्त किया गया है। इसके अतिरिक्त, होक्सबी 5 रिपोर्टर चूहों के अस्थि मज्जा विश्लेषण से पता चला है कि पीएचएससी अंश के लगभग 20% -25% में होक्सबी 5 पीओएस कोशिकाएं होती हैं। होक्सबी 5पॉस पीएचएससी और होक्सबी 5 नेग पीएचएससी का उपयोग करके एक प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण परख से पता चला है कि केवल होक्सबी 5पॉस पीएचएससी में दीर्घकालिक आत्म-नवीकरण क्षमता होती है, जबकि होक्सबी 5नेग पीएचएससी एक छोटी अवधि के भीतर अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता खो देते हैं, यह दर्शाता है कि होक्सबी 5 पीएचएससी अंश16 में एलटी-एचएससी की पहचान करता है।
यहां, हम होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, हम Hoxb5pos / neg pHSCs की आत्म-नवीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए एक प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण परख प्रस्तुत करते हैं (चित्रा 1)। यह होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम हमें एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी को भावी प्रभाव से अलग करने की अनुमति देता है और एलटी-एचएससी-विशिष्ट विशेषताओं की समझ में योगदान देता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
वर्णित सभी पशु प्रयोगों को रिकेन सेंटर फॉर बायोसिस्टम्स डायनामिक्स रिसर्च द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. प्राप्तकर्ता चूहों की पूर्व शर्त।
- प्राप्तकर्ता चूहों के रूप में 8-10 सप्ताह की आयु के पुरुष सी 57बीएल / 6 कॉन्जेनिक चूहों को तैयार करें। प्राप्तकर्ता चूहों की संख्या प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करती है। हम आम तौर पर प्रत्येक स्थिति के लिए 10-20 चूहों को तैयार करते हैं।
- चूहों को एनरोफ्लोक्सासिन (170 मिलीग्राम / एल) के साथ पूरक निष्फल पानी के साथ खिलाएं। चूंकि विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहे संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, पिंजरों को यथासंभव साफ रखें।
नोट: एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक विकिरण से 24 घंटे पहले शुरू होता है और संक्रमण से बचने के लिए प्रत्यारोपण के बाद 3 सप्ताह तक जारी रहता है।
- चूहों को एनरोफ्लोक्सासिन (170 मिलीग्राम / एल) के साथ पूरक निष्फल पानी के साथ खिलाएं। चूंकि विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहे संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, पिंजरों को यथासंभव साफ रखें।
- कुल शरीर विकिरण
- कुल शरीर विकिरण दाता कोशिकाओं के उत्थान को सुनिश्चित करने के लिए प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा कोशिकाओं को नष्ट कर देता है। प्राप्तकर्ता चूहों को एक विकिरण पिंजरे में स्थानांतरित करें। प्रत्यारोपण से पहले 12-16 घंटे में 8.7 GY की एकल खुराक के साथ प्राप्तकर्ता चूहों को विकिरणित किया जाता है।
नोट: उपकरण के आधार पर विकिरण की खुराक और समय भिन्न हो सकता है। घातक विकिरण खुराक की पुष्टि शोधकर्ता के इरेडिएटर और माउस तनाव के साथ की जानी चाहिए। - कुल शरीर विकिरण के बाद उन्हें अपने पिंजरों में वापस कर दें।
- कुल शरीर विकिरण दाता कोशिकाओं के उत्थान को सुनिश्चित करने के लिए प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा कोशिकाओं को नष्ट कर देता है। प्राप्तकर्ता चूहों को एक विकिरण पिंजरे में स्थानांतरित करें। प्रत्यारोपण से पहले 12-16 घंटे में 8.7 GY की एकल खुराक के साथ प्राप्तकर्ता चूहों को विकिरणित किया जाता है।
2. दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं का संग्रह
- 12 सप्ताह की आयु का एक नर होक्सबी 5-ट्राई-एमचेरी माउस तैयार करें, और सीओ2 एक्सपोजर द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें, जिसके बाद ग्रीवा अव्यवस्था या स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित तरीकों का उपयोग करें।
नोट: प्रति माउस अभिकर्मक मात्रा निम्न चरणों में वर्णित है। - बाँझ स्थितियों के तहत, त्वचा को हटा दें, और हड्डियों (फीमर, टिबिया, श्रोणि, ह्यूमरस) को उजागर करें। प्रमुख मांसपेशियों को काटें, और माउस से हड्डियों (फीमर, टिबिया, श्रोणि, ह्यूमरस) लें। उन्हें सीए 2 +- और एमजी2 + मुक्त, बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ बाँझ सेल कल्चर व्यंजनों में रखें।
- संदूषण को रोकने के लिए चिमटी, छोटी कैंची और वाइप्स का उपयोग करके हड्डियों से मांसपेशियों और रेशेदार ऊतकों को ट्रिम करें। ध्यान रखें कि इस चरण के दौरान हड्डियां न टूटें। बाँझपन बनाए रखने के लिए किसी भी टूटी हुई हड्डियों को त्याग दें।
- 70% इथेनॉल (ईटीओएच) के साथ एक मोर्टार और मूसल को स्टरलाइज़ करें, और उन्हें पूरी तरह से सूखने दें। सेल-स्टेनिंग बफर (सीए 2 +- और एमजी 2+ - मुक्त पीबीएस के साथ पूरक 2% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस,2 एमएम ईडीटीए, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ समतुल्यता।
- हड्डियों को मोर्टार में रखें, और सेल-स्टेनिंग बफर के 3 एमएल जोड़ें। मूसल से खुली हड्डियों को कुचल दें। कोमल पाइपिंग द्वारा सेल क्लंप को अलग करें, और सेल निलंबन को 100 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- चरण 2.5 को तब तक दोहराएं जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए। आमतौर पर, तीन बार पर्याप्त है।
3. चुंबकीय छंटाई द्वारा सी-किट + कोशिकाओं का पृथक्करण
- चुंबकीय छंटाई के लिए एंटीबॉडी धुंधला होना।
- 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और सेल स्टेनिंग बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को कम करने के लिए चूहे-आईजीजी (5 मिलीग्राम / एमएल) के 10 μL जोड़ें, और धीरे से पी 1,000 पिपेट का उपयोग करके ऊपर और नीचे पाइप करें। 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- 4 μg / mL की एकाग्रता पर सी-किट एंटीबॉडी (क्लोन 2B8) जोड़ें, और P1,000 पिपेट के साथ मिलाएं। 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- 5 एमएल सेल स्टेनिंग बफर जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएं। 400 x g, 4 ° C, 5 मिनट पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और सेल स्टेनिंग बफर के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
- सी-किट + कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एंटी-एपीसी माइक्रोबीड्स के 35 μL जोड़ें, और P1,000 पिपेट के साथ मिलाएं। 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- सेल-स्टेनिंग बफर के 4-5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और सेल स्टेनिंग बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
- सी-किट + कोशिकाओं को चुंबकीय रूप से सॉर्ट करना
- कक्षों को सॉर्ट करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। संक्षेप में, 3 एमएल सेल स्टेनिंग बफर के साथ एक चुंबकीय सॉर्टिंग कॉलम प्राइम करें। 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से नमूना (1 एमएल) फ़िल्टर करें और चुंबकीय सॉर्टिंग कॉलम पर नमूना लोड करें।
- तीन बार 3 एमएल सेल स्टेनिंग बफर जोड़कर धोएं। कॉलम जलाशय खाली होने पर ही सेल स्टेनिंग बफर जोड़ें।
- बर्फ-ठंडे 15 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर चुंबकीय सॉर्टिंग कॉलम रखें और 5 एमएल सेल स्टेनिंग बफर जोड़ें। प्लंजर को स्तंभ में मजबूती से धकेलकर कोशिकाओं को बाहर निकालें। प्रवाह को बर्फ पर रखें।
नोट: आकस्मिक नमूना हानि के मामले में, हम प्रयोग के अंत तक प्रवाह को बनाए रखते हैं।
4. हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल धुंधला
- 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर चरण 3.2.3 में तैयार किए गए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला यंत्र।
- गोली में 50 μg / mL की एकाग्रता पर CD34 एंटीबॉडी (क्लोन RAM34) जोड़ें, और 60 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
नोट: सीडी 34 के साथ इनक्यूबेशन के पहले घंटे के दौरान सहायक कोशिकाओं की तैयारी प्रसंस्करण समय को कम करने के लिए अनुशंसित है। - तालिका 1 के अनुसार एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार करें। नमूने में मास्टर मिश्रण के 100 μL जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। सीडी 34 एंटीजन के लिए एंटीबॉडी (क्लोन; RAM34) को पर्याप्त धुंधला होने के लिए 90 मिनट की आवश्यकता होती है।
- सेल स्टेनिंग बफर के 4-5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला यंत्र। गोली में 3 μg / mL की एकाग्रता पर स्ट्रेप्टाविडिन-BUV737 जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- सेल स्टेनिंग बफर के 4-5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और सेल स्टेनिंग बफर के 400 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। नमूने को बर्फ पर रखें।
5. सेल तैयारी का समर्थन
- 12 सप्ताह की आयु का एक सीडी 45.1 + सीडी 45.2 + कॉन्जेनिक माउस तैयार करें; आदर्श रूप से, यह दाता माउस के समान उम्र होनी चाहिए। सीओ2 एक्सपोजर द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें, इसके बाद ग्रीवा अव्यवस्था या स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित तरीकों का उपयोग करें।
नोट: दिए गए उदाहरण में, सीडी 45.1 + सीडी 45.2 + कॉन्जेनिक चूहों को बी 6 को पार करके घर में पैदा किया गया था। C57BL/6J चूहों के साथ CD45.1 कॉन्जेनिक चूहे16. - बाँझ परिस्थितियों में, फीमर और टिबिया दोनों लें, और उन्हें सीए2 +- और एमजी2 + मुक्त, बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ बाँझ सेल कल्चर व्यंजनों में रखें। चिमटी और छोटी कैंची का उपयोग करके हड्डियों से मांसपेशियों और रेशेदार ऊतकों को ट्रिम करें।
- हड्डियों के दोनों सिरों को तेज, बाँझ कैंची से काटें। सेल सस्पेंशन बफर के साथ एक बाँझ सेल कल्चर डिश में अस्थि मज्जा को बाहर निकालने के लिए बर्फ-कोल्ड सेल-सस्पेंशन बफर (सीए2 +- और एमजी2 + - मुक्त पीबीएस के साथ पूरक) से भरी 23 जी सुई और 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। कोमल पाइपिंग द्वारा सेल क्लंप को अलग करें।
- पी 1,000 पिपेट का उपयोग करके 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल निलंबन की सेल संख्या की गणना करें और 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल युक्त अस्थि मज्जा सेल निलंबन तैयार करें।
- अस्थि मज्जा कोशिका निलंबन (2 x 105 कोशिकाओं) के 200 μL को 96-अच्छी तरह से, गोल-नीचे प्लेट में स्थानांतरित करें। उपयोग तक बर्फ पर रखें।
नोट: आसान सेल संग्रह के लिए गोल-नीचे प्लेटों की सिफारिश की जाती है।
6. होक्सबी 5पीओएस या होक्सबी 5नेग पीएचएससी सॉर्टिंग।
- गेटिंग सेटअप
- चरण 4.5 में तैयार किए गए नमूने के 400 μL को 35 μm सेल स्ट्रेनर स्नैप कैप के साथ एक गोल-नीचे पॉलीस्टाइनिन टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें। मृत सेल धुंधला अभिकर्मक तैयार करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार विश्लेषण से पहले इसे नमूने में जोड़ें।
- फ्लोसाइटोमीटर चालू करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार विश्लेषण सॉफ़्टवेयर शुरू करें। उसके बाद, लोड दबाएँ, और डेटा प्राप्त करें।
नोट: क्रमबद्ध कोशिकाओं की शुद्धता को बढ़ाने के लिए पांच लेजर और 70 μm नोजल से लैस एक प्रवाह साइटोमीटर की सिफारिश की जाती है। - डबल्स, मृत कोशिकाओं और वंश-सकारात्मक कोशिकाओं को छोड़कर, वंश-सी-किट + एससीए -1 + अंश को गेट करें। इसके बाद, Flk2+ अंश को गेट करें। फिर, CD150+CD34−/निम्न अंश (चित्रा 2) में गेट Hoxb5pos या Hoxb5neg pHSCs का उपयोग करें। पहले प्रयोग में वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए क्षतिपूर्ति करें।
नोट: होक्सबी 5 सकारात्मक कोशिकाओं को वंश-सी-किट + एससीए -1 + सीडी 150 + सीडी 34−/ कमएफएलके 2 - अंश के 20% -25% का प्रतिनिधित्व करने की उम्मीद है।
- Hoxb5pos या Hoxb5neg pHSC सॉर्टिंग;
- 1.5 एमएल कम प्रोटीन बाइंडिंग ट्यूब तैयार करें जिसमें सीए 2 +- और एमजी2 + -मुक्त पीबीएस के 600 μL 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस के साथ पूरक हैं।
- सॉर्ट कलेक्शन डिवाइस पर 1.5 एमएल कम प्रोटीन बाइंडिंग ट्यूब सेट करें, और चरण 6.1.3 में सेट गेटिंग रणनीति का उपयोग करके होक्सबी 5पीओएस या होक्सबी 5नेग पीएचएससी को 1.5 एमएल ट्यूब में सॉर्ट करें। पहली छंटाई में, सॉर्टिंग सटीक मोड से उपज का उपयोग करें।
- स्वचालित सेल जमाव इकाई (एसीडीयू) चरण पर चरण 5.5 में तैयार सहायक कोशिकाओं के साथ 96-वेल प्लेट सेट करें। फ्लो साइटोमीटर के लोडिंग पोर्ट पर चरण 6.2.2 में तैयार 1.5 एमएल कम प्रोटीन बाइंडिंग ट्यूब सेट करें।
- चरण 6.1.3 में सेट गेटिंग रणनीति का उपयोग करके सहायक कोशिकाओं के साथ होक्सबी 5पीओएस या होक्सबी 5नेग पीएचएससी को 96-वेल प्लेट में सॉर्ट करें। अपनी आत्म-नवीकरण क्षमताओं का परीक्षण करने के लिए 10 Hoxb5pos या Hoxb5neg pHSCs को क्रमबद्ध करें।
नोट: शुद्धता बढ़ाने के लिए डबल-सॉर्टिंग की सिफारिश की जाती है। दूसरी छंटाई में, अनुशंसित सॉर्टिंग परिशुद्धता मोड के रूप में शुद्धता का उपयोग करें। - आमतौर पर, 500-1,000 होक्सबी 5पीओएस पीएचएससी और 1,500-4,000 होक्सबी 5नेग पीएचएससी को डबल-सॉर्टिंग के बाद काटा जाता है। सेल व्यवहार्यता (आदर्श रूप से 1-2 घंटे के भीतर) को बढ़ाने के लिए एचएससी छंटाई के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं के साथ आगे बढ़ें।
7. प्रत्यारोपण
- चरण 6.2.4 में तैयार एचएससी-सॉर्टेड, 96-वेल प्लेट को बर्फ पर रखें। बाँझ स्थितियों में एचएससी-क्रमबद्ध, 96-वेल प्लेट को संभालें, आदर्श रूप से सेल हुड में।
- गैस एनेस्थीसिया प्रेरण कक्ष में 2% आइसोफ्लुरेन के साथ एक प्राप्तकर्ता माउस को एनेस्थेटाइज करें। एक बार जब जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज हो जाता है, तो इसे हटा दें, और इसे इसके किनारे पर रखें। पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए, एक हानिकारक उत्तेजना के जवाब में कोई आंदोलन की पुष्टि न करें।
- उचित संज्ञाहरण की पुष्टि के बाद, माउस को होश में आने से रोकने के लिए जितनी जल्दी हो सके रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन करें। रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन में 30 सेकंड से कम समय लगता है।
नोट: चूंकि इंजेक्शन का समय कम है, इसलिए हम आंखों में नेत्र मरहम लगाए बिना प्रक्रिया पूरी करते हैं। हालांकि, अगर प्रक्रिया में अधिक समय लगता है, तो हम नेत्र मरहम के उपयोग की सलाह देते हैं। - एचएससी-सॉर्टेड 96-वेल प्लेट में कोशिकाओं को धीरे से पिपेट करें ताकि उन्हें मिश्रित किया जा सके। 30 ग्राम इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके सॉर्टिंग प्लेट में दाता कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और उन्हें प्राप्तकर्ता चूहों के रेट्रो-ऑर्बिटल शिरापरक जाल में इंजेक्ट करें। अनुशंसित इंजेक्शन की मात्रा ≤ 200 μL है।
- तब तक निरीक्षण करें जब तक कि चूहे होश में न हों और एक साफ पिंजरे में घूम रहे हों। उनकी वसूली की पुष्टि करने के बाद उन्हें उनके पिंजरों में वापस कर दें।
8. परिधीय रक्त विश्लेषण
- पूंछ की नस से परिधीय रक्त के 50 μL एकत्र करें, और इसे 2 mM EDTA के साथ Ca 2+- और Mg2+ मुक्त PBS के 100 μL के साथ फिर से निलंबित करें। सभी नमूनों को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
- लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 200 μL जोड़ें, और 3 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें। एक बार और दोहराएं।
- सेल धुंधला बफर के 200 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें।
- तालिका 2 के अनुसार एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार करें। एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण के 50 μL जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- सेल धुंधला बफर के 150 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें।
- सेल धुंधला बफर के 200 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए 400 x g और 4 °C पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें। सेल स्टेनिंग बफर के 200 μL में पुन: निलंबित करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार विश्लेषण से पहले मृत सेल धुंधला अभिकर्मक जोड़ें।
- प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके परिधीय रक्त चिमेरिज्म का विश्लेषण करें जैसा कि पहलेवर्णित है 16. बहु-वंश पुनर्गठन का पालन करने के लिए प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह, 8 सप्ताह, 12 सप्ताह और 16 सप्ताह में रक्त एकत्र करें। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट चित्रा 3 में प्रदान किए गए हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इससे पहले, प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण परख ों का उपयोग करके आत्म-नवीकरण क्षमता को मापा गया है, जिसमें दाता एचएससी को अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता को बनाए रखने के लिए माना जाता है यदि प्राप्तकर्ता परिधीय रक्त में बहु-वंश दाताकोशिकाएं देखी जाती हैं। इसके अलावा, कई रिपोर्टें एलटी-एचएससी को उन कोशिकाओं के रूप में परिभाषित करती हैं जो दूसरे अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण10,18 के कई महीनों बाद परिधीय रक्त कोशिकाओं का उत्पादन जारी रखती हैं। इसलिए, उनकी आत्म-नवीकरण क्षमताओं की तुलना करने के लिए, होक्सबी 5 रिपोर्टर चूहों से अलग किए गए 10 होक्सबी 5पीओएस या होक्सबी 5नेग पीएचएससी को 2 x 105 पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं के साथ घातक रूप से विकिरणित प्राथमिक प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था। फिर, प्राथमिक प्रत्यारोपण के 16 सप्ताह बाद, प्राथमिक प्राप्तकर्ता चूहों से अलग 1 x 107 अस्थि मज्जा कोशिकाओं को दीर्घकालिक आत्म-नवीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए घातक रूप से विकिरणित द्वितीयक प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया (चित्रा 1)। चित्रा 2 होक्सबी 5-ट्राई-एमचेरी चूहों के अस्थि मज्जा विश्लेषण के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों को दर्शाता है। वंश-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−द्वारा परिभाषित pHSC अंश में लगभग 20%-25% कोशिकाएँ होक्सb5pos pHSC थीं, जो माउस अस्थि मज्जा के केवल 0.001% -0.00125% के लिए जिम्मेदार हैं। चित्रा 3 प्राप्तकर्ता चूहों में परिधीय रक्त विश्लेषण के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट प्रदर्शित करता है। सीडी 45.2 दाता चूहों (होक्सबी 5-ट्राई-एमचेरी चूहों), सीडी 45.1/ सीडी 45.2 सहायक कोशिकाओं और सीडी 45.1 प्राप्तकर्ता चूहों को क्रमशः दाता, सहायक और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं का अलग-अलग विश्लेषण करने के लिए तैयार किया गया था।
चित्रा 4 दाता चिमेरिज्म की पुष्टि करने के लिए प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह, 8 सप्ताह, 12 सप्ताह और 16 सप्ताह में प्राप्तकर्ता चूहों में परिधीय रक्त विश्लेषण दिखाता है। इन विश्लेषणों से पता चला है कि यद्यपि होक्सबी 5 पॉस और होक्सबी 5नेग पीएचएससी प्रत्यारोपण के 4 सप्ताह बाद समान दाता चिमेरिज्म पेश करते हैं, निरंतर हेमटोपोइजिस केवल होक्सबी 5पॉस पीएचएससी प्राप्तकर्ताओं में देखा गया था (चित्रा 4 ए, बी)। दूसरी ओर, होक्सबी 5एनईजी एचएससी ने प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं का उत्पादन करने की क्षमता खोना शुरू कर दिया (चित्रा 4 ए, बी)। द्वितीयक प्रत्यारोपण विश्लेषण में, केवल होक्सबी 5पॉस पीएचएससी प्राप्तकर्ताओं ने मजबूत हेमटोपोइजिस (चित्रा 5 ए, बी) प्रस्तुत किया। इसके विपरीत, होक्सबी 5 नेग पीएचएससी प्राप्तकर्ता चूहों में दाता कोशिकाओं को शायद ही देखा गया था, यह सुझाव देते हुए कि प्राथमिक प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपण के बाद 16 सप्ताह के भीतर होक्सबी 5नेग पीएचएससी अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता खो देते हैं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि होक्सबी 5 अभिव्यक्ति का उपयोग एलटी-एचएससी के लिए एक विशिष्ट मार्कर के रूप में किया जा सकता है।
चित्रा 1: दीर्घकालिक हेमटोपोइएटिक पुनर्गठन परख के लिए प्रयोगात्मक योजनाबद्ध। प्राप्तकर्ता चूहों को घातक रूप से विकिरणित किया गया था और 10 एचएससी और 2 x 105 पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं (सहायक कोशिकाओं) के साथ प्रतिरोपित किया गया था। द्वितीयक प्रत्यारोपण के लिए, प्राथमिक प्राप्तकर्ता चूहों से 1 x 107 पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं को स्थानांतरित किया गया था। संक्षेप: पीबी = परिधीय रक्त; डब्ल्यूबीएम = संपूर्ण अस्थि मज्जा। इस आंकड़े को चेन एट अल.16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: Hoxb5 pos और Hoxb5neg pHSCs को सॉर्ट करने के लिए गेटिंग रणनीति। डबल्स और मृत कोशिकाओं के बहिष्करण के बाद एलकेएस, एफएलके 2−, पीएचएससी, होक्सबी 5पॉस और होक्सबी 5नेग पीएचएससी को अलग करने के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग। मान प्रत्येक अंश के प्रतिशत को इंगित करते हैं ± s.d. (n = 3)। वंशावली में बी 220, सीडी 3, सीडी 4, सीडी 8 ए, जीआर -1 और टेर -119 शामिल हैं। इस आंकड़े को चेन एट अल.16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: प्राप्तकर्ता माउस में परिधीय रक्त के प्रतिनिधि एफएसीएस भूखंड। डबल्स और मृत कोशिकाओं के बहिष्करण के बाद प्राप्तकर्ता माउस में परिधीय रक्त कोशिकाओं (एनके सेल, ग्रैनुलोसाइट, मोनोसाइट, टी सेल और बी सेल) की पहचान करने के लिए गेटिंग योजना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्राथमिक प्रत्यारोपण के बाद प्राप्तकर्ता चूहों में चिमेरिज्म। (ए) 10 होक्सबी 5नेग (एन = 9), होक्सबी 5लो (एन = 13), या होक्सबी 5हाय (एन = 18) पीएचएससी प्राप्त करने वाले प्राथमिक प्राप्तकर्ताओं में 4 सप्ताह, 8 सप्ताह, 12 सप्ताह और 16 सप्ताह में प्रतिशत चिमेरिज्म। प्रत्येक स्तंभ एक व्यक्तिगत माउस का प्रतिनिधित्व करता है। Hoxb5hi अंश को Hoxb5 अभिव्यक्ति के शीर्ष 5% के रूप में परिभाषित किया गया था और अन्य को Hoxb5lo अंश के रूप में परिभाषित किया गया था। (बी) 10 सेल प्राथमिक प्रत्यारोपण में औसत दाता वंश योगदान। त्रुटि पट्टियाँ s.d को निरूपित करती हैं. इस आंकड़े को चेन एट अल.16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: द्वितीयक प्रत्यारोपण के बाद प्राप्तकर्ता चूहों में चिमेरिज्म। (ए) पूरे अस्थि मज्जा माध्यमिक प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह, 8 सप्ताह, 12 सप्ताह और 16 सप्ताह में प्रतिशत चिमेरिज्म। (बी) पूरे अस्थि मज्जा माध्यमिक प्राप्तकर्ताओं में वंश द्वारा व्यक्तिगत दाता चिमेरिज्म। प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्तिगत माउस का प्रतिनिधित्व करती है। इस आंकड़े को चेन एट अल.16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| रोग-प्रतिकारक | क्लोन | एकाग्रता | फ्लोरोक्रोम |
| Flk-2 | A2-F10 | 4 μg/mL | perCP/eFlor710 |
| CD150 | TC15-12F12.2 | 4 μg/mL | BV421 |
| CD11b | M1/70 | 4 μg/mL | BV711 |
| SCA-1 | D7 | 4 μg/mL | BUV395 |
| CD16/32 | 93 | 4 μg/mL | A-700 |
| CD127 | A7R34 | 4 μg/mL | A-700 |
| CD3ε | 145-2C11 | 10 μg/mL | बायोटिन |
| CD4 | GK1.5 | 10 μg/mL | बायोटिन |
| CD8a | 53-6.7 | 10 μg/mL | बायोटिन |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 10 μg/mL | बायोटिन |
| B220 | RA3-6B2 | 10 μg/mL | बायोटिन |
| Ter119 | TER119 | 10 μg/mL | बायोटिन |
तालिका 1: हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल धुंधला होने के लिए एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण।
| रोग-प्रतिकारक | क्लोन | एकाग्रता | फ्लोरोक्रोम |
| CD45.1 | A20 | 1 μg/mL | एफआईटीसी |
| CD45.2 | 104 | 1 μg/mL | पीई |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 2.5 μg/mL | A700 |
| NK1.1 | PK136 | 1 μg/mL | PerCP-Cyanine 5.5 |
| CD11b | M1/70 | 1 μg/mL | BUV395 |
| CD3ε | 145-2C11 | 1 μg/mL | BV421 |
| TCRβ | H57-597 | 1 μg/mL | BV421 |
| B220 | RA3-6B2 | 1 μg/mL | BV786 |
तालिका 2: परिधीय रक्त कोशिका धुंधला होने के लिए एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
परंपरागत रूप से, सेल सतह मार्कर-परिभाषित एचएससी को एचएससी के कार्यों का अध्ययन करने के लिए तैयार किया गया है, जैसे कि आत्म-नवीकरण क्षमता और बहु-शक्ति 19,20,21। हालांकि, इम्यूनोफेनोटाइपिक रूप से परिभाषित (वंश-सी-किट + एससीए -1 + सीडी 150 + सीडी 34−/ लोएफएलके 2−) एचएससी अंश में दो असतत एचएससी आबादी शामिल हैं: एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी 9,10। इसलिए, बोनाफाइड एचएससी, एलटी-एचएससी का विशिष्ट विश्लेषण अभी तक हासिल नहीं किया गया है। तदनुसार, होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके एलटी-एचएससी के लिए एक अलगाव विधि आत्म-नवीकरण क्षमता के आणविक तंत्र की खोज को काफी लाभ पहुंचाएगी।
यहां, हम इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा करेंगे। सबसे पहले, चरण 1 से चरण 7 को बिना किसी रुकावट के पूरा करने की आवश्यकता है। इन चरणों में आमतौर पर 9-12 घंटे लगते हैं, और नमूना व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, इन प्रक्रियाओं के दौरान नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना महत्वपूर्ण है। इसके बाद, लगभग 1 x 108 अस्थि मज्जा कोशिकाओं को एक माउस से काटा जाता है। इस प्रकार, हमें धुंधला प्रदर्शन को पुन: पेश करने के लिए पर्याप्त मात्रा में एंटीबॉडी का उपयोग करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, सीडी 34 एंटीजन (क्लोन) के लिए एंटीबॉडी; RAM34) को पर्याप्त धुंधला होने के लिए 90 मिनट की आवश्यकता होती है, जबकि अन्य एंटीबॉडी के लिए 30 मिनट पर्याप्त है। दूसरा, विकिरण आमतौर पर प्राप्तकर्ता चूहों में पैनसाइटोपेनिया का कारण बनता है। यदि प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल कई प्राप्तकर्ता चूहों में बने रहते हैं, तो यह इंगित करता है कि विकिरण की खुराक अपर्याप्त थी। ऐसे मामले में, विकिरण खुराक के अनुकूलन की सिफारिश की जाती है। तीसरा, यदि प्रत्यारोपण के तुरंत बाद अधिकांश चूहे मर जाते हैं, तो दो संभावित स्पष्टीकरण हैं: सहायक कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या या असफल रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन।
दशकों से, यह विवादास्पद रहा है कि बोनाफाइड एचएससी अंश सजातीय है या विषम22,23,24। इस अध्ययन में, होक्सबी 5पॉस पीएचएससी प्रत्यारोपण प्राप्त करने वाले प्राप्तकर्ता चूहों ने विभिन्न दाता चिमेरा और भेदभाव पैटर्न (चित्रा 4 ए) प्रस्तुत किए, यह दर्शाता है कि यह अंश विषम हो सकता है। हालांकि, ये उतार-चढ़ाव सहायक कोशिकाओं के रूप में अशुद्ध अस्थि मज्जा कोशिकाओं के उपयोग औरव्यक्तिगत चूहों की विभिन्न रेडियो-संवेदनशीलता दोनों के कारण हो सकते हैं।
सारांश में, हमने होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी के अलगाव के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है। आज तक, एलटी-एचएससी का पता लगाना प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण परख पर निर्भर करता है, जिसके लिए 8 महीने से अधिक की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम हमें एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी दोनों को भावी प्रभाव से पहचानने और विभिन्न कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए उनका उपयोग करने में सक्षम बनाता है। चित्रा 4 और चित्रा 5 यह भी दिखाते हैं कि होक्सबी 5 अभिव्यक्ति स्तर दूसरे प्राप्तकर्ता चूहों में दाता चिमेरिज्म की डिग्री के साथ सहसंबद्ध प्रतीत होता है। इसके अतिरिक्त, होक्सबी 5 रिपोर्टर प्रणाली का लाभ उठाते हुए, हमने पहले खुलासा किया था कि एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल प्रत्यारोपण26 के बाद निरंतर हेमटोपोइएटिक पुनर्गठन के लिए पूरक फैशन में काम करते हैं। इसके अलावा, हमने प्रदर्शित किया कि बहिर्जात होक्सबी 5 अभिव्यक्ति आंशिक रूप से एसटी-एचएससी के सेल भाग्य को एलटी-एचएससी में उलट सकती है, यह दर्शाता है कि होक्सबी 5 की उपस्थिति या अनुपस्थिति सेल सतह मार्कर-परिभाषित एचएससी अंश27 में आत्म-नवीकरण क्षमता की विविधता की व्याख्या करती है।
इन निष्कर्षों के अलावा, एलटी-एचएससी का संभावित अलगाव हमें विभिन्न शारीरिक स्थितियों, जैसे उम्र बढ़ने, सूजन, और इतने पर एलटी-एचएससी का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। ये विश्लेषण एलटी-एचएससी के कार्यों की समझ को बहुत सुविधाजनक बनाएंगे।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक ों ने इस अध्ययन से जुड़े हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
हम जानवरों की देखभाल के लिए और रिकेन बीडीआर में प्राप्तकर्ता चूहों के साथ-साथ कोबे विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला प्रबंधन के लिए हितोमी ओगा, कायोको नागासाका और मासाकी मियाहाशी प्रदान करने के लिए कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं। लेखक भी इस काम के लिए चल रहे समर्थन की बहुत सराहना करते हैं। मसानोरी मियानिशी को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) काकेन्ही ग्रांट नंबर जेपी 17के07407 और जेपी 20एच03268, मोचिदा मेमोरियल फाउंडेशन फॉर मेडिकल एंड फार्मास्यूटिकल रिसर्च, द लाइफ साइंस फाउंडेशन ऑफ जापान, द टाकेडा साइंस फाउंडेशन, द एस्टेलस फाउंडेशन फॉर रिसर्च ऑन मेटाबोलिक डिसऑर्डर, और एएमईडी-प्राइम, एएमईडी द्वारा अनुदान संख्या जेपी 18 जीएम 6110020 के तहत समर्थित किया गया था। तारो साकमकी JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP21K20669 और JP22K16334 द्वारा समर्थित है और द्वारा समर्थित था जेएसपीएस कोर-टू-कोर प्रोग्राम और रिकेन जूनियर रिसर्च एसोसिएट प्रोग्राम। कात्सुयुकी निशि को जेएसपीएस ग्रांट नंबर काकेन्ही जेपी 18 जे 13408 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
