Summary
Vi presenterar ett steg-för-steg-protokoll för isolering av långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC) och kortvariga HSC (ST-HSC) med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet.
Abstract
Självförnyelsekapacitet och differentieringspotential för flera linjer betraktas allmänt som de definierande egenskaperna hos hematopoetiska stamceller (HSC). Många studier har dock föreslagit att funktionell heterogenitet finns i HSC-facket. Nya encellsanalyser har rapporterat HSC-kloner med olika cellöden inom HSC-facket, som kallas partiska HSC-kloner. Mekanismerna bakom heterogena eller dåligt reproducerbara resultat är lite förstådda, särskilt när det gäller längden på självförnyelse när renade HSC-fraktioner transplanteras genom konventionell immunfärgning. Att fastställa en reproducerbar isoleringsmetod för långsiktiga HSC (LT-HSC) och kortvariga HSC (ST-HSC), definierad av längden på deras självförnyelse, är därför avgörande för att lösa denna fråga. Med hjälp av opartisk flerstegsscreening identifierade vi en transkriptionsfaktor, Hoxb5, som kan vara en exklusiv markör för LT-HSC i musens hematopoetiska system. Baserat på detta resultat etablerade vi en Hoxb5-rapportmuslinje och isolerade framgångsrikt LT-HSC och ST-HSC. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för isolering av LT-HSC och ST-HSC med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet . Denna isoleringsmetod kommer att hjälpa forskare att bättre förstå mekanismerna för självförnyelse och den biologiska grunden för sådan heterogenitet i HSC-facket.
Introduction
Hematopoetiska stamceller (HSC), som har självförnyelsekapacitet och multipotens, ligger vid toppen av den hematopoetiska hierarkin 1,2. År 1988 visade Weissman och kollegor för första gången att isoleringen av mus HSC kunde uppnås med hjälp av flödescytometri3. Därefter rapporterades en fraktion definierad av en kombination av cellytemarkörer, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 - / loFlk2 −, innehålla alla HSC i möss 4,5,6,7,8.
Immunofenotypiskt definierade (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC (nedan kallade pHSC) ansågs tidigare vara funktionellt homogena. Nya encellsanalyser har dock visat att pHSC fortfarande uppvisar heterogenitet med avseende på deras självförnyelsekapacitet 9,10 och multipotens11,12. Specifikt verkar två populationer existera i pHSC-fraktionen med avseende på deras självförnyelsekapacitet: långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC), som har kontinuerlig självförnyelsekapacitet, och kortvariga hematopoetiska stamceller (ST-HSC), som har övergående självförnyelsekapacitet 9,10.
Hittills är de molekylära mekanismerna för självförnyelsekapacitet som skiljer LT-HSC och ST-HSC fortfarande dåligt förstådda. Det är viktigt att isolera båda cellpopulationerna baserat på deras självförnyelsekapacitet och att upptäcka underliggande molekylära mekanismer. Flera rapportsystem har också införts för att rena LT-HSCs13,14,15; LT-HSC-renheten som definieras av varje rapportörsystem är dock variabel, och exklusiv LT-HSC-rening har hittills inte uppnåtts.
Att utveckla ett isoleringssystem för LT-HSC och ST-HSC kommer därför att påskynda forskningen om självförnyelsekapacitet i pHSC-fraktionen. I isoleringen av LT-HSC och ST-HSC identifierade en studie med flerstegs, opartisk screening en enda gen, Hoxb5, som heterogent uttrycks i pHSC-fraktion16. Dessutom avslöjade benmärgsanalys av Hoxb5-reportermössen att cirka 20% -25% av pHSC-fraktionen består av Hoxb5 pos-celler. En kompetitiv transplantationsanalys med Hoxb5 pos pHSC och Hoxb5 neg pHSC avslöjade att endast Hoxb5pos pHSC har långsiktig självförnyelsekapacitet, medan Hoxb5neg pHSC förlorar sin självförnyelsekapacitet inom en kort period, vilket indikerar att Hoxb5 identifierar LT-HSC i pHSC-fraktionen16.
Här demonstrerar vi ett steg-för-steg-protokoll för att isolera LT-HSC och ST-HSC med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet . Dessutom presenterar vi en kompetitiv transplantationsanalys för att bedöma självförnyelsekapaciteten hos Hoxb5pos/neg pHSC (figur 1). Detta Hoxb5-rapportsystem gör det möjligt för oss att prospektivt isolera LT-HSC och ST-HSC och bidrar till förståelsen av LT-HSC-specifika egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs godkändes av RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Förkonditionering av mottagarmössen
- Förbered möss av typen C57BL / 6 av hankön i åldern 8-10 veckor som mottagarmöss. Antalet mottagarmöss beror på experimentprotokollet. Vi förbereder vanligtvis 10-20 möss för varje tillstånd.
- Mata mössen med steriliserat vatten kompletterat med enrofloxacin (170 mg/l). Eftersom bestrålade mottagarmöss är mycket mottagliga för infektion, håll burarna så rena som möjligt.
OBS: Tillskott med antibiotika börjar 24 timmar före bestrålningen och fortsätter i 3 veckor efter transplantation för att undvika infektioner.
- Mata mössen med steriliserat vatten kompletterat med enrofloxacin (170 mg/l). Eftersom bestrålade mottagarmöss är mycket mottagliga för infektion, håll burarna så rena som möjligt.
- Total bestrålning av kroppen
- Total kroppsbestrålning förstör de mottagande benmärgscellerna för att säkerställa engraftment av givarcellerna. Överför mottagarmössen till en bestrålningsbur. Låt bestråla mottagarmössen med en enstaka dos på 8,7 Gy vid 12-16 h före transplantation.
OBS: Stråldosen och tiden kan variera beroende på utrustningen. Den dödliga stråldosen bör bekräftas med forskarens bestrålnings- och musstam. - Återför dem till sina burar efter den totala kroppsbestrålningen.
- Total kroppsbestrålning förstör de mottagande benmärgscellerna för att säkerställa engraftment av givarcellerna. Överför mottagarmössen till en bestrålningsbur. Låt bestråla mottagarmössen med en enstaka dos på 8,7 Gy vid 12-16 h före transplantation.
2. Insamling av donatorbenmärgsceller
- Förbered en Hoxb5-tri-mCherry-mus som är 12 veckor gammal och avliva musen genom CO2-exponering följt av cervikal dislokation eller med metoder som godkänts av den lokala djuretiska kommittén.
Reagensvolymen per mus beskrivs i följande steg. - Under sterila förhållanden, ta bort huden och exponera benen (lårben, tibia, bäcken, humerus). Skär de stora musklerna och ta benen (lårbenet, skenbenet, bäckenet, humerus) från musen. Lägg dem i sterila cellodlingsskålar med Ca 2+- och Mg2+-fri, iskall PBS.
- Trimma musklerna och fibrösa vävnader från benen med pincett, liten sax och våtservetter för att förhindra kontaminering. Var försiktig så att du inte bryter benen under detta steg. Kassera eventuella brutna ben för att upprätthålla sterilitet.
- Sterilisera en mortel och stöt med 70% etanol (EtOH) och låt dem torka helt. Jämvikt med cellfärgningsbuffert (Ca 2+- och Mg2+-fri PBS kompletterad med 2% värmeinaktiverad FBS, 2 mM EDTA, 100 E/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin).
- Lägg benen i morteln och tillsätt 3 ml cellfärgningsbuffert. Krossa benen öppna med stöten. Separera cellklumparna genom försiktig pipettering och överför cellsuspensionen genom en 100 μm cellsil till ett 50 ml rör.
- Upprepa steg 2.5 tills lösningen är klar. Vanligtvis räcker det med tre gånger.
3. Separation av c-kit + -cellerna genom magnetisk sortering
- Antikroppsfärgning för magnetisk sortering
- Centrifugera proverna vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml cellfärgningsbuffert. Tillsätt 10 μl rått-IgG (5 mg/ml) för att minska icke-specifik antikroppsbindning och pipettera försiktigt upp och ner med en P1 000-pipett. Inkubera på is i 15 min.
- Tillsätt c-Kit-antikroppen (klon 2B8) i en koncentration av 4 μg/ml och blanda med en P1 000-pipett. Inkubera på is i 15 min.
- Tillsätt 5 ml cellfärgningsbuffert och blanda väl. Centrifugera proverna vid 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 500 μL cellfärgningsbuffert.
- Tillsätt 35 μL anti-APC-mikrokulor för att berika c-Kit+ -cellerna och blanda med en P1 000-pipett. Inkubera på is i 15 min.
- Tillsätt 4-5 ml cellfärgningsbuffert. Centrifugera proverna vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml cellfärgningsbuffert.
- Sortera c-Kit+ -cellerna magnetiskt
- Följ tillverkarens instruktioner för att sortera cellerna. Kort sagt, prima en magnetisk sorteringskolonn med 3 ml cellfärgningsbuffert. Filtrera provet (1 ml) genom en 40 μm cellsil och ladda provet på den magnetiska sorteringskolonnen.
- Tvätta genom att tillsätta 3 ml cellfärgningsbuffert tre gånger. Lägg bara till cellfärgningsbufferten när kolonnbehållaren är tom.
- Sätt den magnetiska sorteringskolonnen ovanpå ett iskallt 15 ml rör och tillsätt 5 ml cellfärgningsbuffert. Spola ut cellerna genom att trycka in kolven ordentligt i kolonnen. Håll genomströmningen på is.
OBS: Vid oavsiktlig provförlust behåller vi genomströmningen till slutet av experimentet.
4. Färgning av hematopoetiska stamceller
- Centrifugera provet som beretts i steg 3.2.3 vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter. Aspirera supernatanten.
- Tillsätt CD34-antikroppen (klon RAM34) i en koncentration av 50 μg/ml till pelleten och inkubera på is i 60 minuter.
OBS: Förberedelse av stödcellerna under den första timmen av inkubation med CD34 rekommenderas för att förkorta bearbetningstiden. - Bered antikroppsmasterblandningen enligt tabell 1. Tillsätt 100 μl av masterblandningen till provet och inkubera på is i 30 minuter. Antikroppen för CD34-antigenet (klon; RAM34) kräver 90 min för tillräcklig färgning.
- Tillsätt 4-5 ml cellfärgningsbuffert. Centrifugera provet vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter. Aspirera supernatanten. Tillsätt streptavidin-BUV737 i en koncentration av 3 μg/ml till pelleten och inkubera på is i 30 minuter.
- Tillsätt 4-5 ml cellfärgningsbuffert. Centrifugera provet vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 400 μL cellfärgningsbuffert. Håll provet på is.
5. Stödjande cellberedning
- Förbered en CD45.1 + CD45.2 + kongen mus i åldern 12 veckor gammal; Helst bör detta vara samma ålder som donatormusen. Avliva musen genom CO2-exponering följt av cervikal dislokation eller med metoder som godkänts av den lokala djuretiska kommittén.
OBS: I det angivna exemplet föddes CD45.1 + CD45.2 + kongena möss internt genom att korsa B6. CD45.1 kongena möss med C57BL/6J möss16. - Under sterila förhållanden, ta både lårben och skenben och placera dem i sterila cellodlingsskålar med Ca 2+- och Mg2+-fri, iskall PBS. Trimma musklerna och fibrösa vävnader från benen med pincett och liten sax.
- Skär båda ändarna av benen med vass, steril sax. Använd en 23 G nål och en 5 ml spruta fylld med iskall cellsuspensionsbuffert (Ca 2+- och Mg2+-fri PBS kompletterad med 2% värmeinaktiverad FBS, 100 E/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin) för att spola ut benmärgen i en steril cellodlingsskål med cellsuspensionsbuffert. Dela upp cellklumparna genom försiktig pipettering.
- Filtrera cellsuspensionen genom en 40 μm cellsil med hjälp av en P1 000-pipett. Räkna cellnumret på cellsuspensionen med hjälp av en hemocytometer och bereda en benmärgscellssuspension innehållande 1 x 106 celler/ml.
- Överför 200 μL benmärgscellssuspension (2 x 105 celler) till en rundbottenplatta med 96 brunnar. Håll på is tills användning.
OBS: Rundbottenplattor rekommenderas för enkel cellinsamling.
6. Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC sortering
- Inställning av grind
- Överför 400 μl av det prov som beretts i steg 4.5 till ett provrör av rundbottnad polystyren med ett 35 μm siligt skyddslock. Bered färgningsreagens med döda celler och tillsätt det till provet före analysen enligt tillverkarens anvisningar.
- Slå på en flödescytometer och starta analysprogramvaran enligt tillverkarens instruktioner. Tryck sedan på Läs in och hämta data.
OBS: En flödescytometer utrustad med fem lasrar och ett 70 μm munstycke rekommenderas för att förbättra renheten hos de sorterade cellerna. - När du har uteslutit dubbletter, döda celler och härstamningspositiva celler grindar du Lineage-c-Kit+Sca-1+-fraktionen. Därefter grinda ut Flk2 + -fraktionen. Därefter grind Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSCs i CD150 + CD34 − / låg fraktion (figur 2). Utför kompensation för spektralöverlappningen i det första experimentet.
OBS: Hoxb5-positiva celler förväntas representera 20% -25% av Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 - / lågFlk2 − fraktion.
- Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC sortering
- Bered ett 1,5 ml lågproteinbindande rör med 600 μLCa2+- och Mg2+ -fritt PBS kompletterat med 10% värmeinaktiverat FBS.
- Ställ in 1,5 ml lågproteinbindningsröret på en sorteringsuppsamlingsenhet och sortera Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC i 1,5 ml röret med grindstrategin som anges i steg 6.1.3. I den första sorteringen använder du utbytet från sorteringsprecisionsläget.
- Ställ in 96-brunnsplattan med stödcellerna förberedda i steg 5.5 på steget automatiserad cellavsättningsenhet (ACDU). Ställ in det 1,5 ml lågproteinbindande röret som beretts i steg 6.2.2 på laddningsporten på en flödescytometer.
- Sortera Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSCs i en 96-brunnsplatta med stödcellerna med hjälp av grindstrategin som anges i steg 6.1.3. Sortera 10 Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC för att testa deras självförnyelsekapacitet.
OBS: Dubbelsortering rekommenderas för att förbättra renheten. I den andra sorteringen använder du renhet som rekommenderat sorteringsprecisionsläge. - Vanligtvis skördas 500-1 000 Hoxb5pos pHSC och 1 500-4 000 Hoxb5neg pHSC efter dubbelsortering. Fortsätt med transplantationsprocedurerna så snart som möjligt efter HSC-sorteringen för att förbättra cellviabiliteten (helst inom 1-2 timmar).
7. Transplantation
- Placera den HSC-sorterade plattan med 96 brunnar som förberetts i steg 6.2.4 på is. Hantera den HSC-sorterade plattan med 96 brunnar under sterila förhållanden, helst i en cellhuv.
- Bedöva en mottagarmus med 2% isofluran i en gasanestesiinduktionskammare. När djuret är helt bedövat, ta bort det och placera det på sin sida. För att säkerställa tillräcklig anestesi, bekräfta ingen rörelse som svar på en skadlig stimulans.
- Efter bekräftelse av korrekt anestesi, utför en retro-orbital injektion så snart som möjligt för att förhindra att musen återfår medvetandet. Den retroorbitala injektionen tar mindre än 30 s.
OBS: Eftersom injektionstiden är kort avslutar vi proceduren utan att applicera oftalmisk salva i ögonen. Men om proceduren tar längre tid rekommenderar vi användning av oftalmisk salva. - Pipettera försiktigt cellerna i den HSC-sorterade 96-brunnsplattan för att blanda dem. Samla upp donatorcellerna i sorteringsplattan med en 30 G insulinspruta och injicera dem i retroorbital venös plexus hos mottagarmössen. Rekommenderad injicerbar volym är ≤200 μl.
- Observera tills mössen är medvetna och rör sig i en ren bur. Återför dem till sina burar efter att ha bekräftat deras återhämtning.
8. Perifer blodanalys
- Samla upp 50 μl perifert blod från svansvenen och resuspendera det med 100 μLCa2+- och Mg2+-fritt PBS med 2 mM EDTA. Överför alla prover till en platta med 96 brunnar. Centrifugera vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter och kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μl röd blodkroppslysbuffert och inkubera på is i 3 minuter. Centrifugera proverna vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter och kassera supernatanten. Upprepa en gång till.
- Tillsätt 200 μL cellfärgningsbuffert. Centrifugera proverna vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter och kassera supernatanten.
- Bered antikroppsmasterblandning enligt tabell 2. Tillsätt 50 μl antikroppsmasterblandning och inkubera på is i 30 minuter.
- Tillsätt 150 μL cellfärgningsbuffert. Centrifugera proverna vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter och kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μL cellfärgningsbuffert. Centrifugera proverna vid 400 x g och 4 °C i 5 minuter och kassera supernatanten. Återsuspendera i 200 μl cellfärgningsbuffert och tillsätt dött cellfärgningsreagens före analysen enligt tillverkarens anvisningar.
- Analysera perifer blodchimärism med hjälp av en flödescytometer som beskrivits tidigare16. Samla blod vid 4 veckor, 8 veckor, 12 veckor och 16 veckor efter transplantation för att följa rekonstituering av flera linjer. Representativa flödescytometridiagram visas i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidigare har självförnyelsekapaciteten mätts med hjälp av kompetitiva transplantationsanalyser, där donator-HSC tros behålla sin självförnyelsekapacitet endast om flerlinjegivarceller i mottagarens perifera blod observeras17. Dessutom definierar flera rapporter LT-HSC som celler som fortsätter att producera perifera blodkroppar flera månader efter den andra benmärgstransplantationen10,18. För att jämföra deras självförnyelseförmåga transplanterades därför 10 Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC isolerade från Hoxb5 reportermöss till lethally bestrålade primära mottagarmöss med 2 x 105 hela benmärgsceller. Sedan, 16 veckor efter den primära transplantationen, transplanterades 1 x 107 benmärgsceller isolerade från de primära mottagarmössen till lethally bestrålade sekundära mottagarmöss för att bedöma den långsiktiga självförnyelsekapaciteten (figur 1). Figur 2 visar representativa flödescytometridiagram för benmärgsanalysen hos Hoxb5-tri-mCherry-mössen. Cirka 20% -25% av cellerna i pHSC-fraktionen definierad av Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 - / loFlk2 − var Hoxb5pos pHSC, som står för endast 0,001% -0,00125% av musbenmärgen. Figur 3 visar representativa flödescytometridiagram för perifer blodanalys hos mottagarmössen. CD45.2-donatormössen (Hoxb5-tri-mCherry-möss), CD45.1/CD45.2-stödcellerna respektive CD45.1-mottagarmössen förbereddes för att separat analysera givar-, stöd- och mottagarcellerna.
Figur 4 visar perifera blodanalyser hos mottagarmössen vid 4 veckor, 8 veckor, 12 veckor och 16 veckor efter transplantation för att bekräfta donatorchimärism. Dessa analyser visade att även om Hoxb5 pos och Hoxb5neg pHSC uppvisar liknande donatorchimärism 4 veckor efter transplantation, observerades kontinuerlig hematopoes endast hos Hoxb5pos pHSC-mottagare (figur 4A,B). Å andra sidan började Hoxb5neg HSCs förlora förmågan att producera hematopoetiska celler 8 veckor efter transplantation (figur 4A, B). I den sekundära transplantationsanalysen uppvisade endast Hoxb5pos pHSC-mottagarna robust hematopoes (figur 5A,B). Däremot observerades donatorceller knappast hos Hoxb5 neg pHSC-mottagarmöss, vilket tyder på att Hoxb5neg pHSC förlorar sin självförnyelseförmåga inom 16 veckor efter transplantation hos primära mottagarmöss. Dessa data visar att Hoxb5-uttryck kan användas som en specifik markör för LT-HSC.
Figur 1: Experimentell schematisk för långsiktiga hematopoetiska rekonstitueringsanalyser. De mottagande mössen bestrålades dödligt och transplanterades kompetitivt med 10 HSC och 2 x 105 hela benmärgsceller (stödjeceller). För sekundära transplantationer överfördes 1 x 107 hela benmärgsceller från de primära mottagarmössen. Förkortningar: PB = perifert blod; WBM = hel benmärg. Denna siffra har modifierats från Chen et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Gating-strategi för sortering av Hoxb5pos och Hoxb5neg pHSC. Representativ flödescytometri grind för att isolera LKS, Flk2−, pHSC, Hoxb5pos och Hoxb5neg pHSC efter uteslutning av dubbletter och döda celler. Värdena anger procentandelen av varje fraktion ± s.d. (n = 3). Släktlinjerna inkluderar B220, CD3ε, CD4, CD8a, Gr-1 och Ter-119. Denna siffra har modifierats från Chen et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa FACS-diagram över perifert blod i en mottagarmus. Gating schema för att identifiera perifera blodkroppar (NK-cell, granulocyt, monocyt, T-cell och B-cell) i en mottagarmus efter uteslutning av dubletter och döda celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Chimerism hos mottagarmöss efter primärtransplantation. (A) Procentuell chimärism vid 4 veckor, 8 veckor, 12 veckor och 16 veckor hos primära mottagare som fick 10 Hoxb5neg (n = 9), Hoxb5lo (n = 13) eller Hoxb5hi (n = 18) pHSC. Varje kolumn representerar en enskild mus. Hoxb5hi-fraktionen definierades som de översta 5% av Hoxb5-uttrycket och andra som Hoxb5-lo-fraktionen. (B) Det genomsnittliga bidraget från donatorns härstamning vid 10 celltransplantationer. Felstaplarna anger s.d. Denna siffra har modifierats från Chen et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Chimärism hos mottagarmössen efter sekundär transplantation. (A) Procentuell chimärism vid 4 veckor, 8 veckor, 12 veckor och 16 veckor efter sekundär transplantation av hela benmärgen. (B) Individuell donatorchimärism efter härstamning i sekundära mottagare av hela benmärgen. Varje rad representerar en enskild mus. Denna siffra har modifierats från Chen et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Antikropp | Klon | Koncentration | Fluorokromer |
| FLK-2 | A2-F10 | 4 μg/ml | PerCP/eFlour710 |
| CD150 | TC15-12F12.2 | 4 μg/ml | BV421 |
| CD11b | M1/70 | 4 μg/ml | BV711 |
| SCA-1 | D7 | 4 μg/ml | BUV395 |
| CD16/32 | 93 | 4 μg/ml | A-700 |
| CD127 | A7R34 | 4 μg/ml | A-700 |
| CD3ε | 145-2C11 | 10 μg/ml | Biotin |
| CD4 | GK1.5 | 10 μg/ml | Biotin |
| CD8a | 53-6.7 | 10 μg/ml | Biotin |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 10 μg/ml | Biotin |
| B220 | RA3-6B2 | 10 μg/ml | Biotin |
| Ter119 | TER119 | 10 μg/ml | Biotin |
Tabell 1: Antikroppsmasterblandning för hematopoetisk stamcellsfärgning.
| Antikropp | Klon | Koncentration | Fluorokromer |
| CD45.1 | A20 | 1 μg/ml | FITC |
| CD45.2 | 104 | 1 μg/ml | PE |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 2,5 μg/ml | A700 |
| NK1.1 | PK136 | 1 μg/ml | PerCP-cyanin5,5 |
| CD11b | M1/70 | 1 μg/ml | BUV395 |
| CD3ε | 145-2C11 | 1 μg/ml | BV421 |
| TCRβ | H57-597 | 1 μg/ml | BV421 |
| B220 | RA3-6B2 | 1 μg/ml | BV786 |
Tabell 2: Antikroppsmasterblandning för färgning av perifera blodkroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionellt har cellytemarkördefinierade HSC utarbetats för att studera HSC: s funktioner, såsom självförnyelsekapacitet och multipotens 19,20,21. Den immunofenotypiskt definierade (Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-fraktionen innehåller emellertid två diskreta HSC-populationer: LT-HSC och ST-HSCs 9,10. Därför har den specifika analysen av bonafid HSC, LT-HSCs, ännu inte uppnåtts. Följaktligen kommer en isoleringsmetod för LT-HSC som använder Hoxb5-rapportsystemet avsevärt att gynna sökandet efter de molekylära mekanismerna för självförnyelsekapacitet.
Här kommer vi att diskutera kritiska steg i detta protokoll. Först måste steg 1 till steg 7 slutföras utan avbrott. Dessa steg tar vanligtvis 9-12 timmar, och det är viktigt att hålla proverna vid 4 ° C under hela dessa procedurer, så mycket som möjligt, för att bibehålla provets livskraft. Därefter skördas cirka 1 x 108 benmärgsceller från en mus. Således måste vi använda en tillräcklig volym antikroppar för att reproducera färgningsprestandan. Dessutom har antikroppen för CD34-antigenet (klon; RAM34) kräver 90 min för tillräcklig färgning, medan 30 min räcker för andra antikroppar. För det andra orsakar bestrålning vanligtvis pancytopeni hos mottagarmössen. Om neutrofiler som härrör från mottagaren kvarstår hos många mottagarmöss indikerar detta att stråldosen var otillräcklig. I ett sådant fall rekommenderas optimering av stråldosen. För det tredje, om de flesta mössen dör strax efter transplantationen, finns det två möjliga förklaringar: ett otillräckligt antal stödceller eller misslyckad retroorbital injektion.
I årtionden har det varit kontroversiellt om den bonafida HSC-fraktionen är homogen eller heterogen22,23,24. I denna studie presenterade mottagarmössen som fick Hoxb5pos pHSC-transplantationen olika donatorchimärer och differentieringsmönster (figur 4A), vilket indikerar att denna fraktion kan vara heterogen. Dessa fluktuationer kan dock orsakas både av användningen av orenade benmärgsceller som stödjeceller och de olika radiokänsligheterna hos enskilda möss25.
Sammanfattningsvis har vi demonstrerat ett steg-för-steg-protokoll för isolering av LT-HSC och ST-HSC med Hoxb5-rapportsystemet. Hittills har detektionen av LT-HSC varit beroende av den kompetitiva transplantationsanalysen, som kräver mer än 8 månader. Däremot gör Hoxb5-rapportsystemet det möjligt för oss att identifiera både LT-HSC och ST-HSC prospektivt och använda dem för olika funktionella analyser. Figur 4 och figur 5 visar också att Hoxb5-uttrycksnivån verkar vara korrelerad med graden av donatorchimärism hos den andra mottagarmössen. Genom att utnyttja Hoxb5-rapportsystemet avslöjade vi tidigare att LT-HSC och ST-HSC fungerar på ett komplementärt sätt för kontinuerlig hematopoetisk rekonstitution efter hematopoetisk stamcellstransplantation26. Dessutom visade vi att exogent Hoxb5-uttryck delvis kunde vända cellödet för ST-HSC till det för LT-HSC, vilket indikerar att närvaron eller frånvaron av Hoxb5 förklarar heterogeniteten av självförnyelseförmåga i den cellytemarkördefinierade HSC-fraktionen27.
Utöver dessa fynd tillåter den potentiella isoleringen av LT-HSC oss att analysera LT-HSC under olika fysiologiska förhållanden, såsom åldrande, inflammation och så vidare. Dessa analyser kommer i hög grad att underlätta förståelsen av LT-HSCs funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter i samband med denna studie.
Acknowledgments
Vi tackar Hiroshi Kiyonari för djurvården och för att ge mottagarmöss på RIKEN BDR, liksom Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka och Masaki Miyahashi för laboratoriehantering vid Kobe University. Författarna uppskattar också det pågående stödet för detta arbete. Masanori Miyanishi stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-bidragsnummer JP17K07407 och JP20H03268, Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, Life Science Foundation of Japan, Takeda Science Foundation, Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders och AMED-PRIME, AMED under bidragsnummer JP18GM6110020. Taro Sakamaki stöds av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 och JP22K16334 och stöddes av JSPS Core-to-Core-programmet och RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi stöddes av JSPS bidragsnummer KAKENHI JP18J13408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
