Summary
זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.
Abstract
זרימת סידן בתגובה לגירוי קולטן תאי T היא מדד נפוץ של איתות תאי T. מספר צבעי מחוון סידן פותחו כדי להעריך איתות סידן על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פסים. פרוטוקול זה נועד למדוד תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. סך כל הטחול מסומן בצבע אינדיקטור הסידן היחסי Indo-1, יחד עם פאנל של נוגדנים מצומדים פלואורוכרום למולקולות פני התא. מינוף היכולות של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מספק פלטפורמה לשימוש במגוון רחב של כתמים על פני התא בשילוב עם Indo-1. לאחר מכן תאים מנותחים בזמן אמת ב 37 ° C לפני ואחרי תוספת של נוגדן אנטי CD3 כדי לעורר את קולטן תא T. לאחר פירוק האותות הספקטרליים, מחושב היחס בין Indo-1 הקשור לסידן ללא סידן וניתן לדמיין אותו לאורך זמן עבור כל אוכלוסייה מגודרת של טחול. טכניקה זו יכולה לאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן באוכלוסיות תאים מרובות.
Introduction
זרם סידן המושרה על ידי קולטן תאי T (TCR) הוא מדד שימושי להפעלת תאי T ומשמש לעתים קרובות כדי לקבוע אם לאוכלוסייה של תאי T יש תגובות לקויות בשלבים הפרוקסימליים של מסלול איתות TCR1. מדידות של זרימת סידן מבוצעות בדרך כלל על ידי תיוג מראש של תאי T עם אחד או זוג צבעי מחוון סידן פלואורסצנטיים, ולאחר מכן בחינת האותות הפלואורסצנטיים באמצעות ציטומטריית זרימה בזמן אמת לאחר TCR cross-linking 2,3,4. Indo-1, צבע סידן מטרי, מעורר על ידי לייזר UV עם פליטת שיא בשני אורכי גל שונים התלויים בקשירת סידן5, והוא צבע אינדיקטור נפוץ לניתוח ציטומטריית זרימה של תגובות סידן בלימפוציטים חיים. מכיוון שפרופיל הפליטה של Indo-1 הוא רחב למדי, זה יכול להיות מאתגר לשלב הערכת Indo-1 עם ניתוח סימולטני של סמני פני תא מרובים על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פס. מגבלה זו מגבילה את השימוש בניתוח ציטומטריית זרימה של תגובות סידן לאוכלוסיות מטוהרות מראש של תאי T או לאוכלוסיות המזוהות על ידי קבוצה מוגבלת של מולקולות פני התא.
כדי להתמודד עם המגבלות של מדידת תגובות סידן על אוכלוסיות הטרוגניות של לימפוציטים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה של מעבר פסים, פותח פרוטוקול למדידת פלואורסצנטיות Indo-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. שיטה זו מאפשרת ריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא, תוך ניצול היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. היתרון בשימוש בציטומטריית זרימה בספקטרום מלא על פני ציטומטריית זרימה קונבנציונלית הוא היכולת להבחין בין אותות פלואורסצנטיים לצבעים חופפים מאוד, ובכך להגדיל את מספר סמני פני השטח שניתן להעריך בו זמנית בכל דגימה. ציטומטריית זרימה קונבנציונלית משתמשת במסנני פסים ומוגבלת לפלואורוכרום אחד לכל מערכת גלאים6. ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא אוספת אותות על פני כל הספקטרום של הפלואורוכרום באמצעות 64 גלאים במערכת ציטומטריית זרימה ספקטרליתשל חמישה לייזרים 7,8. בנוסף, ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מנצלת את גלאי APD (Avalanche Photo Diode) בעלי רגישות מוגברת ביחס לגלאי צינור מכפיל אורהקיימים בציטומדי זרימה קונבנציונליים 8. כתוצאה מכך, גישה זו אידיאלית עבור אוכלוסיות תאים הטרוגניות, כגון תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם או תרחיפים של תאי איברי לימפה משניים מורין, מכיוון שהיא מבטלת את הצורך בבידוד של אוכלוסיות תאי T ספציפיות לפני סימון צבע הסידן. במקום זאת, ניתן להשתמש בפרופילי ביטוי של סמני פני השטח של התא ובציטומטריית זרימה לאחר איסוף נתונים כדי להעריך את תגובות הסידן בכל אוכלוסייה מעוניינת בהן. כפי שניתן לראות בדו"ח זה, ניתן לשלב את Indo-1 בקלות עם שמונה נוגדנים מצומדים פלואורוכרום, וכתוצאה מכך בסך הכל 10 חתימות ספקטרליות ייחודיות. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על תערובות של תאים מקווי עכבר מובחנים באופן קונגני, מה שמאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן בתאי T מסוג בר בהשוואה לאלה מקו עכברים ממוקד גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברים הוחזקו בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ בהתאם לפרוטוקולים של IACUC. כל העכברים הומתו על פי תקני AAALAC.
1. הכנת תאים חיסוניים מטחול העכבר
הערה: הרדימו עכברים תמימים באמצעות המתת חסד CO2 . עכברי C57BL/6 שנרכשו ממעבדות ג'קסון וגודלו בבית משמשים לניסויים בגיל 6-12 שבועות. עכברים זכרים ונקבות כאחד משמשים לניסויים.
- יש לחטא את עור העכבר באתנול 70% על מנת לצמצם את האפשרות של מזהמים חיצוניים להיכנס לדגימה.
- נתחו את טחול העכבר באמצעות כלי דיסקציה, מספריים כירורגיים ומלקחיים. קצרו את הטחול והכניסו את הטחול המנותק לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל עם ~5 מ"ל של מדיית RPMI מלאה (cRPMI) על קרח.
הערה: RPMI מלא מורכב מ-10% FBS, 2 mM L-גלוטמין ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.- כדי לקצור את טחול העכבר, בצע חתך של 5 ס"מ לתוך הפרווה והעור לאורך הצד השמאלי של העכבר באמצע הדרך בין הרגליים הקדמיות והאחוריות עם מספריים. פתח את חלל הגוף ~ 5 ס"מ והסר את הטחול באמצעות מלקחיים. הטחול הוא בצבע של שעועית כליה והוא ארוך ושטוח יותר מהכליה השכנה.
- שפכו את התוכן של שלב 1.2 על מסנן סטרילי של 70 מיקרומטר המחובר לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. מפרידים מכנית את הטחול לתרחיף תא בודד על ידי דחיפת הטחול דרך הפילטר עם בוכנה מזרק 5 מ"ל עד שלא נשאר עיסת טחול על פני המסנן.
- גלול את הטחול באמצעות צנטריפוגת רוטור מתנדנדת החוצה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- בזהירות decant supernatant. הטחול הכדורי נשאר בתחתית הצינור החרוטי 50 מ"ל.
- כדי להסיר תאי דם אדומים, להשעות מחדש את splenocytes pelleted ב 1 מ"ל של חיץ ליזה ACK למשך 3 דקות על פי הוראות היצרן. מערבבים היטב.
- להרוות את מאגר הליזיס ACK עם 15 מ"ל של cRPMI.
- גלולה הלימפוציטים לפי ההוראות בשלב 1.4.
- להשעות מחדש את השעיית התא ב 5 מ"ל של cRPMI בצינור חרוטי 50 מ"ל. מניחים את הדגימות על קרח.
- כדי לספור את התאים, העבירו 10 μL של תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.6 מ"ל ודללו ביחס של 1:1 עם תמיסה כחולה טריפאן. לאחר מכן, העבר להמוציטומטר או למערכת ספירת תאים אוטומטית.
- לאחר הספירה, בהתאם לריכוז התא בתרחיף התא כמו בשלב 1.9, יש להכניס את התאים לצנטריפוגה שולחנית בטמפרטורה של 500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להתכונן לתוספת של מדיית cRMPI המכילה צבע אסטר Indo-1 AM.
- חשב את נפח ההשעיה מחדש של התאים כדי להשיג 10-12 x 106 תאים / מ"ל. זהו ריכוז של פי 2 מספירת התאים הכוללת הנדרשת.
- השעה מחדש את התאים בנפח cRPMI המחושב בשלב 1.11. מקם את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 בצינור חרוטי 50 מ"ל עם מכסה מאוורר או צלחת תרבית רקמה.
2. צבע יחסי הודו-1 ותיוג נוגדנים פלואורסצנטיים
- בהתאם להוראות היצרן, הוסף 50 μL של DMSO לבקבוקון המכיל 50 מיקרוגרם של Indo-1 AM. ריכוז תמיסת המלאי הוא 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
הערה: DMSO מסופק במיקרו-בקבוקונים עם הערכה למניעת חמצון של DMSO. - לדלל את aliquot מלאי (1 מיקרוגרם / μL) לתוך נפח הניסוי המתאים (נקבע ב 1.11) של cRPMI בריכוז של 6 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז 2x. אין לאחסן את Indo-1 בתמיסה מימית.
הערה: ניתן להשתמש במאגרים אחרים עם תוספת סידן בהתאם לצרכי התא. - הניחו את המדיה המלאה עם Indo-1 בצד באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
הערה: השתמש בריכוז המינימלי של אסטר Indo-1 AM הדרוש כדי לקבל אות מתאים. זה צריך להיות titrated עבור סוגי תאים שונים. בדרך כלל, ריכוז בין 3-5 מיקרומטר מספיק. עבור תאי T ראשוניים, טעינת תאים עם Indo-1 בריכוז >5 מיקרוגרם/מ"ל מגדילה את העוצמה הפלואורסצנטית הממוצעת (MFI) מעל לוג של 6 על ציטומטרים של זרימה ספקטרלית. אם זה קורה, להפחית את עוצמת לייזר UV ו titrate את Indo-1 לריכוז נמוך יותר. - דילל את מתלי התאים שהוכנו בעבר (בשלב 1.12), 1:1 ב-cRPMI, כולל מדיית 2x Indo-1 שיוצרה בשלב 2.2. ודא כי התאים נמצאים בריכוז בין 5-6 x 106/mL.
הערה: אין לצבוע פקדי כתם יחיד לא מוכתמים או סמן פני שטח של תא כתם יחיד עם Indo-1. הוספת Indo-1 לבקרות נוגדנים עם כתם יחיד תיצור דגימה מרובת צבעים עקב הוספת Indo-1 לתאים מוכתמים בודדים. כלול בקרת INDO-1 (ללא סידן) EGTA נוספה ללוח הדגימה שנוצר בשלב 2.6. - הוסף 1 מ"ל של תאים/באר/מצב ניסיוני לצלחת תרבית רקמה של 12 בארות.
- צור בקרה מוכתמת יחידה עבור דגימת Indo-1 (ללא סידן) באמצעות תאים שהוטענו בעבר בצבע Indo-1 והוסף EGTA לריכוז סופי של 2 mM. EGTA תצבית סידן בתרחיף התא, ותעניק דגימת בקרה נקייה יותר.
- צור בקרה חיובית של Indo-1 (קשור לסידן Indo-1) על ידי הוספת 50 מיקרומטר של יונומיצין לתרחיף התאים הטעון בצבע בציטומטר הזרימה. יונומיצין הוא יונופור סידן חדיר לממברנה הקושר יוני סידן ומקל על העברת יוני סידן לתאים.
- צור באר להדברה שלילית ביולוגית ללא פלואורופורים או צבע הודו-1.
- צור באר לבקרות כתמים בודדות עבור כל אוכלוסיות תאים נוספות המעניינות (נוגדנים מוגדרים על-ידי המשתמש) באמצעות פלואורופורים מצומדים של נוגדנים בעיצוב לוח ציטומטריה של זרימה. אלה לא יכללו את הצבע ביחס הודו-1.
- הוסף את הנוגדן חוסם קולטן Fc (~ 2 מיקרוגרם / 1 x 106 תאים), בהתאם להוראות היצרן, לפני הוספת נוגדנים מצומדים פלואורוכרום נוספים לצביעת פני השטח.
- לדגור על הצלחת במשך 45 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
- השהה מחדש את התאים בצלחת של 12 בארות על ידי הקשה עדינה על הצלחת כל 15 דקות.
- מערבבים ומסירים את כל נפח התאים התלויים במדיה מהצלחת בת 12 הקידוחים. לאחר מכן הוסף את השעיית התא לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל.
- מכניסים את התאים למיקרוצנטריפוגה במהירות של 500XG למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דקרו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של cRPMI שחומם מראש. גלולה שוב ודקנט את הסופרנטנט.
הערה: שטיפת התאים מסירה את כל הנוגדנים החוסמים FC שנותרו. - להשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של cRPMI בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.7 מ"ל ולדגור על כל צינור ב 37 ° C למשך 30 דקות נוספות ב 5% CO2, משאיר את החלק העליון של הצינור פתוח מעט כדי לאפשר חילופי גז. זה מאפשר דה-אסטריפיקציה מלאה של אסטרי AM תוך תאיים.
- מעבירים את התאים חזרה לצלחת תרבית רקמה בת 12 בארות, במידת הצורך. ניתן להוסיף נוגדנים מצומדים נוספים המוגדרים על ידי המשתמש בשלב מנוחה.
הערה: סמנים המשמשים בחלונית השיטות כוללים: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 ו- CD1d/α-galcer tetramer. סמנים נבחרים לניתוח תת-קבוצות של תאי T.- צור תערובת אב של כל הנוגדנים המצומדים פלואורוכרום המוגדרים על-ידי המשתמש בהתאם לסוגי התאים המעניינים בנפח טיטרטיבי קודם לכן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מ"ל.
- הוסף תערובת אב מחושבת עבור 1 מ"ל מנפח התא, תלוי בנוגדנים טיטרטים לתאים נחים.
הערה: היתרון של צביעה בשלב 2.15 במקום בשלב 2.18 מאוחר יותר הוא שהכתמה בשלב 2.15 תקצר את זמן הדגירה הכולל של הניסוי. עם זאת, צביעה בנפח כולל של 1 מ"ל בשלב 2.15 מגבירה את השימוש בנוגדנים.
- לאחר מנוחה, גלולה את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: תאים בצלחת תרבית רקמה של 12 בארות יכולים להיות כדוריים בצלחת עם אביזר צנטריפוגות צלחת. אחרת, גלולה את התאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל. - לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1 מ"ל של 4 ° C cRPMI קר גלולה את התאים שוב כמו בשלב 2.16. מניחים את התאים על קרח.
הערה: אם צובעים תאים על פני השטח בנפרד, לאחר דה-אסטריפיקציה בשלב 2.18, יש צורך בפחות נפח נוגדנים. צביעת פני השטח בשלב זה יכולה להתבצע לאחר שלב המנוחה במאגר זרימה קרה (1x DPBS עם תוספת של 1% FBS), באמצעות נוגדנים המוגדרים על ידי המשתמש, על קרח למשך 30 דקות. שטפו את התאים לאחר הכתם ב-cRPMI כמו בשלב 2.17.- הוסף כתם כדאיות Ghost540 מדולל 1:7,500 ב- DPBS לדגימות בהתאם להוראות היצרן. חום להרוג את התאים ב 55 ° C על בלוק התחממות עבור שליטה חיה / מת מוכתם יחיד.
הערה: צביעת צבע פונקציונלית כדאיות לסילוק תאים מתים בניתוח ציטומטרי זרימה מבוצעת ללא FBS. FBS יכול לקיים אינטראקציה עם צבעי אמין בהתאם להוראות היצרן.
- הוסף כתם כדאיות Ghost540 מדולל 1:7,500 ב- DPBS לדגימות בהתאם להוראות היצרן. חום להרוג את התאים ב 55 ° C על בלוק התחממות עבור שליטה חיה / מת מוכתם יחיד.
- יש להשהות מחדש דגימות בודדות ב-500 מיקרוליטר של cRPMI (נטול פנול אדום) באמצעות צינור זרימת פוליסטירן 5 מ"ל עם מכסה.
הערה: ניתן להשאיר תאים בטמפרטורה של 4°C למשך עד שעה. - יש לחמם כל צינור של 5 מ"ל המכיל תאים, בנפרד, לטמפרטורה של 37°C באמצעות אמבט חרוזים למשך 7 דקות לפני הניתוח של ציטומטר הזרימה תוך שמירה על זמן עקבי בין הדגימות. השתמש בטיימר.
3. צינור אמבט חרוזים: שמירה על טמפרטורה במהלך ניתוח שטף סידן
- להוסיף חרוזי אמבטיה לאמבט מים קטן, ללא תוספת מים; התחממו עד 37 °C.
- בזהירות לחתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לשניים, בסימן 25 מ"ל, עם סכין גילוח; יש להשליך את החלק העליון של הצינור.
- ממלאים את הצינור החצוי 3/4 מהדרך בחרוזי אמבטיה.
- הכניסו את הצינור שנוצר בשלב 3.2 לאמבט החרוזים שנוצר בשלב 3.1. מביאים את הצינור והחרוזים ל 37 מעלות צלזיוס.
- חברו את אמבט החרוזים לשקע חשמל ליד ציטומטר הזרימה על מנת לשמור על הטמפרטורה לקראת ניתוח הדגימה.
- הוסף מתלה קלקר חרוטי בנפח 50 מ"ל חתוך כדי אחיזת צינור אחד כדי למקם את הצינור במקומו בזמן שהוא פועל על ציטומטר הזרימה. זה יבטל את הצורך להחזיק ידנית את הצינור למשך ניתוח העקומה.
4. רכישת זרם סידן באמצעות אנליזה ציטומטרית של זרימה
- היכנס לתוכנת ציטומטר הזרימה במנתח זרימה.
- לחץ על הכרטיסייה Library כדי להוסיף תגים פלואורסצנטיים Indo-1 (הקשורים לסידן) ו-Indo-1 (ללא סידן). בחר תגי ניאון בתפריט התוכנה משמאל. בחר לייזר UV תחת קבוצות תגים פלואורסצנטיות ולחץ על +הוסף כדי להוסיף שם תג פלואורסצנטי (Indo-1 (קשור לסידן)/Indo-1 (ללא סידן)) לספרייה. בחר את אורך גל עירור הלייזר ואת אורך גל הפליטה ולאחר מכן לחץ על שמור. המשך למערך הניסוי.
הערה: Indo-1 מעורר על ידי לייזר UV באורך גל של 355 ננומטר. אורך גל הפליטה של Indo-1 (הקשור לסידן) הוא 372 ננומטר. אורך גל הפליטה של Indo-1 (ללא סידן) הוא 514 ננומטר. - לחץ על הכרטיסייה רכישה. פתח/צור ניסוי חדש והוסף את התגים הפלואורסצנטיים הרצויים לניסוי.
- צור קבוצת התייחסות וקבוצה/ים לדוגמה חדשה עבור הניסוי. תייג הן את הדגימות והן את קבוצות ההתייחסות לפי הצורך.
- תחת הכרטיסיה רכישות , הגדר את האירועים לתיעוד למקסימום: 10,000,000.
- הגדר את עוצמת העצירה לנפח המרבי: 3,000 μL.
- הגדר את זמן העצירה לזמן המרבי: 36,000 שניות.
- רכוש פקדים מוכתמים בודדים עבור נוגדנים מצומדים מוגדרים הכלולים בחלונית הרב-גונית.
- רכוש פקדים מוכתמים בודדים עבור צבע פונקציונלי Indo-1.
- הוסף 50 מיקרומטר של יונומיצין לבקרה החיובית Indo-1 הקשורה לסידן. מערבולת לערבב. הוסף את צינור הזרימה ליציאת הזרקת הדגימה ולחץ על הקלט.
- הוסף בקרת Indo-1 שלילית ללא סידן לציטומטר הזרימה ולחץ על הקלט. EGTA נוסף בשלב 2.6.
- בטל את ערבוב הפקדים המוכתמים הבודדים על ידי לחיצה על כפתור בטל ערבוב .
הערה: יש לרשום את כל הבקרות המוכתמות הבודדות מכל הנוגדנים המצומדים והצבעים הפונקציונליים לפני ביטול ערבוב הדגימות. כדי שלחצן בטל ערבוב יפעל, יש להקליט תחילה את כל פקדי ההפניה. Unmixing יכול להיעשות לפני או אחרי איסוף דגימה.
- לאחר השלמת ביטול הערבוב, צור עלילות רציפות באמצעות גליון העבודה הלא מעורב. SSC-A לעומת FSC-A להסרת פסולת מהדגימה, SSC-A לעומת SSC-H להסרת כפילויות. לאחר מכן מגיע שער ניקוי כדאיות יחד עם פגיעה נוספת באוכלוסיות המעניינות. כדי ליצור שערים, לחץ על Plot. הוסף תרשים לגליון העבודה ולחץ פעמיים בתוך השער כדי ליצור אוכלוסייה מגודרת במורד הזרם. המשיכו עד לטיפול בכל האוכלוסיות המעניינות.
- דגימות בקרה מוכתמות בודדות חמות (משלבים 2.6-2.9 בסעיף Indo-1 ratiometric dye and fluorescent antibody labeling) עד 37°C לניתוח רציף. הגדר את תוכנת ציטומטריית הזרימה.
- הפעל מים DI על הציטומטר במשך 2-3 דקות כדי להבטיח את היציבות הנוזלית של ציטומטר הזרימה.
- הגדר תרשימים רציפים בגליון העבודה הלא מעורב על-ידי יצירת שערים באמצעות הלחצנים 'מצולע', 'מלבן' או 'שער אליפסה'. שער לכלול את האוכלוסייה המעניינת (כלומר, לימפוציטים המשתמשים ב- SSC-A לעומת FSC-A [אפליה בגודל / לימפוציטים]). אוכלוסיות שליליות מופיעות מקובצות סביב אפס בעוד אוכלוסיות חיוביות ניתן לדמיין על ידי הגדלת MFI. אוכלוסיות מעניינות יוגדרו על בסיס השאלה הביולוגית.
- לחץ פעמיים בתוך השער שנוצר ושנה את הפרמטרים ציר Y וציר X ל- SSC-A לעומת SSC-H (אפליה בודדת). השלם את הגדרת פרמטרי הציר על ידי לחיצה שמאלית על המילים על הציר.
- צור תרשים עם SSC-A לעומת אות צבע כדאיות (פרמטרים של שער כדאיות). שער על תאים חיים, אשר שליליים עבור צביעת צבע אמין. תאים חיים, שליליים לכתמים מתים חיים, יתקבצו בסימן 0 בשני צירי Y ו- X.
- לחץ פעמיים על העלילה הפנימית כדי ליצור חלקה חדשה המכילה לימפוציטים חיים של תא בודד בלבד. שנה את ציר Y ל- Indo-1 (סידן קשור) (V1) ו/או Indo-1 (סידן חופשי) (V7) לעומת זמן על ציר X להמחשת זרם הסידן.
- הניחו את הדגימה הביולוגית המחוממת על מכונת SIT והריצו את הדגימות במהירות של 2,500-3,000 אירועים לשנייה על מדיום כדי לאפשר הדמיה של זרימת הסידן באוכלוסיות מוגבלות של מספר תאים (למשל, iNKT).
הערה: על ידי השעיה מחדש של התאים בריכוז של 1 x 106/mL, אירועי התא שנאספו בקצב זרימה בינוני צריכים להיות שווים 2,500-3,000 אירועים לשנייה. הנמיכו את קצב הזרימה תחת בקרת רכישה על ידי לחיצה על התפריט הנפתח או דללו את הדגימה אם לתרחיף התא יש ריכוז מוגבר. הרצת הדגימות בקצב זרימה גבוה יכולה להגביר את התפשטות האות מפלואואורופור אחד לפלואורופורים אחרים בלוח. - מוסיפים את הצינור הבא לאמבט החרוזים כדי להתחמם ל 37 מעלות צלזיוס.
- בבקרת הרכישה, הקש Record כדי להקליט את הנתונים הראשוניים במשך 30 שניות כדי לקבל רמה בסיסית של איתות סידן בדגימה.
- בבקרת הרכישה, לחץ על עצור והסר את הצינור מיציאת הזרקת הדגימה (SIP).
- הוסף 30 מיקרוגרם של אנטי CD3 לא מצומד ישירות לתוך צינור הדגימה כדי להתחיל זרימת סידן. הריכוז הסופי לכל צינור הוא 60 מיקרוגרם/מ"ל.
הערה: אין שלב כביסה לאחר הוספת אנטי CD3. - החזיר את הצינור ל- SIP של המכונה במהירות האפשרית ולחץ על הקלט בתוכנה.
- הקלט נתונים במשך 7 דקות, תוך צפייה בזמן שחלף תחת בקרות הרכישה בתוכנה, כדי לצפות במסלול הזמן של זרימת הסידן בתוך אוכלוסיות המדגם.
- לאחר 7 דקות, לחץ על עצור בתוכנה והוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל של יונומיצין. הקלט במשך 30 שניות כדי לקבל את אות הסידן המרבי בתאים המעניינים. כדי להגביל את הנשיאה של יונומיצין לדגימה הבאה, השלימו שתי שטיפות SIT במכשיר בין הדגימות.
- המשך לדוגמה הבאה וחזור על זרימת העבודה עד שכל הדגימות ייאספו.
- שמור את הניסוי ולחץ על קובץ ה- zip לייצוא . קבצים לא מעורבים ( .fsc) מועלים לתוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה חיצונית.
5. ניתוח עקומת סידן
- באמצעות תוכנת ניתוח6 עבור ציטומטריית זרימה, להמיר אותות פלואורסצנטיים Indo-1 ליחס עבור מדידות סידן בהילוך מהיר. גזור פרמטרים תחת הכרטיסייה כלים על-ידי הוספת הפניות Indo-1 (קשור לסידן)/Indo-1 (סידן חופשי) באמצעות סולם ליניארי. הגדר את המינימום לאפס ואת המקסימום בהתאם לזרם של יחס סידן, בדרך כלל סביב 10. היחס המרבי משתנה בהתאם לסוג התא ול-MFI של Indo-1.
- סמן את הפרמטר שנבחר. תחת כלים, הוסף ניתוח קינטי כדי לבחור את הפרמטר על ידי לחיצה על הכרטיסייה קינטיקה . הגדר את ציר Y לנגזרת.
- בחר MFI (עוצמה פלואורסצנטית ממוצעת) בכרטיסיה Kinetics.
- מוסיפים החלקה גאוסיאנית, אם רוצים. כדי להוסיף החלקה גאוסיאנית, בחר באפשרות בתפריט הסטטיסטיקה הנפתח בתוכנת ניתוח הזרימה. ניתן להוסיף החלקה גאוסיאנית כדי להחליק את ההדמיה של עקומת זרימת הסידן של הניתוח.
- צור טווחים מרובים לסטטיסטיקה לאורך מסלול הזמן של שטף הסידן להשוואות ביולוגיות בתוך הדגימות.
- גרור את הדגימות לעורך הפריסה והוסף את הנתונים הסטטיסטיים כרצונך. ניתוח סטטיסטי משתנה בהתאם לשאלה הביולוגית. למטרות פרסום, מספר עותקים משוכפלים מנותחים באמצעות t-test או ANOVA.
- לרגע של ניתוח זמן, כוונו את השער על רגע מסוים בזמן לאורך שטף הסידן. לבחון את סמני פני השטח הרצויים ואת השער על האוכלוסייה המעוניינת בו; לאחר מכן, העריכו תרשים נקודות דו-ממדי של הודו-1 (ללא סידן) לעומת הודו-1 (קשור לסידן) עבור תאים מגודרים באותו רגע באזור הזמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תהליך העבודה הניסיוני להערכת תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות צבע יחסי הודו-1 עם כתמים על פני השטח המרובבים מוצג באיור 1. לאחר קצירת ועיבוד הטחול של העכבר לתרחיף תא יחיד, התאים מוכתמים באסתר Indo-1 AM ומשטח מוכתמים בנוגדנים המקושרים לפלואורוכרום. לאחר השלמת טעינת הצבע וצביעת הנוגדנים, דגימות הלימפוציטים מתחממות לטמפרטורה ביולוגית (37 מעלות צלזיוס). הדגימות מנותחות לאחר מכן באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא עבור פלואורסצנטיות Indo-1 לאחר התאמה לסוגי התאים הבודדים הרצויים, ללא צורך במיון הדגימות לפני הניתוח. על מנת להשתמש בגלאי Avalanche Photo Diode (APD) בתוך ציטומטר זרימה בספקטרום מלא, יש צורך להמיר את אורך הגל של שיא הפליטה מאורך גל של מסנן פסים הנמדד בננומטר לערוץ המתאים שלו ב-APD. הטבלה המוצגת באיור 2 מספקת קו מנחה, אולם הגלאים האופטימליים עבור שתי חתימות הפלואורסצנטיות של הודו-1 (קשור לסידן לעומת נטול סידן) חייבים להיקבע אמפירית. זה מושג על ידי הכנת דגימות Indo-1 מוכתמות בודדות באמצעות Ionomycin כדי ליצור את האות Indo-1 (הקשור לסידן), ו- EGTA, סוכן כלאט סידן, כדי ליצור את האות Indo-1 (ללא סידן). לאחר ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא, ניתן להמחיש את התעלה המציגה את שיא עוצמת הפלואורסצנטיות עבור כל חתימת הודו-1 (איור 3A). על-ידי נרמול ה-MFI של האוכלוסיות החיוביות לזה של האוכלוסיות השליליות, ניתן לקבוע את השינוי בפלואורסצנטיות של הודו-1 מנטולת סידן לקשורה לסידן (איור 3B). תצוגה זו נוצרת בחוברת עבודה (.xls) באמצעות פקדי ייחוס עבור Indo-1 מאוגד וחופשי, ומציירת שער מרווח שלילי וחיובי עם שערים חיוביים ושליליים ברורים עבור נורמליזציה של MFI כפי שמוצג באיור 3A. סטטיסטיקות MFI לדוגמה ניתן להשיג גם על ידי לחיצה ימנית על טבלת הסטטיסטיקה. בתוכנה, קבעו את יחס ה-MFI על-ידי חלוקת האוכלוסייה החיובית לאוכלוסייה השלילית וכיסו את שני הספקטרום על צג אחד (איור 3B, מימין). החץ המנוקד הצהוב מראה את ההבדלים הספקטרליים המנורמלים בין החתימות הספקטרליות של הודו-1 מאוגד וחופשי.
כדי להעריך את תגובות הסידן לאחר גירוי קולטן תאי T, הפלואורסצנטיות של Indo-1 מוערכת לאחר גירוי אוכלוסיות התאים המעניינות, כפי שמוצג באיור 4. ראשית, נבחנת חלקת זמן לעומת פיזור צד (SSC-A) כדי להעריך את יציבות הנוזל; אות עקבי יציב לאורך ציר הזמן מצביע על יציבות (איור 4A). לאחר מכן, ממחישים את הפיזור קדימה לעומת צד (FSC-A לעומת SSC-A), ואוכלוסיית הלימפוציטים מגודרת כפי שמוצג באיור 4B). אחרי שער הלימפוציטים, שער הבחנה של תא בודד מוחל על-ידי יצירת תרשים של גובה פיזור צדדי לעומת שטח (SSC-H לעומת SSC-A), והסינגלטים, שנופלים על האלכסון, מגודרים כפי שמוצג באיור 4C. לאחר מכן מעריכים את הכדאיות של הסינגלטים, על-ידי בחינת צביעה עם צבע הכדאיות וצביעה על האוכלוסייה השלילית (איור 4D). לבסוף, כדי לנתח תאי T, מזבלה של תאי B/שער בקרה שלילי פנימי מוחל על-ידי gating על האוכלוסייה השלילית CD19 (איור 4E). לאחר מכן האוכלוסייה השלילית ל-CD19 מוערכת עבור תת-קבוצות תאי T באמצעות נוגדנים ל-CD4 ו-CD8 (איור 4F); הדוגמה שמוצגת בוחנת תאי T CD4+ עבור תגובות סידן על-ידי הדמיה של פלואורסצנטיות של הודו-1 (קשור לסידן) לעומת זמן (איור 4G). לאחר התגברות על קטע זמן, ניתן ליצור גם את חלקת Indo-1 (ללא סידן) לעומת Indo-1 (קשורה לסידן) (איור 4H). ניתוח זה ישמש מאוחר יותר כדי לגזור את יחס הודו-1 (ראה שיטות ניתוח עקומת זרם הסידן בתוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה).
בשלב זה של הניתוח, זה עשוי להיות שימושי לנתח רגעים בזמן בתוך העלילה הדו-ממדית של הודו-1 (קשור לסידן) לעומת זמן באוכלוסיות תאים בודדים של עניין. נקודות הזמן האופטימליות כוללות את הסידן הבסיסי הקשור להודו-1 לפני גירוי TCR, תגובת שיא, נקודת זמן מספר דקות לאחר תגובת השיא כאשר רמות הסידן התוך-תאיות יורדות, ולבסוף תגובת הסידן המתעוררת על-ידי הוספת יונומיצין (איור 5A). בדגימת הבסיס לפני הוספת נוגדנים נגד CD3, מזוהה אות Indo-1 חלש (קשור לסידן). במהלך תגובת השיא, התאים מראים אות Indo-1 חזק (הקשור לסידן) ופלואורסצנטיות מופחתת של Indo-1 (ללא סידן). 5 דקות לאחר השיא, הפלואורסצנטיות של האינדו-1 כמעט חזרה לקו הבסיס. לאחר הוספת יונומיצין לדגימה, ניתן לדמיין אות חזק של Indo-1 (הקשור לסידן), מה שמבטיח העמסת צבע נאותה של התאים. אוכלוסיות תאים נדירות (<1%) יכולות להיות קשות לניתוח נגזרות; כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתוח של אוכלוסיות נדירות יכול להתבצע על ידי שרטוט Indo-1 (קשור לסידן) לעומת Indo-1 (ללא סידן) לאחר gating על כל אוכלוסייה מעניינת, כגון תאי CD4+, תאי TCRb+, תאי TCRyg+, תאי CD25+, תאי iNKT ותאי CD19+ (איור 5B,C). שימו לב לתגובת הסידן הניתנת לזיהוי בקלות בתאי T TCRγδ+ ובתאי iNKT (CD1d/α-galcer+). לצורך השוואה של חלבוני פני השטח בתוך אוכלוסיית תאי T מעורבת, נוצרו חלקות דו-ממדיות המראות תת-קבוצות מעניינות. למטה, ניתוח תגובת הסידן לאורך כל מהלך הזמן עבור כל תת-קבוצה מוצג (איור 5C).
בדיקה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע הבדלים ביולוגיים בתאי T מעכברים מסוג בר לעומת עכברים ממוקדים גנטית או בתאי T שלא טופלו לעומת מטופלים במעכבים פרמקולוגיים. בדוגמה שמוצגת באיור 6, תאי T טופלו באמצעות PRN694, מעכב מולקולה קטנה של תאי T טירוזין קינאזות, ITK ו-RLK 9,10. עיכוב של ITK/RLK מעכב את איתות קולטן תאי T, מה שמוביל לתגובת סידן מופחתת בעקבות גירוי קולטן תאי T11 (איור 6A). כדי לכמת את ההשפעות של עיכוב ITK/RLK, ניתן לנתח את העקומות המציגות את היחס בין אינדו-1 (קשור לסידן) לאינדו-1 (נטול סידן) פלואורסצנטיות עבור האזור שמתחת לעקומה (AUC) או שיפוע העקומה עבור כל תנאי (איור 6B,C). כימות זה מתבצע על-ידי חלוקת מהלך הזמן של תגובת הסידן למקטעים בדידים (איור 6A), והערכת השטח שמתחת לעקומה או שיפוע העקומה עבור כל מקטע, כפי שמוצג (איור 6B,C). בסך הכל, פרוטוקול זה מדגים כי ניתן להשתמש בציטומטריית זרימה בספקטרום מלא כדי למדוד זרימת סידן יחד עם סמנים מרובים בפני השטח של התאים באוכלוסיות תאי החיסון הנחקרות. תוצאות אלה מראות כי תת-קבוצות תאים המיוצגות ביותר מ-1% מכלל האוכלוסייה ניתנות להערכה של זרימת סידן לאורך זמן. לעומת זאת, תת-קבוצות תאים פחות נפוצות דורשות ניתוח חלופי באמצעות רגעי זמן.
ניתוח סטטיסטי של נתוני תגובת סידן הוא ספציפי לשאלת הניסוי ולבדיקות הביולוגיות המבוצעות. בנתונים המוצגים בכתב היד בוצעו ניסויים עם העתקים כדי להבטיח את דיוק הניסוי ואת חוסנה של המתודולוגיה; עם זאת, ניסויים מרובים על דגימות ביולוגיות שונות במשך ימים שונים לא בוצעו. לכן, לא יהיה זה ראוי לבצע ניתוחים סטטיסטיים על הנתונים המוצגים.
איור 1: סכמטיות של זרימת העבודה של בדיקת סידן. השימוש בצבע אינדיקטור סידן אסטר Indo-1 AM מספק כלי להמחשת זרם הסידן בתאי מערכת החיסון ובתת-האוכלוסיות שלהם. סכמטי זה מתאר את זרימת העבודה לניתוח תגובות סידן בתאי T טבליות מורין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: המרה של אורכי גל PMT לערוצי APD. ציטומטר זרימת הספקטרום המלא כולל 16 גלאים לגילוי פליטות פלואורסצנטיות לאחר עירור על ידי לייזר UV. המפרט של כל גלאי מצוין בטבלה. מודגשים שני הגלאים המשמשים להערכת פלואורסצנטיות הודו-1, כפי שנקבעו אמפירית באמצעות בקרות מוכתמות יחידות. המרות לאורך גל APD ומדריך למשתמש עבור ציטומטר זרימה ספקטרלית זמינים11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה של החתימה הספקטרלית של הודו-1. (A) למעלה: חתימה ספקטרלית של פלואורסצנטיות Indo-1 בתאי T CD8+ לאחר החדרת יונומיצין כדי לעורר זרם חזק של סידן. את השיא של Indo-1 (קשור לסידן) ניתן לדמיין UV1. למטה: חתימה ספקטרלית של Indo-1 (ללא סידן) המראה את שיא הפלואורסצנטיות ב-UV7. דגימת בקרה זו נוצרה על ידי טיפול בתאים טעונים ב- Indo-1 עם EGTA12 כדי לכלאט כל סידן חופשי חוץ-תאי. (B) שכבת-על משולבת של חמש ספקטרום לייזר של חתימת הודו-1, המציגה MFI ספקטרלי גולמי משמאל ואת הספקטרום המנורמל של הודו-1 קשור לעומת הודו-1 חופשי מימין. ניתן לזהות בקלות הדמיה של המעבר מ-Indo-1 (ללא סידן) בכתום ל-Indo-1 (קשור לסידן) בכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אסטרטגיית Gating להדמיה של תגובות סידן. זרימת העבודה עבור gating רציף של הדגימות מתוארת. (A) יציבות הנוזלים נבחנת באמצעות שער זמן לעומת שער SSC-A. (B) FSC-A לעומת SSC-A משמש לשער על לימפוציטים, ובכך מסלק פסולת תאים ושאריות תאי דם אדומים בדגימה. (C) תאים בודדים מגודרים באמצעות תרשים SSC-H לעומת SSC-A. (D). לאחר מכן מחילים את שער הסינגלט על חלקה של Ghost540 שמת חי לעומת SSC-A; שימוש בתאים שליליים של Ghost540 מבטל תאים שאינם בני קיימא מהניתוח הבא. (E) תאים חיים מנותחים עבור CD19 לעומת SSC-A, ותאים שליליים CD19 (תאים שאינם B) מגודרים. (F) התאים השליליים ל-CD19 נבדקים לצביעת CD4 לעומת CD8. (G) תאי CD4+ מגודרים לאחר מכן כדי להמחיש זמן לעומת הודו-1 (קשור לסידן). (H) נבחר רגע בזמן כדי לייצג את התחלת תגובת זרם הסידן לאחר הוספת נוגדנים נגד CD3 על ידי הדמיה של Indo-1 (ללא סידן) לעומת Indo-1 (הקשור לסידן) פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיה של פלואורסצנטיות הודו-1 באוכלוסיות מגודרות של תימוציטים מורינים בנקודות זמן בדידות בתגובת הסידן. סך כל התימוציטים, עוררו עם נוגדן נגד CD3 ואחריו יונומיצין לאחר 6 דקות של איסוף הדגימות. בארבע נקודות זמן בדידות, כפי שניתן לראות בקופסאות המלבניות המתוארות בחלקות הזמן הדו-ממדיות לעומת הודו-1 (הקשורות לסידן), נבדקו תת-אוכלוסיות שונות של תימוציטים לתגובות סידן. (A) תרשימים דו-ממדיים המראים gating עבור אות Indo-1 הבסיסי, תגובת השיא, 5 דקות לאחר תגובת השיא, והתגובה ליונומיצין. מתחת לכל חלקה מוצג CD4 לעומת צביעת CD8 (משמאל) והעלילה של Indo-1 (ללא סידן) לעומת Indo-1 (קשור לסידן) על תימוציטים חיוביים בודדים (SP) CD4 מגודרים. (B) חלקות של Indo-1 (ללא סידן) לעומת Indo-1 (הקשורות לסידן) על תת-קבוצות מגודרות של תימוציטים מוצגות בכל אחת מארבע נקודות הזמן, תוך שימוש באסטרטגיית gating המוצגת ב-(A). (C) נוצרו חלקות דו-ממדיות המראות צביעה של סך כל התימוציטים, עם הנוגדנים שצוינו. תת-קבוצות ספציפיות היו מגודרות (שורה עליונה) ונבדקו תגובות סידן לעומת זמן (למטה). כחול בהיר (SP) אוכלוסיית CD8+, אוכלוסיית CD4 אדומה (SP), המציגה את הזרם הגדול ביותר של סידן, כתום CD4 + CD8+ תימוציט חיובי כפול, תאי iNKT ירוקים כהים, ירוק בהיר CD25+, תאי T סגולים TCRγδ+ ותאי B CD19+ שחורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: עיכוב תגובת הסידן בתאי T CD8+ שטופלו במעכב מולקולה קטנה של ITK/RLK. במהלך העמסת הצבע Indo-1, טחול טופל בשתי מנות של PRN694, 100 ננומטר (אפור כהה) ו 200 ננומטר (אפור בהיר). (A) יחס הודו-1 (קשור לסידן/ללא סידן) מוצג לעומת זמן עבור תאים לא מטופלים (אדום) ותאים שטופלו ב-PRN694. עקומות מראות תגובת סידן של תאי T CD8+ מגודרים. הקו השחור מייצג את השליטה השלילית של טחול טעון עם Indo-1 ומשטח מוכתם, אבל לא מגורה עם נוגדן נגד CD3. (ב,ג) ניתן לנתח את הנתונים על-ידי חלוקת ציר הזמן המוצג ב-(A) לשמונה מקטעים, המוצגים באופן חזותי עם קווים מנוקדים שחורים, וחישוב השטח שמתחת לעקומה (AUC) (B), או השיפוע של כל עקומה (שיפוע) (C) בכל מרווח זמן של התגובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר בדיקה ממוטבת שנועדה למדוד תגובות סידן בתאי T ראשוניים של מורין העמוסים בצבע אינדיקטור ביחס הודו-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא 7,8. היתרון בביצוע בדיקות שטף סידן באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא הוא היכולת להכפיף צביעת סמן תאי שטח בשילוב עם הערכה של פלואורסצנטיות Indo-1. לציטומטריית זרימה בספקטרום מלא יש יתרון בכך שהיא מאפשרת שימוש בצבעים חופפים מאוד, ובכך מגדילה את מספר הסמנים שניתן להשתמש בהם בלוח. זאת בשל העובדה כי ציטומטר זרימה ספקטרום מלא אוסף את כל אור הלייזר הנפלט על פני מערך של גלאים עבור כל דגימה מנותחת, במקום גלאי אחד ייעודי פלואורוכרום אחד. שימוש בכל הספקטרום של כל פלואור מאפשר רגישות גבוהה יותר של הבדיקה ומספק אמצעי לזיהוי פלואורוכרומים ייחודיים ספקטרלית שיהיו להם אותות חופפים אם ייאספו על ציטומטר זרימה של מעבר פס. זה גם מבטל את הצורך בבידוד מראש של תת-קבוצה של תאים הנחקרים.
במחקר זה, פאנל של סמנים בפני השטח של התא הוערך עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום. פאנל זה כלל αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 ו-CD1d-αgal-cer tetramer-APC; בנוסף, הפאנל כלל את הצבע Ghost540 המת חי. הערוץ האופטימלי לזיהוי כל אחד מהפלואורוכרומים הללו זמין במדריך למשתמש ציטומטר זרימה בספקטרום מלא13. לעומת זאת, הגילוי של Indo-1 (ללא סידן) ו-Indo-1 (קשור לסידן) נקבע אמפירית, אם כי ערוץ שיא משוער לגילוי כל חתימה פלואורסצנטית הוערך בהתבסס על אורכי הגל הידועים של שיא הפליטה עבור שתי הצורות של Indo-1. ניתן גם להמיר את אורכי הגל של שיא הפליטה מאורכי גל של מסנן bandpass המשמשים בציטומטרים רגילים של זרימה ונמדדים בננומטר לערוצים המתאימים שלהם בגלאי Avalanche Photo Diode (APD) המשמשים את ציטומטר זרימת הספקטרום המלא; זה יכול גם לספק הערכה של ערוצים אופטימליים לזיהוי Indo-1 (ללא סידן) ו- Indo-1 (קשור לסידן), בהתאמה. מכיוון שפקדים מוכתמים בודדים כלולים עבור כל תג פלואורסצנטי, תהליך ביטול הערבוב מבטל את החתימות הפלואורסצנטיות, ומאפשר הדמיה של עוצמת הפלואאורוכרום על התאים בכל דגימה. כפי שמתואר בשיטה זו, ניתוח נתונים יכול להתבצע על ידי gating על תת-קבוצות תאים מעניינות והדמיה של היחס בין זיהוי Indo-1 (ללא סידן) ו- Indo-1 (קשור לסידן) לעומת זמן.
יש מגבלות של מבחן זה. לדוגמה, ריכוזים של Indo-1 מתחת ל-3 מיקרומטר לא אפשרו הדמיה מוצלחת של תגובת זרימת הסידן בתאי T. מכיוון שבדיקה זו כוללת גם מדידות ריבוב של תגובת הסידן עם ניתוח של סמנים מרובים בפני השטח של התא על אוכלוסיות הטרוגניות של תאים באמצעות ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא, הכרחי לבצע טיטרציה זהירה של כל הנוגדנים המתויגים פלואורסצנטית המשמשים, כולל אלה המשמשים לבקרות המוכתמות היחידות. זה חשוב ליישום מוצלח של אלגוריתם unmixing ליניארי רגיש מאוד14. בנוסף, לא ניתן היה לדמיין מהלך זמן מלא של זרימת סידן עבור תת-קבוצות תאים המייצגות פחות מ-1% מכלל האוכלוסייה המנותחת. במקום זאת, הערכה של תגובת הסידן בתת-קבוצות נדירות אלה דרשה אסטרטגיית ניתוח חלופית תוך שימוש ברגעים בזמן15. ניתוח הרגעים בזמן מספק תמונות של האותות הפלואורסצנטיים של Indo-1 (ללא סידן) לעומת Indo-1 (קשור לסידן) בשלבים בדידים של תגובת הסידן, ולא לאורך כל מהלך התגובה. לבסוף, חשוב גם להכיר במגבלות השימוש בסמני משטח בודדים כדי להגדיר תת-קבוצות של תאי T. לדוגמה, צביעת תימוציטים בנוגדן α-CD25 אינה מספיקה כדי להבדיל בין תאי T רגולטוריים CD4+ לבין כל אוכלוסיות התימוציט האחרות. זאת בשל העובדה כי רוב תאי אב תימוציט מוקדם (CD4-CD8-) גם לבטא CD2516. זה עשוי להסביר את היעדר תגובת זרימת הסידן הניתנת לזיהוי בתימוציטים CD4 + CD25+ מגודרים .
האופטימיזציה של פרוטוקול זה דרשה הערכה זהירה של מספר משתנים שהיו המפתח להצלחת הבדיקה. אלה כוללים אופטימיזציה של השיבוט הספציפי של נוגדן אנטי CD3 בשימוש, טיטרציה של הריכוז האופטימלי של נוגדן זה, ואת הצורך crosslinking נוגדנים באמצעות מערכת ביוטין / streptavidin המסורתית. עבור תאי T מורינים, ריכוז של 30 מיקרוגרם לדגימה עבור 6 x 106 תאים בנפח 500 μL נמצא ככמות הנוגדנים המינימלית הדרושה לתגובות סידן אופטימליות. באופן מעניין, תגובות סידן חזקות נצפו עם שיבוט נוגדנים נגד CD3 17A2, אך לא עם שיבוט 145-2C11; יתר על כן, בעת שימוש בשיבוט 17A2, הוספת מגיב קרוסלינקינג משני הייתה מיותרת17. בדיקות באמצעות שיבוט אנטי-CD3 ביוטינילציה 17A2 עם או בלי סטרפטאבידין לא הראו שיפור בתגובת הסידן בנוכחות סטרפטאבידין קרוסלינקינג. ייתכן כי נוגדן זה כלל אגרגטים, וכי אגרגטים אלה היוו את יעילות הגירוי של הנוגדן בהיעדר הצלבה גלויה. עם זאת, מכיוון שניסויים אלה בוצעו במשך חודשים רבים עם בקבוקונים שונים של נוגדן אנטי-CD3 זה, התוצאות שהתקבלו היו ניתנות לשחזור רב; לכן, היכולת של נוגדן זה לעורר תאי T אינה צפויה להשתנות בין המשתמשים.
תגובות סידן חזקות בתאי T ראשוניים דורשות שמירה על התאים בטמפרטורה ביולוגית של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל רכישת הדגימה; לעומת זאת, תאי B ראשוניים יראו תגובת סידן לנוגדן אנטי-IgM בטמפרטורת החדר. בהתבסס על הרגישות של תגובת הסידן של תאי T לטמפרטורה, חיוני להבטיח שכל דגימה מטופלת באופן זהה; לדוגמה, יש לחמם כל דגימה ל -37 מעלות צלזיוס באותה שיטה ולמשך אותו משך זמן. בהיעדר עקביות זו, ניתן להבחין בשינויים בתגובות הסידן, אך ייתכן שלא יצביעו על הבדלים רלוונטיים ביולוגית בין הדגימות.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את הפרטים של ביצוע בדיקות שטף סידן המבוססות על הערכת פלואורסצנטיות Indo-1 באמצעות ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא בשילוב עם צביעת סמן תא פני שטח מרובי. השיטה מאפשרת לחוקרים להימנע מהצורך בבידוד או מיון של אוכלוסיות תאים ספציפיות לפני סימון צבע הסידן. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיית ניתוח נוספת המשמשת להדמיה של תגובות סידן ברגעים בדידים בזמן בתוך תת-אוכלוסיות תאים נפרדות. ניתוח רגעים בזמן יכול להיות מיושם בהצלחה על אוכלוסיות נדירות (<1% מכלל האוכלוסייה), אשר אחרת אינם ניתנים לגילוי בעת הערכת כל עקומת תגובת הסידן. בעתיד, ניתן יהיה להרחיב בדיקה זו לשימוש בנוגדנים מצומדים פלואורוכרום נוספים, תוך ניצול היכולות הנרחבות של ציטומטר זרימת הספקטרום המלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.
Acknowledgments
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry משאב משותף, RRID:SCR_021321, תודה רבה לעמיתינו ב- Cytek על דיונים מתמשכים של ניתוח ציטומטרי ספקטרלי מלא בתוכנות Aurora ו- SpectroFlo. דמויות נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M.
- Nolan, J. P., Condello, D.
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
- SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
- FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
