Analyse van T-celreceptor-geïnduceerde calciuminstroom in primaire muizen T-cellen door full spectrum flow cytometrie

Summary

Calciuminflux, een maat voor T-celsignalering, is een effectieve manier om reacties op T-celreceptorstimulatie te analyseren. Dit protocol voor het multiplexen van Indo-1 met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen maakt gebruik van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie.

Abstract

Calciuminstroom als reactie op T-celreceptorstimulatie is een veel voorkomende maat voor T-celsignalering. Verschillende calciumindicatorkleurstoffen zijn ontwikkeld om calciumsignalering te beoordelen door band-pass flowcytometrie. Dit protocol is ontworpen om calciumresponsen in primaire murine T-cellen te meten met behulp van full spectrum flowcytometrie. Totale splenocyten worden gelabeld met de ratiometrische calciumindicatorkleurstof Indo-1, samen met een panel van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen celoppervlakmoleculen. Het benutten van de mogelijkheden van full spectrum flowcytometrie biedt een platform voor het gebruik van een breed scala aan celoppervlakvlekken in combinatie met Indo-1. Cellen worden vervolgens in real-time geanalyseerd bij 37 °C voor en na de toevoeging van een anti-CD3-antilichaam om de T-celreceptor te stimuleren. Na het ontmengen van de spectrale signalen wordt de verhouding van calciumgebonden tot calciumvrije Indo-1 berekend en kan deze in de loop van de tijd worden gevisualiseerd voor elke gated populatie van splenocyten. Deze techniek kan de gelijktijdige analyse van calciumresponsen in meerdere celpopulaties mogelijk maken.

Introduction

T-celreceptor (TCR) geïnduceerde calciuminflux is een nuttige maat voor T-celactivatie en wordt vaak gebruikt om te bepalen of een populatie T-cellen verminderde reacties heeft in de proximale stappen van de TCR-signaleringsroute¹. Metingen van calciuminstroom worden over het algemeen uitgevoerd door de T-cellen vooraf te labelen met één of een paar fluorescerende calciumindicatorkleurstoffen en vervolgens de fluorescerende signalen te onderzoeken met behulp van flowcytometrie in realtime na TCR-crosslinking ^2,3,4. Indo-1, een ratio-metrische calciumkleurstof, wordt geëxciteerd door de UV-laser met piekemissies op twee verschillende golflengten, afhankelijk van calciumbinding⁵, en is een veelgebruikte indicatorkleurstof voor flowcytometrie-analyse van calciumresponsen in levende lymfocyten. Omdat het emissieprofiel van Indo-1 vrij breed is, kan het een uitdaging zijn om Indo-1-beoordeling te combineren met gelijktijdige analyse van meerdere celoppervlakmarkers door band-pass flowcytometrie. Deze beperking beperkt het gebruik van flowcytometrie-analyse van calciumresponsen op voorgezuiverde populaties van T-cellen of op populaties geïdentificeerd door een beperkte set celoppervlakmoleculen.

Om de beperkingen van het meten van calciumresponsen op heterogene populaties van primaire lymfocyten met behulp van band-pass flowcytometrie aan te pakken, werd een protocol ontwikkeld om Indo-1 fluorescentie te meten met behulp van full spectrum flow cytometrie. Deze methode maakt het mogelijk om Indo-1 te multiplexen met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie. Het voordeel van het gebruik van full spectrum flowcytometrie ten opzichte van conventionele flowcytometrie is het vermogen om de fluorescerende signalen te onderscheiden van sterk overlappende kleurstoffen, waardoor het aantal oppervlaktemarkers dat tegelijkertijd in elk monster kan worden beoordeeld, toeneemt. Conventionele flowcytometrie maakt gebruik van bandpassfilters en is beperkt tot één fluorochroom per detectorsysteem⁶. Full spectrum flowcytometrie verzamelt signalen over het gehele spectrum van het fluorochroom met behulp van 64 detectoren op een vijf-laser spectraal flowcytometriesysteem ^7,8. Bovendien maakt full spectrum flowcytometrie gebruik van APD-detectoren (Avalanche Photo Diode) die een verhoogde gevoeligheid hebben ten opzichte van fotomultiplicatorbuisdetectoren die aanwezig zijn op conventionele flowcytometers⁸. Bijgevolg is deze aanpak ideaal voor de heterogene celpopulaties, zoals perifere mononucleaire bloedcellen of muriene secundaire lymfoïde orgaancelsuspensies, omdat het de noodzaak voor de isolatie van specifieke T-celpopulaties voorafgaand aan calciumkleurstofetikettering elimineert. In plaats daarvan kunnen celoppervlakmarkerexpressieprofielen en flowcytometriegating na gegevensverzameling worden gebruikt om calciumresponsen in elke relevante populatie te beoordelen. Zoals aangetoond in dit rapport, kan Indo-1 gemakkelijk worden gecombineerd met acht fluorochroom-geconjugeerde antilichamen, wat resulteert in een totaal van 10 unieke spectrale handtekeningen. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast op mengsels van cellen uit congenetisch verschillende muizenlijnen, waardoor de gelijktijdige analyse van calciumresponsen in wildtype T-cellen mogelijk is in vergelijking met die van een gengerichte muizenlijn.

Protocol

Muizen werden onderhouden op de Anschutz Medical-campus van de Universiteit van Colorado in overeenstemming met IACUC-protocollen. Alle muizen werden geëuthanaseerd volgens de AAALAC-normen.

1. Bereiding van immuuncellen uit de milt van de muis

LET OP: Euthanaseer naïeve muizen met CO 2-euthanasie. C57BL / 6-muizen gekocht bij Jackson Laboratories en intern gefokt, worden gebruikt voor experimenten op de leeftijd van 6-12 weken. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen worden gebruikt voor experimenten.

1. Desinfecteer de muizenhuid met 70% ethanol om de kans te verkleinen dat externe verontreinigingen in het monster terechtkomen.
2. Ontleed de milt van de muis met behulp van dissectiegereedschappen, een chirurgische schaar en een tang. Oogst de milt en plaats de losgemaakte milt in een conische buis van 50 ml met ~ 5 ml complete RPMI-media (cRPMI) op ijs.
   OPMERKING: Complete RPMI bestaat uit 10% FBS, 2 mM L-glutamine en 1% penicilline / streptomycine.
   1. Om de milt van de muis te oogsten, maakt u met een schaar een incisie van 5 cm in de vacht en huid langs de linkerkant van de muis halverwege tussen de voor- en achterpoten. Open de lichaamsholte ~5 cm en verwijder de milt met een tang. De milt is de kleur van een nierboon en is langer en platter dan de naburige nier.
3. Giet de inhoud van stap 1.2 op een steriel filter van 70 μm dat is bevestigd aan een nieuwe conische buis van 50 ml. Scheid de milt mechanisch in een suspensie met één cel door de milt door het filter te duwen met een zuiger van 5 ml spuit totdat er geen miltpulp op het filteroppervlak achterblijft.
4. Pelleteer de splenocyten met behulp van een uitklapbare rotorcentrifuge op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
5. Decanteer het supernatant zorgvuldig. De gepelletiseerde splenocyten blijven op de bodem van de 50 ml conische buis.
6. Om rode bloedcellen te verwijderen, suspensieer de gepelletiseerde splenocyten opnieuw in 1 ml ACK-lysisbuffer gedurende 3 minuten volgens de instructies van de fabrikant. Meng goed.
7. Blus de ACK-lysisbuffer met 15 ml cRPMI.
8. Pellet de lymfocyten zoals aangegeven in stap 1.4.
9. Suspensie van de celsuspensie opnieuw in 5 ml cRPMI in een conische buis van 50 ml. Leg de monsters op ijs.
   1. Om de cellen te tellen, brengt u 10 μL van de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 0,6 ml en verdunt u in een verhouding van 1:1 met trypan blauwe oplossing. Ga vervolgens over naar een hemocytometer of een geautomatiseerd celtelsysteem.
10. Na het tellen, afhankelijk van de celconcentratie in celsuspensie zoals in stap 1.9, pellet je de cellen in een tafelcentrifuge bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten om je voor te bereiden op de toevoeging van cRMPI-media die Indo-1 AM-esterkleurstof bevatten.
11. Bereken het volume voor hersuspensie van de cellen om 10-12 x 10⁶ cellen / ml te bereiken. Dit is een concentratie van 2x van het totale benodigde celgetal.
12. Suspensie van de cellen opnieuw in het volume cRPMI berekend in stap 1.11. Plaats de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ in een conische buis van 50 ml met het deksel geventileerd of in een weefselkweekplaat.

2. Indo-1 ratiometrische kleurstof en fluorescerende antilichaametikettering

1. Voeg volgens de instructies van de fabrikant 50 μL DMSO toe aan een injectieflacon met 50 μg Indo-1 AM. De concentratie van de stamoplossing is 1 μg/μL.
   OPMERKING: DMSO wordt geleverd in microflacons met de kit om oxidatie van DMSO te voorkomen.
2. Verdun het stamaliquot (1 μg/μL) tot het juiste experimentele volume (vastgesteld in 1.11) cRPMI in een concentratie van 6 μg/ml, een concentratie van 2x. Bewaar Indo-1 niet in een waterige oplossing.
   OPMERKING: Andere buffers met toegevoegd calcium kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de celbehoeften.
3. Zet complete media met Indo-1 opzij in een waterbad bij 37 °C.
   OPMERKING: Gebruik de minimale concentratie Indo-1 AM-ester die nodig is om een adequaat signaal te verkrijgen. Dit moet worden getitreerd voor verschillende celtypen. Meestal is een concentratie tussen 3-5 μM voldoende. Voor primaire T-cellen verhoogt het laden van cellen met Indo-1 in een concentratie >5 μg/ml de gemiddelde fluorescerende intensiteit (MFI) boven een log van 6 op spectrale flowcytometers. Als dit gebeurt, verlaagt u de UV-laserintensiteit en titreer de Indo-1 naar een lagere concentratie.
4. Verdun eerder bereide celsuspensie (in stap 1.12), 1:1 in cRPMI, inclusief de 2x Indo-1 media gemaakt in stap 2.2. Zorg ervoor dat de cellen een concentratie hebben tussen 5-6 x 10⁶/ml.
   OPMERKING: Laad geen ongekleurde enkele vlekcontrole of oppervlaktemarkering enkele vlekcelcontroles met Indo-1. Het toevoegen van Indo-1 aan antilichaamcontroles met één vlek zal een meerkleurig monster creëren vanwege de Indo-1 die wordt toegevoegd aan enkele gekleurde cellen. Voeg indo-1 (calciumvrije) EGTA toe aan de monsterplaat die in stap 2.6 is gemaakt.
5. Voeg 1 ml cellen / put / experimentele toestand toe aan een weefselkweekplaat met 12 putten.
6. Maak een enkele gekleurde controle voor Indo-1 (calciumvrij) monster met behulp van eerder Indo-1 kleurstof-geladen cellen en voeg EGTA toe tot een uiteindelijke concentratie van 2 mM. EGTA zal calcium in de celsuspensie cheleren, waardoor een schoner controlemonster ontstaat.
   1. Creëer een Indo-1 positieve controle (Indo-1 calciumgebonden) door 50 μM ionomycine toe te voegen aan de kleurstofgeladen celsuspensie bij de flowcytometer. Ionomycine is een membraandoorlatende calciumionofoor die calciumionen bindt en de overdracht van calciumionen in cellen vergemakkelijkt.
7. Maak een put voor biologische negatieve bestrijding zonder fluoroforen of Indo-1 kleurstof.
8. Maak een put voor enkele kleurcontroles voor eventuele extra celpopulaties van belang (antilichamen die door de gebruiker zijn gedefinieerd) met behulp van antilichaamgeconjugeerde fluoroforen in een flowcytometriepaneelontwerp. Deze zullen de Indo-1 ratiometrische kleurstof niet omvatten.
9. Voeg het Fc-receptorblokkerende antilichaam (~ 2 μg / 1 x 10⁶ cellen) toe, volgens de instructies van de fabrikant, voordat extra fluorochroom-geconjugeerde antilichamen voor oppervlaktekleuring worden toegevoegd.
10. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij 37 °C met 5% CO_2.
11. Resuspensie van de cellen in een plaat met 12 putten door elke 15 minuten zachtjes op de plaat te tikken.
12. Meng en verwijder het volledige volume cellen dat in de media is gesuspendeerd van de 12-putplaat. Voeg vervolgens de celsuspensie toe aan microcentrifugebuizen van 1,7 ml.
13. Pellet de cellen in een microcentrifuge op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Decanteer het supernatant en was de cellen door 1 ml voorverwarmde cRPMI toe te voegen. Pelleteer opnieuw en decanteer het supernatant.
    OPMERKING: Het wassen van de cellen verwijdert alle resterende FC-blokkerende antilichamen.
14. Resuspendeer de cellen in 1 ml cRPMI in microcentrifugebuizen van 1,7 ml en incubeer elke buis bij 37 °C gedurende nog eens 30 minuten bij 5% CO₂, waarbij de bovenkant van de buis iets open blijft om gasuitwisseling mogelijk te maken. Dit maakt volledige de-esterificatie van de intracellulaire AM-esters mogelijk.
15. Breng de cellen indien nodig terug in een weefselkweekplaat met 12 putten. Extra door de gebruiker gedefinieerde getitreerde fluorochroom-geconjugeerde antilichamen kunnen in een rustfase worden toegevoegd.
    OPMERKING: Markeringen die in het methodenpaneel worden gebruikt, zijn: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 en CD1d/α-galcer tetrameer. Markers worden gekozen om T-cel subsets te analyseren.
    1. Maak een mastermix van alle door de gebruiker gedefinieerde fluorochroom-geconjugeerde antilichamen volgens de celtypen van belang bij een eerder getitreerd volume in een microcentrifugebuis van 1,7 ml.
    2. Voeg een berekende mastermix toe voor 1 ml van het celvolume, afhankelijk van getitreerde antilichamen tegen rustcellen.
       OPMERKING: Het voordeel van kleuring bij stap 2.15 in plaats van de latere stap 2.18 is dat kleuring bij stap 2.15 de totale incubatietijd voor het experiment verkort. Kleuring in een totaal volume van 1 ml bij stap 2.15 verhoogt echter het gebruik van antilichamen.
16. Pellet de cellen na rust op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Cellen in een weefselkweekplaat met 12 putten kunnen in de plaat worden gepelletiseerd met een plaatcentrifugeaccessoire. Pellet de cellen anders in een microcentrifugebuis van 1,7 ml.
17. Was de cellen door de pellet opnieuw te gebruiken in 1 ml 4 °C koude cRPMI en pellet de cellen opnieuw zoals in stap 2.16. Plaats de cellen op ijs.
    OPMERKING: Als oppervlaktekleuringscellen afzonderlijk worden gebruikt, is na de-esterificatie bij stap 2.18 minder antilichaamvolume nodig. Oppervlaktekleuring bij deze stap kan worden uitgevoerd na de rustfase in koudestroombuffer (1x DPBS met toegevoegde 1% FBS), met behulp van door de gebruiker gedefinieerde antilichamen, op ijs gedurende 30 minuten. Was de cellen na de vlek in cRPMI zoals in stap 2.17.
    1. Voeg levensvatbaarheidsvlek Ghost540 verdund 1:7.500 in DPBS toe aan monsters volgens de instructies van de fabrikant. Warmte doodt de cellen bij 55 °C op een opwarmblok voor enkelgekleurde levend/dood controle.
       OPMERKING: Levensvatbaarheid functionele kleurstofkleuring om dode cellen te elimineren in flowcytometrische analyse wordt uitgevoerd zonder FBS. FBS kan interageren met aminekleurstoffen volgens de instructies van de fabrikant.
18. Suspensie van afzonderlijke monsters opnieuw in 500 μL cRPMI (fenolroodvrij) met behulp van een polystyreenstroombuis van 5 ml met een dop.
    OPMERKING: Cellen kunnen maximaal een uur bij 4 °C worden bewaard.
19. Verwarm elke buis van 5 ml met cellen, afzonderlijk, tot 37 °C met behulp van een kraalbad gedurende 7 minuten voorafgaand aan de analyse op de flowcytometer, waarbij de tijd tussen de monsters consistent blijft. Gebruik een timer.

3. Kraalbadbuis: temperatuur handhaven tijdens calciumfluxanalyse

1. Voeg badkralen toe aan een klein waterbad, zonder toevoeging van water; opwarmen tot 37 °C.
2. Snijd voorzichtig een conische buis van 50 ml doormidden, bij de markering van 25 ml, met een scheermesje; Gooi de bovenkant van de buis weg.
3. Vul de gehalveerde tube 3/4 van de weg met badparels.
4. Plaats de in stap 3.2 gemaakte buis in het kralenbad dat in stap 3.1 is gemaakt. Breng de tube en kralen op 37 °C.
5. Steek het kraalbad in een stopcontact naast de flowcytometer om de temperatuur te handhaven ter voorbereiding op monsteranalyse.
6. Voeg een conisch piepschuimrek van 50 ml toe om één buis vast te houden om de buis op zijn plaats te plaatsen terwijl hij op de flowcytometer loopt. Dit elimineert de noodzaak om de buis handmatig vast te houden voor de duur van de curve-analyse.

4. Verwerving van calciuminstroom met behulp van flowcytometrische analyse

1. Log in op de flowcytometersoftware op een flowanalysator.
2. Klik op het tabblad Bibliotheek om Indo-1 (calciumgebonden) en Indo-1 (calciumvrij) fluorescerende tags toe te voegen. Selecteer Fluorescerende tags in het softwaremenu aan de linkerkant. Selecteer UV-laser onder fluorescerende taggroepen en klik op +toevoegen om een fluorescerende tagnaam (Indo-1 (calciumgebonden)/Indo-1 (calciumvrij)) aan de bibliotheek toe te voegen. Kies de golflengte van de laserexcitatie en de emissiegolflengte en klik vervolgens op Opslaan. Ga verder met de experimentele opstelling.
   OPMERKING: Indo-1 wordt geëxciteerd door de UV-laser op een golflengte van 355 nm. De emissiegolflengte van Indo-1 (calciumgebonden) is 372 nm. De emissiegolflengte van Indo-1 (calciumvrij) is 514 nm.
3. Klik op het tabblad Acquisitie. Open/maak een nieuw experiment en voeg de gewenste fluorescerende tags toe aan het experiment.
4. Maak referentiegroep en een nieuwe voorbeeldgroep(en) voor het experiment. Label indien nodig zowel de monsters als de referentiegroepen.
5. Stel op het tabblad Acquisities de gebeurtenissen in die moeten worden vastgelegd op het maximum: 10.000.000.
6. Stel het stopvolume in op het maximale volume: 3.000 μL.
7. Stel de stoptijd in op de maximale tijd: 36.000 s.
8. Verkrijg enkele gekleurde controles voor gedefinieerde geconjugeerde antilichamen die zijn opgenomen in het meerkleurige paneel.
9. Verkrijg enkele gekleurde bedieningselementen voor Indo-1 functionele kleurstof.
   1. Voeg 50 μM ionomycine toe aan de calciumgebonden Indo-1 positieve controle. Vortex om te mixen. Voeg de stroombuis toe aan de injectiepoort van het monster en klik op Opnemen.
   2. Voeg calciumvrije Indo-1 negatieve controle toe aan de flowcytometer en klik op Opnemen. EGTA is toegevoegd in stap 2.6.
   3. Verwijder het mixen van de enkele gekleurde besturingselementen door op de knop Unmix te klikken.
      OPMERKING: Alle enkelvoudige gekleurde controles van alle geconjugeerde antilichamen en functionele kleurstoffen moeten worden geregistreerd voordat de monsters worden ontmengd. Om de Unmix-knop te laten werken, moeten eerst alle referentiebesturingselementen worden opgenomen. Ontmengen kan voor of na het verzamelen van monsters.
10. Zodra het ontmengen is voltooid, maakt u opeenvolgende plots met behulp van het niet-gemengde werkblad. SSC-A versus FSC-A verwijderen van vuil uit monster, SSC-A versus SSC-H om doubletten te verwijderen. Dit wordt gevolgd door een opruimpoort voor levensvatbaarheid, samen met verdere gating op populaties van belang. Om poorten aan te maken, klikt u op Plot. Voeg een plot toe aan het werkblad en dubbelklik binnen de poort om een stroomafwaartse gated populatie te maken. Ga door totdat alle populaties van belang zijn meegeteld.
11. Warme enkelgekleurde controlemonsters (van stap 2.6-2.9 in sectie Indo-1 ratiometrische kleurstof en fluorescerende antilichaametikettering) tot 37 °C voor sequentiële analyse. Stel de flowcytometriesoftware in.
12. Laat DI-water gedurende 2-3 minuten op de cytometer lopen om de vloeistofstabiliteit van de flowcytometer te garanderen.
13. Stel opeenvolgende plots in op het ongemengde werkblad door poorten te maken met de poortknoppen Polygoon, Rechthoek of Ellips. Poort om de populatie van belang op te nemen (d.w.z. lymfocyten die SSC-A versus FSC-A gebruiken [discriminatie van grootte / lymfocyten]). Negatieve populaties lijken geclusterd rond nul, terwijl positieve populaties kunnen worden gevisualiseerd door MFI te verhogen. Populaties van belang zullen door de gebruiker worden gedefinieerd op basis van de biologische vraag.
14. Dubbelklik binnen de gemaakte gate en wijzig de parameters van de Y-as en X-as in SSC-A versus SSC-H (singletdiscriminatie). Voltooi het definiëren van de asparameters door met de linkermuisknop op de woorden op de as te klikken.
15. Maak een plot met SSC-A versus levensvatbaarheid kleurstofsignaal (levensvatbaarheidspoortparameters). Poort op levende cellen, die negatief zijn voor aminekleurstofkleuring. Levende cellen, negatief voor levende dode kleuring, zullen clusteren bij de 0-markering op zowel de Y- als de X-as.
16. Dubbelklik op de binnenste plot om een nieuwe plot te maken die alleen eencellige levende lymfocyten bevat. Verander de Y-as in Indo-1 (gebonden-calcium) (V1) en/of Indo-1 (vrij-calcium) (V7) versus tijd op de X-as voor visualisatie van de calciuminstroom.
17. Plaats het verwarmde biologische monster op de SIT van de machine en voer de monsters uit op 2.500-3.000 gebeurtenissen (s) op medium om visualisatie van calciuminstroom in beperkte celaantalpopulaties (bijv. iNKT) mogelijk te maken.
    OPMERKING: Door de cellen te resuspenderen in een concentratie van 1 x 10⁶ / ml, moeten de celgebeurtenissen die worden verzameld met een gemiddelde stroomsnelheid gelijk zijn aan 2.500-3.000 gebeurtenissen / s. Verlaag het debiet onder acquisitiecontrole door op het vervolgkeuzemenu te klikken of verdun het monster als de celsuspensie een verhoogde concentratie heeft. Het uitvoeren van de monsters met een hoge stroomsnelheid kan de verspreiding van het signaal van de ene fluorofoor naar andere fluoroforen in het paneel verhogen.
18. Voeg de volgende tube toe aan het kralenbad om op te warmen tot 37 °C.
19. Druk in de Acquisition Control op Record om de initiële gegevens voor 30 s vast te leggen om een basaal niveau van calciumsignalering in het monster te verkrijgen.
20. Klik in de Acquisition Control op Stop en verwijder de buis uit de Sample Injection Port (SIP).
21. Voeg 30 μg ongeconjugeerd anti-CD3 rechtstreeks toe aan de monsterbuis om de calciuminstroom te initiëren. De uiteindelijke concentratie per buis is 60 μg/ml.
    OPMERKING: Er is geen wasstap na de toevoeging van anti-CD3.
22. Plaats de buis zo snel mogelijk terug op de SIP van de machine en druk op Record in de software.
23. Registreer gegevens gedurende 7 minuten, kijkend naar de tijd die is verstreken onder de acquisitiecontroles in de software, om het tijdsverloop van calciuminstroom binnen de steekproefpopulaties te observeren.
24. Druk na 7 minuten op Stop in de software en voeg 1 μg / ml ionomycine toe. Neem op gedurende 30 s om het maximale calciumsignaal in de cellen van belang te verkrijgen. Om de overdracht van ionomycine naar het volgende monster te beperken, voltooit u twee SIT-spoelingen op het instrument tussen de monsters.
25. Ga verder met het volgende voorbeeld en herhaal de workflow totdat alle monsters zijn verzameld.
26. Sla het experiment op en klik op het zip-bestand exporteren . Ongemengde bestanden (.fsc) worden geüpload naar externe flowcytometrie-analysesoftware.

5. Calcium curve analyse

1. Met behulp van een analysesoftware⁶ voor flowcytometrie, zet Indo-1 fluorescerende signalen om in een verhouding voor time-lapse calciummetingen. Leid parameters af onder het tabblad tools door verwijzingen Indo-1 (calciumgebonden)/Indo-1 (vrij-calcium) in te voegen met behulp van een lineaire schaal. Stel het minimum in op nul en het maximum op basis van de instroom van calciumverhouding, meestal rond de 10. De maximale verhouding varieert per celtype en MFI van Indo-1.
2. Markeer de geselecteerde parameter. Voeg onder tools kinetische analyse toe om de parameter te kiezen door op het tabblad Kinetiek te klikken. Stel de Y-as in op afgeleid.
3. Selecteer MFI (gemiddelde fluorescerende intensiteit) op het tabblad Kinetica.
4. Voeg desgewenst Gaussische gladheid toe. Als u Gaussische afvlakking wilt toevoegen, selecteert u de optie in het vervolgkeuzemenu met statistieken in de stroomanalysesoftware. Gaussische afvlakking kan worden toegevoegd om de visualisatie van de calciuminstroomcurve van de analyse glad te strijken.
5. Maak meerdere bereiken voor statistieken langs het calciumfluxtijdverloop voor biologische vergelijkingen binnen de monsters.
6. Sleep de voorbeelden naar de lay-outeditor en voeg de statistieken naar wens toe. Statistische analyse varieert afhankelijk van de biologische vraag. Voor publicatiedoeleinden worden meerdere replicaties geanalyseerd met behulp van t-test of ANOVA.
7. Voor een moment van tijdsanalyse, zet de poort op een specifiek moment in de tijd langs de calciumflux. Onderzoek de gewenste oppervlaktemarkeringen en poort op de populatie van belang; beoordeel vervolgens een tweedimensionale dot-plot van Indo-1 (calciumvrij) versus Indo-1 (calciumgebonden) voor gated cellen binnen dat moment in het tijdsgebied.

Representative Results

De experimentele workflow om calciumresponsen in primaire murine T-cellen te beoordelen met behulp van een Indo-1 ratiometrische kleurstof met multiplexing oppervlaktevlekken is weergegeven in figuur 1. Na het oogsten en verwerken van de splenocyten van de muis tot een enkele celsuspensie, worden de cellen gekleurd met een Indo-1 AM-ester en het oppervlak gekleurd met fluorochroom-gekoppelde antilichamen. Zodra de kleurstofbelasting en antilichaamkleuring zijn voltooid, worden de lymfocytenmonsters opgewarmd tot een biologische temperatuur (37 °C). De monsters worden vervolgens geanalyseerd met behulp van full spectrum flowcytometrie voor Indo-1 fluorescentie na gating op de gewenste individuele celtypen, zonder dat de monsters voorafgaand aan de analyse hoeven te worden gesorteerd. Om Avalanche Photo Diode (APD) detectoren binnen de full spectrum flow cytometer te gebruiken, is het noodzakelijk om de piekemissiegolflengte van een bandpassfiltergolflengte gemeten in nm om te zetten in het respectieve kanaal op de APD. De tabel in figuur 2 geeft een richtlijn, maar de optimale detectoren voor de twee fluorescentiesignaturen van Indo-1 (calciumgebonden versus calciumvrij) moeten empirisch worden bepaald. Dit wordt bereikt door het bereiden van enkele gekleurde Indo-1 monsters met behulp van Ionomycine om het Indo-1 (calcium-gebonden) signaal te genereren, en EGTA, een calcium chelaatvormer, om het Indo-1 (calciumvrije) signaal te genereren. Na analyse met behulp van full spectrum flowcytometrie kan het kanaal dat de piekfluorescentie-intensiteit voor elke Indo-1-signatuur weergeeft, worden gevisualiseerd (figuur 3A). Door de MFI van de positieve populaties te normaliseren naar die van de negatieve populaties, kan de verschuiving in Indo-1 fluorescentie van calciumvrij naar calciumgebonden worden bepaald (figuur 3B). Deze weergave wordt gegenereerd in een werkmap (.xls) met behulp van referentiebesturingselementen voor zowel gebonden als vrije Indo-1, waarbij een negatieve en positieve intervalpoort wordt getekend met duidelijke positieve en negatieve poorten voor MFI-normalisatie zoals weergegeven in (Figuur 3A). Voorbeeld MFI-statistieken kunnen ook worden verkregen door met de rechtermuisknop op de tabel met statistieken te klikken. Bepaal in de software de MFI-ratio door de positieve populatie te delen door de negatieve populatie en leg de twee spectra op één scherm over elkaar (figuur 3B, rechts). De gele stippelpijl toont de genormaliseerde spectrale verschillen tussen de spectrale handtekeningen van zowel gebonden als vrij Indo-1.

Om calciumresponsen na T-celreceptorstimulatie te evalueren, wordt de Indo-1-fluorescentie beoordeeld na gating op de celpopulaties van belang, zoals weergegeven in figuur 4. Eerst wordt een plot van tijd versus zijverstrooiing (SSC-A) onderzocht om de vloeistofstabiliteit te beoordelen; een stabiel consistent signaal over de tijdsas duidt op stabiliteit (figuur 4A). Vervolgens wordt de voorwaartse versus zijverstrooiing (FSC-A vs. SSC-A) gevisualiseerd en wordt de lymfocytenpopulatie afgesloten zoals weergegeven in (figuur 4B). Na de lymfocytenpoort wordt een enkele celdiscriminatiepoort toegepast door een plot van zijverstrooiingshoogte versus gebied te genereren (SSC-H versus SSC-A), en de singlets, die op de diagonaal vallen, zijn gated zoals weergegeven in figuur 4C. De singlets worden vervolgens beoordeeld op levensvatbaarheid, door kleuring met de levensvatbaarheidskleurstof te onderzoeken en de negatieve populatie te gaten (figuur 4D). Ten slotte wordt voor de analyse van T-cellen een B-cel dump/interne negatieve controlepoort toegepast door gating op de CD19-negatieve populatie (figuur 4E). De CD19-negatieve populatie wordt vervolgens beoordeeld op T-celsubsets met behulp van antilichamen tegen CD4 en CD8 (figuur 4F); het getoonde voorbeeld onderzoekt CD4⁺ T-cellen op calciumresponsen door Indo-1 (calciumgebonden) fluorescentie versus tijd te visualiseren (figuur 4G). Na het gaten op een tijdsegment kan ook de Indo-1 (calciumvrij) versus Indo-1 (calciumgebonden) plot worden gegenereerd (figuur 4H). Deze analyse zal later worden gebruikt om de Indo-1-verhouding af te leiden (zie methoden calciuminfluxcurveanalyse in flowcytometrie-analysesoftware).

Op dit punt in de analyse kan het nuttig zijn om momenten in de tijd te analyseren binnen de tweedimensionale plot van Indo-1 (calciumgebonden) versus tijd in individuele celpopulaties van belang. De optimale tijdspunten omvatten de baseline calcium gebonden aan Indo-1 voorafgaand aan TCR-stimulatie, de piekrespons, een tijdspunt enkele minuten na de piekrespons als intracellulaire calciumspiegels dalen, en ten slotte de calciumrespons die wordt opgewekt door ionomycine toe te voegen (figuur 5A). In het baselinemonster voorafgaand aan anti-CD3-antilichaamtoevoeging wordt een zwak Indo-1 (calciumgebonden) signaal gedetecteerd. Tijdens de piekrespons vertonen de cellen een sterk Indo-1 (calciumgebonden) signaal en een verminderde fluorescentie van Indo-1 (calciumvrij). Op 5 minuten na de piek keerde de Indo-1 fluorescentie bijna terug naar de uitgangswaarde. Nadat ionomycine aan het monster is toegevoegd, kan een robuust signaal van Indo-1 (calciumgebonden) worden gevisualiseerd, waardoor een adequate kleurstofbelasting van de cellen wordt gegarandeerd. Zeldzame celpopulaties (<1%) kunnen moeilijk zijn voor afgeleide analyse; om deze beperking te overwinnen, kan een analyse van de zeldzame populaties worden uitgevoerd door Indo-1 (calciumgebonden) versus Indo-1 (calciumvrij) uit te zetten na gating op elke populatie van belang, zoals CD4 + -cellen, TCRb ⁺ -cellen, TCRyg + -cellen, CD25 + -cellen, iNKT-cellen en CD19 ⁺ -cellen (figuur 5B, C). Let op de gemakkelijk detecteerbare calciumrespons in TCRγδ+ T-cellen en iNKT-cellen (CD1d/α-galcer⁺). Voor de vergelijking van oppervlakte-eiwitten binnen een gemengde muriene T-celpopulatie werden tweedimensionale plots gemaakt met subsets van belang. Hieronder wordt de analyse van de calciumrespons over het gehele tijdsverloop voor elke subset weergegeven (figuur 5C).

Deze test kan ook worden gebruikt om biologische verschillen vast te stellen in T-cellen van wild-type versus gen-gerichte muizen of in T-cellen onbehandeld versus behandeld met farmacologische remmers. In het voorbeeld in figuur 6 werden T-cellen behandeld met PRN694, een kleine molecuulremmer van de T-cel tyrosinekinasen, ITK en RLK ^9,10. Remming van ITK/RLK dempt de T-celreceptorsignalering, wat leidt tot een verminderde calciumrespons na T-celreceptorstimulatie¹¹ (figuur 6A). Om de effecten van ITK/RLK-remming te kwantificeren, kunnen de curven die de verhouding tussen Indo-1 (calciumgebonden) en Indo-1 (calciumvrij) fluorescentie weergeven, vervolgens worden geanalyseerd voor het gebied onder de curve (AUC) of helling van de curve voor elke aandoening (figuur 6B, C). Deze kwantificering wordt uitgevoerd door het tijdsverloop van de calciumrespons in afzonderlijke segmenten te verdelen (figuur 6A) en het gebied onder de curve of de helling van de curve voor elk segment te beoordelen, zoals weergegeven (figuur 6B,C). Over het algemeen toont dit protocol aan dat volledige spectrum flowcytometrie kan worden gebruikt om calciuminstroom te meten, samen met meerdere celoppervlakmarkers in immuuncelpopulaties die worden onderzocht. Deze resultaten tonen aan dat celsubsets die worden vertegenwoordigd op meer dan 1% van de totale populatie kunnen worden beoordeeld op calciuminstroom in de loop van de tijd. Daarentegen vereisen minder overvloedige celsubsets alternatieve analyse met behulp van tijdsmomenten.

Statistische analyse van calciumresponsgegevens is specifiek voor de experimentele vraag en de biologische testen die worden uitgevoerd. In de gegevens die in het manuscript werden gepresenteerd, werden experimenten uitgevoerd met replicaties om experimentele nauwkeurigheid en de robuustheid van de methodologie te garanderen; Meerdere experimenten op verschillende biologische monsters gedurende verschillende dagen werden echter niet uitgevoerd. Daarom zou het niet passend zijn om statistische analyses uit te voeren op de gepresenteerde gegevens.

Figuur 1: Schematische van calcium assay workflow. Het gebruik van de Indo-1 AM ester calcium indicator kleurstof biedt een hulpmiddel om de instroom van calcium in immuuncellen en hun subpopulaties te visualiseren. Dit schema schetst de workflow voor de analyse van calciumresponsen in muriene milt T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Conversie van PMT-golflengten naar APD-kanalen. De full spectrum flow cytometer heeft 16 detectoren om fluorescerende emissies te detecteren na excitatie door de UV-laser. De specificaties van elke detector zijn aangegeven in de tabel. Gemarkeerd zijn de twee detectoren die worden gebruikt voor de beoordeling van Indo-1-fluorescentie, zoals empirisch werden bepaald met behulp van enkele gekleurde controles. Conversies naar APD-golflengte en gebruikershandleiding voor spectrale flowcytometer zijn beschikbaar¹¹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Visualisatie van de Indo-1 spectrale signatuur. (A) Boven: Spectrale signatuur van Indo-1 fluorescentie in CD8⁺ T-cellen na introductie van ionomycine om een robuuste instroom van calcium op te wekken. De piek van Indo-1 (calciumgebonden) kan worden gevisualiseerd in UV1. Onder: Spectrale signatuur van Indo-1 (calciumvrij) met de piekfluorescentie in UV7. Dit controlemonster werd gegenereerd door Indo-1-geladen cellen te behandelen met EGTA¹² om extracellulair vrij calcium te cheleren. (B) Gecombineerde vijf laserspectrumoverlay van de Indo-1-signatuur, met ruwe spectrale MFI aan de linkerkant en de genormaliseerde spectra van Indo-1 gebonden versus vrije Indo-1 aan de rechterkant. Visualisatie van de verschuiving van Indo-1 (calciumvrij) in oranje naar Indo-1 (calciumgebonden) in blauw kan gemakkelijk worden gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Gating strategie voor visualisatie van calciumresponsen. De workflow voor sequentiële gating van de monsters wordt geschetst. (A) Fluidic stability wordt onderzocht met behulp van een tijd versus SSC-A gate. (B) FSC-A versus SSC-A wordt gebruikt om lymfocyten te gaten, waardoor celresten en resterende rode bloedcellen in het monster worden geëlimineerd. (C) Enkele cellen worden afgesloten met behulp van een SSC-H versus SSC-A plot. (D). De singlet gate wordt vervolgens toegepast op een plot van levend-dode Ghost540 versus SSC-A; gating op Ghost540-negatieve cellen elimineert niet-levensvatbare cellen uit latere analyse. (E) Levende cellen worden geanalyseerd op CD19 versus SSC-A en CD19-negatieve cellen (niet-B-cellen) worden afgesloten. (F) De CD19-negatieve cellen worden onderzocht op CD4 versus CD8 kleuring. (G) CD4⁺ cellen worden vervolgens afgesloten om de tijd versus Indo-1 (calciumgebonden) te visualiseren. (H) Een moment in de tijd wordt geselecteerd om de initiatie van de calciuminfluxrespons na toevoeging van anti-CD3-antilichamen weer te geven door Indo-1 (calciumvrij) versus Indo-1 (calciumgebonden) fluorescentie te visualiseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Visualisatie van Indo-1 fluorescentie in gated populaties van murine thymocyten op discrete tijdstippen in de calciumrespons. Totale thymocyten werden gestimuleerd met anti-CD3-antilichaam gevolgd door ionomycine na 6 minuten van de monsterverzameling. Op vier discrete tijdstippen, zoals aangegeven in de rechthoekige vakken op de tweedimensionale tijdsplots versus Indo-1 (calciumgebonden), werden verschillende subpopulaties van thymocyten onderzocht op calciumresponsen. (A) Tweedimensionale plots met gating voor het baseline Indo-1-signaal, de piekrespons, 5 min post-peak respons en de respons op ionomycine. Onder elke plot wordt CD4 versus CD8-kleuring (links) en de plot van Indo-1 (calciumvrij) versus Indo-1 (calciumgebonden) op gated CD4 single positive (SP) thymocyten getoond. (B) Plots van Indo-1 (calciumvrij) versus Indo-1 (calciumgebonden) op gated subsets van thymocyten worden weergegeven op elk van de vier tijdstippen, met behulp van de gating-strategie weergegeven onder (A). (C) Er werden tweedimensionale plots gemaakt met kleuring van het totaal aantal thymocyten met de aangegeven antilichamen. Specifieke subgroepen werden omheind (bovenste rij) en onderzocht op calciumresponsen versus tijd (onder). Lichtblauwe (SP) CD8+ populatie, rode (SP) CD4 populatie, die de grootste instroom van calcium vertoont, oranje CD4⁺CD8+ dubbelpositieve thymocyten, donkergroene iNKT cellen, lichtgroene CD25+, paarse TCRγδ+ T-cellen, en zwarte CD19⁺ B cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Remming van de calciumrespons in CD8⁺ T-cellen behandeld met een kleine molecuulremmer van ITK/RLK. Tijdens de Indo-1 kleurstofbelasting werden splenocyten behandeld met twee doses PRN694, 100 nM (donkergrijs) en 200 nM (lichtgrijs). (A) Indo-1-verhouding (calciumgebonden/calciumvrij) wordt weergegeven versus tijd voor onbehandelde cellen (rood) en cellen behandeld met PRN694. Curven tonen de calciumrespons van gated CD8⁺ T-cellen. De zwarte lijn vertegenwoordigt de negatieve controle van splenocyten geladen met Indo-1 en oppervlak gekleurd, maar niet gestimuleerd met anti-CD3-antilichaam. (B,C) De gegevens kunnen worden geanalyseerd door de tijdas weergegeven in (A) te verdelen in acht segmenten, gevisualiseerd met zwarte stippellijnen, en het gebied onder de curve (AUC) (B) of de helling van elke curve (helling) (C) te berekenen op elk tijdsinterval van de respons. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde test die is ontworpen om calciumresponsen te meten in primaire muizen T-cellen geladen met getitreerde Indo-1 ratiometrische indicatorkleurstof met behulp van full spectrum flowcytometrie ^7,8. Het voordeel van het uitvoeren van calciumfluxtesten met behulp van volledige spectrum flowcytometrie is de mogelijkheid om oppervlaktecelmarkerkleuring te multiplexen in combinatie met beoordeling van Indo-1-fluorescentie. Full spectrum flowcytometrie heeft het voordeel dat het gebruik van sterk overlappende kleurstoffen mogelijk is, waardoor het aantal markers dat in een paneel kan worden gebruikt, toeneemt. Dit komt door het feit dat de full spectrum flow cytometer al het laserlicht verzamelt dat wordt uitgezonden over een reeks detectoren voor elk geanalyseerd monster, in plaats van één detector te hebben die is gewijd aan één fluorochroom. Het gebruik van het volledige spectrum van elke fluor zorgt voor een hogere gevoeligheid van de test en biedt een middel om spectraal unieke fluorochromen te identificeren die overlappende signalen zouden hebben als ze zouden worden verzameld op een band-pass flowcytometer. Dit elimineert ook de noodzaak van pre-isolatie van een celsubset die wordt onderzocht.

In deze studie werd een panel van celoppervlakmarkers beoordeeld met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen. Dit panel bestond uit αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 en CD1d-αgal-cer tetrameer-APC; daarnaast bevatte het paneel de levend-dode Ghost540-kleurstof. Het optimale kanaal om elk van deze fluorochromen te detecteren is beschikbaar in de gebruikershandleiding van de full spectrum flow cytometer¹³. Daarentegen werd de detectie van Indo-1 (calciumvrij) en Indo-1 (calciumgebonden) empirisch bepaald, hoewel een geschat piekkanaal voor detectie van elke fluorescerende signatuur werd geschat op basis van de bekende piekemissiegolflengten voor de twee vormen van Indo-1. Het is ook mogelijk om de piekemissiegolflengten van bandpass-filtergolflengten die worden gebruikt op conventionele flowcytometers en gemeten in nm om te zetten naar hun respectieve kanalen op de Avalanche Photo Diode (APD) -detectoren die worden gebruikt door de full spectrum flow cytometer; dit kan ook een schatting geven van optimale kanalen om respectievelijk Indo-1 (calciumvrij) en Indo-1 (calciumgebonden) te detecteren. Omdat enkele gekleurde besturingselementen zijn opgenomen voor elke fluorescerende tag, deconvolueert het ontmengingsproces de fluorescerende handtekeningen, waardoor de intensiteit van elk fluorochroom op cellen in elk monster kan worden gevisualiseerd. Zoals beschreven in deze methode, kan data-analyse worden uitgevoerd door te gaten op celsubsets van belang en de verhouding van detecteren Indo-1 (calciumvrij) en Indo-1 (calciumgebonden) versus tijd te visualiseren.

Er zijn beperkingen aan deze test. Concentraties van Indo-1 onder 3 μM maakten bijvoorbeeld geen succesvolle visualisatie van de calciuminstroomrespons in T-cellen mogelijk. Aangezien deze test ook multiplexingmetingen van de calciumrespons mogelijk maakt met analyse van meerdere celoppervlakmarkers op heterogene populaties van cellen met behulp van volledige spectrumflowcytometrie, is het noodzakelijk om alle fluorescerend gelabelde antilichamen die worden gebruikt, inclusief die welke worden gebruikt voor de enkelvoudige gekleurde controles, zorgvuldig te titreren. Dit is belangrijk voor een succesvolle implementatie van het zeer gevoelige lineaire ontmengalgoritme¹⁴. Bovendien kon een volledig tijdsverloop van calciuminstroom niet worden gevisualiseerd voor celsubsets die minder dan 1% van de totale populatie vertegenwoordigen die wordt geanalyseerd. In plaats daarvan vereiste een beoordeling van de calciumrespons in deze zeldzame subgroepen een alternatieve analysestrategie met behulp van momenten in tijd¹⁵. De momentenanalyse biedt momentopnamen van de fluorescerende signalen van Indo-1 (calciumvrij) versus Indo-1 (calciumgebonden) in discrete stadia van de calciumrespons, in plaats van het volledige tijdsverloop van de respons. Ten slotte is het ook belangrijk om de beperkingen te herkennen van het gebruik van enkele oppervlaktemarkeringen om subsets van T-cellen te definiëren. Het kleuren van thymocyten met α-CD25-antilichaam is bijvoorbeeld niet voldoende om CD4+ regulerende T-cellen te onderscheiden van alle andere thymocytenpopulaties. Dit komt door het feit dat de meerderheid van de vroege thymocytenvoorloper (CD4-CD8-) cellen ook CD25¹⁶ tot expressie brengen. Dit verklaart waarschijnlijk de afwezigheid van een detecteerbare calciuminfluxrespons in gated CD4 + CD25 + thymocyten.

De optimalisatie van dit protocol vereiste een zorgvuldige beoordeling van verschillende variabelen die essentieel waren voor het succes van de test. Deze omvatten optimalisatie van de specifieke kloon van het gebruikte anti-CD3-antilichaam, titratie van de optimale concentratie van dit antilichaam en de noodzaak van antilichaamverknoping met behulp van het traditionele biotine / streptavidin-systeem. Voor murine T-cellen bleek de concentratie van 30 μg/monster voor 6 x 10⁶ cellen in een volume van 500 μL de minimale hoeveelheid antilichaam te zijn die nodig is voor een optimale calciumrespons. Interessant is dat robuuste calciumresponsen werden waargenomen met anti-CD3-antilichaamkloon 17A2, maar niet met kloon 145-2C11; bovendien was bij gebruik van kloon 17A2 het toevoegen van een secundair crosslinking-reagens niet nodig¹⁷. Tests met gebiotinyleerde anti-CD3-kloon 17A2 met of zonder streptavidin toonden geen versterking van de calciumrespons in aanwezigheid van streptavidine-crosslinking. Het is mogelijk dat dit antilichaam aggregaten bevatte en dat deze aggregaten verantwoordelijk waren voor de stimulatie-werkzaamheid van het antilichaam bij afwezigheid van openlijke cross-linking. Omdat deze experimenten echter in de loop van vele maanden werden uitgevoerd met verschillende injectieflacons van dit anti-CD3-antilichaam, waren de verkregen resultaten zeer reproduceerbaar; daarom is het niet waarschijnlijk dat het vermogen van dit antilichaam om T-cellen te stimuleren varieert tussen gebruikers.

Robuuste calciumresponsen in primaire T-cellen vereisen het handhaven van de cellen op de biologische temperatuur van 37 °C gedurende de hele monsterverwerving; primaire B-cellen daarentegen vertonen een calciumrespons op anti-IgM-antilichamen bij kamertemperatuur. Op basis van de gevoeligheid van de T-cel calciumrespons op temperatuur, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat elk monster hetzelfde wordt behandeld; Zo moet elk monster volgens dezelfde methode en voor dezelfde duur worden opgewarmd tot 37 °C. Bij afwezigheid van deze consistentie kunnen variaties in calciumresponsen worden waargenomen, maar zijn mogelijk niet indicatief voor biologisch relevante verschillen tussen monsters.

Samenvattend beschrijft dit protocol de details van het uitvoeren van calciumfluxtests op basis van de beoordeling van Indo-1-fluorescentie met behulp van volledige spectrumflowcytometrie in combinatie met multiplex-oppervlaktecelmarkerkleuring. De methode stelt onderzoekers in staat om de noodzaak van isolatie of sortering van specifieke celpopulaties voorafgaand aan calciumkleurstofetikettering te vermijden. Bovendien schetst dit protocol een aanvullende analysemethodologie die wordt gebruikt om calciumresponsen op discrete momenten in de tijd binnen verschillende celsubpopulaties te visualiseren. De momentenanalyse kan met succes worden toegepast op zeldzame (<1% van de totale) celpopulaties, die anders niet detecteerbaar zijn bij het beoordelen van het geheel van de calciumresponscurve. In de toekomst zou deze test kunnen worden uitgebreid met het gebruik van extra fluorochroom-geconjugeerde antilichamen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de uitgebreide mogelijkheden van de volledige spectrum flowcytometer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well TC treated plates	Cell Treat	229111
50 mL conical	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes	Corning	352052
5mL syringe	BD syringe	309646	plunger only is used sheith is discarded
70uM filter	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Cell Incubator	Formal Scientific
Dissection Tools forceps	McKesson	#487593	Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors	McKesson	#970135	Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye
ionomycin	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL	Light Labs	A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Block
RPMI	Gibco	1875093	+ phenol red
RPMI phenol free	Gibco	11835030	-phenol red
Table top centrifuge	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack		Product No: C06019	Includes Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Dry bath