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Immunology and Infection

फुल स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्राथमिक मुराइन टी-कोशिकाओं में टी-सेल रिसेप्टर-प्रेरित कैल्शियम प्रवाह का विश्लेषण

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64526
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

Summary

कैल्शियम प्रवाह, टी-सेल सिग्नलिंग का एक उपाय, टी-सेल रिसेप्टर उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने का एक प्रभावी तरीका है। सेल सतह अणुओं पर निर्देशित एंटीबॉडी के पैनलों के साथ इंडो -1 को मल्टीप्लेक्स करने के लिए यह प्रोटोकॉल पूर्ण स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री की अत्यधिक लचीली क्षमताओं का लाभ उठाता है।

Abstract

टी-सेल रिसेप्टर उत्तेजना के जवाब में कैल्शियम प्रवाह टी-सेल सिग्नलिंग का एक सामान्य उपाय है। बैंड-पास फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कैल्शियम सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए कई कैल्शियम संकेतक रंजक विकसित किए गए हैं। यह प्रोटोकॉल पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके प्राथमिक मुराइन टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कुल स्प्लेनोसाइट्स को सेल सतह अणुओं के लिए फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के एक पैनल के साथ अनुपातमेट्रिक कैल्शियम संकेतक डाई इंडो -1 के साथ लेबल किया जाता है। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री की क्षमताओं का लाभ उठाना इंडो -1 के साथ संयोजन में सेल सतह के दाग की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करने के लिए एक मंच प्रदान करता है। टी-सेल रिसेप्टर को उत्तेजित करने के लिए एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी को जोड़ने से पहले और बाद में कोशिकाओं का वास्तविक समय में 37 डिग्री सेल्सियस पर विश्लेषण किया जाता है। वर्णक्रमीय संकेतों को अनमिक्स करने के बाद, कैल्शियम-बाध्य और कैल्शियम मुक्त इंडो -1 के अनुपात की गणना की जाती है और स्प्लेनोसाइट्स की प्रत्येक गेटेड आबादी के लिए समय के साथ कल्पना की जा सकती है। यह तकनीक कई सेल आबादी में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के एक साथ विश्लेषण की अनुमति दे सकती है।

Introduction

टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) प्रेरित कैल्शियम प्रवाह टी-सेल सक्रियण का एक उपयोगी उपाय है और अक्सर यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि टी-कोशिकाओं की आबादी ने टीसीआर सिग्नलिंग मार्ग1 के समीपस्थ चरणों में बिगड़ा हुआ प्रतिक्रियाएं हैं या नहीं। कैल्शियम प्रवाह के माप आम तौर पर टी-कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक रंगों की एक या एक जोड़ी के साथ पूर्व-लेबल करके किए जाते हैं, और फिर टीसीआर क्रॉस-लिंकिंग 2,3,4 के बाद वास्तविक समय में फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके फ्लोरोसेंटसंकेतों की जांच करते हैं। इंडो -1, एक अनुपात-मीट्रिक कैल्शियम डाई, कैल्शियम बाइंडिंग5 पर निर्भर दो अलग-अलग तरंग दैर्ध्य पर चरम उत्सर्जन के साथ यूवी लेजर द्वारा उत्साहित है, और जीवित लिम्फोसाइटों में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला संकेतक डाई है। चूंकि इंडो -1 का उत्सर्जन प्रोफाइल काफी व्यापक है, इसलिए बैंड-पास फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कई सेल सतह मार्करों के एक साथ विश्लेषण के साथ इंडो -1 मूल्यांकन को जोड़ना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह सीमा टी-कोशिकाओं की पूर्व-शुद्ध आबादी या सेल सतह अणुओं के सीमित सेट द्वारा पहचानी गई आबादी के लिए कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के उपयोग को प्रतिबंधित करती है।

बैंड-पास फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके प्राथमिक लिम्फोसाइटों की विषम आबादी पर कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को मापने की सीमाओं को संबोधित करने के लिए, पूर्ण स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके इंडो -1 फ्लोरेसेंस को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। यह विधि पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री की अत्यधिक लचीली क्षमताओं का लाभ उठाते हुए, सेल सतह अणुओं पर निर्देशित एंटीबॉडी के पैनलों के साथ इंडो -1 को मल्टीप्लेक्स करने की अनुमति देती है। पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री पर पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने का लाभ फ्लोरोसेंट संकेतों को अत्यधिक अतिव्यापी रंगों से अलग करने की क्षमता है, जिससे सतह मार्करों की संख्या बढ़ जाती है जिन्हें प्रत्येक नमूने में एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। पारंपरिक फ्लो साइटोमेट्री बैंडपास फिल्टर का उपयोग करता है और एक फ्लोरोक्रोम प्रति डिटेक्टर सिस्टम6 तक सीमित है। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री पांच-लेजर वर्णक्रमीय प्रवाह साइटोमेट्री सिस्टम 7,8 पर 64 डिटेक्टरों का उपयोग करके फ्लोरोक्रोम के पूरे स्पेक्ट्रम में संकेत एकत्र करता है। इसके अलावा, पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री एपीडी (हिमस्खलन फोटो डायोड) डिटेक्टरों का लाभ उठाती है जिन्होंने पारंपरिक प्रवाह साइटोमीटर 8 पर मौजूद फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब डिटेक्टरों के सापेक्ष संवेदनशीलता में वृद्धि कीहै। नतीजतन, यह दृष्टिकोण विषम कोशिका आबादी के लिए आदर्श है, जैसे परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं या मुराइन माध्यमिक लिम्फोइड अंग कोशिका निलंबन, क्योंकि यह कैल्शियम डाई लेबलिंग से पहले विशिष्ट टी-सेल आबादी के अलगाव की आवश्यकता को समाप्त करता है। इसके बजाय, डेटा संग्रह के बाद सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल और फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग का उपयोग रुचि की प्रत्येक आबादी में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। जैसा कि इस रिपोर्ट में दिखाया गया है, इंडो -1 को आसानी से आठ फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कुल 10 अद्वितीय वर्णक्रमीय हस्ताक्षर होते हैं। इसके अलावा, इस विधि को आसानी से अलग-अलग माउस लाइनों से कोशिकाओं के मिश्रण पर लागू किया जा सकता है, जिससे जीन-लक्षित माउस लाइन की तुलना में जंगली-प्रकार की टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के एक साथ विश्लेषण की अनुमति मिलती है।

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Protocol

चूहों को आईएसीयूसी प्रोटोकॉल के अनुसार कोलोराडो विश्वविद्यालय एंशुट्ज़ मेडिकल कैंपस में बनाए रखा गया था। सभी चूहों को एएएएलएसी मानकों के अनुसार इच्छामृत्यु दी गई थी।

1. माउस प्लीहा से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तैयारी

नोट: सीओ2 इच्छामृत्यु के साथ भोले चूहों को इच्छामृत्यु दें। जैक्सन लेबोरेटरीज से खरीदे गए सी 57बीएल /6 चूहों और इन-हाउस नस्लों का उपयोग 6-12 सप्ताह की उम्र में प्रयोगों के लिए किया जाता है। प्रयोगों के लिए नर और मादा दोनों चूहों का उपयोग किया जाता है।

  1. नमूने में बाहरी दूषित पदार्थों की संभावना को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस की त्वचा को कीटाणुरहित करें।
  2. विच्छेदन उपकरण, सर्जिकल कैंची और बल का उपयोग करके माउस प्लीहा को विच्छेदित करें। तिल्ली को काटें और अलग प्लीहा को बर्फ पर ~ 5 एमएल पूर्ण आरपीएमआई मीडिया (सीआरपीएमआई) के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
    नोट: पूर्ण आरपीएमआई में 10% एफबीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं।
    1. माउस तिल्ली की कटाई के लिए, कैंची के साथ आगे और पीछे के पैरों के बीच आधे रास्ते में माउस के बाईं ओर फर और त्वचा में 5 सेमी का चीरा लगाएं। शरीर गुहा ~ 5 सेमी खोलें और बल का उपयोग करके प्लीहा को हटा दें। तिल्ली एक किडनी बीन का रंग है और पड़ोसी गुर्दे की तुलना में लंबा और चापलूसी है।
  3. चरण 1.2 की सामग्री को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से जुड़े बाँझ 70 μm फ़िल्टर पर डालें। यांत्रिक रूप से प्लीहा को 5 एमएल सिरिंज प्लंजर के साथ फ़िल्टर के माध्यम से धक्का देकर एक एकल सेल निलंबन में अलग करें जब तक कि फ़िल्टर की सतह पर कोई प्लीहा गूदा न रह जाए।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर स्विंग-आउट रोटर काउंटरटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके स्प्लेनोसाइट्स को पेलेट करें।
  5. सुपरनैटेंट को सावधानी से हटा दें। पेलेट स्प्लेनोसाइट्स 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के तल पर रहते हैं।
  6. लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 3 मिनट के लिए एसीके लाइसिस बफर के 1 एमएल में पेलेट स्प्लेनोसाइट्स को फिर से निलंबित करें। अच्छी तरह मिलाएं।
  7. 15 एमएल सीआरपीएमआई के साथ एसीके लाइसिस बफर को बुझाएं।
  8. चरण 1.4 में निर्देशित लिम्फोसाइटों को गोली मार दें।
  9. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सीआरपीएमआई के 5 एमएल में सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें। नमूने को बर्फ पर रखें।
    1. कोशिकाओं की गणना करने के लिए, सेल निलंबन के 10 μL को 0.6 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्रिपैन ब्लू समाधान के साथ 1: 1 अनुपात में पतला करें। फिर, हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल गिनती प्रणाली में स्थानांतरित करें।
  10. गिनती के बाद, चरण 1.9 में सेल निलंबन में सेल एकाग्रता के आधार पर, इंडो -1 एएम एस्टर डाई युक्त सीआरएमपीआई मीडिया को जोड़ने के लिए तैयार करने के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम पर टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में कोशिकाओं को गोली मार दें।
  11. 10-12 x 106 कोशिकाओं / एमएल को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के पुन: निलंबन के लिए मात्रा की गणना करें। यह आवश्यक कुल सेल गिनती की 2x एकाग्रता है।
  12. चरण 1.11 में गणना की गई सीआरपीएमआई की मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर या तो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ढक्कन छिद्रित या ऊतक संस्कृति प्लेट के साथ रखें।

2. इंडो -1 अनुपातमेट्रिक डाई और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी लेबलिंग

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, इंडो -1 एएम के 50 μg वाली शीशी में 50 μL DMSO जोड़ें। स्टॉक समाधान की एकाग्रता 1 μg / μL है।
    नोट: डीएमएसओ के किसी भी ऑक्सीकरण को रोकने के लिए किट के साथ माइक्रो-शीशियों में डीएमएसओ प्रदान किया जाता है।
  2. स्टॉक एलिकोट (1 μg/μL) को cRPMI के उपयुक्त प्रयोगात्मक आयतन (1.11 में स्थापित) में 6 μg/mL, एक 2x सांद्रता पर पतला करें। इंडो -1 को जलीय घोल में स्टोर न करें।
    नोट: सेल की जरूरतों के आधार पर अतिरिक्त कैल्शियम के साथ अन्य बफर का उपयोग किया जा सकता है।
  3. इंडो -1 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पूरा मीडिया सेट करें।
    नोट: पर्याप्त सिग्नल प्राप्त करने के लिए आवश्यक इंडो -1 एएम एस्टर की न्यूनतम एकाग्रता का उपयोग करें। इसे अलग-अलग सेल प्रकारों के लिए टाइटरेट करने की आवश्यकता है। आमतौर पर, 3-5 μM के बीच एकाग्रता पर्याप्त है। प्राथमिक टी-कोशिकाओं के लिए, इंडो -1 के साथ >5 μg / mL सांद्रता पर कोशिकाओं को लोड करने से वर्णक्रमीय प्रवाह साइटोमीटर पर 6 के लॉग से ऊपर औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) बढ़ जाती है। यदि ऐसा होता है, तो यूवी लेजर तीव्रता को कम करें और इंडो -1 को कम एकाग्रता तक सीमित करें।
  4. पहले से तैयार सेल सस्पेंशन (चरण 1.12 में), सीआरपीएमआई में 1: 1, जिसमें चरण 2.2 में किए गए 2x इंडो -1 मीडिया शामिल हैं। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं 5-6 x 106 / एमएल के बीच एकाग्रता पर हैं।
    नोट: इंडो -1 के साथ बिना दाग वाले एकल दाग नियंत्रण या सतह मार्कर एकल दाग सेल नियंत्रण को डाई न करें। सिंगल स्टेन एंटीबॉडी कंट्रोल में इंडो-1 को जोड़ने से सिंगल दाग वाली कोशिकाओं में जोड़े गए इंडो-1 के कारण एक बहु-रंग नमूना तैयार होगा। चरण 2.6 में बनाई गई नमूना प्लेट में इंडो -1 (कैल्शियम मुक्त) ईजीटीए अतिरिक्त नियंत्रण शामिल करें।
  5. 12-वेल टिशू कल्चर प्लेट में 1 एमएल कोशिकाओं / अच्छी तरह से / प्रयोगात्मक स्थिति जोड़ें।
  6. पहले इंडो -1 डाई-लोडेड कोशिकाओं का उपयोग करके इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) नमूने के लिए एक एकल दाग नियंत्रण बनाएं और ईजीटीए को 2 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। ईजीटीए सेल निलंबन में कैल्शियम को चेलेट करेगा, जिससे एक क्लीनर नियंत्रण नमूना मिलेगा।
    1. प्रवाह साइटोमीटर पर डाई लोडेड सेल सस्पेंशन में 50 μM आयनमाइसिन जोड़कर एक इंडो -1 सकारात्मक नियंत्रण (इंडो -1 कैल्शियम-बाध्य) बनाएं। आयोनोमाइसिन एक झिल्ली पारगम्य कैल्शियम आयोनोफोर है जो कैल्शियम आयनों को बांधता है और कोशिकाओं में कैल्शियम आयनों के हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करता है।
  7. बिना फ्लोरोफोरे या इंडो -1 डाई के जैविक नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक कुआं बनाएं।
  8. फ्लो साइटोमेट्री पैनल डिज़ाइन में एंटीबॉडी संयुग्मित फ्लोरोफोरेस का उपयोग करके रुचि के किसी भी अतिरिक्त सेल आबादी (एंटीबॉडी उपयोगकर्ता परिभाषित) के लिए एकल दाग नियंत्रण के लिए एक कुआं बनाएं। इनमें इंडो-1 रेशियोमेट्रिक डाई शामिल नहीं होगी।
  9. सतह धुंधला होने के लिए अतिरिक्त फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ने से पहले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एफसी रिसेप्टर ब्लॉकिंग एंटीबॉडी (~ 2 μg / 1 x 106 कोशिकाएं) जोड़ें।
  10. प्लेट को 5% CO2 के साथ 37 °C पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. हर 15 मिनट में प्लेट को धीरे से टैप करके कोशिकाओं को 12-वेल प्लेट में पुन: निलंबित करें।
  12. 12-वेल प्लेट से मीडिया में निलंबित कोशिकाओं की पूरी मात्रा को मिलाएं और हटा दें। फिर सेल निलंबन को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में जोड़ें।
  13. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में कोशिकाओं को गोली मार दें। सुपरनैटेंट को डिकैंट करें और पूर्व-गर्म सीआरपीएमआई के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। फिर से गोली चलाओ और सुपरनैटेंट को अलग करो।
    नोट: कोशिकाओं को धोने से किसी भी शेष एफसी ब्लॉकिंग एंटीबॉडी को हटा दिया जाता है।
  14. 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सीआरपीएमआई के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और प्रत्येक ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, जिससे गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए ट्यूब का शीर्ष थोड़ा खुला रह जाता है। यह इंट्रासेल्युलर एएम एस्टर के पूर्ण डी-एस्टरीफिकेशन की अनुमति देता है।
  15. यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को 12-अच्छी तरह से ऊतक संवर्धन प्लेट में वापस स्थानांतरित करें। अतिरिक्त उपयोगकर्ता परिभाषित टाइटेटेड फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी को आराम के चरण में जोड़ा जा सकता है।
    नोट: विधि पैनल में उपयोग किए जाने वाले मार्करों में शामिल हैं: घोस्ट 540, सीडी 4, सीडी 8, टीसीआर, टीसीआर, सीडी 25, और सीडी 1 डी / α-गॉल्सर टेट्रामर। मार्करों को टी-सेल उपसमुच्चय का विश्लेषण करने के लिए चुना जाता है।
    1. 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पहले से टाइटेटेड वॉल्यूम पर सेल प्रकार की रुचि के अनुसार सभी उपयोगकर्ता-परिभाषित फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी का एक मास्टर मिश्रण बनाएं।
    2. सेल वॉल्यूम के 1 एमएल के लिए एक गणना मास्टर मिश्रण जोड़ें, जो आराम करने वाली कोशिकाओं के लिए टाइटेटेड एंटीबॉडी पर निर्भर करता है।
      नोट: बाद के चरण 2.18 के बजाय चरण 2.15 पर धुंधला होने का लाभ यह है कि चरण 2.15 पर धुंधला होने से प्रयोग के लिए समग्र इनक्यूबेशन समय कम हो जाएगा। हालांकि, चरण 2.15 पर 1 एमएल की कुल मात्रा में धुंधला होने से एंटीबॉडी का उपयोग बढ़ जाता है।
  16. आराम करने के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं को छर्रेट करें।
    नोट: 12-वेल टिशू कल्चर प्लेट में कोशिकाओं को प्लेट सेंट्रीफ्यूज एक्सेसरी के साथ प्लेट में पेलेट किया जा सकता है। अन्यथा, कोशिकाओं को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पेलेट करें।
  17. 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे सीआरपीएमआई के 1 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करके कोशिकाओं को धोएं और चरण 2.16 में कोशिकाओं को फिर से गोली मार दें। कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
    नोट: यदि सतह धुंधला कोशिकाएं अलग से, चरण 2.18 पर डी-एस्टरीफिकेशन के बाद, कम एंटीबॉडी मात्रा की आवश्यकता होती है। इस चरण में सतह धुंधलापन ठंडे प्रवाह बफर (1% एफबीएस के साथ 1x DPBS) में आराम चरण के बाद किया जा सकता है, उपयोगकर्ता-परिभाषित एंटीबॉडी का उपयोग करके, 30 मिनट के लिए बर्फ पर। चरण 2.17 में सीआरपीएमआई में दाग के बाद कोशिकाओं को धोएं।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूने में डीपीबीएस में व्यवहार्यता दाग घोस्ट 540 पतला 1: 7,500 जोड़ें। गर्मी एकल दाग वाले जीवित / मृत नियंत्रण के लिए वार्मिंग ब्लॉक पर 55 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को मारती है।
      नोट: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण में मृत कोशिकाओं को खत्म करने के लिए व्यवहार्यता कार्यात्मक डाई धुंधला एफबीएस के बिना किया जाता है। एफबीएस निर्माता के निर्देशों के अनुसार अमाइन रंगों के साथ बातचीत कर सकता है।
  18. कैप के साथ 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन फ्लो ट्यूब का उपयोग करके सीआरपीएमआई (फिनोल रेड-फ्री) के 500 μL में व्यक्तिगत नमूनों को फिर से निलंबित करें।
    नोट: कोशिकाओं को एक घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ा जा सकता है।
  19. नमूनों के बीच संगत समय रखने वाले प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण से पहले 7 मिनट के लिए एक मोती स्नान का उपयोग करके कोशिकाओं वाले प्रत्येक 5 एमएल ट्यूब को व्यक्तिगत रूप से 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। टाइमर का उपयोग करें।

3. बीड बाथ ट्यूब: कैल्शियम फ्लक्स विश्लेषण के दौरान तापमान बनाए रखना

  1. एक छोटे से पानी के स्नान में स्नान मोती जोड़ें, जिसमें कोई पानी नहीं जोड़ा गया है; 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. एक रेजर ब्लेड के साथ 25 एमएल निशान पर एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को सावधानीपूर्वक आधा काट लें; ट्यूब के शीर्ष को छोड़ दें।
  3. आधे ट्यूब को स्नान मोतियों के साथ 3/4 रास्ते भरें।
  4. चरण 3.2 में बनाई गई ट्यूब को चरण 3.1 में बनाए गए मोती स्नान में रखें। ट्यूब और मोतियों को 37 डिग्री सेल्सियस तक लाएं।
  5. नमूना विश्लेषण की तैयारी में तापमान बनाए रखने के लिए प्रवाह साइटोमीटर के बगल में एक विद्युत आउटलेट में मोती स्नान प्लग करें।
  6. प्रवाह साइटोमीटर पर चलते समय ट्यूब को जगह पर रखने के लिए एक ट्यूब को पकड़ने के लिए 50 एमएल शंक्वाकार स्टायरोफोम रैक कट जोड़ें। यह वक्र विश्लेषण की अवधि के लिए ट्यूब को मैन्युअल रूप से पकड़ने की आवश्यकता को समाप्त कर देगा।

4. प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके कैल्शियम प्रवाह का अधिग्रहण

  1. प्रवाह विश्लेषक पर प्रवाह साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में लॉग इन करें।
  2. इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड) और इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) फ्लोरोसेंट टैग जोड़ने के लिए लाइब्रेरी टैब पर क्लिक करें। बाईं ओर सॉफ्टवेयर मेनू पर फ्लोरोसेंट टैग का चयन करें। फ्लोरोसेंट टैग समूहों के तहत यूवी लेजर का चयन करें और लाइब्रेरी में एक फ्लोरोसेंट टैग नाम (इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड)/इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त)) जोड़ने के लिए +जोड़ें पर क्लिक करें। लेजर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य चुनें, और फिर सहेजें पर क्लिक करें। प्रयोगात्मक सेटअप जारी रखें।
    नोट: इंडो -1 355 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर यूवी लेजर द्वारा उत्तेजित है। इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड) की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 372 एनएम है। इंडो -1 (कैल्शियम मुक्त) की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 514 एनएम है।
  3. अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें। एक नया प्रयोग खोलें / बनाएं और प्रयोग में वांछित फ्लोरोसेंट टैग जोड़ें।
  4. प्रयोग के लिए संदर्भ समूह और एक नया नमूना समूह बनाएँ। नमूने और संदर्भ समूहों दोनों को आवश्यकतानुसार लेबल करें।
  5. अधिग्रहण टैब के तहत, घटनाओं को अधिकतम रिकॉर्ड करने के लिए सेट करें: 10,000,000।
  6. स्टॉपिंग वॉल्यूम को अधिकतम वॉल्यूम पर सेट करें: 3,000 μL.
  7. रुकने का समय अधिकतम समय पर सेट करें: 36,000 s.
  8. मल्टीकलर पैनल में शामिल परिभाषित संयुग्मित-एंटीबॉडी के लिए एकल दाग वाले नियंत्रण प्राप्त करें।
  9. इंडो -1 कार्यात्मक डाई के लिए एकल दाग वाले नियंत्रण प्राप्त करें।
    1. कैल्शियम बाध्य इंडो -1 सकारात्मक नियंत्रण के लिए 50 μM आयनोमाइसिन जोड़ें। मिश्रण करने के लिए भंवर। नमूना इंजेक्शन पोर्ट में प्रवाह ट्यूब जोड़ें और रिकॉर्ड पर क्लिक करें।
    2. प्रवाह साइटोमीटर में कैल्शियम मुक्त इंडो -1 नकारात्मक नियंत्रण जोड़ें और रिकॉर्ड पर क्लिक करें। ईजीटीए चरण 2.6 में जोड़ा गया था।
    3. अनमिक्स बटन पर क्लिक करके एकल दाग वाले नियंत्रणों को अनमिक्स करें।
      नोट: नमूनों को अनमिक्स करने से पहले सभी संयुग्मित एंटीबॉडी और कार्यात्मक रंगों से सभी एकल दाग वाले नियंत्रण दर्ज किए जाने चाहिए। अनमिक्स बटन को कार्य करने के लिए, सभी संदर्भ नियंत्रणों को पहले रिकॉर्ड करने की आवश्यकता है। नमूना संग्रह से पहले या बाद में अनमिक्सिंग की जा सकती है।
  10. एक बार अनमिक्सिंग पूरी हो जाने के बाद, अनमिक्स किए गए कार्यपत्रक का उपयोग करके अनुक्रमिक प्लॉट बनाएं। एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए नमूने से मलबा हटाने के लिए, एसएससी-ए बनाम एसएससी-एच डबल्स को हटाने के लिए। इसके बाद रुचि की आबादी पर आगे की पकड़ के साथ-साथ एक व्यवहार्यता सफाई द्वार होता है। गेट बनाने के लिए, प्लॉट पर क्लिक करें। कार्यपत्रक में एक प्लॉट जोड़ें, और डाउनस्ट्रीम गेटेड आबादी बनाने के लिए गेट के अंदर डबल क्लिक करें। तब तक जारी रखें जब तक कि रुचि की सभी आबादी का हिसाब न हो जाए।
  11. अनुक्रमिक विश्लेषण के लिए गर्म एकल दाग वाले नियंत्रण नमूने (खंड इंडो -1 अनुपात मीट्रिक डाई और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी लेबलिंग में चरण 2.6-2.9 से) 37 डिग्री सेल्सियस तक। प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर सेट करें।
  12. प्रवाह साइटोमीटर की द्रव स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए साइटोमीटर पर 2-3 मिनट के लिए डीआई पानी चलाएं।
  13. बहुभुज, आयत या दीर्घवृत्त गेट बटन का उपयोग करके गेट बनाकर अमिश्रित कार्यपत्रक पर अनुक्रमिक प्लॉट सेट करें। रुचि की आबादी को शामिल करने के लिए गेट (यानी, एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए [आकार / लिम्फोसाइट्स भेदभाव] का उपयोग करने वाले लिम्फोसाइट्स)। नकारात्मक आबादी शून्य के आसपास समूहित दिखाई देती है जबकि सकारात्मक आबादी को एमएफआई में वृद्धि करके देखा जा सकता है। रुचि की आबादी को जैविक प्रश्न के आधार पर उपयोगकर्ता परिभाषित किया जाएगा।
  14. बनाए गए गेट के अंदर डबल क्लिक करें और वाई-अक्ष और एक्स-अक्ष मापदंडों को एसएससी-ए बनाम एसएससी-एच (एकल भेदभाव) में बदलें। अक्ष पर शब्दों पर बाएं क्लिक करके अक्ष मापदंडों को परिभाषित करना पूरा करें।
  15. एसएससी-ए बनाम व्यवहार्यता डाई सिग्नल (व्यवहार्यता गेट पैरामीटर) के साथ एक प्लॉट बनाएं। जीवित कोशिकाओं पर गेट , जो अमाइन डाई धुंधला होने के लिए नकारात्मक हैं। जीवित कोशिकाएं, जीवित मृत धुंधलापन के लिए नकारात्मक, वाई और एक्स अक्षों दोनों पर 0 निशान पर क्लस्टर होंगी।
  16. केवल एकल कोशिका जीवित लिम्फोसाइटों वाले एक नया प्लॉट बनाने के लिए अंदर के प्लॉट पर डबल क्लिक करें। कैल्शियम प्रवाह के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक्स-अक्ष पर वाई-अक्ष को इंडो -1 (बाउंड-कैल्शियम) (वी 1) और / या इंडो -1 (फ्री-कैल्शियम) (वी 7) बनाम समय में बदलें।
  17. मशीन एसआईटी पर गर्म जैविक नमूना रखें और सीमित सेल संख्या आबादी (जैसे, आईएनकेटी) में कैल्शियम प्रवाह के दृश्य की अनुमति देने के लिए माध्यम पर 2,500-3,000 घटनाओं / सेकंड पर नमूने चलाएं।
    नोट: 1 x 106/एमएल की एकाग्रता पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करके, मध्यम प्रवाह दर पर एकत्रित सेल घटनाओं को 2,500-3,000 घटनाओं / सेकंड के बराबर होना चाहिए। ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करके अधिग्रहण नियंत्रण के तहत प्रवाह दर को कम करें या यदि सेल निलंबन में एकाग्रता में वृद्धि हुई है तो नमूने को पतला करें। उच्च प्रवाह दर पर नमूने चलाने से पैनल में एक फ्लोरोफोरे से अन्य फ्लोरोफोरे में सिग्नल का प्रसार बढ़ सकता है।
  18. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए मोती स्नान में अगली ट्यूब जोड़ें।
  19. अधिग्रहण नियंत्रण में, नमूने में कैल्शियम सिग्नलिंग का बेसल स्तर प्राप्त करने के लिए 30 सेकंड के लिए प्रारंभिक डेटा रिकॉर्ड करने के लिए रिकॉर्ड दबाएं।
  20. अधिग्रहण नियंत्रण में, स्टॉप पर क्लिक करें और नमूना इंजेक्शन पोर्ट (SIP) से ट्यूब निकालें।
  21. कैल्शियम प्रवाह शुरू करने के लिए सीधे नमूना ट्यूब में 30 μg असंयुग्मित एंटी-CD3 जोड़ें। प्रति ट्यूब अंतिम सांद्रता 60 μg / mL है।
    नोट: एंटी-सीडी 3 को जोड़ने के बाद कोई धोने का कदम नहीं है।
  22. ट्यूब को जितनी जल्दी हो सके मशीन एसआईपी पर वापस रखें और सॉफ्टवेयर में रिकॉर्ड दबाएं।
  23. नमूना आबादी के भीतर कैल्शियम प्रवाह के समय-पाठ्यक्रम का निरीक्षण करने के लिए, सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण नियंत्रण के तहत बीत चुके समय को देखते हुए 7 मिनट के लिए डेटा रिकॉर्ड करें।
  24. 7 मिनट के बाद, सॉफ़्टवेयर में स्टॉप दबाएं और आयनमाइसिन के 1 μg / mL जोड़ें। रुचि की कोशिकाओं में अधिकतम कैल्शियम संकेत प्राप्त करने के लिए 30 सेकंड के लिए रिकॉर्ड करें। अगले नमूने में आयनमाइसिन के कैरीओवर को सीमित करने के लिए, नमूनों के बीच उपकरण पर दो एसआईटी फ्लश पूरा करें।
  25. अगले नमूने पर जारी रखें और वर्कफ़्लो को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी नमूने एकत्र न हो जाएं।
  26. प्रयोग सहेजें और निर्यात ज़िप फ़ाइल पर क्लिक करें। अमिश्रित फ़ाइलें (.fsc) बाह्य प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पर अपलोड की जाती हैं.

5. कैल्शियम वक्र विश्लेषण

  1. फ्लो साइटोमेट्री के लिए एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर6 का उपयोग करके, इंडो -1 फ्लोरोसेंट सिग्नल को टाइम-लैप्स कैल्शियम माप के अनुपात में परिवर्तित करें। एक रैखिक पैमाने का उपयोग करके इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड)/इंडो -1 (फ्री-कैल्शियम) संदर्भ डालकर टूल टैब के तहत पैरामीटर प्राप्त करें। कैल्शियम अनुपात की आमद के अनुसार न्यूनतम को शून्य और अधिकतम पर सेट करें, आमतौर पर लगभग 10। अधिकतम अनुपात इंडो -1 के सेल प्रकार और एमएफआई द्वारा भिन्न होता है।
  2. चयनित पैरामीटर हाइलाइट करें. उपकरण के तहत, कैनेटीक्स टैब पर क्लिक करके पैरामीटर चुनने के लिए गतिज विश्लेषण जोड़ें। Y-अक्ष को व्युत्पन्न करने के लिए सेट करें।
  3. कैनेटीक्स टैब के भीतर एमएफआई (औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता) का चयन करें।
  4. यदि वांछित हो तो गॉसियन स्मूथिंग जोड़ें। गॉसियन स्मूथिंग जोड़ने के लिए, प्रवाह विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पुल-डाउन सांख्यिकी मेनू में विकल्प का चयन करें। गॉसियन स्मूथिंग को विश्लेषण के कैल्शियम प्रवाह वक्र के विज़ुअलाइज़ेशन को सुचारू बनाने के लिए जोड़ा जा सकता है।
  5. नमूनों के भीतर जैविक तुलना के लिए कैल्शियम फ्लक्स टाइम कोर्स के साथ आंकड़ों के लिए कई श्रेणियां बनाएं।
  6. नमूने को लेआउट संपादक में खींचें और इच्छानुसार आंकड़े जोड़ें। सांख्यिकीय विश्लेषण जैविक प्रश्न के आधार पर भिन्न होता है। प्रकाशन उद्देश्यों के लिए, टी-टेस्ट या एनोवा का उपयोग करके कई प्रतिकृतियों का विश्लेषण किया जाता है।
  7. समय विश्लेषण के एक पल के लिए, कैल्शियम प्रवाह के साथ समय में एक विशिष्ट क्षण पर गेट सेट करें। रुचि की आबादी पर वांछित सतह मार्करों और गेट की जांच करें; फिर, समय क्षेत्र में उस क्षण के भीतर गेटेड कोशिकाओं के लिए इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) बनाम इंडो -1 (कैल्शियम बाध्य) के दो-आयामी डॉट-प्लॉट का आकलन करें।

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Representative Results

मल्टीप्लेक्सिंग सतह के दाग के साथ इंडो -1 अनुपातमेट्रिक डाई का उपयोग करके प्राथमिक मुराइन टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो चित्रा 1 में दिखाया गया है। माउस स्प्लेनोसाइट्स को एकल सेल निलंबन में काटने और संसाधित करने के बाद, कोशिकाओं को इंडो -1 एएम एस्टर से दाग दिया जाता है और फ्लोरोक्रोम-लिंक्ड एंटीबॉडी के साथ सतह दाग दिया जाता है। एक बार डाई लोडिंग और एंटीबॉडी धुंधला होने के बाद, लिम्फोसाइट नमूने जैविक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) तक गर्म हो जाते हैं। विश्लेषण से पहले नमूनों को छांटने की आवश्यकता के बिना, वांछित व्यक्तिगत सेल प्रकारों पर गेटिंग के बाद इंडो -1 फ्लोरेसेंस के लिए पूर्ण स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण किया जाता है। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमीटर के भीतर हिमस्खलन फोटो डायोड (एपीडी) डिटेक्टरों का उपयोग करने के लिए, एनएम में मापा गया बैंडपास फिल्टर तरंग दैर्ध्य से चरम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को एपीडी पर अपने संबंधित चैनल में परिवर्तित करना आवश्यक है। चित्रा 2 में दिखाई गई तालिका एक दिशानिर्देश प्रदान करती है, लेकिन इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य बनाम कैल्शियम-मुक्त) के दो प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों के लिए इष्टतम डिटेक्टरों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड) सिग्नल उत्पन्न करने के लिए आयनमाइसिन का उपयोग करके एकल दाग वाले इंडो -1 नमूने तैयार करके और ईजीटीए, एक कैल्शियम चेलटिंग एजेंट, इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) सिग्नल उत्पन्न करने के लिए इसे पूरा किया जाता है। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण के बाद, प्रत्येक इंडो -1 हस्ताक्षर के लिए चरम प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शित करने वाले चैनल की कल्पना की जा सकती है (चित्रा 3 ए)। सकारात्मक आबादी के एमएफआई को नकारात्मक आबादी में सामान्य करके, इंडो -1 फ्लोरेसेंस में कैल्शियम मुक्त से कैल्शियम-बाध्य में बदलाव निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 3 बी)। यह डिस्प्ले एक कार्यपुस्तिका (.xls) में बाध्य और मुक्त इंडो -1 दोनों के लिए संदर्भ नियंत्रण का उपयोग करके उत्पन्न होता है, जो एमएफआई सामान्यीकरण के लिए स्पष्ट सकारात्मक और नकारात्मक द्वार के साथ एक नकारात्मक और सकारात्मक अंतराल गेट खींचता है जैसा कि (चित्रा 3 ए) में दिखाया गया है। नमूना एमएफआई आंकड़े आंकड़े तालिका पर राइट क्लिक करके भी प्राप्त किए जा सकते हैं। सॉफ्टवेयर में, सकारात्मक आबादी को नकारात्मक आबादी के साथ विभाजित करके एमएफआई अनुपात निर्धारित करें और एक ही डिस्प्ले पर दो स्पेक्ट्रा को ओवरले करें (चित्रा 3 बी, दाएं)। पीले बिंदीदार तीर बंधे और मुक्त इंडो -1 दोनों के वर्णक्रमीय हस्ताक्षरों के बीच सामान्यीकृत वर्णक्रमीय अंतर दिखाता है।

टी-सेल रिसेप्टर उत्तेजना के बाद कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए, इंडो -1 फ्लोरेसेंस का मूल्यांकन रुचि की सेल आबादी पर गेटिंग के बाद किया जाता है, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है। सबसे पहले, तरल स्थिरता का आकलन करने के लिए समय बनाम साइड स्कैटर (एसएससी-ए) के प्लॉट की जांच की जाती है; समय अक्ष में एक स्थिर सुसंगत संकेत स्थिरता को इंगित करता है (चित्रा 4 ए)। इसके बाद, फॉरवर्ड बनाम साइड स्कैटर (एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए) की कल्पना की जाती है, और लिम्फोसाइट आबादी को गेट किया जाता है जैसा कि दिखाया गया है (चित्रा 4 बी)। लिम्फोसाइट गेट के बाद, साइड स्कैटर ऊंचाई बनाम क्षेत्र (एसएससी-एच बनाम एसएससी-ए) का एक प्लॉट उत्पन्न करके एक एकल सेल भेदभाव गेट लागू किया जाता है, और सिंगलेट्स, जो विकर्ण पर गिरते हैं, को चित्र 4 सी में दिखाए गए अनुसार गेट किया जाता है। इसके बाद व्यवहार्यता डाई के साथ धुंधलापन की जांच करके और नकारात्मक आबादी पर गेटिंग करके सिंगल्स का व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन किया जाता है (चित्रा 4 डी)। अंत में, टी-कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, सीडी 19-नकारात्मक आबादी (चित्रा 4 ई) पर गेटिंग करके एक बी-सेल डंप / आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण गेट लागू किया जाता है। सीडी 19-नकारात्मक आबादी का मूल्यांकन सीडी 4 और सीडी 8 (चित्रा 4 एफ) के एंटीबॉडी का उपयोग करके टी-सेल उपसमुच्चय के लिए किया जाता है; दिखाया गया उदाहरण इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) प्रतिदीप्ति बनाम समय (चित्रा 4 जी) की कल्पना करके कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के लिए सीडी 4 + टी-कोशिकाओं की जांच करता है। टाइम सेगमेंट पर गेटिंग करने के बाद, इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) बनाम इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड) प्लॉट भी उत्पन्न किया जा सकता है (चित्रा 4 एच)। इस विश्लेषण का उपयोग बाद में इंडो -1 अनुपात प्राप्त करने के लिए किया जाएगा (प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कैल्शियम प्रवाह वक्र विश्लेषण के तरीके देखें)।

विश्लेषण में इस बिंदु पर, रुचि की व्यक्तिगत सेल आबादी में इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) बनाम समय के दो-आयामी कथानक के भीतर समय में क्षणों का विश्लेषण करना उपयोगी हो सकता है। इष्टतम टाइमपॉइंट में टीसीआर उत्तेजना से पहले इंडो -1 से बंधे बेसलाइन कैल्शियम, पीक प्रतिक्रिया, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम के स्तर में गिरावट के रूप में चरम प्रतिक्रिया के कई मिनट बाद एक टाइमपॉइंट और अंत में आयनमाइसिन (चित्रा 5 ए) जोड़कर प्राप्त कैल्शियम प्रतिक्रिया शामिल है। एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी जोड़ने से पहले बेसलाइन नमूने में, एक कमजोर इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) संकेत का पता लगाया जाता है। चरम प्रतिक्रिया के दौरान, कोशिकाएं एक मजबूत इंडो-1 (कैल्शियम-बाध्य) संकेत और इंडो -1 (कैल्शियम मुक्त) की कम प्रतिदीप्ति दिखाती हैं। पीक के 5 मिनट बाद, इंडो -1 फ्लोरेसेंस लगभग बेसलाइन पर लौट आया। नमूने में आयनमाइसिन जोड़े जाने के बाद, इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) के एक मजबूत संकेत की कल्पना की जा सकती है, जिससे कोशिकाओं की पर्याप्त डाई-लोडिंग सुनिश्चित होती है। व्युत्पन्न विश्लेषण के लिए दुर्लभ सेल आबादी (<1%) मुश्किल हो सकती है; इस सीमा को दूर करने के लिए, दुर्लभ आबादी का विश्लेषण इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड) बनाम इंडो -1 (कैल्शियम मुक्त) को प्लॉट करके किया जा सकता है, जैसे कि सीडी 4 + कोशिकाएं, टीसीआरबी + कोशिकाएं, टीसीआरवाईजी + कोशिकाएं, सीडी 25 + कोशिकाएं, आईएनकेटी कोशिकाएं, और सीडी 19 + कोशिकाएं (चित्रा 5 बी, सी)। टीसीआर + टी-कोशिकाओं और आईएनकेटी कोशिकाओं (सीडी 1 डी / α-गैल्सर +) में आसानी से पता लगाने योग्य कैल्शियम प्रतिक्रिया पर ध्यान दें। मिश्रित मुराइन टी-सेल आबादी के भीतर सतह प्रोटीन की तुलना के लिए, रुचि के उपसमुच्चय दिखाते हुए दो-आयामी भूखंड बनाए गए थे। नीचे, प्रत्येक उप-समूह के लिए पूरे समय पाठ्यक्रम में कैल्शियम प्रतिक्रिया का विश्लेषण प्रदर्शित किया गया है (चित्रा 5 सी)।

इस परख का उपयोग जंगली-प्रकार बनाम जीन-लक्षित चूहों या टी-कोशिकाओं में औषधीय अवरोधकों के साथ इलाज किए गए टी-कोशिकाओं में जैविक अंतर स्थापित करने के लिए भी किया जा सकता है। चित्रा 6 में दिखाए गए उदाहरण में, टी-कोशिकाओं को पीआरएन 694 के साथ इलाज किया गया था, जो टी-सेल टायरोसिन किनेसेस, आईटीके और आरएलके 9,10 का एक छोटा अणु अवरोधक है। आरएलके का निषेध टी-सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग को कम करता है, जिससे टी-सेल रिसेप्टर उत्तेजना11 (चित्रा 6 ए) के बाद कैल्शियम प्रतिक्रिया कम हो जाती है। आईटीके/आरएलके अवरोध के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए, इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड) और इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) प्रतिदीप्ति के अनुपात को प्रदर्शित करने वाले वक्रों का विश्लेषण प्रत्येक स्थिति के लिए वक्र (एयूसी) या वक्र के ढलान के तहत क्षेत्र के लिए किया जा सकता है (चित्रा 6 बी, सी)। यह परिमाणीकरण कैल्शियम प्रतिक्रिया के समय पाठ्यक्रम को असतत खंडों (चित्रा 6 ए) में विभाजित करके किया जाता है, और प्रत्येक खंड के लिए वक्र या वक्र के ढलान के नीचे के क्षेत्र का आकलन करता है, जैसा कि दिखाया गया है (चित्रा 6 बी, सी)। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग जांच के तहत प्रतिरक्षा कोशिका आबादी में कई सेल सतह मार्करों के साथ कैल्शियम प्रवाह को मापने के लिए किया जा सकता है। इन परिणामों से पता चलता है कि कुल आबादी के 1% से अधिक पर प्रतिनिधित्व किए गए सेल उपसमुच्चय का मूल्यांकन समय के साथ कैल्शियम प्रवाह के लिए किया जा सकता है। इसके विपरीत, कम प्रचुर मात्रा में सेल उपसमुच्चय को समय के क्षणों का उपयोग करके वैकल्पिक विश्लेषण की आवश्यकता होती है।

कैल्शियम प्रतिक्रिया डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रयोगात्मक प्रश्न और जैविक परख के लिए विशिष्ट है जो किए जा रहे हैं। पांडुलिपि में प्रस्तुत आंकड़ों में, प्रयोगात्मक सटीकता और कार्यप्रणाली की मजबूती सुनिश्चित करने के लिए प्रतिकृति के साथ प्रयोग किए गए थे; हालांकि, अलग-अलग दिनों में विभिन्न जैविक नमूनों पर कई प्रयोग नहीं किए गए थे। इसलिए, प्रस्तुत आंकड़ों पर सांख्यिकीय विश्लेषण करना उचित नहीं होगा।

Figure 1
चित्रा 1: कैल्शियम परख वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। इंडो -1 एएम एस्टर कैल्शियम इंडिकेटर डाई का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनकी उप-आबादी में कैल्शियम के प्रवाह की कल्पना करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यह योजनाबद्ध मुराइन स्प्लेनिक टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो को रेखांकित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पीएमटी तरंग दैर्ध्य को एपीडी चैनलों में बदलना। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमीटर में यूवी लेजर द्वारा उत्तेजना के बाद फ्लोरोसेंट उत्सर्जन का पता लगाने के लिए 16 डिटेक्टर हैं। प्रत्येक डिटेक्टर के विनिर्देशों को तालिका में इंगित किया गया है। इंडो -1 फ्लोरेसेंस के मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले दो डिटेक्टरों पर प्रकाश डाला गया है, जैसा कि एकल दाग वाले नियंत्रणों का उपयोग करके अनुभवपूर्वक निर्धारित किया गया था। वर्णक्रमीय प्रवाह साइटोमीटर के लिए एपीडी तरंग दैर्ध्य और उपयोगकर्ता मैनुअल मेंरूपांतरण उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: इंडो -1 वर्णक्रमीय हस्ताक्षर का विज़ुअलाइज़ेशन। (ए) शीर्ष: कैल्शियम की एक मजबूत आमद प्राप्त करने के लिए आयनोमाइसिन परिचय के बाद सीडी 8 + टी-कोशिकाओं में इंडो -1 फ्लोरेसेंस का वर्णक्रमीय हस्ताक्षर। यूवी 1 में इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड) के शिखर की कल्पना की जा सकती है। नीचे: इंडो -1 (कैल्शियम मुक्त) का वर्णक्रमीय हस्ताक्षर यूवी 7 में चरम प्रतिदीप्ति दिखाता है। यह नियंत्रण नमूना ईजीटीए12 के साथ इंडो -1-लोडेड कोशिकाओं का इलाज करके उत्पन्न किया गया था ताकि किसी भी बाह्य मुक्त कैल्शियम को हटाया जा सके। (बी) इंडो -1 हस्ताक्षर के पांच लेजर स्पेक्ट्रम ओवरले को संयुक्त किया गया, जो बाईं ओर कच्चे वर्णक्रमीय एमएफआई और दाईं ओर इंडो -1 बाध्य बनाम मुक्त इंडो -1 के सामान्यीकृत स्पेक्ट्रा को दर्शाता है। नारंगी रंग में इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) से नीले रंग में इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) में बदलाव का दृश्य आसानी से पता लगाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए गेटिंग रणनीति। नमूने के अनुक्रमिक गेटिंग के लिए वर्कफ़्लो को रेखांकित किया गया है। (ए) एसएससी-ए गेट बनाम समय का उपयोग करके द्रविक स्थिरता की जांच की जाती है। (बी) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए का उपयोग लिम्फोसाइटों पर गेट करने के लिए किया जाता है, जिससे नमूने में सेल मलबे और अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं को समाप्त किया जाता है। (सी) एसएससी-एच बनाम एसएससी-ए प्लॉट का उपयोग करके एकल कोशिकाओं को गेट किया जाता है। सिंगलेट गेट को तब लाइव-डेड घोस्ट 540 बनाम एसएससी-ए के प्लॉट पर लागू किया जाता है; घोस्ट 540-नकारात्मक कोशिकाओं पर गेटिंग बाद के विश्लेषण से गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को खत्म कर देती है। (ई) सीडी 19 बनाम एसएससी-ए के लिए लाइव कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाता है, और सीडी 19-नकारात्मक कोशिकाओं (गैर-बी कोशिकाओं) को गेट किया जाता है। (च) सीडी 19-नकारात्मक कोशिकाओं की जांच सीडी 4 बनाम सीडी 8 धुंधला होने के लिए की जाती है। (जी) सीडी 4 + कोशिकाओं को तब समय बनाम इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) की कल्पना करने के लिए गेट किया जाता है। (एच) इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) बनाम इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) प्रतिदीप्ति की कल्पना करके एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी जोड़ के बाद कैल्शियम प्रवाह प्रतिक्रिया की शुरुआत का प्रतिनिधित्व करने के लिए समय में एक क्षण का चयन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: कैल्शियम प्रतिक्रिया में असतत समय बिंदुओं पर मुराइन थाइमोसाइट्स की गेटेड आबादी में इंडो -1 फ्लोरेसेंस का विज़ुअलाइज़ेशन। नमूना संग्रह के 6 मिनट के बाद आयनोमाइसिन के बाद कुल थाइमोसाइट्स को एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी के साथ उत्तेजित किया गया था। चार असतत समय बिंदुओं पर, जैसा कि समय बनाम इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) के दो-आयामी भूखंडों पर उल्लिखित आयताकार बक्से में इंगित किया गया है, कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के लिए थाइमोसाइट्स की विभिन्न उप-आबादी की जांच की गई थी। (ए) बेसलाइन इंडो -1 सिग्नल, पीक प्रतिक्रिया, 5 मिनट पोस्ट-पीक प्रतिक्रिया और आयनमाइसिन की प्रतिक्रिया के लिए गेटिंग दिखाने वाले द्वि-आयामी भूखंड। प्रत्येक प्लॉट के नीचे सीडी 4 बनाम सीडी 8 धुंधला (बाएं) और गेटेड सीडी 4 सिंगल पॉजिटिव (एसपी) थाइमोसाइट्स पर इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) बनाम इंडो -1 (कैल्शियम-बाउंड) का प्लॉट दिखाया गया है। (बी) थाइमोसाइट्स के गेटेड उपसमुच्चय पर इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) बनाम इंडो -1 (कैल्शियम-बाध्य) के भूखंडों को (ए) में दिखाए गए गेटिंग रणनीति का उपयोग करके चार समय-बिंदुओं में से प्रत्येक पर दिखाया गया है। (ग) संकेतित एंटीबॉडी के साथ कुल थाइमोसाइट्स के धुंधलापन को दर्शाने वाले द्वि-आयामी भूखंड बनाए गए थे। विशिष्ट उपसमुच्चय को गेट (शीर्ष पंक्ति) पर गेट किया गया और कैल्शियम प्रतिक्रियाओं बनाम समय (नीचे) के लिए जांच की गई। हल्के नीले (एसपी) सीडी 8 + आबादी, लाल (एसपी) सीडी 4 आबादी, जो कैल्शियम की सबसे बड़ी आमद प्रदर्शित करती है, नारंगी सीडी 4 + सीडी 8 + डबल पॉजिटिव थाइमोसाइट्स, गहरे हरे रंग की आईएनकेटी कोशिकाएं, हल्के हरे रंग की सीडी 25 +, बैंगनी टीसीआर + टी-कोशिकाएं, और काली सीडी 19 + बी कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: सीडी 8 + टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रिया का निषेध आईटीके / आरएलके के एक छोटे अणु अवरोधक के साथ इलाज किया जाता है। इंडो -1 डाई-लोडिंग के दौरान, स्प्लेनोसाइट्स को पीआरएन 694, 100 एनएम (डार्क ग्रे) और 200 एनएम (हल्के भूरे) की दो खुराक के साथ इलाज किया गया था। (क) इंडो-1 अनुपात (कैल्शियम-बाध्य/कैल्शियम-मुक्त) अनुपचारित कोशिकाओं (लाल) और पीआरएन694 के साथ उपचारित कोशिकाओं के लिए समय के मुकाबले दिखाया गया है। कर्व्स गेटेड सीडी 8 + टी-कोशिकाओं की कैल्शियम प्रतिक्रिया दिखाते हैं। काली रेखा इंडो -1 और सतह के दाग से भरे स्प्लेनोसाइट्स के नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करती है, लेकिन एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी के साथ उत्तेजित नहीं होती है। (बी, सी) डेटा का विश्लेषण (ए) में दिखाए गए समय अक्ष को आठ खंडों में विभाजित करके किया जा सकता है, काली बिंदीदार रेखाओं के साथ कल्पना की जा सकती है, और प्रतिक्रिया के प्रत्येक समय अंतराल पर वक्र (एयूसी) (बी), या प्रत्येक वक्र (ढलान) (सी) के ढलान के तहत क्षेत्र की गणना की जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल एक अनुकूलित परख का वर्णन करता है जो पूर्ण स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री 7,8 का उपयोग करके टाइटरेटेड इंडो -1 अनुपातमेट्रिक संकेतक डाई से भरी प्राथमिक मुराइन टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके कैल्शियम फ्लक्स परख करने का लाभ इंडो -1 फ्लोरेसेंस के मूल्यांकन के साथ संयोजन में सतह सेल मार्कर धुंधला करने की क्षमता है। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री में अत्यधिक अतिव्यापी रंगों के उपयोग की अनुमति देने का लाभ है, जिससे मार्करों की संख्या बढ़ जाती है जिनका उपयोग पैनल में किया जा सकता है। यह इस तथ्य के कारण है कि पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमीटर एक फ्लोरोक्रोम को समर्पित एक डिटेक्टर के बजाय विश्लेषण किए गए प्रत्येक नमूने के लिए डिटेक्टरों की एक सरणी में उत्सर्जित सभी लेजर प्रकाश को एकत्र करता है। प्रत्येक फ्लोर के पूरे स्पेक्ट्रम का उपयोग करने से परख की उच्च संवेदनशीलता की अनुमति मिलती है और वर्णक्रमीय रूप से अद्वितीय फ्लोरोक्रोम की पहचान करने का एक साधन प्रदान करता है जिसमें बैंड-पास प्रवाह साइटोमीटर पर एकत्र किए जाने पर अतिव्यापी संकेत होंगे। यह जांच के तहत सेल उप-समूह के पूर्व-अलगाव की आवश्यकता को भी समाप्त करता है।

इस अध्ययन में, सेल सतह मार्करों के एक पैनल का मूल्यांकन फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ किया गया था। इस पैनल में ACD4-APC-Cy7, CCD8-FITC, CD19-PE, 3TCR-PerCP-Cy5.5, α-TCR-PE-Cy5, CD25-PE-Cy7, और CD1d-_gal-cer टेट्रामर-APC शामिल थे; इसके अलावा, पैनल में लाइव-डेड घोस्ट 540 डाई शामिल थी। इन फ्लोरोक्रोम में से प्रत्येक का पता लगाने के लिए इष्टतम चैनल पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमीटर उपयोगकर्ता मैनुअल13 में उपलब्ध है। इसके विपरीत, इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) और इंडो -1 (कैल्शियम बाध्य) का पता लगाना अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया था, हालांकि प्रत्येक फ्लोरोसेंट हस्ताक्षर का पता लगाने के लिए एक अनुमानित पीक चैनल का अनुमान इंडो -1 के दो रूपों के लिए ज्ञात पीक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के आधार पर लगाया गया था। पारंपरिक प्रवाह साइटोमीटर पर उपयोग किए जाने वाले बैंडपास फिल्टर तरंग दैर्ध्य से चरम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को परिवर्तित करना और एनएम में मापा जाता है, पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमीटर द्वारा उपयोग किए जाने वाले हिमस्खलन फोटो डायोड (एपीडी) डिटेक्टरों पर उनके संबंधित चैनलों में परिवर्तित करना भी संभव है; यह क्रमशः इंडो -1 (कैल्शियम मुक्त) और इंडो -1 (कैल्शियम बाध्य) का पता लगाने के लिए इष्टतम चैनलों का अनुमान भी प्रदान कर सकता है। चूंकि प्रत्येक फ्लोरोसेंट टैग के लिए एकल दाग वाले नियंत्रण शामिल होते हैं, इसलिए अनमिक्सिंग प्रक्रिया फ्लोरोसेंट हस्ताक्षरों को डीकॉन्वोल्यूट करती है, जिससे प्रत्येक नमूने में कोशिकाओं पर प्रत्येक फ्लोरोक्रोम की तीव्रता के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। जैसा कि इस पद्धति में वर्णित है, डेटा विश्लेषण रुचि के सेल उपसमुच्चय पर गेटिंग करके और समय बनाम भारत -1 (कैल्शियम-मुक्त) और इंडो -1 (कैल्शियम बाध्य) के अनुपात की कल्पना करके किया जा सकता है।

इस परख की सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, 3 μM से नीचे इंडो -1 की सांद्रता ने टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रवाह प्रतिक्रिया के सफल विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति नहीं दी। चूंकि यह परख पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके कोशिकाओं की विषम आबादी पर कई सेल सतह मार्करों के विश्लेषण के साथ कैल्शियम प्रतिक्रिया के मल्टीप्लेक्सिंग माप को भी समायोजित करती है, इसलिए एकल दाग वाले नियंत्रणों के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी फ्लोरोसेंटली टैग किए गए एंटीबॉडी को सावधानीपूर्वक टाइट करना अनिवार्य है। यह अत्यधिक संवेदनशील रैखिक अनमिक्सिंग एल्गोरिदम14 के सफल कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, विश्लेषण की जा रही कुल आबादी के 1% से कम का प्रतिनिधित्व करने वाले सेल उपसमुच्चय के लिए कैल्शियम प्रवाह के एक पूर्ण समय पाठ्यक्रम की कल्पना नहीं की जा सकती है। इसके बजाय, इन दुर्लभ उपसमुच्चय में कैल्शियम प्रतिक्रिया के आकलन के लिए समय15 में क्षणों का उपयोग करके एक वैकल्पिक विश्लेषण रणनीति की आवश्यकता होती है। समय विश्लेषण में क्षण प्रतिक्रिया के पूरे समय पाठ्यक्रम के बजाय कैल्शियम प्रतिक्रिया के असतत चरणों में इंडो -1 (कैल्शियम-मुक्त) बनाम इंडो -1 (कैल्शियम बाध्य) के फ्लोरोसेंट संकेतों के स्नैपशॉट प्रदान करते हैं। अंत में, टी-कोशिकाओं के उपसमुच्चय को परिभाषित करने के लिए एकल सतह मार्करों का उपयोग करने की सीमाओं को पहचानना भी महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, α-सीडी 25 एंटीबॉडी के साथ थाइमोसाइट्स को धुंधला करना सीडी 4 + नियामक टी-कोशिकाओं को अन्य सभी थाइमोसाइट आबादी से अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं है। यह इस तथ्य के कारण है कि प्रारंभिक थाइमोसाइट पूर्वज (सीडी 4-सीडी 8-) कोशिकाओं के बहुमत भी सीडी 2516 को व्यक्त करते हैं। यह गेटेड सीडी 4 + सीडी 25 + थाइमोसाइट्स में एक पता लगाने योग्य कैल्शियम प्रवाह प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति के लिए जिम्मेदार होने की संभावना है।

इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए कई चर के सावधानीपूर्वक मूल्यांकन की आवश्यकता थी जो परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण थे। इनमें उपयोग किए गए एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी के विशिष्ट क्लोन का अनुकूलन, इस एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता का अनुमापन और पारंपरिक बायोटिन / स्ट्रेप्टाविडिन प्रणाली का उपयोग करके एंटीबॉडी क्रॉसलिंकिंग की आवश्यकता शामिल है। मुराइन टी-कोशिकाओं के लिए, 500 μL मात्रा में 6 x 106 कोशिकाओं के लिए 30 μg / नमूने की एकाग्रता इष्टतम कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की न्यूनतम मात्रा पाई गई। दिलचस्प बात यह है कि एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी क्लोन 17 ए 2 के साथ मजबूत कैल्शियम प्रतिक्रियाएं देखी गईं, लेकिन क्लोन 145-2 सी 11 के साथ नहीं; इसके अलावा, क्लोन 17 ए 2 का उपयोग करते समय, एक द्वितीयक क्रॉसलिंकिंग अभिकर्मक जोड़नाअनावश्यक था। स्ट्रेप्टाविडिन के साथ या उसके बिना बायोटिनिलेटेड एंटी-सीडी 3 क्लोन 17 ए 2 का उपयोग करने वाले परीक्षणों ने स्ट्रेप्टाविडिन क्रॉसलिंकिंग की उपस्थिति में कैल्शियम प्रतिक्रिया में कोई वृद्धि नहीं दिखाई। यह संभव है कि इस एंटीबॉडी में समुच्चय शामिल हों, और यह कि इन समुच्चय ने ओवरट क्रॉस-लिंकिंग की अनुपस्थिति में एंटीबॉडी की उत्तेजना प्रभावकारिता के लिए जिम्मेदार ठहराया। हालांकि, जैसा कि इन प्रयोगों को इस एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी की विभिन्न शीशियों के साथ कई महीनों के दौरान किया गया था, प्राप्त परिणाम अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे; इसलिए, टी-कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस एंटीबॉडी की क्षमता उपयोगकर्ताओं के बीच भिन्न होने की संभावना नहीं है।

प्राथमिक टी-कोशिकाओं में मजबूत कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को नमूना अधिग्रहण के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस के जैविक तापमान पर कोशिकाओं को बनाए रखने की आवश्यकता होती है; इसके विपरीत, प्राथमिक बी कोशिकाएं कमरे के तापमान पर एंटी-आईजीएम एंटीबॉडी के लिए कैल्शियम प्रतिक्रिया दिखाएंगी। तापमान के लिए टी-सेल कैल्शियम प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता के आधार पर, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक नमूने का इलाज समान है; उदाहरण के लिए, प्रत्येक नमूने को एक ही विधि का उपयोग करके और समय की समान लंबाई के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए। इस स्थिरता की अनुपस्थिति में, कैल्शियम प्रतिक्रियाओं में भिन्नता देखी जा सकती है, लेकिन नमूनों के बीच जैविक रूप से प्रासंगिक अंतर का संकेत नहीं हो सकता है।

सारांश में, यह प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्स सतह सेल मार्कर धुंधला होने के साथ संयोजन में पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके इंडो -1 फ्लोरेसेंस के मूल्यांकन के आधार पर कैल्शियम फ्लक्स परख करने के विवरण का वर्णन करता है। विधि जांचकर्ताओं को कैल्शियम डाई लेबलिंग से पहले विशिष्ट सेल आबादी के अलगाव या छंटाई की आवश्यकता से बचने की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एक अतिरिक्त विश्लेषण पद्धति को रेखांकित करता है जिसका उपयोग अलग-अलग सेल उप-आबादी के भीतर समय में असतत क्षणों में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की कल्पना करने के लिए किया जाता है। समय विश्लेषण में क्षणों को दुर्लभ (कुल का <1%) सेल आबादी पर सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है, जो कैल्शियम प्रतिक्रिया वक्र की संपूर्णता का आकलन करते समय अन्यथा अज्ञात हैं। भविष्य में, इस परख को अतिरिक्त फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के उपयोग के लिए विस्तारित किया जा सकता है, पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमीटर की व्यापक क्षमताओं का लाभ उठाते हुए।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

R01AI132419, सीयू | एएमसी इम्यूनोमाइक्रो फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन, आरआरआईडी: SCR_021321, ऑरोरा और स्पेक्ट्रोफ्लो सॉफ्टवेयर पर पूर्ण वर्णक्रमीय साइटोमेट्रिक विश्लेषण की निरंतर चर्चा के लिए साइटेक में हमारे सहयोगियों के लिए बहुत धन्यवाद। आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 190
फुल स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्राथमिक मुराइन टी-कोशिकाओं में टी-सेल रिसेप्टर-प्रेरित कैल्शियम प्रवाह का विश्लेषण
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Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L.… More

Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

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