Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse af T-cellereceptor-induceret calciumtilstrømning i primære murin-T-celler ved fuldspektret flowcytometri

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64526
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

Summary

Calciumtilstrømning, et mål for T-cellesignalering, er en effektiv måde at analysere reaktioner på T-cellereceptorstimulering. Denne protokol til multiplexing af Indo-1 med paneler af antistoffer rettet mod celleoverflademolekyler udnytter de meget fleksible muligheder for fuldspektret flowcytometri.

Abstract

Calciumtilstrømning som reaktion på T-cellereceptorstimulering er et almindeligt mål for T-cellesignalering. Flere calciumindikatorfarvestoffer er blevet udviklet til vurdering af calciumsignalering ved båndpasflowcytometri. Denne protokol er designet til at måle calciumresponser i primære murin T-celler ved hjælp af fuldspektret flowcytometri. Samlede splenocytter er mærket med det ratiometriske calciumindikatorfarvestof Indo-1 sammen med et panel af fluorkromkonjugerede antistoffer mod celleoverflademolekyler. Udnyttelse af mulighederne for fuldspektret flowcytometri giver en platform til udnyttelse af en bred vifte af celleoverfladepletter i kombination med Indo-1. Celler analyseres derefter i realtid ved 37 °C før og efter tilsætning af et anti-CD3-antistof for at stimulere T-cellereceptoren. Efter blanding af spektralsignalerne beregnes forholdet mellem calciumbundet og calciumfrit Indo-1 og kan visualiseres over tid for hver lukket population af splenocytter. Denne teknik kan muliggøre samtidig analyse af calciumresponser i flere cellepopulationer.

Introduction

T-cellereceptor (TCR) induceret calciumtilstrømning er et nyttigt mål for T-celleaktivering og bruges ofte til at bestemme, om en population af T-celler har nedsat respons i de proksimale trin i TCR-signalvejen1. Målinger af calciumtilstrømning udføres generelt ved at præmærke T-cellerne med et eller et par fluorescerende calciumindikatorfarvestoffer og derefter undersøge de fluorescerende signaler ved hjælp af flowcytometri i realtid efter TCR-tværbinding 2,3,4. Indo-1, et forholdsmetrisk calciumfarvestof, er ophidset af UV-laseren med maksimale emissioner ved to forskellige bølgelængder afhængig af calciumbinding5 og er et almindeligt anvendt indikatorfarvestof til flowcytometrianalyse af calciumresponser i levende lymfocytter. Da emissionsprofilen for Indo-1 er ret bred, kan det være udfordrende at kombinere Indo-1-vurdering med samtidig analyse af flere celleoverflademarkører ved båndpasflowcytometri. Denne begrænsning begrænser brugen af flowcytometrianalyse af calciumresponser til prærensede populationer af T-celler eller til populationer identificeret ved et begrænset sæt celleoverflademolekyler.

For at løse begrænsningerne ved måling af calciumresponser på heterogene populationer af primære lymfocytter ved hjælp af båndpasflowcytometri blev der udviklet en protokol til måling af Indo-1-fluorescens ved hjælp af fuldspektret flowcytometri. Denne metode giver mulighed for multiplexing af Indo-1 med paneler af antistoffer rettet mod celleoverflademolekyler og drager fordel af de meget fleksible muligheder for fuldspektret flowcytometri. Fordelen ved at anvende fuldspektret flowcytometri frem for konventionel flowcytometri er dens evne til at skelne fluorescerende signaler fra stærkt overlappende farvestoffer og derved øge antallet af overflademarkører, der kan vurderes samtidigt i hver prøve. Konventionel flowcytometri bruger båndpasfiltre og er begrænset til en fluorochrom pr. Detektorsystem6. Fuldspektret flowcytometri indsamler signaler over hele spektret af fluorochromen ved hjælp af 64 detektorer på et fem-laser spektral flowcytometrisystem 7,8. Derudover drager fuldspektret flowcytometri fordel af APD (Avalanche Photo Diode) detektorer, der har øget følsomhed i forhold til fotomultiplikatorrørdetektorer, der findes på konventionelle flowcytometre8. Derfor er denne tilgang ideel til de heterogene cellepopulationer, såsom mononukleære celler i perifert blod eller murine sekundære lymfoide organcellesuspensioner, da det eliminerer behovet for isolering af specifikke T-cellepopulationer før calciumfarvestofmærkning. I stedet kan celleoverflademarkørekspressionsprofiler og flowcytometri-gating efter dataindsamling bruges til at vurdere calciumresponser i hver population af interesse. Som vist i denne rapport kan Indo-1 let kombineres med otte fluorkromkonjugerede antistoffer, hvilket resulterer i i alt 10 unikke spektrale signaturer. Desuden kan denne metode let anvendes på blandinger af celler fra genisk forskellige muselinjer, hvilket muliggør samtidig analyse af calciumresponser i vildtype-T-celler sammenlignet med dem fra en genmålrettet muselinje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus blev vedligeholdt på University of Colorado Anschutz Medical campus i overensstemmelse med IACUC protokoller. Alle mus blev aflivet i henhold til AAALAC-standarder.

1. Forberedelse af immunceller fra musemilten

BEMÆRK: Aflive naive mus med CO2 eutanasi. C57BL/6-mus købt hos Jackson Laboratories og opdrættet internt anvendes til forsøg, når de er 6-12 uger gamle. Både han- og hunmus bruges til forsøg.

  1. Desinficer musehuden med 70% ethanol for at reducere muligheden for, at eksterne forurenende stoffer kommer ind i prøven.
  2. Disseker musemilten ved hjælp af dissektionsværktøjer, kirurgisk saks og tang. Høst milten og læg den løsrevne milt i 50 ml konisk rør med ~ 5 ml komplet RPMI-medie (cRPMI) på is.
    BEMÆRK: Komplet RPMI består af 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 1% penicillin / streptomycin.
    1. For at høste musemilten skal du lave et 5 cm snit i pelsen og huden langs venstre side af musen halvvejs mellem for- og bagbenene med en saks. Åbn kropshulrummet ~ 5 cm og fjern milten ved hjælp af tang. Milten er farven på en nyrebønne og er længere og fladere end den nærliggende nyre.
  3. Hæld indholdet af trin 1.2 på et sterilt 70 μm filter, der er fastgjort til et nyt 50 ml konisk rør. Milten adskilles mekanisk i en enkeltcellesuspension ved at skubbe milten gennem filteret med et 5 ml sprøjtestempel, indtil der ikke er miltmasse tilbage på filteroverfladen.
  4. Splenocytterne pelletes ved hjælp af en svingbar rotor bordpladecentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  5. Supernatanten dekanteres forsigtigt. De pelleterede splenocytter forbliver i bunden af det 50 ml koniske rør.
  6. For at fjerne røde blodlegemer skal du resuspendere de pelleterede splenocytter i 1 ml ACK-lysisbuffer i 3 minutter i henhold til producentens anvisninger. Bland godt.
  7. ACK-lysisbufferen slukkes med 15 ml cRPMI.
  8. Pellet lymfocytterne som anvist i trin 1.4.
  9. Opslæm cellesuspensionen igen i 5 ml cRPMI i et 50 ml konisk rør. Anbring prøverne på is.
    1. For at tælle cellerne overføres 10 μL af cellesuspensionen til et 0,6 ml mikrocentrifugerør og fortyndes i forholdet 1:1 med Trypanblå opløsning. Overfør derefter til et hæmocytometer eller automatiseret celletællingssystem.
  10. Afhængigt af cellekoncentrationen i cellesuspension som i trin 1.9 pelleteres cellerne efter tælling i en bordcentrifuge ved 500 x g ved 4 °C i 5 minutter for at forberede tilsætning af cRMPI-medier, der indeholder Indo-1 AM-esterfarvestof.
  11. Beregn volumen for re-suspension af cellerne for at opnå 10-12 x 106 celler / ml. Dette er en 2x koncentration af det samlede celletal, der kræves.
  12. Ophæv cellerne i mængden af cRPMI beregnet i trin 1.11 igen. Cellerne anbringes ved 37 °C med 5 % CO2 enten i et 50 ml konisk rør med låget ventileret eller en vævskulturplade.

2. Indo-1 ratiometrisk farvestof og fluorescerende antistof mærkning

  1. I henhold til producentens anvisninger tilsættes 50 μL DMSO i et hætteglas indeholdende 50 μg Indo-1 AM. Stamopløsningens koncentration er 1 μg/μL.
    BEMÆRK: DMSO leveres i mikrohætteglas med sættet for at forhindre oxidation af DMSO.
  2. Stamprøven (1 μg/μl) fortyndes i det relevante forsøgsvolumen (bestemt i 1.11) cRPMI i en koncentration på 6 μg/ml, en koncentration på 2x. Opbevar ikke Indo-1 i en vandig opløsning.
    BEMÆRK: Andre buffere med tilsat calcium kan bruges afhængigt af cellebehovet.
  3. Komplette medier med Indo-1 sættes til side i vandbad ved 37 °C.
    BEMÆRK: Brug den minimumskoncentration af Indo-1 AM-ester, der er nødvendig for at opnå et passende signal. Dette skal titreres til forskellige celletyper. Typisk er en koncentration mellem 3-5 μM tilstrækkelig. For primære T-celler øger belastningsceller med Indo-1 i en koncentration >5 μg / ml gennemsnitlig fluorescerende intensitet (MFI) over en log på 6 på spektralflowcytometre. Hvis dette sker, skal du reducere UV-laserintensiteten og titrere Indo-1 til en lavere koncentration.
  4. Fortyndet tidligere forberedt cellesuspension (i trin 1.12), 1:1 i cRPMI, inklusive 2x Indo-1-mediet fremstillet i trin 2.2. Sørg for, at cellerne har en koncentration mellem 5-6 x 106/ml.
    BEMÆRK: Farvelæg ikke ubejdset enkeltpletkontrol eller overflademarkør enkeltpletcellekontroller med Indo-1. Tilføjelse af Indo-1 til enkeltpletantistofkontroller vil skabe en flerfarvet prøve på grund af Indo-1 tilføjet til enkeltfarvede celler. Medtag indo-1 (calciumfri) EGTA tilføjet kontrol til prøvepladen, der blev oprettet i trin 2.6.
  5. Tilsæt 1 ml celler / brønd / eksperimentel tilstand i en 12-brønds vævskulturplade.
  6. Opret en enkelt farvet kontrol til Indo-1 (calciumfri) prøve ved hjælp af tidligere Indo-1 farvestofbelastede celler, og tilføj EGTA til en endelig koncentration på 2 mM. EGTA chelerer calcium i cellesuspensionen, hvilket giver en renere kontrolprøve.
    1. Opret en Indo-1 positiv kontrol (Indo-1 calciumbundet) ved at tilsætte 50 μM ionomycin til den farvestofbelastede cellesuspension ved flowcytometeret. Ionomycin er en membrangennemtrængelig calciumionofor, der binder calciumioner og letter overførslen af calciumioner til celler.
  7. Opret en brønd til biologisk negativ kontrol uden fluoroforer eller Indo-1-farvestof.
  8. Opret en brønd til enkeltpletkontrol for eventuelle yderligere cellepopulationer af interesse (antistoffer brugerdefineret) ved hjælp af antistofkonjugerede fluoroforer i et flowcytometripaneldesign. Disse inkluderer ikke Indo-1-forholdetrisk farvestof.
  9. Tilføj Fc-receptorblokerende antistof (~ 2 μg / 1 x 106 celler) i henhold til producentens instruktioner, inden der tilsættes yderligere fluorkromkonjugerede antistoffer til overfladefarvning.
  10. Pladen inkuberes i 45 minutter ved 37 °C med 5% CO2.
  11. Resuspender cellerne i en plade med 12 brønde ved forsigtigt at banke på pladen hvert 15. minut.
  12. Bland og fjern hele volumenet af celler, der er suspenderet i mediet fra 12-brøndpladen. Derefter tilsættes cellesuspensionen til 1,7 ml mikrocentrifugeglas.
  13. Pellet cellerne i en mikrocentrifuge ved 500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Supernatanten dekanteres, og cellerne vaskes ved tilsætning af 1 ml forvarmet cRPMI. Pellet igen og dekanter supernatanten.
    BEMÆRK: Vask af cellerne fjerner eventuelt resterende FC-blokerende antistof.
  14. Resuspender cellerne i 1 ml cRPMI i 1,7 ml mikrocentrifugeglas og inkuber hvert glas ved 37 °C i yderligere 30 minutter ved 5% CO2, mens toppen af røret er let åben for at muliggøre gasudveksling. Dette muliggør fuldstændig de-esterificering af de intracellulære AM-estere.
  15. Overfør cellerne tilbage til en 12-brønds vævskulturplade, hvis det er nødvendigt. Yderligere brugerdefinerede titrerede fluorkromkonjugerede antistoffer kan tilsættes i en hvilefase.
    BEMÆRK: Markører brugt i metodepanelet omfatter: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 og CD1d/α-galcer tetramer. Markører vælges til at analysere T-celleundergrupper.
    1. Opret en masterblanding af alle de brugerdefinerede fluorkromkonjugerede antistoffer i henhold til de celletyper, der er interessante ved et tidligere titreret volumen i et 1,7 ml mikrocentrifugerør.
    2. Tilsæt en beregnet masterblanding for 1 ml af cellevolumenet, afhængigt af titrerede antistoffer mod hvileceller.
      BEMÆRK: Fordelen ved farvning på trin 2.15 i stedet for det senere trin 2.18 er, at farvning på trin 2.15 vil reducere den samlede inkubationstid for eksperimentet. Imidlertid øger farvning i et samlet volumen på 1 ml ved trin 2.15 antistofbrugen.
  16. Efter hvile pelletes cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Celler i en 12-brønds vævskulturplade kan pelleteres i pladen med et pladecentrifugetilbehør. Ellers pellet cellerne i et 1,7 ml mikrocentrifugerør.
  17. Cellerne vaskes ved at resuspendere pelleten i 1 ml 4 °C kold cRPMI og pellet cellerne igen som i trin 2.16. Placer cellerne på is.
    BEMÆRK: Hvis overfladefarvningsceller separat, efter deesterificering ved trin 2.18, er der behov for mindre antistofvolumen. Overfladefarvning på dette trin kan udføres efter hvilefasen i koldstrømsbuffer (1x DPBS tilsat 1% FBS) ved hjælp af brugerdefinerede antistoffer på is i 30 minutter. Vask cellerne efter pletten i cRPMI som i trin 2.17.
    1. Tilsæt levedygtighedsplet Ghost540 fortyndet 1:7,500 i DPBS til prøver i henhold til producentens anvisninger. Varme dræber cellerne ved 55 °C på en opvarmningsblok til enkeltfarvet levende/død kontrol.
      BEMÆRK: Levedygtighed funktionel farvestoffarvning for at eliminere døde celler i flowcytometrisk analyse udføres uden FBS. FBS kan interagere med aminfarvestoffer i henhold til producentens anvisninger.
  18. Resuspender individuelle prøver i 500 μL cRPMI (phenol rødfri) ved hjælp af et 5 ml polystyrenflowrør med en hætte.
    BEMÆRK: Celler kan stå ved 4 °C i op til en time.
  19. Hvert 5 ml rør, der indeholder celler, opvarmes individuelt til 37 °C ved hjælp af et perlebad i 7 minutter før analysen på flowcytometeret, idet tiden holdes konsistent mellem prøverne. Brug en timer.

3. Perlebadrør: opretholdelse af temperaturen under calciumfluxanalyse

  1. Tilføj badeperler til et lille vandbad uden tilsat vand; varme op til 37 °C.
  2. Skær forsigtigt et 50 ml konisk rør i halve ved 25 ml mærket med et barberblad; Kassér toppen af røret.
  3. Fyld det halverede rør 3/4 af vejen med badeperler.
  4. Anbring røret, der blev oprettet i trin 3.2, i perlebadet, der blev oprettet i trin 3.1. Rør og perler bringes op på 37 °C.
  5. Sæt perlebadet i en stikkontakt ved siden af flowcytometeret for at opretholde temperaturen som forberedelse til prøveanalyse.
  6. Tilføj et 50 ml konisk isoporstativ skåret for at holde et rør for at placere røret på plads, mens du kører på flowcytometeret. Dette eliminerer behovet for manuelt at holde røret i løbet af kurveanalysen.

4. Erhvervelse af calciumtilstrømning ved hjælp af flowcytometrisk analyse

  1. Log ind på flowcytometersoftwaren på en flowanalysator.
  2. Klik på fanen Bibliotek for at tilføje Indo-1 (calciumbundet) og Indo-1 (calciumfri) fluorescerende tags. Vælg Fluorescerende tags i softwaremenuen til venstre. Vælg UV-laser under fluorescerende taggrupper, og klik på +tilføj for at tilføje et fluorescerende tagnavn (Indo-1 (calciumbundet)/Indo-1 (calciumfrit)) til biblioteket. Vælg laserexcitationsbølgelængden og emissionsbølgelængden, og klik derefter på Gem. Fortsæt til den eksperimentelle opsætning.
    BEMÆRK: Indo-1 er ophidset af UV-laseren ved en bølgelængde på 355 nm. Emissionsbølgelængden for Indo-1 (calciumbundet) er 372 nm. Emissionsbølgelængden for Indo-1 (calciumfri) er 514 nm.
  3. Klik på fanen Erhvervelse. Åbn/opret et nyt eksperiment, og tilføj de ønskede fluorescerende tags til eksperimentet.
  4. Opret referencegruppe og en eller flere nye prøvegrupper til eksperimentet. Mærk både prøverne og referencegrupperne efter behov.
  5. Under fanen Anskaffelser skal du indstille de hændelser, der skal registreres, til maksimum: 10.000.000.
  6. Indstil stopvolumen til den maksimale lydstyrke: 3.000 μL.
  7. Indstil stoptiden til den maksimale tid: 36.000 s.
  8. Anskaf enkeltfarvede kontroller til definerede konjugerede antistoffer, der er inkluderet i flerfarvepanelet.
  9. Få enkeltfarvede kontroller til Indo-1 funktionelt farvestof.
    1. Tilsæt 50 μM ionomycin til den calciumbundne Indo-1 positive kontrol. Vortex at blande. Tilføj flowrøret til prøveinjektionsporten, og klik på Optag.
    2. Tilsæt calciumfri Indo-1 negativ kontrol til flowcytometeret, og klik på Optag. EGTA blev tilføjet i trin 2.6.
    3. Bland de enkeltfarvede kontroller ved at klikke på knappen Unmix .
      BEMÆRK: Alle enkeltfarvede kontroller fra alle konjugerede antistoffer og funktionelle farvestoffer skal registreres, før prøverne blandes. For at Unmix-knappen skal fungere, skal alle referencekontroller først registreres. Unmixing kan ske før eller efter prøveindsamling.
  10. Når blandingen er fuldført, skal du oprette sekventielle afbildninger ved hjælp af det ublandede regneark. SSC-A versus FSC-A fjerner snavs fra prøven, SSC-A versus SSC-H for at fjerne dubletter. Dette efterfølges af en levedygtighedsoprydningsport sammen med yderligere gating på populationer af interesse. For at oprette porte skal du klikke på Plot. Føj en afbildning til regnearket, og dobbeltklik inde i porten for at oprette en nedstrøms lukket befolkning. Fortsæt, indtil der er taget højde for alle de relevante populationer.
  11. Varme enkeltfarvede kontrolprøver (fra trin 2.6-2.9 i afsnit Indo-1 ratiometrisk farvestof og fluorescerende antistofmærkning) til 37 °C til sekventiel analyse. Konfigurer flowcytometrisoftwaren.
  12. Kør DI-vand på cytometeret i 2-3 minutter for at sikre flowcytometerets flydende stabilitet.
  13. Konfigurer sekventielle afbildninger i det ublandede regneark ved at oprette porte ved hjælp af portknapperne Polygon, Rektangel eller Ellipse. Gate til at omfatte populationen af interesse (dvs. lymfocytter ved hjælp af SSC-A vs. FSC-A [diskrimination af størrelse / lymfocytter]). Negative populationer vises grupperet omkring nul, mens positive populationer kan visualiseres ved at øge MFI. Populationer af interesse vil blive brugerdefineret baseret på det biologiske spørgsmål.
  14. Dobbeltklik inde i den oprettede port, og skift Y-akse- og X-akseparametre til SSC-A versus SSC-H (singlet-diskrimination). Komplet definition af akseparametrene ved at venstreklikke på ordene på aksen.
  15. Opret et plot med SSC-A versus levedygtighedsfarvesignal (levedygtighedsportparametre). Gate på levende celler, som er negative for aminfarvefarvning. Levende celler, negative for levende døde farvninger, vil klynge sig ved 0-mærket på både Y- og X-akserne.
  16. Dobbeltklik på det indvendige plot for at oprette et nyt plot, der kun indeholder enkeltcellede levende lymfocytter. Skift Y-aksen til Indo-1 (bundet-calcium) (V1) og/eller Indo-1 (frit calcium) (V7) versus tiden på X-aksen for visualisering af calciumtilstrømningen.
  17. Placer den opvarmede biologiske prøve på maskinens SIT, og kør prøverne ved 2.500-3.000 hændelser/s på medium for at muliggøre visualisering af calciumtilstrømning i begrænsede celleantalpopulationer (f.eks. iNKT).
    BEMÆRK: Ved at resuspendere cellerne i en koncentration på 1 x 106/ml bør cellehændelserne indsamlet ved medium strømningshastighed være lig med 2.500-3.000 hændelser/s. Sænk strømningshastigheden under anskaffelseskontrol ved at klikke på rullemenuen eller fortynd prøven, hvis cellesuspensionen har en øget koncentration. Kørsel af prøverne med en høj strømningshastighed kan øge spredningen af signalet fra en fluorofor til andre fluoroforer i panelet.
  18. Tilsæt det næste rør til perlebadet for at varme op til 37 °C.
  19. I anskaffelseskontrollen skal du trykke på Record for at registrere de indledende data i 30 s for at opnå et basalniveau af calciumsignalering i prøven.
  20. I anskaffelseskontrollen skal du klikke på Stop og fjerne røret fra Sample Injection Port (SIP).
  21. Der tilsættes 30 μg ukonjugeret anti-CD3 direkte i prøveglasset for at igangsætte calciumtilstrømningen. Den endelige koncentration pr. rør er 60 μg/ml.
    BEMÆRK: Der er intet vasketrin efter tilsætning af anti-CD3.
  22. Sæt røret tilbage på maskinens SIP så hurtigt som muligt, og tryk på Optag i softwaren.
  23. Optag data i 7 minutter, se den tid, der er gået under erhvervelseskontrollerne i softwaren, for at observere tidsforløbet for calciumtilstrømning inden for prøvepopulationerne.
  24. Efter 7 minutter skal du trykke på Stop i softwaren og tilføje 1 μg/ml ionomycin. Optag i 30 s for at opnå det maksimale calciumsignal i cellerne af interesse. For at begrænse overførslen af ionomycin til den næste prøve skal du udfylde to SIT-skylninger på instrumentet mellem prøverne.
  25. Fortsæt til næste eksempel, og gentag arbejdsprocessen, indtil alle prøverne er indsamlet.
  26. Gem eksperimentet, og klik på eksport-zip-filen. Ublandede filer (.fsc) uploades til ekstern flowcytometrianalysesoftware.

5. Analyse af calciumkurve

  1. Brug en analysesoftware6 til flowcytometri til at konvertere indo-1 fluorescerende signaler til et forhold for time-lapse calciummålinger. Udled parametre under fanen værktøjer ved at indsætte referencerne Indo-1 (calciumbundet)/Indo-1 (frit calcium) ved hjælp af en lineær skala. Indstil minimumet til nul og maksimum i henhold til tilstrømningen af calciumforhold, typisk omkring 10. Det maksimale forhold varierer efter celletype og MFI af Indo-1.
  2. Fremhæv den valgte parameter. Tilføj kinetisk analyse under værktøjer for at vælge parameteren ved at klikke på fanen Kinetik . Indstil Y-aksen til afledt.
  3. Vælg MFI (gennemsnitlig fluorescerende intensitet) under fanen Kinetik.
  4. Tilføj Gaussisk udjævning, hvis det ønskes. For at tilføje Gaussisk udjævning skal du vælge indstillingen i rullemenuen statistik i flowanalysesoftwaren. Gaussisk udjævning kan tilføjes for at udjævne visualiseringen af calciumtilstrømningskurven for analyse.
  5. Opret flere intervaller for statistik langs calciumfluxtidsforløbet for biologiske sammenligninger inden for prøverne.
  6. Træk eksemplerne til layouteditoren, og tilføj statistikken efter behov. Statistisk analyse varierer afhængigt af det biologiske spørgsmål. Til publikationsformål analyseres flere replikater ved hjælp af t-test eller ANOVA.
  7. For et øjebliks tidsanalyse skal du indstille porten på et bestemt tidspunkt langs calciumfluxen. Undersøg de ønskede overflademarkører og porte på populationen af interesse; Vurder derefter et todimensionelt prikplot af Indo-1 (calciumfri) versus Indo-1 (calciumbundet) for lukkede celler inden for det øjeblik i tidsområdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den eksperimentelle arbejdsgang til vurdering af calciumresponser i primære murin-T-celler ved anvendelse af et Indo-1-ratiometrisk farvestof med multiplexerende overfladepletter er vist i figur 1. Efter høst og behandling af musesplenocytterne i en enkelt cellesuspension farves cellerne med en Indo-1 AM-ester og overfladen farves med fluorkrombundne antistoffer. Når farvestofbelastningen og antistoffarvningen er afsluttet, opvarmes lymfocytprøverne til en biologisk temperatur (37 °C). Prøverne analyseres derefter ved hjælp af fuldspektret flowcytometri for Indo-1-fluorescens efter gating på de enkelte celletyper, der ønskes, uden behov for sortering af prøverne inden analyse. For at kunne anvende APD-detektorer (Avalanche Photo Diode) inden for fuldspektret flowcytometeret er det nødvendigt at konvertere peak emission bølgelængden fra en båndpasfilterbølgelængde målt i nm til dens respektive kanal på APD. Tabellen vist i figur 2 giver en retningslinje, men de optimale detektorer for de to fluorescenssignaturer af Indo-1 (calciumbundet versus calciumfri) skal bestemmes empirisk. Dette opnås ved at forberede enkeltfarvede Indo-1-prøver ved hjælp af ionomycin til at generere Indo-1 (calciumbundet) signal og EGTA, et calciumchelateringsmiddel, til at generere Indo-1 (calciumfrit) signal. Efter analyse ved hjælp af fuldspektret flowcytometri kan kanalen, der viser den maksimale fluorescensintensitet for hver Indo-1-signatur, visualiseres (figur 3A). Ved at normalisere MFI'en for de positive populationer til den for de negative populationer kan skiftet i Indo-1-fluorescens fra calciumfri til calciumbundet bestemmes (figur 3B). Dette display genereres i en projektmappe (.xls) ved hjælp af referencekontroller for både bundet og fri Indo-1, der tegner en negativ og positiv intervalport med klare positive og negative porte til MFI-normalisering som vist i (figur 3A). Eksempel på MFI-statistik kan også fås ved at højreklikke på statistiktabellen. I softwaren bestemmes MFI-forholdet ved at dividere den positive befolkning med den negative befolkning og overlejre de to spektre på et enkelt display (figur 3B, højre). Den gule stiplede pil viser de normaliserede spektrale forskelle mellem spektralsignaturerne for både bundet og fri Indo-1.

For at evaluere calciumresponser efter T-cellereceptorstimulering vurderes Indo-1-fluorescensen efter gating på de relevante cellepopulationer, som vist i figur 4. Først undersøges et plot af tid versus sidespredning (SSC-A) for at vurdere fluidisk stabilitet; et stabilt konsistent signal over tidsaksen indikerer stabilitet (figur 4A). Derefter visualiseres spredningen fremad versus side (FSC-A vs. SSC-A), og lymfocytpopulationen er lukket som vist i (figur 4B). Efter lymfocytporten påføres en enkelt cellediskrimineringsport ved at generere et plot af sidespredningshøjde versus areal (SSC-H vs. SSC-A), og singlerne, der falder på diagonalen, er lukket som vist i figur 4C. Singlets vurderes derefter for levedygtighed ved at undersøge farvning med levedygtighedsfarvestoffet og gating på den negative population (figur 4D). Endelig, for at analysere T-celler, anvendes en B-celledump / intern negativ kontrolport ved at gating på den CD19-negative population (figur 4E). Den CD19-negative population vurderes derefter for T-celleundergrupper ved hjælp af antistoffer mod CD4 og CD8 (figur 4F); det viste eksempel undersøger CD4 + T-celler for calciumresponser ved at visualisere Indo-1 (calciumbundet) fluorescens versus tid (figur 4G). Efter gating på et tidssegment kan Indo-1 (calciumfri) versus Indo-1 (calciumbundet) plot også genereres (figur 4H). Denne analyse vil senere blive brugt til at udlede Indo-1-forholdet (se metoder calciumtilstrømningskurveanalyse i flowcytometrianalysesoftware).

På dette tidspunkt i analysen kan det være nyttigt at analysere øjeblikke i tid inden for det todimensionelle plot af Indo-1 (calciumbundet) versus tid i individuelle cellepopulationer af interesse. De optimale tidspunkter inkluderer baseline calcium bundet til Indo-1 før TCR-stimulering, topresponsen, et tidspunkt flere minutter efter topresponsen, når intracellulære calciumniveauer falder, og endelig calciumresponsen fremkaldt ved tilsætning af ionomycin (figur 5A). I baselineprøven før tilsætning af anti-CD3-antistof detekteres et svagt Indo-1 (calciumbundet) signal. Under topresponsen viser cellerne et stærkt Indo-1 (calciumbundet) signal og en reduceret fluorescens af Indo-1 (calciumfri). 5 minutter efter toppen vendte Indo-1-fluorescensen næsten tilbage til baseline. Efter ionomycin er tilsat til prøven, kan et robust signal af Indo-1 (calciumbundet) visualiseres, hvilket sikrer tilstrækkelig farvestofbelastning af cellerne. Sjældne cellepopulationer (<1 %) kan være vanskelige at foretage derivatanalyser; For at overvinde denne begrænsning kan analyse af de sjældne populationer udføres ved at plotte Indo-1 (calciumbundet) versus Indo-1 (calciumfri) efter gating på hver population af interesse, såsom CD4 + celler, TCRb + celler, TCRyg + celler, CD25 + celler, iNKT celler og CD19 + celler (figur 5B, C). Bemærk det let påviselige calciumrespons i TCRγδ+ T-celler og iNKT-celler (CD1d/α-galcer+). Til sammenligning af overfladeproteiner inden for en blandet murin T-cellepopulation blev der oprettet todimensionelle plots, der viser delmængder af interesse. Nedenfor vises analysen af calciumresponsen over hele tidsforløbet for hver delmængde (figur 5C).

Dette assay kan også bruges til at etablere biologiske forskelle i T-celler fra vildtype-versus genmålrettede mus eller i T-celler ubehandlede versus behandlet med farmakologiske hæmmere. I eksemplet vist i figur 6 blev T-celler behandlet med PRN694, en lille molekylehæmmer af T-celletyrosinkinaserne, ITK og RLK 9,10. Hæmning af ITK/RLK dæmper T-cellereceptorsignalering, hvilket fører til et reduceret calciumrespons efter T-cellereceptorstimulering11 (figur 6A). For at kvantificere virkningerne af ITK/RLK-hæmning kan kurverne, der viser forholdet mellem Indo-1 (calciumbundet) og Indo-1 (calciumfri) fluorescens, derefter analyseres for arealet under kurven (AUC) eller kurvens hældning for hver tilstand (figur 6B,C). Denne kvantificering udføres ved at opdele calciumresponsens tidsforløb i diskrete segmenter (figur 6A) og vurdere arealet under kurven eller kurvens hældning for hvert segment som vist (figur 6B,C). Samlet set viser denne protokol, at fuldspektret flowcytometri kan bruges til at måle calciumtilstrømning sammen med flere celleoverflademarkører i immuncellepopulationer, der undersøges. Disse resultater viser, at celleundergrupper repræsenteret ved mere end 1% af den samlede befolkning kan vurderes for calciumtilstrømning over tid. I modsætning hertil kræver mindre rigelige celleundergrupper alternativ analyse ved hjælp af øjeblikke.

Statistisk analyse af calciumresponsdata er specifik for det eksperimentelle spørgsmål og de biologiske assays, der udføres. I de data, der blev præsenteret i manuskriptet, blev der udført eksperimenter med replikater for at sikre eksperimentel nøjagtighed og metodens robusthed; Imidlertid blev der ikke udført flere eksperimenter på forskellige biologiske prøver over forskellige dage. Det vil derfor ikke være hensigtsmæssigt at foretage statistiske analyser af de fremlagte data.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over arbejdsgangen for calciumanalyse. Brugen af Indo-1 AM ester calciumindikatorfarvestof giver et værktøj til at visualisere tilstrømningen af calcium i immunceller og deres underpopulationer. Dette skema skitserer arbejdsgangen til analyse af calciumresponser i murin-milt-T-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Konvertering af PMT-bølgelængder til APD-kanaler. Fuldspektret flowcytometer har 16 detektorer til at detektere fluorescerende emissioner efter excitation af UV-laseren. Specifikationerne for hver detektor er angivet i tabellen. Fremhævet er de to detektorer, der anvendes til vurdering af Indo-1 fluorescens, som blev bestemt empirisk ved hjælp af enkeltfarvede kontroller. Konverteringer til APD-bølgelængde og brugervejledning til spektralflowcytometer er tilgængelige11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Visualisering af Indo-1 spektralsignaturen. (A) Top: Spektral signatur af Indo-1 fluorescens i CD8 + T-celler efter ionomycin introduktion for at fremkalde en robust tilstrømning af calcium. Toppen af Indo-1 (calciumbundet) kan visualiseres i UV1. Nederst: Spektral signatur af Indo-1 (calciumfri), der viser den maksimale fluorescens i UV7. Denne kontrolprøve blev genereret ved at behandle Indo-1-belastede celler med EGTA12 for at chelere ethvert ekstracellulært frit calcium. (B) Kombineret fem laserspektrumoverlejring af Indo-1-signaturen, der viser rå spektral MFI til venstre og de normaliserede spektre af Indo-1 bundet versus fri Indo-1 til højre. Visualisering af skiftet fra Indo-1 (calciumfri) i orange til Indo-1 (calciumbundet) i blåt kan let detekteres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Gating strategi for visualisering af calcium responser. Arbejdsprocessen for sekventiel gating af prøverne er skitseret. (A) Fluidisk stabilitet undersøges ved hjælp af en tid versus SSC-A-port. (B) FSC-A versus SSC-A bruges til at gate på lymfocytter og derved eliminere cellerester og resterende røde blodlegemer i prøven. (C) Enkeltceller er lukket ved hjælp af et SSC-H versus SSC-A-plot. (D). Singlet-porten anvendes derefter på et plot af levende døde Ghost540 versus SSC-A; gating på Ghost540-negative celler eliminerer ikke-levedygtige celler fra efterfølgende analyse. (E) Levende celler analyseres for CD19 versus SSC-A, og CD19-negative celler (ikke-B-celler) er gated på. (F) De CD19-negative celler undersøges for CD4 versus CD8-farvning. (G) CD4 + celler er derefter gated på for at visualisere tid versus Indo-1 (calciumbundet). (H) Et tidspunkt vælges til at repræsentere initieringen af calciumtilstrømningsresponsen efter tilsætning af anti-CD3-antistof ved at visualisere Indo-1 (calciumfri) versus Indo-1 (calciumbundet) fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Visualisering af Indo-1 fluorescens i lukkede populationer af murine thymocytter på diskrete tidspunkter i calciumresponsen. Total thymocytter blev stimuleret med anti-CD3 antistof efterfulgt af ionomycin efter 6 min af prøveopsamlingen. Ved fire diskrete tidspunkter, som angivet i de rektangulære kasser, der er skitseret på de todimensionelle tidsplots versus Indo-1 (calciumbundet), blev forskellige underpopulationer af thymocytter undersøgt for calciumresponser. (A) Todimensionale plots, der viser gating for baseline Indo-1-signalet, peakresponsen, 5 min post-peak respons og responsen på ionomycin. Nedenfor vises hvert plot CD4 versus CD8-farvning (venstre) og plottet af Indo-1 (calciumfri) versus Indo-1 (calciumbundet) på gated CD4 enkelt positive (SP) thymocytter. (B) Plots af Indo-1 (calciumfri) versus Indo-1 (calciumbundet) på lukkede delmængder af thymocytter vises på hvert af de fire tidspunkter ved hjælp af gating-strategien vist i (A). (C) Todimensionale plots blev oprettet, der viser farvning af samlede thymocytter med de angivne antistoffer. Specifikke undergrupper blev gated (øverste række) på og undersøgt for calciumrespons versus tid (nederst). Lyseblå (SP) CD8+ population, rød (SP) CD4 population, som udviser den største tilstrømning af calcium, orange CD4+CD8+ dobbeltpositive thymocytter, mørkegrønne iNKT celler, lysegrøn CD25+, lilla TCRγδ+ T-celler, og sorte CD19+ B-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Hæmning af calciumrespons i CD8+ T-celler behandlet med en lille molekylehæmmer af ITK/RLK. Under Indo-1-farvestofbelastningen blev splenocytter behandlet med to doser PRN694, 100 nM (mørkegrå) og 200 nM (lysegrå). (A) Indo-1-forhold (calciumbundet/calciumfrit) vises versus tid for ubehandlede celler (røde) og celler behandlet med PRN694. Kurver viser calciumrespons af gated CD8 + T-celler. Den sorte linje repræsenterer den negative kontrol af splenocytter fyldt med Indo-1 og overfladefarvet, men ikke stimuleret med anti-CD3-antistof. (B,C) Dataene kan analyseres ved at dividere tidsaksen vist i (A) i otte segmenter, visualiseret med sorte stiplede linjer og beregne arealet under kurven (AUC) (B) eller hældningen af hver kurve (hældning) (C) ved hvert tidsinterval af responsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver et optimeret assay designet til at måle calciumresponser i primære murin T-celler fyldt med titreret Indo-1 ratiometrisk indikatorfarvestof ved hjælp af fuldspektret flowcytometri 7,8. Fordelen ved at udføre calciumfluxassays ved hjælp af fuldspektret flowcytometri er evnen til at multiplexere overfladecellemarkørfarvning i kombination med vurdering af Indo-1-fluorescens. Fuldspektret flowcytometri har den fordel, at det tillader anvendelse af stærkt overlappende farvestoffer og derved øger antallet af markører, der kan bruges i et panel. Dette skyldes det faktum, at fuldspektret flowcytometer samler alt laserlys, der udsendes på tværs af en række detektorer for hver analyseret prøve, snarere end at have en detektor dedikeret til en fluorochrom. Brug af hele spektret af hver fluor giver mulighed for højere følsomhed af analysen og giver et middel til at identificere spektralt unikke fluorkromer, der ville have overlappende signaler, hvis de blev samlet på et båndpasflowcytometer. Dette eliminerer også behovet for præisolering af en celledelmængde, der undersøges.

I denne undersøgelse blev et panel af celleoverflademarkører vurderet med fluorkromkonjugerede antistoffer. Dette panel omfattede αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 og CD1d-αgal-cer tetramer-APC; Derudover inkluderede panelet det levende døde Ghost540-farvestof. Den optimale kanal til at detektere hver af disse fluorochromer er tilgængelig i brugervejledningen til fuldspektret flowcytometer13. I modsætning hertil blev påvisningen af Indo-1 (calciumfri) og Indo-1 (calciumbundet) empirisk bestemt, selvom en omtrentlig topkanal til påvisning af hver fluorescerende signatur blev estimeret baseret på de kendte topemissionsbølgelængder for de to former for Indo-1. Det er også muligt at konvertere peak emission bølgelængder fra båndpasfilter bølgelængder anvendt på konventionelle flow cytometre og målt i nm til deres respektive kanaler på Avalanche Photo Diode (APD) detektorer, der anvendes af fuldspektret flow cytometer; dette kan også give et skøn over optimale kanaler til at detektere henholdsvis Indo-1 (calciumfri) og Indo-1 (calciumbundet). Da enkeltfarvede kontroller er inkluderet for hvert fluorescerende mærke, deconvoluterer unmixing-processen de fluorescerende signaturer, hvilket muliggør visualisering af hver fluorochromes intensitet på celler i hver prøve. Som beskrevet i denne metode kan dataanalyse udføres ved at gating på celleundergrupper af interesse og visualisere forholdet mellem detektere Indo-1 (calciumfri) og Indo-1 (calciumbundet) versus tid.

Der er begrænsninger for dette assay. For eksempel tillod koncentrationer af Indo-1 under 3 μM ikke en vellykket visualisering af calciumtilstrømningsresponsen i T-celler. Da dette assay også rummer multiplexeringsmålinger af calciumresponsen med analyse af flere celleoverflademarkører på heterogene populationer af celler ved hjælp af fuldspektret flowcytometri, er det bydende nødvendigt omhyggeligt at titrere alle fluorescerende mærkede antistoffer, der anvendes, inklusive dem, der anvendes til de enkeltfarvede kontroller. Dette er vigtigt for en vellykket implementering af den meget følsomme lineære unmix-algoritme14. Derudover kunne et komplet tidsforløb af calciumtilstrømning ikke visualiseres for celleundergrupper, der repræsenterer mindre end 1% af den samlede befolkning, der analyseres. I stedet krævede en vurdering af calciumresponsen i disse sjældne undergrupper en alternativ analysestrategi ved hjælp af øjeblikkei tid 15. Momenterne i tidsanalysen giver snapshots af de fluorescerende signaler af Indo-1 (calciumfri) versus Indo-1 (calciumbundet) på diskrete stadier af calciumresponsen, snarere end hele responsens tidsforløb. Endelig er det også vigtigt at anerkende begrænsningerne ved at bruge enkeltoverflademarkører til at definere delmængder af T-celler. For eksempel er farvning af thymocytter med α-CD25-antistof ikke tilstrækkeligt til at skelne CD4 + regulatoriske T-celler fra alle andre thymocytpopulationer. Dette skyldes det faktum, at størstedelen af tidlige thymocytstamceller (CD4-CD8-) celler også udtrykker CD2516. Dette vil sandsynligvis forklare fraværet af et påviseligt calciumtilstrømningsrespons i gated CD4 + CD25 + thymocytter.

Optimeringen af denne protokol krævede omhyggelig vurdering af flere variabler, der var nøglen til analysesucces. Disse omfatter optimering af den specifikke klon af anti-CD3-antistof, der anvendes, titrering af den optimale koncentration af dette antistof og behovet for antistoftværbinding ved hjælp af det traditionelle biotin/streptavidin-system. For murin T-celler blev koncentrationen af 30 μg/prøve for 6 x 106 celler i et 500 μL volumen fundet at være den mindste mængde antistof, der var nødvendig for optimale calciumresponser. Interessant nok blev robuste calciumresponser observeret med anti-CD3-antistofklon 17A2, men ikke med klon 145-2C11; Desuden var det unødvendigt at tilføje et sekundært tværbindingsreagens ved anvendelse af klon17A2 17. Test med biotinyleret anti-CD3-klon 17A2 med eller uden streptavidin viste ingen forbedring af calciumresponsen i nærvær af streptavidin-tværbinding. Det er muligt, at dette antistof omfattede aggregater, og at disse aggregater tegnede sig for antistoffets stimuleringseffektivitet i fravær af åbenlys tværbinding. Da disse eksperimenter imidlertid blev udført i løbet af mange måneder med forskellige hætteglas med dette anti-CD3-antistof, var de opnåede resultater meget reproducerbare; derfor vil dette antistofs evne til at stimulere T-celler sandsynligvis ikke variere blandt brugerne.

Robuste calciumreaktioner i primære T-celler kræver, at cellerne holdes på den biologiske temperatur på 37 °C under hele prøvetagningen; i modsætning hertil vil primære B-celler vise et calciumrespons på anti-IgM-antistof ved stuetemperatur. Baseret på følsomheden af T-cellens calciumrespons på temperatur er det afgørende at sikre, at hver prøve behandles ens; F.eks. skal hver prøve opvarmes til 37 °C efter samme metode og i samme tidsrum. I mangel af denne konsistens kan variationer i calciumrespons observeres, men er muligvis ikke tegn på biologisk relevante forskelle mellem prøver.

Sammenfattende beskriver denne protokol detaljerne ved udførelse af calciumfluxassays baseret på vurderingen af Indo-1-fluorescens ved anvendelse af fuldspektret flowcytometri i kombination med multiplexoverfladecellemarkørfarvning. Metoden gør det muligt for efterforskere at undgå behovet for isolering eller sortering af specifikke cellepopulationer inden calciumfarvestofmærkning. Desuden skitserer denne protokol en yderligere analysemetode, der anvendes til at visualisere calciumresponser på diskrete tidspunkter inden for forskellige cellesubpopulationer. Momenterne i tidsanalysen kan med succes anvendes på sjældne (<1% af de samlede) cellepopulationer, som ellers ikke kan detekteres, når man vurderer hele calciumresponskurven. I fremtiden kan dette assay udvides til anvendelse af yderligere fluorkromkonjugerede antistoffer, idet man udnytter de omfattende muligheder i fuldspektret flowcytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at erklære.

Acknowledgments

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_021321, Mange tak til vores kolleger hos Cytek for løbende diskussioner af fuld spektral cytometrisk analyse på Aurora og SpectroFlo software. Figurer blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

Tags

Immunologi og infektion nummer 190
Analyse af T-cellereceptor-induceret calciumtilstrømning i primære murin-T-celler ved fuldspektret flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L.… More

Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter