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Immunology and Infection

Análisis de la afluencia de calcio inducida por receptores de células T en células T murinas primarias mediante citometría de flujo de espectro completo

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64526
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

Summary

La afluencia de calcio, una medida de la señalización de las células T, es una forma efectiva de analizar las respuestas a la estimulación del receptor de células T. Este protocolo para multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de superficie celular aprovecha las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo.

Abstract

La afluencia de calcio en respuesta a la estimulación del receptor de células T es una medida común de la señalización de células T. Se han desarrollado varios colorantes indicadores de calcio para evaluar la señalización de calcio mediante citometría de flujo de paso de banda. Este protocolo está diseñado para medir las respuestas de calcio en células T murinas primarias utilizando citometría de flujo de espectro completo. Los esplenocitos totales se marcan con el colorante indicador de calcio ratiométrico Indo-1, junto con un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo contra moléculas de la superficie celular. Aprovechar las capacidades de la citometría de flujo de espectro completo proporciona una plataforma para utilizar una amplia gama de tinciones de superficie celular en combinación con Indo-1. Las células se analizan en tiempo real a 37 °C antes y después de la adición de un anticuerpo anti-CD3 para estimular el receptor de células T. Después de desmezclar las señales espectrales, se calcula la proporción de Indo-1 unido a calcio libre y se puede visualizar a lo largo del tiempo para cada población cerrada de esplenocitos. Esta técnica puede permitir el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en poblaciones celulares múltiples.

Introduction

La afluencia de calcio inducida por receptores de células T (TCR) es una medida útil de la activación de células T y se usa con frecuencia para determinar si una población de células T tiene respuestas deterioradas en los pasos proximales de la vía de señalización TCR1. Las mediciones de la afluencia de calcio generalmente se realizan marcando previamente las células T con uno o un par de colorantes indicadores fluorescentes de calcio, y luego examinando las señales fluorescentes utilizando citometría de flujo en tiempo real después de la reticulación TCR 2,3,4. Indo-1, un colorante de calcio métrico de relación, es excitado por el láser UV con emisiones máximas en dos longitudes de onda diferentes dependiendo de la unión al calcio5, y es un colorante indicador comúnmente utilizado para el análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio en linfocitos vivos. Como el perfil de emisión de Indo-1 es bastante amplio, puede ser difícil combinar la evaluación de Indo-1 con el análisis simultáneo de múltiples marcadores de superficie celular mediante citometría de flujo de paso de banda. Esta limitación restringe la utilización del análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio a poblaciones prepurificadas de células T o a poblaciones identificadas por un conjunto limitado de moléculas de superficie celular.

Para abordar las limitaciones de medir las respuestas de calcio en poblaciones heterogéneas de linfocitos primarios mediante citometría de flujo de paso de banda, se desarrolló un protocolo para medir la fluorescencia Indo-1 mediante citometría de flujo de espectro completo. Este método permite multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de la superficie celular, aprovechando las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo. La ventaja de utilizar la citometría de flujo de espectro completo sobre la citometría de flujo convencional es su capacidad para distinguir las señales fluorescentes de colorantes altamente superpuestos, aumentando así el número de marcadores de superficie que se pueden evaluar simultáneamente en cada muestra. La citometría de flujo convencional utiliza filtros de paso de banda y está restringida a un fluorocromo por sistema detector6. La citometría de flujo de espectro completo recoge señales en todo el espectro del fluorocromo utilizando 64 detectores en un sistema de citometría de flujo espectral de cincoláseres 7,8. Además, la citometría de flujo de espectro completo aprovecha los detectores APD (Avalanche Photo Diode) que tienen una mayor sensibilidad en relación con los detectores de tubos fotomultiplicadores presentes en los citómetros de flujo convencionales8. En consecuencia, este enfoque es ideal para las poblaciones de células heterogéneas, como las células mononucleares de sangre periférica o las suspensiones murinas de células de órganos linfoides secundarios, ya que elimina la necesidad de aislar poblaciones específicas de células T antes del marcado del colorante de calcio. En cambio, los perfiles de expresión del marcador de superficie celular y la activación por citometría de flujo después de la recopilación de datos se pueden usar para evaluar las respuestas al calcio en cada población de interés. Como se muestra en este informe, Indo-1 se puede combinar fácilmente con ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo, lo que resulta en un total de 10 firmas espectrales únicas. Además, este método se puede aplicar fácilmente a mezclas de células de líneas de ratón congénicamente distintas, lo que permite el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en células T de tipo salvaje en comparación con las de una línea de ratón dirigida a genes.

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Protocol

Los ratones se mantuvieron en el campus médico Anschutz de la Universidad de Colorado de acuerdo con los protocolos de IACUC. Todos los ratones fueron sacrificados de acuerdo con los estándares de AAALAC.

1. Preparación de células inmunes del bazo del ratón

NOTA: Eutanasia a ratones ingenuos con eutanasia deCO2 . Los ratones C57BL / 6 comprados en Jackson Laboratories y criados internamente se utilizan para experimentos a las 6-12 semanas de edad. Tanto los ratones machos como las hembras se utilizan para experimentos.

  1. Desinfecte la piel del ratón con etanol al 70% para reducir la posibilidad de que los contaminantes externos entren en la muestra.
  2. Diseccionar el bazo del ratón con herramientas de disección, tijeras quirúrgicas y fórceps. Recolecte el bazo y coloque el bazo desprendido en un tubo cónico de 50 ml con ~ 5 ml de medios RPMI completos (cRPMI) en hielo.
    NOTA: El RPMI completo está compuesto por 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina.
    1. Para cosechar el bazo del ratón, haga una incisión de 5 cm en el pelaje y la piel a lo largo del lado izquierdo del ratón a medio camino entre las patas delanteras y traseras con tijeras. Abra la cavidad corporal ~ 5 cm y retire el bazo con fórceps. El bazo es del color de un frijol y es más largo y plano que el riñón vecino.
  3. Verter el contenido del paso 1.2 en un filtro estéril de 70 μm conectado a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Separe mecánicamente el bazo en una suspensión de una sola célula empujando el bazo a través del filtro con un émbolo de jeringa de 5 ml hasta que no quede pulpa de bazo en la superficie del filtro.
  4. Granular los esplenocitos utilizando una centrífuga de encimera de rotor basculante a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Decantar cuidadosamente el sobrenadante. Los esplenocitos granulados permanecen en el fondo del tubo cónico de 50 ml.
  6. Para eliminar los glóbulos rojos, vuelva a suspender los esplenocitos granulados en 1 ml de tampón de lisis ACK durante 3 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar bien.
  7. Apague el tampón de lisis ACK con 15 ml de cRPMI.
  8. Granular los linfocitos como se indica en el paso 1.4.
  9. Vuelva a suspender la suspensión celular en 5 ml de cRPMI en un tubo cónico de 50 ml. Coloque las muestras en hielo.
    1. Para contar las células, transfiera 10 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml y diluya en una proporción de 1:1 con la solución de azul de tripano. Luego, transfiéralo a un hemocitómetro o sistema automatizado de conteo celular.
  10. Después de contar, dependiendo de la concentración celular en suspensión celular como en el paso 1.9, granular las celdas en una centrífuga de mesa a 500 x g a 4 °C durante 5 min para prepararse para la adición de medios cRMPI que contengan colorante éster Indo-1 AM.
  11. Calcular el volumen para la resuspensión de las células para lograr 10-12 x 106 células/ml. Esta es una concentración de 2x del recuento total de células requerido.
  12. Vuelva a suspender las celdas en el volumen de cRPMI calculado en el paso 1.11. Coloque las células a 37 °C con 5% deCO2 en un tubo cónico de 50 ml con la tapa ventilada o en una placa de cultivo de tejidos.

2. Colorante ratiométrico Indo-1 y etiquetado de anticuerpos fluorescentes

  1. Según las instrucciones del fabricante, añadir 50 μL de DMSO en un vial que contenga 50 μg de Indo-1 AM. La concentración de la solución madre es de 1 μg/μL.
    NOTA: DMSO se proporciona en micro-viales con el kit para evitar cualquier oxidación de DMSO.
  2. Diluir la alícuota madre (1 μg/μL) en el volumen experimental apropiado (establecido en 1.11) de cRPMI a una concentración de 6 μg/ml, una concentración de 2x. No almacene Indo-1 en una solución acuosa.
    NOTA: Se pueden usar otros tampones con calcio agregado dependiendo de las necesidades celulares.
  3. Ponga a un lado el soporte completo con Indo-1 en un baño maría a 37 °C.
    NOTA: Utilice la concentración mínima de éster Indo-1 AM necesaria para obtener una señal adecuada. Esto debe ajustarse para diferentes tipos de células. Típicamente, una concentración entre 3-5 μM es suficiente. Para las células T primarias, la carga de células con Indo-1 a una concentración >5 μg/ml aumenta la intensidad fluorescente media (MFI) por encima de un log de 6 en los citómetros de flujo espectral. Si esto ocurre, disminuya la intensidad del láser UV y titule el Indo-1 a una concentración más baja.
  4. Diluir la suspensión celular previamente preparada (en el paso 1.12), 1:1 en cRPMI, incluyendo los medios 2x Indo-1 fabricados en el paso 2.2. Asegúrese de que las células estén en una concentración entre 5-6 x 106/mL.
    NOTA: No cargue con tinte el control de manchas individuales sin teñir ni los controles de celda de tinción única con Indo-1. Agregar Indo-1 a los controles de anticuerpos de tinción única creará una muestra multicolor debido al Indo-1 agregado a las células teñidas individuales. Incluya el control agregado de EGTA indo-1 (sin calcio) a la placa de muestra creada en el paso 2.6.
  5. Agregue 1 ml de células/pozo/condición experimental en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos.
  6. Cree un solo control teñido para la muestra Indo-1 (libre de calcio) utilizando células previamente cargadas con colorante Indo-1 y agregue EGTA a una concentración final de 2 mM. EGTA quelará el calcio en la suspensión celular, dando una muestra de control más limpia.
    1. Cree un control positivo de Indo-1 (Indo-1 unido al calcio) agregando 50 μM de ionomicina a la suspensión celular cargada de colorante en el citómetro de flujo. La ionomicina es un ionóforo de calcio permeable a la membrana que se une a los iones de calcio y facilita la transferencia de iones de calcio a las células.
  7. Crear un pozo para el control biológico negativo sin fluoróforos ni colorante Indo-1.
  8. Crear un pozo para controles de tinción única para cualquier población celular adicional de interés (anticuerpos definidos por el usuario) utilizando fluoróforos conjugados con anticuerpos en un diseño de panel de citometría de flujo. Estos no incluirán el tinte ratiométrico Indo-1.
  9. Agregue el anticuerpo bloqueador del receptor Fc (~ 2 μg / 1 x 106 células), según las instrucciones del fabricante, antes de agregar anticuerpos conjugados con fluorocromo adicionales para la tinción de superficie.
  10. Incubar la placa durante 45 min a 37 °C con 5% deCO2.
  11. Vuelva a suspender las células en una placa de 12 pocillos golpeando suavemente la placa cada 15 minutos.
  12. Mezcle y retire todo el volumen de células suspendidas en el medio de la placa de 12 pocillos. Luego agregue la suspensión celular a los tubos de microcentrífuga de 1.7 ml.
  13. Granular las células en una microcentrífuga a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante y lavar las células añadiendo 1 ml de cRPMI precalentado. Pellet de nuevo y decantar el sobrenadante.
    NOTA: El lavado de las células elimina cualquier anticuerpo bloqueador FC restante.
  14. Resuspender las células en 1 ml de cRPMI en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml e incubar cada tubo a 37 °C durante 30 minutos adicionales al 5% deCO2, dejando la parte superior del tubo ligeramente abierta para permitir el intercambio de gases. Esto permite la desesterificación completa de los ésteres AM intracelulares.
  15. Transfiera las células de nuevo a una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos, si es necesario. Se pueden agregar anticuerpos conjugados con fluorocromo titulados adicionales definidos por el usuario en una fase de reposo.
    NOTA: Los marcadores utilizados en el panel de métodos incluyen: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 y tetrámero CD1d/α-galcer. Los marcadores se eligen para analizar subconjuntos de células T.
    1. Cree una mezcla maestra de todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo definidos por el usuario de acuerdo con los tipos de células de interés a un volumen previamente titulado en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
    2. Agregue una mezcla maestra calculada para 1 ml del volumen celular, dependiendo de los anticuerpos titulados contra las células en reposo.
      NOTA: La ventaja de teñir en el paso 2.15 en lugar del paso posterior 2.18 es que la tinción en el paso 2.15 disminuirá el tiempo total de incubación para el experimento. Sin embargo, la tinción en un volumen total de 1 ml en el paso 2.15 aumenta el uso de anticuerpos.
  16. Después del reposo, granular las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Las células en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos se pueden peletizar en la placa con un accesorio de centrífuga de placa. De lo contrario, granule las células en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
  17. Lavar las células resuspendiendo el pellet en 1 ml de cRPMI frío a 4 °C y volver a granular las células como en el paso 2.16. Coloque las celdas en hielo.
    NOTA: Si las células de tinción superficial por separado, después de la desesterificación en el paso 2.18, se necesita menos volumen de anticuerpos. La tinción superficial en este paso se puede realizar después de la fase de reposo en tampón de flujo frío (1x DPBS con FBS agregado al 1%), utilizando anticuerpos definidos por el usuario, en hielo durante 30 min. Lave las células después de la tinción en cRPMI como en el paso 2.17.
    1. Agregue la tinción de viabilidad Ghost540 diluida 1:7,500 en DPBS a las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El calor mata las células a 55 °C en un bloque de calentamiento para un solo control vivo / muerto teñido.
      NOTA: La viabilidad funcional de la tinción de colorante para eliminar las células muertas en el análisis citométrico de flujo se realiza sin FBS. FBS puede interactuar con colorantes de amina según las instrucciones del fabricante.
  18. Vuelva a suspender muestras individuales en 500 μL de cRPMI (libre de rojo de fenol) utilizando un tubo de flujo de poliestireno de 5 ml con una tapa.
    NOTA: Las células se pueden dejar a 4 °C durante un máximo de una hora.
  19. Calentar cada tubo de 5 ml que contenga células, individualmente, a 37 °C usando un baño de perlas durante 7 minutos antes del análisis en el citómetro de flujo manteniendo el tiempo constante entre las muestras. Utilice un temporizador.

3. Tubo de baño de cuentas: mantenimiento de la temperatura durante el análisis de flujo de calcio

  1. Agregue cuentas de baño a un pequeño baño de agua, sin agua agregada; calentamiento hasta 37 °C.
  2. Corte cuidadosamente un tubo cónico de 50 ml por la mitad, en la marca de 25 ml, con una cuchilla de afeitar; Deseche la parte superior del tubo.
  3. Llene el tubo cortado por la mitad 3/4 del camino con cuentas de baño.
  4. Coloque el tubo creado en el paso 3.2 en el baño de cuentas creado en el paso 3.1. Llevar el tubo y las perlas a 37 °C.
  5. Enchufe el baño de perlas en una toma de corriente junto al citómetro de flujo para mantener la temperatura en preparación para el análisis de muestras.
  6. Agregue un corte de rejilla de espuma de poliestireno cónico de 50 ml para sostener un tubo para colocar el tubo en su lugar mientras se ejecuta en el citómetro de flujo. Esto eliminará la necesidad de sostener manualmente el tubo durante la duración del análisis de la curva.

4. Adquisición de afluencia de calcio mediante análisis citométrico de flujo

  1. Inicie sesión en el software del citómetro de flujo en un analizador de flujo.
  2. Haga clic en la pestaña Biblioteca para agregar etiquetas fluorescentes Indo-1 (unido al calcio) e Indo-1 (sin calcio). Seleccione Etiquetas fluorescentes en el menú de software de la izquierda. Seleccione láser UV en grupos de etiquetas fluorescentes y haga clic en +agregar para agregar un nombre de etiqueta fluorescente (Indo-1 (unido al calcio) / Indo-1 (sin calcio)) a la biblioteca. Elija la longitud de onda de excitación láser y la longitud de onda de emisión, y luego haga clic en Guardar. Continúe con la configuración experimental.
    NOTA: Indo-1 es excitado por el láser UV a una longitud de onda de 355 nm. La longitud de onda de emisión de Indo-1 (unida al calcio) es de 372 nm. La longitud de onda de emisión de Indo-1 (libre de calcio) es de 514 nm.
  3. Haga clic en la pestaña Adquisición. Abra / cree un nuevo experimento y agregue las etiquetas fluorescentes deseadas al experimento.
  4. Cree un grupo de referencia y un nuevo grupo de muestra para el experimento. Etiquete tanto las muestras como los grupos de referencia según sea necesario.
  5. En la pestaña Adquisiciones , establezca los eventos que se registrarán al máximo: 10.000.000.
  6. Ajuste el volumen de parada al volumen máximo: 3.000 μL.
  7. Ajuste el tiempo de parada al tiempo máximo: 36.000 s.
  8. Adquiera controles de tinción única para anticuerpos conjugados definidos incluidos en el panel multicolor.
  9. Adquiera controles de tinción única para el tinte funcional Indo-1.
    1. Añadir 50 μM de ionomicina al control positivo Indo-1 unido al calcio. Vórtice para mezclar. Agregue el tubo de flujo al puerto de inyección de muestra y haga clic en Grabar.
    2. Agregue el control negativo Indo-1 libre de calcio al citómetro de flujo y haga clic en Grabar. EGTA se agregó en el paso 2.6.
    3. Desmezcle los controles de una sola mancha haciendo clic en el botón Desmezclar .
      NOTA: Todos los controles de tinción única de todos los anticuerpos conjugados y colorantes funcionales deben registrarse antes de desmezclar las muestras. Para que el botón Desmezclar funcione, primero deben grabarse todos los controles de referencia. La mezcla se puede hacer antes o después de la recolección de muestras.
  10. Una vez completada la desmezcla, cree gráficos secuenciales utilizando la hoja de cálculo sin mezclar. SSC-A versus FSC-A eliminando restos de la muestra, SSC-A versus SSC-H para eliminar dobletes. Esto es seguido por una puerta de limpieza de viabilidad junto con una mayor activación de las poblaciones de interés. Para crear puertas, haga clic en Trazar. Agregue una gráfica a la hoja de cálculo y haga doble clic dentro de la puerta para crear una población cerrada aguas abajo. Continúe hasta que se contabilicen todas las poblaciones de interés.
  11. Muestras de control teñidas individuales calientes (desde los pasos 2.6-2.9 en la sección Indo-1 colorante ratiométrico y etiquetado de anticuerpos fluorescentes) hasta 37 °C para análisis secuencial. Configure el software de citometría de flujo.
  12. Deje correr agua DI en el citómetro durante 2-3 minutos para garantizar la estabilidad fluídica del citómetro de flujo.
  13. Configure gráficos secuenciales en la hoja de cálculo sin mezclar creando puertas con los botones Polígono, Rectángulo o Elipse. Puerta para incluir la población de interés (es decir, linfocitos que usan SSC-A vs. FSC-A [discriminación de tamaño / linfocitos]). Las poblaciones negativas aparecen agrupadas alrededor de cero, mientras que las poblaciones positivas se pueden visualizar aumentando la IMF. Las poblaciones de interés serán definidas por el usuario en función de la cuestión biológica.
  14. Haga doble clic dentro de la puerta creada y cambie los parámetros del eje Y y del eje X a SSC-A frente a SSC-H (discriminación de singletes). Complete la definición de los parámetros del eje haciendo clic izquierdo en las palabras del eje.
  15. Cree una gráfica con SSC-A frente a la señal de colorante de viabilidad (parámetros de compuerta de viabilidad). Puerta en células vivas, que son negativas para la tinción de colorante de amina. Las células vivas, negativas para la tinción muerta viva, se agruparán en la marca 0 en los ejes Y y X.
  16. Haga doble clic en la gráfica interior para crear una nueva gráfica que contenga solo linfocitos vivos de una sola célula. Cambie el eje Y a Indo-1 (calcio unido) (V1) y/o Indo-1 (calcio libre) (V7) frente al tiempo en el eje X para la visualización de la afluencia de calcio.
  17. Coloque la muestra biológica calentada en la máquina SIT y ejecute las muestras a 2,500-3,000 eventos / s en el medio para permitir la visualización de la afluencia de calcio en poblaciones de número limitado de células (por ejemplo, iNKT).
    NOTA: Al resuspender las células a una concentración de 1 x 106/ml, los eventos celulares recogidos a un caudal medio deben ser iguales a 2.500-3.000 eventos/s. Baje el caudal bajo control de adquisición haciendo clic en el menú desplegable o diluya la muestra si la suspensión celular tiene una concentración aumentada. Ejecutar las muestras a un alto caudal puede aumentar la propagación de la señal de un fluoróforo a otros fluoróforos en el panel.
  18. Añadir el siguiente tubo al baño de perlas para calentar a 37 °C.
  19. En el Control de adquisición, pulse Grabar para registrar los datos iniciales durante 30 s para obtener un nivel basal de señalización de calcio en la muestra.
  20. En el Control de adquisición, haga clic en Detener y retire el tubo del puerto de inyección de muestras (SIP).
  21. Agregue 30 μg de anti-CD3 no conjugado directamente en el tubo de muestra para iniciar la afluencia de calcio. La concentración final por tubo es de 60 μg/ml.
    NOTA: No hay ningún paso de lavado después de la adición de anti-CD3.
  22. Vuelva a colocar el tubo en el SIP de la máquina lo más rápido posible y pulse Grabar en el software.
  23. Registre los datos durante 7 minutos, observando el tiempo transcurrido bajo los controles de adquisición en el software, para observar el curso temporal de la afluencia de calcio dentro de las poblaciones de la muestra.
  24. Después de 7 minutos, presione Detener en el software y agregue 1 μg / ml de ionomicina. Registrar durante 30 s para obtener la máxima señal de calcio en las células de interés. Para limitar el arrastre de ionomicina a la siguiente muestra, complete dos descargas SIT en el instrumento entre muestras.
  25. Continúe con la siguiente muestra y repita el flujo de trabajo hasta que se hayan recopilado todas las muestras.
  26. Guarde el experimento y haga clic en el archivo zip de exportación . Los archivos sin mezclar (.fsc) se cargan en un software externo de análisis de citometría de flujo.

5. Análisis de la curva de calcio

  1. Usando un software de análisis6 para citometría de flujo, convierta las señales fluorescentes Indo-1 a una proporción para mediciones de calcio de lapso de tiempo. Derive parámetros en la pestaña de herramientas insertando referencias Indo-1 (unido al calcio)/Indo-1 (calcio libre) utilizando una escala lineal. Establezca el mínimo en cero y el máximo de acuerdo con la afluencia de la proporción de calcio, generalmente alrededor de 10. La proporción máxima varía según el tipo de célula y la MFI de Indo-1.
  2. Resalte el parámetro seleccionado. En herramientas, agregue análisis cinético para elegir el parámetro haciendo clic en la pestaña Cinética . Establezca el eje Y en derivado.
  3. Seleccione MFI (intensidad fluorescente media) en la pestaña Cinética.
  4. Agregue suavizado gaussiano, si lo desea. Para agregar suavizado gaussiano, seleccione la opción en el menú desplegable de estadísticas del software de análisis de flujo. Se puede agregar suavizado gaussiano para suavizar la visualización de la curva de afluencia de calcio del análisis.
  5. Crear múltiples rangos para estadísticas a lo largo del curso de tiempo de flujo de calcio para comparaciones biológicas dentro de las muestras.
  6. Arrastre las muestras al editor de diseño y agregue las estadísticas como desee. El análisis estadístico varía dependiendo de la cuestión biológica. Para fines de publicación, se analizan múltiples réplicas utilizando t-test o ANOVA.
  7. Para un momento de análisis de tiempo, coloque la puerta en un momento específico en el tiempo a lo largo del flujo de calcio. Examine los marcadores de superficie deseados y la puerta en la población de interés; luego, evalúe un diagrama de puntos bidimensional de Indo-1 (libre de calcio) versus Indo-1 (unido al calcio) para células cerradas dentro de ese momento en la región de tiempo.

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Representative Results

El flujo de trabajo experimental para evaluar las respuestas de calcio en células T murinas primarias utilizando un colorante ratiométrico Indo-1 con tinciones superficiales de multiplexación se muestra en la Figura 1. Después de cosechar y procesar los esplenocitos de ratón en una suspensión de una sola célula, las células se tiñen con un éster Indo-1 AM y se tiñen superficialmente con anticuerpos ligados al fluorocromo. Una vez que se completa la carga de colorante y la tinción de anticuerpos, las muestras de linfocitos se calientan a una temperatura biológica (37 °C). Las muestras se analizan utilizando citometría de flujo de espectro completo para la fluorescencia Indo-1 después de la activación de los tipos de células individuales deseados, sin la necesidad de clasificar las muestras antes del análisis. Para utilizar detectores de fotodiodos de avalancha (APD) dentro del citómetro de flujo de espectro completo, es necesario convertir la longitud de onda de emisión máxima de una longitud de onda de filtro de paso de banda medida en nm a su canal respectivo en el APD. La tabla que se muestra en la Figura 2 proporciona una guía, pero los detectores óptimos para las dos firmas de fluorescencia de Indo-1 (unido al calcio versus libre de calcio) deben determinarse empíricamente. Esto se logra mediante la preparación de muestras únicas de Indo-1 teñidas utilizando ionomicina para generar la señal Indo-1 (unida al calcio), y EGTA, un agente quelante del calcio, para generar la señal Indo-1 (libre de calcio). Después del análisis utilizando citometría de flujo de espectro completo, se puede visualizar el canal que muestra la intensidad máxima de fluorescencia para cada firma Indo-1 (Figura 3A). Al normalizar la MFI de las poblaciones positivas a la de las poblaciones negativas, se puede determinar el cambio en la fluorescencia Indo-1 de libre de calcio a unida al calcio (Figura 3B). Esta visualización se genera en un libro de trabajo (.xls) utilizando controles de referencia para Indo-1 enlazado y libre, dibujando una puerta de intervalo negativo y positivo con puertas positivas y negativas claras para la normalización de MFI como se muestra en (Figura 3A). También se pueden obtener ejemplos de estadísticas de MFI haciendo clic derecho en la tabla de estadísticas. En el software, determine la relación MFI dividiendo la población positiva con la población negativa y superponga los dos espectros en una sola pantalla (Figura 3B, derecha). La flecha punteada amarilla muestra las diferencias espectrales normalizadas entre las firmas espectrales de Indo-1 unido y libre.

Para evaluar las respuestas de calcio después de la estimulación del receptor de células T, la fluorescencia Indo-1 se evalúa después de la activación de las poblaciones celulares de interés, como se muestra en la Figura 4. Primero, se examina una gráfica de tiempo versus dispersión lateral (SSC-A) para evaluar la estabilidad fluídica; una señal estable y consistente a lo largo del eje de tiempo indica estabilidad (Figura 4A). A continuación, se visualiza la dispersión hacia adelante versus hacia el lado (FSC-A vs. SSC-A), y la población de linfocitos está cerrada como se muestra en (Figura 4B). Después de la puerta de linfocitos, se aplica una sola puerta de discriminación de células generando una gráfica de altura de dispersión lateral frente al área (SSC-H vs. SSC-A), y los singletes, que caen en diagonal, están cerrados como se muestra en la Figura 4C. A continuación, se evalúa la viabilidad de los singletes, examinando la tinción con el colorante de viabilidad y la activación de la población negativa (Figura 4D). Finalmente, para analizar las células T, se aplica un volcado de células B / puerta de control negativo interno mediante gating en la población CD19 negativa (Figura 4E). La población CD19 negativa se evalúa para los subconjuntos de células T utilizando anticuerpos contra CD4 y CD8 (Figura 4F); el ejemplo que se muestra examina las respuestas de calcio de las células T CD4 + mediante la visualización de la fluorescencia Indo-1 (unida al calcio) frente al tiempo (Figura 4G). Después de la activación en un segmento de tiempo, también se puede generar la gráfica Indo-1 (libre de calcio) versus Indo-1 (unida al calcio) (Figura 4H). Este análisis se utilizará posteriormente para derivar la relación Indo-1 (ver métodos de análisis de curva de afluencia de calcio en software de análisis de citometría de flujo).

En este punto del análisis, puede ser útil analizar momentos en el tiempo dentro de la gráfica bidimensional de Indo-1 (unido al calcio) versus tiempo en poblaciones celulares individuales de interés. Los puntos de tiempo óptimos incluyen el calcio basal unido a Indo-1 antes de la estimulación TCR, la respuesta máxima, un punto de tiempo varios minutos después de la respuesta máxima a medida que disminuyen los niveles de calcio intracelular y, finalmente, la respuesta de calcio provocada al agregar ionomicina (Figura 5A). En la muestra basal antes de la adición de anticuerpos anti-CD3, se detecta una señal débil de Indo-1 (unida al calcio). Durante la respuesta máxima, las células muestran una fuerte señal de Indo-1 (unida al calcio) y una fluorescencia reducida de Indo-1 (libre de calcio). A los 5 minutos después del pico, la fluorescencia Indo-1 casi volvió a la línea de base. Después de agregar ionomicina a la muestra, se puede visualizar una señal robusta de Indo-1 (unido al calcio), asegurando una carga de tinte adecuada de las células. Las poblaciones de células raras (<1%) pueden ser difíciles para el análisis de derivados; para superar esta limitación, se puede realizar un análisis de las poblaciones raras trazando Indo-1 (unido al calcio) versus Indo-1 (libre de calcio) después de la activación en cada población de interés, como células CD4 +, células TCRb +, células TCRyg +, células CD25 +, células iNKT y células CD19 + (Figura 5B, C). Tenga en cuenta la respuesta de calcio fácilmente detectable en las células T TCRγδ+ y las células iNKT (CD1d / α-galcer +). Para la comparación de proteínas de superficie dentro de una población mixta de células T murinas, se crearon gráficos bidimensionales que muestran subconjuntos de interés. A continuación, se muestra el análisis de la respuesta del calcio durante todo el curso de tiempo para cada subconjunto (Figura 5C).

Este ensayo también se puede utilizar para establecer diferencias biológicas en células T de ratones de tipo salvaje versus genes dirigidos o en células T no tratadas versus tratadas con inhibidores farmacológicos. En el ejemplo mostrado en la Figura 6, las células T fueron tratadas con PRN694, un inhibidor de molécula pequeña de las tirosina quinasas de células T, ITK y RLK 9,10. La inhibición de ITK/RLK amortigua la señalización del receptor de células T, lo que lleva a una respuesta reducida al calcio después de la estimulación del receptor de células T11 (Figura 6A). Para cuantificar los efectos de la inhibición de ITK/RLK, las curvas que muestran la relación de fluorescencia Indo-1 (unida al calcio) a Indo-1 (libre de calcio) se pueden analizar para el área bajo la curva (AUC) o la pendiente de la curva para cada condición (Figura 6B, C). Esta cuantificación se realiza seccionando el curso temporal de la respuesta al calcio en segmentos discretos (Figura 6A) y evaluando el área bajo la curva o la pendiente de la curva para cada segmento, como se muestra (Figura 6B, C). En general, este protocolo demuestra que la citometría de flujo de espectro completo se puede utilizar para medir la afluencia de calcio junto con múltiples marcadores de superficie celular en poblaciones de células inmunes bajo investigación. Estos resultados muestran que los subconjuntos celulares representados en más del 1% de la población total pueden evaluarse para determinar la afluencia de calcio a lo largo del tiempo. Por el contrario, los subconjuntos celulares menos abundantes requieren un análisis alternativo utilizando momentos de tiempo.

El análisis estadístico de los datos de respuesta al calcio es específico para la pregunta experimental y los ensayos biológicos que se están realizando. En los datos presentados en el manuscrito, se realizaron experimentos con réplicas para asegurar la precisión experimental y la robustez de la metodología; Sin embargo, no se realizaron múltiples experimentos en diferentes muestras biológicas durante diferentes días. Por lo tanto, no sería apropiado realizar análisis estadísticos sobre los datos presentados.

Figure 1
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo del ensayo de calcio. El uso del colorante indicador de calcio éster Indo-1 AM proporciona una herramienta para visualizar la afluencia de calcio en las células inmunes y sus subpoblaciones. Este esquema describe el flujo de trabajo para el análisis de las respuestas de calcio en células T esplénicas murinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Conversión de longitudes de onda PMT a canales APD. El citómetro de flujo de espectro completo tiene 16 detectores para detectar emisiones fluorescentes después de la excitación por el láser UV. Las especificaciones de cada detector se indican en la tabla. Se destacan los dos detectores utilizados para la evaluación de la fluorescencia Indo-1, ya que se determinaron empíricamente utilizando controles de tinción única. Las conversiones a longitud de onda APD y el manual de usuario para el citómetro de flujo espectral están disponibles11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Visualización de la firma espectral Indo-1. (A) Arriba: Firma espectral de la fluorescencia Indo-1 en células T CD8+ después de la introducción de ionomicina para provocar una afluencia robusta de calcio. El pico de Indo-1 (unido al calcio) se puede visualizar en UV1. Abajo: Firma espectral de Indo-1 (libre de calcio) que muestra el pico de fluorescencia en UV7. Esta muestra de control se generó tratando células cargadas con Indo-1 con EGTA12 para quelar cualquier calcio libre extracelular. (B) Se combinaron cinco superposiciones de espectro láser de la firma Indo-1, mostrando MFI espectral en bruto a la izquierda y los espectros normalizados de Indo-1 unido versus Indo-1 libre a la derecha. La visualización del cambio de Indo-1 (libre de calcio) en naranja a Indo-1 (unido al calcio) en azul se puede detectar fácilmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Estrategia de acceso para la visualización de las respuestas al calcio. Se describe el flujo de trabajo para la activación secuencial de las muestras. (A) La estabilidad fluídica se examina utilizando una puerta de tiempo versus SSC-A. (B) FSC-A versus SSC-A se utiliza para bloquear los linfocitos, eliminando así los restos celulares y los glóbulos rojos residuales en la muestra. (C) Las celdas individuales están cerradas usando una gráfica SSC-H versus SSC-A. (D). La puerta singlete se aplica a una trama de Ghost540 vivo-muerto versus SSC-A; Las células negativas para Ghost540 eliminan las células no viables del análisis posterior. (E) Las células vivas se analizan para CD19 versus SSC-A, y las células CD19 negativas (células no B) están activadas. (F) Las células CD19 negativas se examinan para detectar tinción CD4 versus CD8. (G) Las células CD4 + se activan para visualizar el tiempo frente a Indo-1 (unido al calcio). (H) Se selecciona un momento en el tiempo para representar el inicio de la respuesta de afluencia de calcio después de la adición de anticuerpos anti-CD3 mediante la visualización de fluorescencia Indo-1 (libre de calcio) versus Indo-1 (unida al calcio). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Visualización de la fluorescencia Indo-1 en poblaciones cerradas de timocitos murinos en puntos de tiempo discretos en la respuesta al calcio. Los timocitos totales fueron estimulados con anticuerpos anti-CD3 seguidos de ionomicina después de 6 min de la recolección de la muestra. En cuatro puntos de tiempo discretos, como se indica en los cuadros rectangulares descritos en las gráficas bidimensionales de tiempo versus Indo-1 (unido al calcio), se examinaron diferentes subpoblaciones de timocitos para las respuestas de calcio. (A) Gráficos bidimensionales que muestran la activación de la señal indo-1 basal, la respuesta máxima, la respuesta post-pico de 5 minutos y la respuesta a la ionomicina. Debajo de cada gráfico se muestra la tinción CD4 versus CD8 (izquierda) y la gráfica de Indo-1 (libre de calcio) versus Indo-1 (unida al calcio) en timocitos CD4 positivos (SP) cerrados. (B) Las gráficas de Indo-1 (libre de calcio) versus Indo-1 (unido al calcio) en subconjuntos cerrados de timocitos se muestran en cada uno de los cuatro puntos temporales, utilizando la estrategia de compuerta que se muestra en (A). (C) Se crearon gráficos bidimensionales que mostraban la tinción de timocitos totales con los anticuerpos indicados. Los subconjuntos específicos se cerraron (fila superior) y se examinaron para determinar las respuestas de calcio frente al tiempo (abajo). Población CD8+ azul claro, población CD4 roja (SP), que exhibe la mayor afluencia de calcio, timocitos CD4+CD8+ doble positivos, células iNKT de color verde oscuro, CD25+ de color verde claro, células T TCRγδ+ púrpuras y células B CD19+ negras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Inhibición de la respuesta al calcio en células T CD8+ tratadas con un inhibidor de molécula pequeña de ITK/RLK. Durante la carga de colorante Indo-1, los esplenocitos fueron tratados con dos dosis de PRN694, 100 nM (gris oscuro) y 200 nM (gris claro). (A) La relación Indo-1 (unida al calcio/libre de calcio) se muestra frente al tiempo para las células no tratadas (rojo) y las células tratadas con PRN694. Las curvas muestran la respuesta al calcio de las células T CD8+ cerradas. La línea negra representa el control negativo de los esplenocitos cargados con Indo-1 y teñidos superficialmente, pero no estimulados con anticuerpos anti-CD3. (B,C) Los datos se pueden analizar dividiendo el eje de tiempo que se muestra en (A) en ocho segmentos, visualizados con líneas punteadas negras, y calculando el área bajo la curva (AUC) (B), o la pendiente de cada curva (pendiente) (C) en cada intervalo de tiempo de la respuesta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un ensayo optimizado diseñado para medir las respuestas de calcio en células T murinas primarias cargadas con colorante indicador ratiométrico Indo-1 titulado utilizando citometría de flujo de espectro completo 7,8. La ventaja de realizar ensayos de flujo de calcio utilizando citometría de flujo de espectro completo es la capacidad de multiplexar la tinción del marcador celular de superficie en combinación con la evaluación de la fluorescencia Indo-1. La citometría de flujo de espectro completo tiene la ventaja de permitir el uso de colorantes altamente superpuestos, aumentando así el número de marcadores que se pueden usar en un panel. Esto se debe al hecho de que el citómetro de flujo de espectro completo recoge toda la luz láser emitida a través de una serie de detectores para cada muestra analizada, en lugar de tener un detector dedicado a un fluorocromo. El uso de todo el espectro de cada fluor permite una mayor sensibilidad del ensayo y proporciona un medio para identificar fluorocromos espectralmente únicos que tendrían señales superpuestas si se recogieran en un citómetro de flujo de paso de banda. Esto también elimina la necesidad de aislamiento previo de un subconjunto de células bajo investigación.

En este estudio, se evaluó un panel de marcadores de superficie celular con anticuerpos conjugados con fluorocromo. Este panel incluyó αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 y CD1d-αgal-cer tetrámero-APC; además, el panel incluyó el tinte Ghost540 vivo-muerto. El canal óptimo para detectar cada uno de estos fluorocromos está disponible en el manual del usuario del citómetro de flujo de espectro completo13. En contraste, la detección de Indo-1 (libre de calcio) e Indo-1 (unido al calcio) se determinó empíricamente, aunque se estimó un canal de pico aproximado para la detección de cada firma fluorescente basado en las longitudes de onda de emisión pico conocidas para las dos formas de Indo-1. También es posible convertir las longitudes de onda de emisión máxima de las longitudes de onda del filtro de paso de banda utilizadas en los citómetros de flujo convencionales y medidas en nm a sus respectivos canales en los detectores de fotodiodos de avalancha (APD) utilizados por el citómetro de flujo de espectro completo; esto también puede proporcionar una estimación de los canales óptimos para detectar Indo-1 (libre de calcio) e Indo-1 (unido al calcio), respectivamente. Dado que se incluyen controles de tinción única para cada etiqueta fluorescente, el proceso de desmezcla descontornea las firmas fluorescentes, lo que permite la visualización de la intensidad de cada fluorocromo en las células de cada muestra. Como se describe en este método, el análisis de datos se puede realizar mediante la activación de subconjuntos celulares de interés y la visualización de la proporción de detección de Indo-1 (libre de calcio) e Indo-1 (unido al calcio) versus el tiempo.

Hay limitaciones de este ensayo. Por ejemplo, las concentraciones de Indo-1 por debajo de 3 μM no permitieron una visualización exitosa de la respuesta de afluencia de calcio en las células T. Como este ensayo también acomoda mediciones de multiplexación de la respuesta al calcio con análisis de múltiples marcadores de superficie celular en poblaciones heterogéneas de células utilizando citometría de flujo de espectro completo, es imperativo valorar cuidadosamente todos los anticuerpos marcados con fluorescencia utilizados, incluidos los utilizados para los controles de tinción única. Esto es importante para la implementación exitosa del algoritmo de desmezcla lineal altamente sensible14. Además, no se pudo visualizar un curso de tiempo completo de afluencia de calcio para subconjuntos celulares que representan menos del 1% de la población total que se analiza. En cambio, una evaluación de la respuesta al calcio en estos subconjuntos raros requirió una estrategia de análisis alternativa utilizando momentos en el tiempo15. El análisis de momentos en el tiempo proporciona instantáneas de las señales fluorescentes de Indo-1 (libre de calcio) versus Indo-1 (unido al calcio) en etapas discretas de la respuesta al calcio, en lugar de todo el curso temporal de la respuesta. Finalmente, también es importante reconocer las limitaciones del uso de marcadores de superficie únicos para definir subconjuntos de células T. Por ejemplo, la tinción de timocitos con el anticuerpo α-CD25 no es suficiente para distinguir las células T reguladoras CD4 + de todas las demás poblaciones de timocitos. Esto se debe al hecho de que la mayoría de las células progenitoras de timocitos tempranos (CD4-CD8-) también expresan CD2516. Es probable que esto explique la ausencia de una respuesta detectable de afluencia de calcio en los timocitos CD4 + CD25 + cerrados.

La optimización de este protocolo requirió una evaluación cuidadosa de varias variables que fueron clave para el éxito del ensayo. Estos incluyen la optimización del clon específico del anticuerpo anti-CD3 utilizado, la titulación de la concentración óptima de este anticuerpo y la necesidad de reticulación de anticuerpos utilizando el sistema tradicional de biotina / estreptavidina. Para las células T murinas, se encontró que la concentración de 30 μg/muestra para 6 x 106 células en un volumen de 500 μL era la cantidad mínima de anticuerpos necesaria para respuestas óptimas de calcio. Curiosamente, se observaron respuestas robustas de calcio con el clon de anticuerpos anti-CD3 17A2, pero no con el clon 145-2C11; además, cuando se usaba el clon 17A2, la adición de un reactivo de reticulación secundario era innecesaria17. Las pruebas que utilizaron el clon 17A2 anti-CD3 biotinilado con o sin estreptavidina no mostraron una mejora de la respuesta al calcio en presencia de reticulación de estreptavidina. Es posible que este anticuerpo incluyera agregados, y que estos agregados explicaran la eficacia de estimulación del anticuerpo en ausencia de reticulación manifiesta. Sin embargo, como estos experimentos se realizaron a lo largo de muchos meses con diferentes viales de este anticuerpo anti-CD3, los resultados obtenidos fueron altamente reproducibles; por lo tanto, no es probable que la capacidad de este anticuerpo para estimular las células T varíe entre los usuarios.

Las respuestas robustas de calcio en las células T primarias requieren mantener las células a la temperatura biológica de 37 °C durante toda la adquisición de la muestra; por el contrario, las células B primarias mostrarán una respuesta de calcio al anticuerpo anti-IgM a temperatura ambiente. Sobre la base de la sensibilidad de la respuesta del calcio de las células T a la temperatura, es fundamental garantizar que cada muestra se trate de la misma manera; por ejemplo, cada muestra debe calentarse a 37 °C utilizando el mismo método y durante el mismo período de tiempo. En ausencia de esta consistencia, se pueden observar variaciones en las respuestas al calcio, pero pueden no ser indicativas de diferencias biológicamente relevantes entre las muestras.

En resumen, este protocolo describe los detalles de la realización de ensayos de flujo de calcio basados en la evaluación de la fluorescencia Indo-1 utilizando citometría de flujo de espectro completo en combinación con tinción de marcadores celulares de superficie múltiple. El método permite a los investigadores evitar la necesidad de aislamiento o clasificación de poblaciones celulares específicas antes del etiquetado del colorante de calcio. Además, este protocolo describe una metodología de análisis adicional utilizada para visualizar las respuestas de calcio en momentos discretos en el tiempo dentro de distintas subpoblaciones celulares. El análisis de momentos en el tiempo se puede aplicar con éxito a poblaciones celulares raras (<1% del total), que de otro modo son indetectables al evaluar la totalidad de la curva de respuesta al calcio. En el futuro, este ensayo podría ampliarse al uso de anticuerpos conjugados con fluorocromo adicionales, aprovechando las amplias capacidades del citómetro de flujo de espectro completo.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Acknowledgments

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muchas gracias a nuestros colegas de Cytek por las continuas discusiones sobre el análisis citométrico espectral completo en el software Aurora y SpectroFlo. Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

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References

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Inmunología e infección Número 190
Análisis de la afluencia de calcio inducida por receptores de células T en células T murinas primarias mediante citometría de flujo de espectro completo
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Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

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