Summary
O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.
Abstract
O influxo de cálcio em resposta à estimulação do receptor de células T é uma medida comum da sinalização de células T. Vários corantes indicadores de cálcio foram desenvolvidos para avaliar a sinalização do cálcio por citometria de fluxo passa-faixa. Este protocolo é projetado para medir as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando citometria de fluxo de espectro completo. Os esplenócitos totais são marcados com o corante indicador de cálcio ratiométrico Indo-1, juntamente com um painel de anticorpos conjugados ao fluorocromo para moléculas de superfície celular. Aproveitar os recursos da citometria de fluxo de espectro completo fornece uma plataforma para utilizar uma ampla gama de colorações da superfície celular em combinação com o Indo-1. As células são então analisadas em tempo real a 37 °C antes e depois da adição de um anticorpo anti-CD3 para estimular o receptor de células T. Depois de desmisturar os sinais espectrais, a proporção de Indo-1 ligado ao cálcio e livre de cálcio é calculada e pode ser visualizada ao longo do tempo para cada população fechada de esplenócitos. Esta técnica pode permitir a análise simultânea das respostas do cálcio em múltiplas populações celulares.
Introduction
O influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T (TCR) é uma medida útil da ativação de células T e é frequentemente usado para determinar se uma população de células T tem respostas prejudicadas nas etapas proximais da via de sinalização TCR1. As medidas do influxo de cálcio são geralmente realizadas pré-marcando as células T com um ou um par de corantes indicadores fluorescentes de cálcio e, em seguida, examinando os sinais fluorescentes usando citometria de fluxo em tempo real após a reticulação do TCR 2,3,4. O indo-1, um corante de cálcio ratio-métrico, é excitado pelo laser UV com pico de emissões em dois comprimentos de onda diferentes dependentes da ligação do cálcio5, e é um corante indicador comumente usado para análise por citometria de fluxo das respostas de cálcio em linfócitos vivos. Como o perfil de emissão de Indo-1 é bastante amplo, pode ser desafiador combinar a avaliação de Indo-1 com a análise simultânea de múltiplos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo passa-faixa. Essa limitação restringe o uso da análise por citometria de fluxo das respostas do cálcio a populações pré-purificadas de células T ou a populações identificadas por um conjunto limitado de moléculas de superfície celular.
Para abordar as limitações da medição das respostas de cálcio em populações heterogêneas de linfócitos primários usando citometria de fluxo passa-faixa, um protocolo foi desenvolvido para medir a fluorescência do Indo-1 usando citometria de fluxo de espectro completo. Este método permite a multiplexação do Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular, aproveitando as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo. A vantagem do uso da citometria de fluxo de espectro total sobre a citometria de fluxo convencional é sua capacidade de distinguir os sinais fluorescentes de corantes altamente sobrepostos, aumentando assim o número de marcadores de superfície que podem ser avaliados simultaneamente em cada amostra. A citometria de fluxo convencional utiliza filtros passa-banda e é restrita a um fluorocromo por sistema detector6. A citometria de fluxo de espectro total coleta sinais em todo o espectro do fluorocromo usando 64 detectores em um sistema de citometria de fluxo espectral de cincolasers 7,8. Além disso, a citometria de fluxo de espectro total aproveita os detectores APD (Avalanche Photo Diode) que apresentam sensibilidade aumentada em relação aos detectores de tubo fotomultiplicador presentes nos citômetros de fluxoconvencionais8. Consequentemente, esta abordagem é ideal para populações de células heterogêneas, tais como células mononucleares do sangue periférico ou suspensões de células linfoides secundárias murinas, pois elimina a necessidade do isolamento de populações específicas de células T antes da marcação do corante de cálcio. Em vez disso, os perfis de expressão de marcadores de superfície celular e o gating por citometria de fluxo após a coleta de dados podem ser usados para avaliar as respostas de cálcio em cada população de interesse. Como mostrado neste relatório, o Indo-1 pode ser prontamente combinado com oito anticorpos conjugados ao fluorocromo, resultando em um total de 10 assinaturas espectrais únicas. Além disso, este método pode ser prontamente aplicado a misturas de células de linhagens de camundongos congenicamente distintas, permitindo a análise simultânea das respostas de cálcio em células T selvagens em comparação com aquelas de uma linhagem de camundongos direcionada a genes.
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Protocol
Os camundongos foram mantidos no campus de Medicina da Universidade do Colorado Anschutz de acordo com os protocolos da IACUC. Todos os camundongos foram eutanasiados de acordo com os padrões da AAALAC.
1. Preparação de células imunes do baço de camundongo
NOTA: Eutanásia de camundongos ingênuos com eutanásia por CO2 . Camundongos C57BL/6 comprados do Jackson Laboratories e criados internamente são usados para experimentos com 6-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas são utilizados para experimentos.
- Desinfetar a pele do rato com etanol a 70% para reduzir a possibilidade de entrada de contaminantes externos na amostra.
- Disseque o baço de camundongo usando ferramentas de dissecção, tesoura cirúrgica e pinça. Colher o baço e colocá-lo destacado em tubo cônico de 50 mL com ~5 mL de meio RPMI completo (cRPMI) sobre gelo.
NOTA: O RMIP completo é composto por SFB a 10%, L-glutamina a 2 mM e penicilina/estreptomicina a 1%.- Para colher o baço do rato, faça uma incisão de 5 cm no pelo e na pele ao longo do lado esquerdo do rato a meio caminho entre as patas dianteiras e traseiras com uma tesoura. Abra a cavidade do corpo ~5 cm e remova o baço usando pinças. O baço é da cor de um feijão e é mais longo e plano do que o rim vizinho.
- Deite o conteúdo do passo 1.2 num filtro estéril de 70 μm ligado a um novo tubo cónico de 50 ml. Separe mecanicamente o baço em uma suspensão de célula única, empurrando o baço através do filtro com um êmbolo de seringa de 5 mL até que nenhuma polpa de baço permaneça na superfície do filtro.
- Pelotar os esplenócitos utilizando uma centrífuga de bancada de rotor oscilante a 500 x g por 5 min a 4 °C.
- Decantar cuidadosamente o sobrenadante. Os esplenócitos peletizados permanecem no fundo do tubo cônico de 50 mL.
- Para remover as hemácias, ressuspenda os esplenócitos peletizados em 1 mL de tampão de lise ACK por 3 minutos de acordo com as instruções do fabricante. Misture bem.
- Temperar o tampão de lise ACK com 15 mL de cRPMI.
- Pellet os linfócitos conforme indicado no passo 1.4.
- Ressuspender a suspensão celular em 5 mL de cRPMI em um tubo cônico de 50 mL. Coloque as amostras no gelo.
- Para contar as células, transfira 10 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL e dilua na proporção de 1:1 com solução de azul de Trypan. Em seguida, transferir para um hemocitômetro ou sistema automatizado de contagem celular.
- Após a contagem, dependendo da concentração celular na suspensão celular como na etapa 1.9, pastlet as células em uma centrífuga de mesa a 500 x g a 4 °C por 5 min para se preparar para a adição de meios cRMPI contendo corante éster Indo-1 AM.
- Calcular o volume de ressuspensão das células para atingir 10-12 x 106 células/mL. Esta é uma concentração de 2x da contagem total de células necessária.
- Ressuspenda as células no volume de cRPMI calculado na etapa 1.11. Colocar as células a 37 °C com CO2 a 5% num tubo cónico de 50 ml com a tampa ventilada ou numa placa de cultura de tecidos.
2. Corante ratiométrico indo-1 e marcação de anticorpos fluorescentes
- De acordo com as instruções do fabricante, adicione 50 μL de DMSO num frasco para injetáveis contendo 50 μg de Indo-1 AM. A concentração da solução-mãe é de 1 μg/μL.
NOTA: DMSO é fornecido em micro-frascos com o kit para evitar qualquer oxidação de DMSO. - Diluir a alíquota de reserva (1 μg/μL) no volume experimental adequado (estabelecido em 1.11) de cRPMI a uma concentração de 6 μg/ml, uma concentração de 2x. Não armazene Indo-1 em solução aquosa.
NOTA: Outros tampões com adição de cálcio podem ser usados dependendo das necessidades celulares. - Reserve o meio completo com Indo-1 em banho-maria a 37 °C.
NOTA: Use a concentração mínima de éster Indo-1 AM necessária para obter um sinal adequado. Isso precisa ser titulado para vários tipos de células. Normalmente, uma concentração entre 3-5 μM é suficiente. Para células T primárias, células de carga com Indo-1 em uma concentração >5 μg/mL aumenta a intensidade fluorescente média (MFI) acima de um log de 6 em citômetros de fluxo espectral. Se isso ocorrer, diminua a intensidade do laser UV e titule o Indo-1 para uma concentração mais baixa. - Diluir a suspensão celular previamente preparada (no passo 1.12), 1:1 em cRPMI, incluindo o meio 2x Indo-1 fabricado no passo 2.2. Certifique-se de que as células estão em uma concentração entre 5-6 x 106/mL.
NOTA: Não core o controle de mancha única sem coloração ou os controles de célula de mancha única do marcador de superfície com Indo-1. A adição de Indo-1 a controles de anticorpos de coloração única criará uma amostra multicolorida devido ao Indo-1 adicionado a células coradas únicas. Incluir o controle adicionado de EGTA indo-1 (sem cálcio) à placa de amostra criada na etapa 2.6. - Adicionar 1 mL de células/poço/condição experimental em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.
- Crie um único controle corado para amostra de Indo-1 (livre de cálcio) usando células previamente carregadas de corante Indo-1 e adicione EGTA a uma concentração final de 2 mM. O EGTA irá quelar o cálcio na suspensão celular, fornecendo uma amostra de controle mais limpa.
- Criar um controle positivo de Indo-1 (ligado ao cálcio Indo-1) adicionando 50 μM de ionomicina à suspensão celular carregada com corante no citômetro de fluxo. A ionomicina é um ionóforo de cálcio permeável à membrana que se liga aos íons cálcio e facilita a transferência de íons cálcio para dentro das células.
- Crie um poço para controle biológico negativo sem fluoróforos ou corante Indo-1.
- Crie um poço para controles de coloração única para quaisquer populações celulares adicionais de interesse (anticorpos definidos pelo usuário) usando fluoróforos conjugados de anticorpos em um design de painel de citometria de fluxo. Estes não incluirão o corante ratiométrico Indo-1.
- Adicionar o anticorpo bloqueador do receptor Fc (~2 μg/1 x 106 células), de acordo com as instruções do fabricante, antes de adicionar anticorpos adicionais conjugados ao fluorocromo para coloração de superfície.
- Incubar a placa durante 45 minutos a 37 °C com 5% de CO2.
- Ressuspenda as células em uma placa de 12 poços tocando suavemente a placa a cada 15 min.
- Misture e remova todo o volume de células suspensas no meio da placa de 12 poços. Em seguida, adicione a suspensão celular a tubos de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Pastilhar as células em microcentrífuga a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e lavar as células adicionando 1 mL de cRPMI pré-aquecido. Pelotizar novamente e decantar o sobrenadante.
NOTA: A lavagem das células remove qualquer anticorpo bloqueador de FC restante. - Ressuspender as células em 1 mL de cRPMI em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL e incubar cada tubo a 37 °C por mais 30 min a 5% de CO2, deixando a parte superior do tubo ligeiramente aberta para permitir a troca gasosa. Isso permite a desesterificação completa dos ésteres de AM intracelulares.
- Transfira as células de volta para uma placa de cultura de tecidos de 12 poços, se necessário. Anticorpos adicionais titulados conjugados ao fluorocromo definidos pelo usuário podem ser adicionados em uma fase de repouso.
NOTA: Os marcadores usados no painel de métodos incluem: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 e tetrâmero CD1d/α-galcer. Os marcadores são escolhidos para analisar subtipos de células T.- Crie uma mistura mestre de todos os anticorpos conjugados ao fluorocromo definidos pelo usuário de acordo com os tipos celulares de interesse em um volume previamente titulado em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Adicionar uma mistura mestra calculada para 1 ml do volume celular, dependente de anticorpos titulados para células em repouso.
NOTA: A vantagem da coloração na etapa 2.15 em vez da etapa posterior 2.18 é que a coloração na etapa 2.15 diminuirá o tempo total de incubação do experimento. No entanto, a coloração em um volume total de 1 mL na etapa 2.15 aumenta o uso de anticorpos.
- Após o repouso, pastelar as células a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
NOTA: As células em uma placa de cultura de tecido de 12 poços podem ser peletizadas na placa com um acessório de centrífuga de placa. Caso contrário, coloque as células em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. - Lavar as células ressuspendendo o pellet em 1 ml de cRPMI frio a 4 °C e novamente pastilhar as células como no passo 2.16. Coloque as células no gelo.
NOTA: Se as células de coloração de superfície separadamente, após a desesterificação na etapa 2.18, menos volume de anticorpos é necessário. A coloração superficial nesta etapa pode ser realizada após a fase de repouso em tampão de fluxo frio (1x DPBS com adição de 1% de SFB), usando anticorpos definidos pelo usuário, em gelo por 30 min. Lavar as células após a coloração em cRPMI como no passo 2.17.- Adicione a mancha de viabilidade Ghost540 diluída 1:7.500 em DPBS às amostras de acordo com as instruções do fabricante. O calor mata as células a 55 °C em um bloco de aquecimento para controle de vivos/mortos com coloração única.
NOTA: A coloração funcional do corante de viabilidade para eliminar células mortas na análise por citometria de fluxo é realizada sem FBS. FBS pode interagir com corantes de amina de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicione a mancha de viabilidade Ghost540 diluída 1:7.500 em DPBS às amostras de acordo com as instruções do fabricante. O calor mata as células a 55 °C em um bloco de aquecimento para controle de vivos/mortos com coloração única.
- Ressuspender amostras individuais em 500 μL de cRPMI (livre de fenol vermelho) usando um tubo de fluxo de poliestireno de 5 mL com tampa.
NOTA: As células podem ser deixadas a 4 °C por até uma hora. - Aquecer a cada tubo de 5 mL contendo células, individualmente, a 37 °C em banho de esferas por 7 min antes da análise no citômetro de fluxo, mantendo o tempo consistente entre as amostras. Use um temporizador.
3. Tubo de banho de talão: manutenção da temperatura durante a análise do fluxo de cálcio
- Adicione contas de banho a um pequeno banho-maria, sem adição de água; aquecer até 37 °C.
- Cortar cuidadosamente um tubo cônico de 50 mL ao meio, na marca de 25 mL, com lâmina de barbear; Descarte a parte superior do tubo.
- Encha o tubo cortado pela metade 3/4 do caminho com contas de banho.
- Coloque o tubo criado no passo 3.2 no banho de contas criado no passo 3.1. Leve o tubo e as contas a 37 °C.
- Conecte o banho de contas a uma tomada elétrica ao lado do citômetro de fluxo para manter a temperatura em preparação para a análise da amostra.
- Adicione um corte cônico de isopor de 50 mL para segurar um tubo para posicioná-lo no lugar enquanto funciona no citômetro de fluxo. Isso eliminará a necessidade de segurar manualmente o tubo durante a análise da curva.
4. Aquisição do influxo de cálcio por citometria de fluxo
- Faça login no software do citômetro de fluxo em um analisador de fluxo.
- Clique na guia Biblioteca para adicionar etiquetas fluorescentes Indo-1 (ligadas ao cálcio) e Indo-1 (sem cálcio). Selecione Tags fluorescentes no menu do software à esquerda. Selecione o laser UV em grupos de etiquetas fluorescentes e clique em +adicionar para adicionar um nome de etiqueta fluorescente (Indo-1 (ligado ao cálcio)/Indo-1 (sem cálcio)) à biblioteca. Escolha o comprimento de onda de excitação a laser e o comprimento de onda de emissão e, em seguida, clique em Salvar. Continue para a montagem experimental.
NOTA: Indo-1 é excitado pelo laser UV em um comprimento de onda de 355 nm. O comprimento de onda de emissão do Indo-1 (ligado ao cálcio) é de 372 nm. O comprimento de onda de emissão do Indo-1 (isento de cálcio) é de 514 nm. - Clique na aba Aquisição. Abra/crie um novo experimento e adicione as tags fluorescentes desejadas ao experimento.
- Crie um Grupo de Referência e um novo grupo de amostra para o experimento. Rotular as amostras e os grupos de referência conforme necessário.
- Na guia Aquisições , defina os eventos para registrar no máximo: 10.000.000.
- Ajuste o volume de parada para o volume máximo: 3.000 μL.
- Defina o tempo de parada para o tempo máximo: 36.000 s.
- Adquira controles de coloração única para anticorpos conjugados definidos incluídos no painel multicolorido.
- Adquira controles de coloração única para corante funcional Indo-1.
- Adicionar 50 μM de ionomicina ao controle positivo de Indo-1 ligado ao cálcio. Vórtice para misturar. Adicione o tubo de fluxo à porta de injeção da amostra e clique em Gravar.
- Adicione o controle negativo de Indo-1 sem cálcio ao citômetro de fluxo e clique em Recordar. EGTA foi adicionado na etapa 2.6.
- Desmisture os controles manchados clicando no botão Desmisturar .
NOTA: Todos os controles corados individualmente de todos os anticorpos conjugados e corantes funcionais devem ser registrados antes de desmisturar as amostras. Para que o botão Desmisturar funcione, todos os controles de referência precisam ser gravados primeiro. A desmistura pode ser feita antes ou depois da coleta da amostra.
- Quando a desmistura estiver concluída, crie gráficos sequenciais usando a planilha não misturada. SSC-A versus FSC-A removendo detritos da amostra, SSC-A versus SSC-H para remover duplicatas. Segue-se um portão de limpeza de viabilidade e um confinamento adicional às populações de interesse. Para criar portões, clique em Plotar. Adicione um gráfico à planilha e clique duas vezes dentro do portão para criar uma população fechada a jusante. Continue até que todas as populações de interesse sejam contabilizadas.
- Amostras de controle quentes de coloração única (das etapas 2.6-2.9 na seção Indo-1 ratiometric dye and fluorescent antibody labeling) a 37 °C para análise sequencial. Configure o software de citometria de fluxo.
- Passe água DI no citômetro por 2-3 min para garantir a estabilidade fluídica do citômetro de fluxo.
- Configure gráficos sequenciais na planilha não misturada criando portas usando os botões Polygon, Rectangle ou Ellipse gate. Porta para incluir a população de interesse (ou seja, linfócitos usando SSC-A vs. FSC-A [discriminação tamanho/linfócitos]). Populações negativas aparecem agrupadas em torno de zero, enquanto populações positivas podem ser visualizadas pelo aumento da MFI. As populações de interesse serão definidas com base na questão biológica.
- Clique duas vezes dentro do portão criado e altere os parâmetros dos eixos Y e X para SSC-A versus SSC-H (discriminação singlete). Complete a definição dos parâmetros do eixo clicando com o botão esquerdo do mouse nas palavras no eixo.
- Crie um gráfico com SSC-A versus sinal de corante de viabilidade (parâmetros da porta de viabilidade). Portão em células vivas, que são negativas para coloração de corante de amina. As células vivas, negativas para coloração de mortos vivos, se agruparão na marca 0 nos eixos Y e X.
- Clique duas vezes no gráfico interno para criar um novo gráfico contendo apenas linfócitos vivos de célula única. Alterar o eixo Y para Indo-1 (cálcio ligado) (V1) e/ou Indo-1 (cálcio livre) (V7) versus o tempo no eixo X para visualização do influxo de cálcio.
- Coloque a amostra biológica aquecida na máquina SIT e execute as amostras a 2.500-3.000 eventos/s em meio para permitir a visualização do influxo de cálcio em populações de número limitado de células (por exemplo, iNKT).
NOTA: Ao ressuspender as células a uma concentração de 1 x 106/mL, os eventos celulares coletados na taxa de fluxo médio devem ser iguais a 2.500-3.000 eventos/s. Diminua a vazão sob controle de aquisição clicando no menu suspenso ou dilua a amostra se a suspensão da célula tiver uma concentração aumentada. Executar as amostras a uma alta taxa de fluxo pode aumentar a propagação do sinal de um fluoróforo para outros fluoróforos no painel. - Adicione o tubo seguinte ao banho de contas para aquecer a 37 °C.
- No Controle de Aquisição, pressione Record para registrar os dados iniciais por 30 s para obter um nível basal de sinalização de cálcio na amostra.
- No Controle de Aquisição, clique em Parar e remova o tubo da Porta de Injeção de Amostra (SIP).
- Adicionar 30 μg de anti-CD3 não conjugado diretamente no tubo de amostra para iniciar o influxo de cálcio. A concentração final por tubo é de 60 μg/mL.
NOTA: Não há etapa de lavagem após a adição de anti-CD3. - Coloque o tubo de volta no SIP da máquina o mais rápido possível e pressione Gravar no software.
- Registrar os dados por 7 min, observando o tempo decorrido sob os controles de aquisição no software, para observar o curso temporal do influxo de cálcio dentro das populações amostrais.
- Após 7 min, pressione Stop no software e adicione 1 μg/mL de ionomicina. Registrar por 30 s para obter o sinal máximo de cálcio nas células de interesse. Para limitar o transporte de ionomicina para a próxima amostra, complete duas lavagens de SIT no instrumento entre as amostras.
- Continue para a próxima amostra e repita o fluxo de trabalho até que todas as amostras tenham sido coletadas.
- Salve o experimento e clique no arquivo zip de exportação . Arquivos não misturados (.fsc) são carregados para o software de análise de citometria de fluxo externo.
5. Análise da curva de cálcio
- Usando um software de análise6 para citometria de fluxo, converta sinais fluorescentes Indo-1 em uma razão para medidas de cálcio por lapso de tempo. Derive parâmetros na guia ferramentas inserindo referências Indo-1 (cálcio-ligado)/Indo-1 (cálcio-livre) usando uma escala linear. Defina o mínimo para zero e o máximo de acordo com a relação de influxo de cálcio, normalmente em torno de 10. A razão máxima varia de acordo com o tipo de célula e MFI de Indo-1.
- Realce o parâmetro selecionado. Em ferramentas, adicione análise cinética para escolher o parâmetro clicando na guia Cinética . Defina o eixo Y como derivado.
- Selecione MFI (intensidade fluorescente média) na guia Cinética.
- Adicione o alisamento gaussiano, se desejar. Para adicionar suavização gaussiana, selecione a opção no menu suspenso de estatísticas no software de análise de fluxo. O alisamento gaussiano pode ser adicionado para suavizar a visualização da curva de influxo de cálcio da análise.
- Crie vários intervalos para estatísticas ao longo do curso de tempo de fluxo de cálcio para comparações biológicas dentro das amostras.
- Arraste os exemplos para o editor de layout e adicione as estatísticas conforme desejado. A análise estatística varia de acordo com a questão biológica. Para fins de publicação, múltiplas réplicas são analisadas usando teste t ou ANOVA.
- Para um momento de análise de tempo, coloque a porta em um momento específico no tempo ao longo do fluxo de cálcio. Examinar os marcadores de superfície desejados e portar sobre a população de interesse; em seguida, avaliar um dot-plot bidimensional de Indo-1 (isento de cálcio) versus Indo-1 (ligado ao cálcio) para células fechadas dentro desse momento na região temporal.
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Representative Results
O fluxo de trabalho experimental para avaliar as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando um corante ratiométrico Indo-1 com coloração superficial multiplexadora é mostrado na Figura 1. Após a colheita e processamento dos esplenócitos de camundongos em uma única suspensão celular, as células são coradas com um éster Indo-1 AM e a superfície corada com anticorpos ligados ao fluorocromo. Uma vez concluída a carga do corante e a coloração de anticorpos, as amostras de linfócitos são aquecidas até uma temperatura biológica (37 °C). As amostras são então analisadas usando citometria de fluxo de espectro completo para fluorescência Indo-1 após o gating nos tipos celulares individuais desejados, sem a necessidade de triagem das amostras antes da análise. Para usar detectores Avalanche Photo Diode (APD) dentro do citômetro de fluxo de espectro completo, é necessário converter o comprimento de onda de pico de emissão de um comprimento de onda de filtro passa-banda medido em nm para seu respectivo canal no APD. A tabela mostrada na Figura 2 fornece uma diretriz, mas os detectores ótimos para as duas assinaturas de fluorescência do Indo-1 (ligado ao cálcio versus isento de cálcio) devem ser determinados empiricamente. Isso é conseguido através da preparação de amostras de Indo-1 coradas isoladamente usando Ionomicina para gerar o sinal de Indo-1 (ligado ao cálcio) e EGTA, um agente quelante de cálcio, para gerar o sinal de Indo-1 (livre de cálcio). Após análise por citometria de fluxo de espectro completo, pode-se visualizar o canal que exibe o pico de intensidade de fluorescência para cada assinatura Indo-1 (Figura 3A). Normalizando o IMF das populações positivas para o das populações negativas, o deslocamento da fluorescência do Indo-1 de isento de cálcio para ligado ao cálcio pode ser determinado (Figura 3B). Essa exibição é gerada em uma pasta de trabalho (.xls) usando controles de referência para Indo-1 vinculado e livre, desenhando uma porta de intervalo negativa e positiva com portas positivas e negativas claras para normalização de IFM, conforme mostrado na (Figura 3A). Exemplos de estatísticas de IFM também podem ser obtidos clicando com o botão direito do mouse na tabela de estatísticas. No software, determine a razão IFM dividindo a população positiva com a população negativa e sobreponha os dois espectros em um único monitor (Figura 3B, à direita). A seta pontilhada amarela mostra as diferenças espectrais normalizadas entre as assinaturas espectrais de Indo-1 ligado e livre.
Para avaliar as respostas do cálcio após a estimulação do receptor de células T, a fluorescência do Indo-1 é avaliada após o acoplamento das populações celulares de interesse, como mostrado na Figura 4. Primeiro, um gráfico de dispersão temporal versus lateral (SSC-A) é examinado para avaliar a estabilidade fluídica; um sinal consistente estável ao longo do eixo do tempo indica estabilidade (Figura 4A). Em seguida, visualiza-se a dispersão anterior versus lateral (FSC-A vs. SSC-A) e a população de linfócitos é fechada, como mostrado na Figura 4B. Após a porta de linfócitos, uma porta de discriminação de célula única é aplicada, gerando um gráfico de altura de dispersão lateral versus área (SSC-H vs. SSC-A), e os singletes, que caem na diagonal, são fechados como mostrado na Figura 4C. Os singlets são então avaliados quanto à viabilidade, examinando-se a coloração com o corante de viabilidade e o gating na população negativa (Figura 4D). Finalmente, para analisar as células T, uma porta de despejo de células B/controle negativo interno é aplicada por acoplamento na população CD19-negativa (Figura 4E). A população CD19-negativa é então avaliada para subgrupos de células T usando anticorpos para CD4 e CD8 (Figura 4F); o exemplo mostrado examina as células T CD4+ em busca de respostas de cálcio visualizando a fluorescência Indo-1 (ligada ao cálcio) em relação ao tempo (Figura 4G). Após o acoplamento de um segmento de tempo, o gráfico Indo-1 (isento de cálcio) versus Indo-1 (ligado ao cálcio) também pode ser gerado (Figura 4H). Esta análise será posteriormente utilizada para derivar a razão Indo-1 (ver métodos de análise da curva de influxo de cálcio no software de análise por citometria de fluxo).
Neste ponto da análise, pode ser útil analisar momentos no tempo dentro do gráfico bidimensional de Indo-1 (ligado ao cálcio) versus tempo em populações celulares individuais de interesse. Os momentos ideais incluem o cálcio basal ligado ao Indo-1 antes da estimulação com TCR, o pico de resposta, um ponto de tempo vários minutos após o pico de resposta à medida que os níveis de cálcio intracelular diminuem e, finalmente, a resposta de cálcio provocada pela adição de ionomicina (Figura 5A). Na amostra basal antes da adição de anticorpos anti-CD3, um sinal fraco de Indo-1 (ligado ao cálcio) é detectado. Durante o pico de resposta, as células mostram um forte sinal de Indo-1 (ligado ao cálcio) e uma fluorescência reduzida do Indo-1 (livre de cálcio). Em 5 min após o pico, a fluorescência do Indo-1 quase retornou à linha de base. Após a adição de ionomicina à amostra, um sinal robusto de Indo-1 (ligado ao cálcio) pode ser visualizado, garantindo uma carga adequada de corante das células. Populações celulares raras (<1 %) podem ser difíceis para análise de derivados; para superar essa limitação, a análise das populações raras pode ser realizada plotando Indo-1 (ligado ao cálcio) versus Indo-1 (livre de cálcio) após o acoplamento em cada população de interesse, como células CD4+, células TCRb+, células TCRyg+, células CD25+, células iNKT e células CD19+ (Figura 5B,C). Observe a resposta de cálcio prontamente detectável em células T TCRγδ+ e células iNKT (CD1d/α-galcer+). Para comparação de proteínas de superfície dentro de uma população mista de células T murinas, gráficos bidimensionais foram criados mostrando subconjuntos de interesse. A seguir, é apresentada a análise da resposta do cálcio ao longo de todo o curso temporal para cada subgrupo (Figura 5C).
Este ensaio também pode ser usado para estabelecer diferenças biológicas em células T de camundongos selvagens versus camundongos alvo de genes ou em células T não tratadas versus tratadas com inibidores farmacológicos. No exemplo mostrado na Figura 6, as células T foram tratadas com PRN694, uma pequena molécula inibidora das tirosina quinases de células T, ITK e RLK 9,10. A inibição da ITK/RLK atenua a sinalização do receptor de células T, levando a uma resposta reduzida de cálcio após a estimulação do receptor de células T11 (Figura 6A). Para quantificar os efeitos da inibição da ITK/RLK, as curvas que exibem a razão entre fluorescência Indo-1 (ligada ao cálcio) e Indo-1 (livre de cálcio) podem então ser analisadas para a área sob a curva (AUC) ou inclinação da curva para cada condição (Figura 6B,C). Essa quantificação é realizada seccionando-se o curso temporal da resposta do cálcio em segmentos discretos (Figura 6A) e avaliando-se a área sob a curva ou a inclinação da curva para cada segmento, como mostrado (Figura 6B,C). Em geral, este protocolo demonstra que a citometria de fluxo de espectro total pode ser usada para medir o influxo de cálcio juntamente com múltiplos marcadores de superfície celular em populações de células imunes sob investigação. Esses resultados mostram que subpopulações celulares representadas em mais de 1% da população total podem ser avaliadas quanto ao influxo de cálcio ao longo do tempo. Em contraste, subconjuntos celulares menos abundantes requerem análise alternativa usando momentos de tempo.
A análise estatística dos dados de resposta ao cálcio é específica para a questão experimental e os ensaios biológicos que estão sendo realizados. Nos dados apresentados no manuscrito, foram realizados experimentos com réplicas para garantir a exatidão experimental e a robustez da metodologia; no entanto, múltiplos experimentos em diferentes amostras biológicas ao longo de diferentes dias não foram realizados. Portanto, não seria apropriado realizar análises estatísticas sobre os dados apresentados.
Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho do ensaio de cálcio. O uso do corante indicador de cálcio éster Indo-1 AM fornece uma ferramenta para visualizar o influxo de cálcio em células imunes e suas subpopulações. Este esquema descreve o fluxo de trabalho para análise das respostas de cálcio em células T esplênicas murinas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Conversão dos comprimentos de onda PMT para canais APD. O citômetro de fluxo de espectro completo possui 16 detectores para detectar emissões fluorescentes após excitação pelo laser UV. As especificações de cada detector estão indicadas na tabela. Destacam-se os dois detectores utilizados para a avaliação da fluorescência do Indo-1, que foram determinados empiricamente por meio de controles corados com um único corado. Conversões para comprimento de onda APD e manual do usuário para citômetro de fluxo espectral estão disponíveis11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização da assinatura espectral do Indo-1. (A) Topo: Assinatura espectral da fluorescência do Indo-1 em células T CD8+ após a introdução da ionomicina para provocar um influxo robusto de cálcio. O pico de Indo-1 (ligado ao cálcio) pode ser visualizado no UV1. Fundo: Assinatura espectral de Indo-1 (livre de cálcio) mostrando o pico de fluorescência no UV7. Esta amostra controle foi gerada pelo tratamento de células carregadas de Indo-1 com EGTA12 para quelar qualquer cálcio livre extracelular. (B) Combinação de cinco sobreposições de espectro de laser da assinatura Indo-1, mostrando MFI espectral bruta à esquerda e os espectros normalizados de Indo-1 ligado versus Indo-1 livre à direita. A visualização da mudança de Indo-1 (livre de cálcio) em laranja para Indo-1 (ligado ao cálcio) em azul pode ser prontamente detectada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Estratégia de Gating para visualização das respostas do cálcio. O fluxo de trabalho para o fechamento sequencial das amostras é descrito. (A) A estabilidade fluídica é examinada usando uma porta de tempo versus SSC-A. (B) FSC-A versus SSC-A é usado para controlar linfócitos, eliminando assim restos celulares e hemácias residuais na amostra. (C) Células individuais são fechadas usando um gráfico SSC-H versus SSC-A. (D). O portão singlet é então aplicado a uma trama de mortos-vivos Ghost540 versus SSC-A; O gating em células Ghost540-negativas elimina as células não viáveis da análise subsequente. (E) As células vivas são analisadas para CD19 versus SSC-A, e as células CD19-negativas (não-células B) são acopladas. (F) As células CD19-negativas são examinadas para coloração CD4 versus CD8. (G) As células CD4+ são então acopladas para visualizar o tempo versus o Indo-1 (ligado ao cálcio). (H) Um momento no tempo é selecionado para representar o início da resposta de influxo de cálcio após a adição de anticorpos anti-CD3, visualizando fluorescência Indo-1 (livre de cálcio) versus Indo-1 (ligada ao cálcio). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Visualização da fluorescência do Indo-1 em populações fechadas de timócitos murinos em momentos discretos na resposta ao cálcio. Os timócitos totais foram estimulados com anticorpo anti-CD3 seguido de ionomicina após 6 min da coleta da amostra. Em quatro momentos discretos, como indicado nas caixas retangulares delineadas nos gráficos bidimensionais de tempo versus Indo-1 (ligado ao cálcio), diferentes subpopulações de timócitos foram examinadas quanto às respostas de cálcio. (A) Gráficos bidimensionais mostrando o gating para o sinal Indo-1 basal, a resposta de pico, 5 min de resposta pós-pico e a resposta à ionomicina. Abaixo de cada gráfico é mostrado o coloramento CD4 versus CD8 (à esquerda) e o gráfico de Indo-1 (isento de cálcio) versus Indo-1 (ligado ao cálcio) nos timócitos CD4 único positivo (SP) gated gated. (B) Gráficos de Indo-1 (livre de cálcio) versus Indo-1 (ligado ao cálcio) em subconjuntos fechados de timócitos são mostrados em cada um dos quatro momentos, usando a estratégia de gating mostrada em (A). (C) Foram criados gráficos bidimensionais mostrando a coloração dos timócitos totais com os anticorpos indicados. Subgrupos específicos foram fechados (linha superior) e examinados quanto às respostas de cálcio versus tempo (inferior). População CD8+ azul clara (SP), população CD4 vermelha (SP), que exibe o maior influxo de cálcio, timócitos CD4+CD8+ duplo-positivos laranja, células iNKT verde-escuras, células T CD25+ verde-claras, células T TCRγδ+ roxas e células B CD19+ pretas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Inibição da resposta de cálcio em células T CD8+ tratadas com uma pequena molécula inibidora de ITK/RLK. Durante a carga de corante Indo-1, os esplenócitos foram tratados com duas doses de PRN694, 100 nM (cinza escuro) e 200 nM (cinza claro). (A) A razão Indo-1 (ligado/isento de cálcio) é mostrado em relação ao tempo para células não tratadas (vermelho) e células tratadas com PRN694. As curvas mostram a resposta de cálcio dos linfócitos T CD8+ fechados. A linha preta representa o controle negativo de esplenócitos carregados com Indo-1 e corados superficialmente, mas não estimulados com anticorpo anti-CD3. (B,C) Os dados podem ser analisados dividindo-se o eixo de tempo mostrado em (A) em oito segmentos, visualizados com linhas pontilhadas pretas, e calculando-se a área sob a curva (AUC) (B), ou a inclinação de cada curva (inclinação) (C) em cada intervalo de tempo da resposta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um ensaio otimizado projetado para medir as respostas de cálcio em células T primárias murinas carregadas com corante indicador ratiométrico Indo-1 titulado usando citometria de fluxo de espectro completo 7,8. A vantagem de realizar ensaios de fluxo de cálcio usando citometria de fluxo de espectro total é a capacidade de coloração de marcadores de superfície celular multiplex em combinação com a avaliação da fluorescência do Indo-1. A citometria de fluxo de espectro total tem a vantagem de permitir o uso de corantes altamente sobrepostos, aumentando assim o número de marcadores que podem ser usados em um painel. Isso se deve ao fato de que o citômetro de fluxo de espectro completo coleta toda a luz laser emitida através de uma matriz de detectores para cada amostra analisada, em vez de ter um detector dedicado a um fluorocromo. O uso de todo o espectro de cada fluor permite uma maior sensibilidade do ensaio e fornece um meio de identificar fluorocromos espectralmente únicos que teriam sinais sobrepostos se coletados em um citômetro de fluxo passa-faixa. Isso também elimina a necessidade de pré-isolamento de um subconjunto celular sob investigação.
Neste estudo, um painel de marcadores de superfície celular foi avaliado com anticorpos conjugados ao fluorocromo. Este painel incluiu αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 e CD1d-αgal-cer tetramer-APC; além disso, o painel incluiu o corante Ghost540 de mortos-vivos. O canal ideal para detectar cada um desses fluorocromos está disponível no manual do usuário do citômetro de fluxo de espectro completo13. Em contraste, a detecção de Indo-1 (livre de cálcio) e Indo-1 (ligado ao cálcio) foi determinada empiricamente, embora um canal de pico aproximado para detecção de cada assinatura fluorescente tenha sido estimado com base nos comprimentos de onda de pico de emissão conhecidos para as duas formas de Indo-1. Também é possível converter os comprimentos de onda de pico de emissão dos comprimentos de onda do filtro passa-banda usados em citômetros de fluxo convencionais e medidos em nm para seus respectivos canais nos detectores Avalanche Photo Diode (APD) usados pelo citômetro de fluxo de espectro completo; isso também pode fornecer uma estimativa dos canais ótimos para detectar Indo-1 (livre de cálcio) e Indo-1 (ligado ao cálcio), respectivamente. Uma vez que controles corados únicos são incluídos para cada tag fluorescente, o processo de desmistura descomplica as assinaturas fluorescentes, permitindo a visualização da intensidade de cada fluorocromo nas células de cada amostra. Como descrito neste método, a análise dos dados pode ser realizada por meio da contagem de subgrupos celulares de interesse e visualização da razão entre detectar Indo-1 (livre de cálcio) e Indo-1 (ligado ao cálcio) versus o tempo.
Há limitações deste ensaio. Por exemplo, concentrações de Indo-1 abaixo de 3 μM não permitiram a visualização bem-sucedida da resposta de influxo de cálcio em células T. Como este ensaio também acomoda medidas de multiplexação da resposta de cálcio com análise de múltiplos marcadores de superfície celular em populações heterogêneas de células usando citometria de fluxo de espectro completo, é imperativo titular cuidadosamente todos os anticorpos fluorescentemente marcados usados, incluindo aqueles usados para os controles corados com uma única mancha. Isso é importante para o sucesso da implementação do algoritmo de desmistura linear altamente sensível14. Além disso, um curso temporal completo do influxo de cálcio não pôde ser visualizado para subgrupos celulares que representam menos de 1% da população total analisada. Em vez disso, uma avaliação da resposta do cálcio nesses raros subgrupos exigiu uma estratégia alternativa de análise usando momentos no tempo15. A análise de momentos no tempo fornece instantâneos dos sinais fluorescentes de Indo-1 (livre de cálcio) versus Indo-1 (ligado ao cálcio) em estágios discretos da resposta de cálcio, em vez de todo o curso de tempo da resposta. Finalmente, também é importante reconhecer as limitações do uso de marcadores de superfície única para definir subconjuntos de células T. Por exemplo, a coloração de timócitos com o anticorpo α-CD25 não é suficiente para distinguir as células T reguladoras CD4+ de todas as outras populações de timócitos. Isso se deve ao fato de que a maioria das células progenitoras do timócito precoce (CD4-CD8-) também expressa CD2516. Isso provavelmente é responsável pela ausência de uma resposta detectável de influxo de cálcio em timócitos CD4+CD25+ fechados.
A otimização desse protocolo exigiu uma avaliação criteriosa de várias variáveis que foram fundamentais para o sucesso do ensaio. Estes incluem a otimização do clone específico do anticorpo anti-CD3 usado, a titulação da concentração ideal desse anticorpo e a necessidade de reticulação de anticorpos usando o sistema tradicional de biotina/estreptavidina. Para células T murinas, a concentração de 30 μg/amostra para 6 x 106 células em um volume de 500 μL foi encontrada como a quantidade mínima de anticorpo necessária para respostas ideais de cálcio. Curiosamente, respostas robustas de cálcio foram observadas com o clone 17A2 do anticorpo anti-CD3, mas não com o clone 145-2C11; além disso, ao utilizar o clone 17A2, a adição de um reagente secundário para ligações cruzadas foi desnecessária17. Testes utilizando o clone 17A2 anti-CD3 biotinilado com ou sem estreptavidina não mostraram aumento da resposta de cálcio na presença de reticulação com estreptavidina. É possível que esse anticorpo tenha incluído agregados, e que esses agregados tenham sido responsáveis pela eficácia de estimulação do anticorpo na ausência de ligações cruzadas evidentes. No entanto, como esses experimentos foram realizados ao longo de muitos meses com diferentes frascos desse anticorpo anti-CD3, os resultados obtidos foram altamente reprodutíveis; portanto, a capacidade deste anticorpo para estimular as células T não é susceptível de variar entre os usuários.
Respostas robustas de cálcio em células T primárias requerem a manutenção das células à temperatura biológica de 37 °C durante toda a aquisição da amostra; em contraste, as células B primárias mostrarão uma resposta de cálcio ao anticorpo anti-IgM à temperatura ambiente. Com base na sensibilidade da resposta do cálcio das células T à temperatura, é fundamental garantir que cada amostra seja tratada da mesma forma; por exemplo, cada amostra deve ser aquecida a 37 °C utilizando o mesmo método e durante o mesmo período de tempo. Na ausência dessa consistência, variações nas respostas ao cálcio podem ser observadas, mas podem não ser indicativas de diferenças biologicamente relevantes entre as amostras.
Em resumo, este protocolo descreve os detalhes da realização de ensaios de fluxo de cálcio com base na avaliação da fluorescência do Indo-1 usando citometria de fluxo de espectro completo em combinação com a coloração de marcadores de superfície de células multiplex. O método permite que os pesquisadores evitem a necessidade de isolamento ou classificação de populações celulares específicas antes da marcação do corante de cálcio. Além disso, este protocolo descreve uma metodologia de análise adicional usada para visualizar as respostas de cálcio em momentos discretos no tempo dentro de subpopulações celulares distintas. A análise de momentos no tempo pode ser aplicada com sucesso a populações celulares raras (<1% do total), que de outra forma são indetectáveis quando se avalia a totalidade da curva de resposta ao cálcio. No futuro, este ensaio poderia ser expandido para o uso de anticorpos adicionais conjugados ao fluorocromo, aproveitando as extensas capacidades do citômetro de fluxo de espectro completo.
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Disclosures
Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.
Acknowledgments
R01AI132419, - Brasil | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muito obrigado aos nossos colegas da Cytek por discussões contínuas de análise citométrica espectral completa no software Aurora e SpectroFlo. As figuras foram criadas com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M.
- Nolan, J. P., Condello, D.
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
- SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
- FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
