Summary
يصف البروتوكول الحالي نموذجا للفأر لاستئصال التعصيب الأدرينالي من خلال تحديد واستئصال العقدة العنقية العلوية.
Abstract
تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الجهاز العصبي السمبثاوي يلعب دورا مهما في تطور السرطان. ينظم التعصيب الأدرينالي إفراز الغدد اللعابية ، وإيقاع الساعة البيولوجية ، والضمور البقعي ، ووظيفة المناعة ، وفسيولوجيا القلب. استئصال الودي الجراحي للفئران هو طريقة لدراسة آثار التعصيب الأدرينالي من خلال السماح بالاستئصال الأدرينالي الكامل من جانب واحد مع تجنب الحاجة إلى التدخل الدوائي المتكرر والآثار الجانبية المرتبطة به. ومع ذلك ، فإن استئصال الودي الجراحي في الفئران يمثل تحديا تقنيا بسبب صغر حجم العقدة العنقية العلوية. تصف هذه الدراسة تقنية جراحية لتحديد واستئصال العقدة العنقية العلوية بشكل موثوق لاستئصال الجهاز العصبي الودي. يتم التحقق من صحة التعرف الناجح على العقدة وإزالتها عن طريق تصوير العقد الودية الفلورية باستخدام فأر معدل وراثيا ، وتحديد متلازمة هورنر بعد الاستئصال ، وتلطيخ العلامات الأدرينالية في العقد المقطوعة ، ومراقبة تناقص التألق المناعي الأدرينالي في الأعضاء المستهدفة بعد استئصال الودي. يتيح هذا النموذج إجراء دراسات مستقبلية لتطور السرطان بالإضافة إلى العمليات الفسيولوجية الأخرى التي ينظمها الجهاز العصبي الودي.
Introduction
أفادت دراسات متعددة أن الأعصاب في البيئة المكروية للورم تلعب دورا نشطا في دعم تطور الورم. ثبت أن استئصال الأعصاب الأدرينالية الودية يضعف تطور الورم وانتشاره في سرطان البروستاتا والمعدة في الجسم الحي1،2،3 ، في حين أن الحصار الدوائي للمستقبلات الأدرينالية يمنع نمو الورم في سرطان الرأس والرقبة4. كما تم وصف المشاركة العصبية الودية في تطور سرطان البنكرياس وعنق الرحم والخلايا القاعدية5،6،7.
داخل الجهاز العصبي السمبثاوي، العقدة العنقية العلوية (SCG) هي العقدة الوحيدة في الجذع السمبثاوي التي تعصب الرأس. ينظم SCG الوظائف الفسيولوجية المختلفة ، مثل إفراز اللعاب وإيقاع الساعة البيولوجية ، ويعصب مباشرة الغدد الليمفاوية العنقية8،9،10. كما تورط SCG في العمليات المرضية مثل التنكس البقعي11 وتطور تسلخ الأبهر12. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن استئصال SCG لتفاقم إصابة الكلى الحادة الناجمة عن نقص التروية13 وكذلك تغيير ميكروبات الأمعاء في الفئران14.
سيمثل الاستئصال الكامل ل SCG في نموذج الفأر تقنية تجريبية قيمة لتمكين أبحاث السرطان والجهاز العصبي اللاإرادي. في حين أن العديد من الدراسات قد استخدمت حصار مستقبلات الأدرينالية الدوائية كاستئصال الأدرينالية15،16،17،18،19،20 ، يسمح الاستئصال الجراحي بالاجتثاث الأدرينالية الكامل من جانب واحد مع تجنب الحاجة إلى التدخل الدوائي المتكرر والآثار الجانبية المرتبطةبه 21،22،23.
تم وصف الاستئصال الجراحي ل SCG في الفئران24 ، واستخدمت معظم التقارير التي تدرس تأثير استئصال العقدة العنقية العلوي (SCGx) نموذج الفئران. بالمقارنة مع نموذج الفئران ، فإن SCGx أكثر تحديا من الناحية الفنية في الفئران بسبب صغر حجم SCG. ومع ذلك ، فإن الفئران أسهل نسبيا في التعامل معها ، وأكثر فعالية من حيث التكلفة ، وأكثر قابلية للتلاعب الجيني. كان غارسيا وآخرون من أوائل الذين أبلغوا عن SCGx في الفئران ، ووجد أنه يؤثر على إطلاق الأنسولين25. في الآونة الأخيرة ، وصف Ziegler et al. SCGx في الفئران بناء على التقنية المنشورة الموصوفة للفئران24،26. تصف هذه المقالة وغيرها طريقة يتم فيها تحديد الشريان السباتي المشترك (CCA) وتشريحه لأول مرة ، ويتم إزالة SCG لاحقا من تشعب CCA21،22،27،28. في هذه المقالة ، يتم وصف تقنية أقل توغلا وأكثر أمانا في الفئران التي تتجنب تشريح CCA ، وبالتالي تقليل المضاعفات الأكثر خطورة لهذا الإجراء - النزيف من إصابة في CCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان. تم استخدام ذكور وإناث الفئران NSG البالغة من العمر ثمانية أسابيع هنا. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتم تعقيم الأدوات ، وتطهير سطح العمل الجراحي ، وتطهير سطح جلد الحيوان ، ويرتدي الجراح قفازات معقمة طوال العملية.
1. إعداد الفئران والإعداد قبل الجراحة
- في اليوم السابق للجراحة ، قم بتخدير الماوس بنسبة 2٪ إيزوفلوران في غرفة الحث (3.75 في العرض × 9 في العمق × 3.75 في الارتفاع ، انظر جدول المواد).
ملاحظة: عادة ما يتم تحقيق مستوى التخدير الجراحي في 3-5 دقائق ، اعتمادا على الحيوان الفردي. تقييم مدى كفاية التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، وزيادة نسبة الأيزوفلوران حسب الاقتضاء.- حلق الجانب البطني من الرقبة أو استخدم عامل كيميائي لإزالة الشعر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- في يوم الجراحة ، قم بتخدير الماوس بنسبة 2٪ إيزوفلوران في غرفة الحث. تقييم مدى كفاية التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، وزيادة نسبة الأيزوفلوران حسب الاقتضاء.
- يتم تطبيق 2 ملغ/ كغ من ميلوكسيكام تحت الجلد من أجل التسكين الجهازي الوقائي. تطبيق مرهم العيون الموضعي (انظر جدول المواد) لمنع إصابات العين والجفاف تحت التخدير.
- ضع الماوس تحت مجهر تشريح على جانبه الظهري وقدم الدعم الحراري. الحفاظ على التخدير الاستنشاقي مع 2٪ -2.5٪ إيزوفلوران باستخدام مبخر دقيق ومخروط الأنف. ثبت كلا الطرفين الأماميين برفق بشريط مضاد للحساسية (انظر جدول المواد).
- قم بتنظيف الجانب البطني المحلوق من الرقبة باستخدام بوفيدون اليود ، ثم امسحه بنسبة 70٪ كحول. كرر هذه العملية مرتين أخريين. تأكد من خلو موقع الجراحة من أي شعر مترسدل.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام زوج من الملقط المنحني القصير. تأكد من استخدام زوج من الملقط الدقيق أو العيني للعمل بشكل مناسب في هذه المساحة الضيقة. يمكن تضمين إعداد إضافي قبل الجراحة وفقا للإرشادات المؤسسية.
2. تشريح
- قم بعمل شق جلدي في خط الوسط بطول 1.5 سم على الجانب البطني من الرقبة باستخدام مقص صغير من حوالي 2 مم تحت الذقن إلى 2 مم فوق الشق القصي.
- اسحب حواف الجلد بشكل جانبي بالملقط لفضح اللفافة الكامنة والغدد اللعابية تحت الفك السفلي. افصل الجلد عن اللفافة الأساسية عن طريق إدخال مقص مدبب تحت الجلد على كل جانب ونشره. اسحب الغدد تحت الفك السفلي ذيليا بالملقط للكشف عن العضلات الكامنة.
- حدد موقع تقاطع البطن الخلفي للعضلة ثنائية المعدة والعضلة اللامية (الشكل 1 أ ، الدائرة السوداء). يظهر الوريد الوداجي الأمامي يمتد طوليا وجانبيا إلى العضلة اللامية اللامية.
ملاحظة: تغطي العضلة اللامية القصبة الهوائية طوليا ، بينما تقع العضلة ثنائية المعدة بشكل عرضي في الجانب القحفي من القصبة الهوائية (الشكل 1C).- أدخل طرف ملقط بزاوية 45 درجة عند هذا التقاطع ، الجانبي للوريد الوداجي الأمامي ، لاختراق ونشر فتحة في اللفافة العنقية العميقة التي تعلوها.
- احتفظ بهذه النافذة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.3.1 مفتوحة باستخدام ملقط بزاوية 45 درجة. قم بتوسيع هذه الفتحة على نطاق أوسع من خلال إجراء مناورات الانتشار باستخدام زوج من الملقط المنحني في اليد الأخرى.
3. تحديد واستئصال العقدة
- حدد موقع العقدة العنقية العلوية (SCG) على الجدار الجانبي للمساحة المكشوفة. يظهر كنسيج دائري لؤلؤي.
ملاحظة: إذا لم يتم تحديد SCG ، فيجب فحص الأنسجة الموجودة في هذا الفضاء بشكل جانبي ومتفوق. يمكن الخلط بسهولة بين SCG والدهون ، والتي غالبا ما تكون موجودة في هذه المنطقة. الدهون لها مسحة صفراء قليلا ، بينما في المقابل ، يظهر SCG أبيض لؤلؤي. - مع الحفاظ على الفتحة بالملقط باليد الأخرى ، أمسك SCG برفق بالملقط ، واسحبه من الفتحة لجعله في رؤية أفضل.
- بمجرد رؤية SCG ، أمسك بالقاعدة الجانبية ل SCG ، حيث لا تزال متصلة بالأنسجة المحيطة. باستخدام اليد الأخرى ، اسحب SCG ببطء ورفق في الاتجاه البطني والذيلي.
- اسحب SCG عدة مرات لإزالة العقدة تدريجيا شيئا فشيئا. حافظ على العقدة سليمة أثناء هذه المناورة لضمان عدم ترك بقايا العقدة المتبقية وراءها.
ملاحظة: اسحب العقدة برفق ، حيث قد يحدث نزيف أثناء هذه الخطوة. في حالة حدوث نزيف بسيط ، استخدم السليلوز المؤكسد المتجدد أو شريط صغير من الشاش المعقم للحفاظ على الضغط على الفتحة لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة. ثم ارفع الشاش ببطء وأعد التقييم. كرر عملية الضغط على الفتحة حسب الضرورة حتى يتوقف النزيف.
- اسحب SCG عدة مرات لإزالة العقدة تدريجيا شيئا فشيئا. حافظ على العقدة سليمة أثناء هذه المناورة لضمان عدم ترك بقايا العقدة المتبقية وراءها.
- حرر ببطء الملقط الآخر الذي يحمل قاعدة العقدة. تحقق من النزيف من خلال البحث عن تجمع الدم.
ملاحظة: النز الطفيف في هذا الوقت أمر طبيعي. راقب وتأكد من عدم وجود نزيف مستمر أو كبير قبل إغلاق الإجراء وإنهائه. في حالة حدوث ذلك ، اضغط مع الاستمرار على الفتحة ، كما هو موضح في الخطوة 3.3.1. - حرك الغدد اللعابية مرة أخرى إلى مواقعها التشريحية الطبيعية. قم بتقريب وإغلاق الجلد باستخدام خيوط نايلون بسيطة متقطعة 5-0 (انظر جدول المواد).
- ضع الماوس في قفص نظيف بمفرده للسماح بالشفاء التام من التخدير.
ملاحظة: قد يستغرق الأمر من 5 إلى 15 دقيقة حتى يستيقظ الماوس تماما من التخدير. لا تترك الفأر دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا تضع الماوس في قفص مع الفئران الأخرى حتى يتعافى تماما. تقييم الماوس للتعافي بعد الجراحة مرة واحدة على الأقل كل 24 ساعة لمدة 72 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول الاستئصال الجراحي ل SCG في نموذج الماوس. يوضح الشكل 2 المعالم التشريحية ، بما في ذلك CCA والوريد الوداجي الأمامي و SCG. مع التشريح (الشكل 2 أ) ، يمكن رؤية الوريد الوداجي الأمامي الأيمن وهو يتأرجح على طول الحدود الجانبية للقصبة الهوائية. نظرا لأنه يقع أعمق من الوريد الوداجي الأمامي ، فإن CCA الأيسر وتشعبه في الشريان السباتي الداخلي (ICA) والشريان السباتي الخارجي (ECA) لا يرى إلا بشكل ضعيف جانبي للوريد. عند فحص هذا في NSG. B6-P0Tdفأر الطماطم المعدل وراثيا (فأر P0-Cre TdTomato حيث تكون خلايا شوان حمراء فلورية ، عمل غير منشور) مع خلايا عصبية فلورية حمراء تحت مجهر الفلورسنت ، يمكن رؤية العصب المبهم الفلوري وهو يتأرجح بشكل جانبي إلى CCA ، ويمكن رؤية SCG الفلوري عند تشعب CCA ، الجانبي للوريد الوداجي الأمامي (الشكل 2 ب).
بعد استئصال SCG في فأر طبيعي وفأر معدل وراثيا ، تم تأكيد الأنسجة المقطوعة من خلال مضانها الأحمر مقارنة بالتحكم في SCG غير الفلوري (الشكل 3A) والتلوين المناعي لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، وهو علامة للأعصاب الأدرينالية 13,29 (الشكل 3B).
إذا تم تنفيذ الإجراء بشكل صحيح ، يصاب الفأر بمتلازمة هورنر المماثلة مباشرة بعد الجراحة عند استعادة وعيه الكامل24. لوحظ تدلي الجفون ، تدلي الجفن ، وهو علامة على متلازمة هورنر (الشكل 4 ب).
الغدة اللعابية تحت الفك السفلي هي واحدة من الأنسجة المعصبة بواسطة SCG. للتحقق من نجاح SCGx ، تم إجراء تلطيخ التألق المناعي ل TH على الغدة اللعابية تحت الفك السفلي اليمنى بعد SCGx الأيمن وأكد الاجتثاث الناجح للإشارات الأدرينالية مع غياب تلطيخ العصب TH (الجانب الأيمن من الخط المنقط ، الشكل 5 أ). في المقابل ، حافظت الغدة تحت الفك السفلي اليسرى (بدون SCGx) على مدخلاتها الأدرينالية وتلطيخ العصب TH سليما (الجانب الأيسر من الخط المنقط ، الشكل 5 أ). تم تأكيد هذه النتائج من خلال القياس الكمي (الشكل 5 ب). أكد القياس الكمي ELISA للنورادرينالين13،30،31 في هذه الأنسجة انخفاضا كبيرا في تعبير النورإبينفرين في الغدة تحت الفك السفلي على جانب SCGx على عكس جانب الجراحة الوهمية الضابطة (الشكل 6). تم تحليل القياس الكمي لكليهما بواسطة اختبار t للطالب غير المزاوج ثنائي الذيل.
الشكل 1: يعمل الوريد الوداجي الأمامي الأيسر كمعلم تشريحي. (أ) يمكن رؤية الوريد الوداجي الأمامي الأيسر (السهم الأزرق) وهو يدور طوليا وبجانب الحافة الجانبية للعضلة اللامية. عند ثقب اللفافة العنقية العميقة بين زاوية البطن الخلفي للعضلات ثنائية المعدة والعضلات اللامية ، يجب أن يكون الثقب أيضا جانبيا للوريد الوداجي الأمامي (الدائرة السوداء). (ب) عندما تتمدد اللفافة العنقية العميقة قليلا، يمكن أيضا رؤية العصب المبهم (السهم الأبيض) والشريان السباتي المشترك بتشعبه (السهم الأحمر). (ج) رسم توضيحي منمق ل (ب). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: M = العضلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: SCG وعلاقته بالمعالم التشريحية في فأر معدل وراثيا مع خلايا عصبية فلورية. أ: تشريح فأر معدل وراثيا مع خلايا عصبية فلورية حمراء، يوضح الشريان السباتي المشترك الأيمن (سهم أحمر يشير إلى تشعبه) والوريد الوداجي الأمامي. يتشعب الشريان السباتي المشترك إلى الشريان السباتي الخارجي (ECA) والشريان السباتي الداخلي (ICA). يشير السهم الأصفر إلى العصب المبهم الذي يمتد أفقيا إلى الشريان السباتي المشترك. تبدو المسافة بين الشريان السباتي المشترك والعصب المبهم أوسع هنا عندما يدور رأس الفأر لالتقاط جميع التراكيب في هذه الصورة. (ب) نفس التشريح الذي تم فحصه بالتصوير الفلوري. العصب المبهم (السهم الأصفر) له مضان أحمر ويرى مرة أخرى يركض بشكل جانبي إلى الشريان السباتي المشترك (سهم أحمر يشير إلى تشعبه). يقع SCG الفلوري عند تشعب الشريان السباتي (رأس السهم الأصفر). يمتد الوريد الوداجي الأمامي (السهم الأزرق) الإنسي إلى الشريان السباتي المشترك. يمكن رؤية اللفافة العنقية العميقة التي تغطي هذه الهياكل من خلال انعكاسها اللامع. شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: صور مجهرية للعقدة المقطوعة . (أ) استئصال العقد العنقية العلوية تحت المجهر الفلوري. يظهر اليسار SCG مقطوعا من ماوس عادي ، يعمل كعنصر تحكم غير فلوري. يظهر اليمين SCG الفلوري المقطوع من فأر معدل وراثيا مع خلايا عصبية فلورية حمراء. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) تلطيخ مناعي لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، وهو علامة للأعصاب الأدرينالية ، في العقدة الفلورية الحمراء المقطوعة (P0). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تطور متلازمة هورنر بعد SCGx. (أ) فأر عادي قبل SCGx. (ب) تطور تدلي الجفون (السهم الأسود)، وتدلي الجفن، بعد SCGx المماثل، وهو علامة على الإصابة بمتلازمة هورنر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التألق المناعي وتلطيخ H&E المقابل للعلامة الأدرينالية في الأنسجة المستهدفة بعد جراحة SCGx مقابل الجراحة الوهمية. (أ) تلطيخ التألق المناعي الأيسر لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) في الغدة اللعابية تحت الفك السفلي بعد جراحة SCGx أو الجراحة الوهمية. الحق ، تلطيخ H & E المقابلة لنفس الأنسجة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي للتلطيخ TH. تمثل البيانات متوسط ± SEM. التحليل الإحصائي بواسطة اختبار t للطالب غير المزاوج ثنائي الطرف ، p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: القياس الكمي ELISA للنورادرينالين في الغدة اللعابية بعد جراحة SCGx مقابل الجراحة الوهمية. تمثل البيانات متوسط ± SEM. التحليل الإحصائي بواسطة اختبار t للطالب غير المزاوج ثنائي الطرف ، p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول نموذج الماوس للاستئصال الجراحي من جانب واحد لمدخلات SCG. تسمح هذه التقنية بدراسة آثار التعصيب الأدرينالي في بيئات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا زراعة العقدة المتعاطفة المقطوعة في ثقافة 3D matrigel للتجارب في المختبر 30.
تم إجراء الدراسات التي تتضمن SCGx في الغالب على الفئران ، حيث يسمح تشريحها الأكبر بتصور تشريحي وتشريح أسهل. في حين تم وصف SCGx في الفئران من قبل من قبل Ziegler et al.26 وتم الإبلاغ عنه لفترة وجيزة في دراسات أخرى21،22،27،28 ، استندت التقنية إلى تلك المستخدمة في الفئران ، حيث يتم الكشف عن CCA وتشريحه قبل استئصال SCG. على عكس نموذج الفئران ، فإن CCA في الفئران أصغر وأرق ، مما يجعل التشريح أكثر صعوبة ، وبالتالي ، أكثر عرضة للمضاعفات الخطيرة للنزيف الكبير من CCA. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب التعرض ل CCA معالجة أكثر شمولا ، بما في ذلك إزاحة العضلة القصية الترقوية الخشائية ، وكذلك تشريح الغدة اللعابية ودورانهاالجانبي 26. في المقابل ، تستخدم الطريقة الحالية الوريد الوداجي الأمامي بدلا من CCA كمعلم تشريحي. بالمقارنة مع CCA ، يقع الوريد الوداجي الأمامي بشكل سطحي أكثر ويمتد أكثر في الجمجمة (الشكل 2A). هذا يقدم بعض المزايا. أولا ، يمكن رؤية هذا المعلم بسهولة أكبر دون تشريح وتشريح الغدة اللعابية والعضلة القصية الترقوية الخشائية ، مما يجعل الجراحة أقل توغلا. لذلك ، يتطلب هذا البروتوكول فقط سحب اللعاب لأسفل قليلا (الخطوة 2.2). الحد الأدنى من التشريح يقصر أيضا وقت الجراحة ومدة التخدير للحيوان. علاوة على ذلك ، من خلال تجنب التشريح المكثف للتقييم القطري المشترك ، فإن هذا يقلل من فرص إصابة CCA ، مما قد يؤدي إلى نزيف كبير ومميت في الحالات الخطيرة. التلاعب ب CCA أمر لا مفر منه ، حيث يقع SCG عند تشعب CCA ، ولكن من خلال الاقتراب من هذه المنطقة خلف الإنسي عبر ثقب بجوار الوريد الوداجي الأمامي بدلا من فتح اللفافة التي تغطي CCA مباشرة ، يقلل هذا البروتوكول من الاتصال ، وبالتالي خطر إصابة هذا الشريان الرئيسي.
تواجه تحديين رئيسيين عند إجراء هذه الجراحة. الأول هو التحديد الناجح ل SCG ، خاصة بالنظر إلى الحجم الصغير جدا للمعالم التشريحية والعقدة نفسها في نماذج الفئران. لذلك ، فإن تشريح المعالم وتحديدها بعناية أمران ضروريان. في الخطوة 2.3 ، يجب إدخال ملقط بزاوية لاختراق اللفافة العنقية العميقة بزاوية البطن الخلفي للعضلات ثنائية المعدة والعضلات اللامية. خلال هذه الخطوة ، عادة ما يرى الوريد الوداجي الأمامي وهو يعمل جنبا إلى جنب مع الحافة الجانبية للعضلة اللامية ويجب أن يبقى وسطيا حتى نقطة الإدخال (الشكل 1) ؛ هذا معلم مهم وسيساعد في الدخول إلى المساحة الصحيحة للعثور على SCG. إذا لم يتم رؤية SCG في المنطقة الجانبية من هذا الفضاء ، فيجب استكشاف الأنسجة بشكل جانبي ومتفوق. خلال هذا التشريح ، يتم تصور غمد الشريان السباتي بشكل جانبي لمجال الرؤية لتجنب نزيف الأنسجة المحيطة وللمساعدة في تحديد SCG الإنسي لهذا الهيكل.
التحدي الرئيسي الثاني لهذا الإجراء هو إدارة خطر النزيف. هناك العديد من الهياكل الوعائية الحرجة المجاورة ل SCG ، بما في ذلك CCA والشريان السباتي الخارجي والوريد الوداجي الداخلي. في تجربتنا ، إذا حدث نزيف ، فإنه يصادف أثناء الجراحة وليس بعد الجراحة. قد تصادف النزيف أثناء خطوة فك الملقط في الخطوة 3.4. من المرجح أن تحدث إصابة الأوعية عند محاولة تقشير العقدة وتقشيرها بلطف من الأوعية والأنسجة المحيطة. قد لا يظهر النزيف النشط على الفور لأنه يتم تثبيت زوج من الملقط بالقرب من الأوعية في تلك المنطقة. لذلك ، يمكن تحديد النزيف بمجرد إطلاق الملقط ، ومن المهم فحص المنطقة بعناية بعد إزالة العقدة. في حالة نادرة من الاستنزاف بسبب تمزق في وعاء كبير ، يكون الضغط على المنطقة غير مجدي بسبب المعدل السريع للنزيف. في هذه الحالة ، يجب إنهاء الجراحة ، ويجب القتل الرحيم للفأر.
نظرا لتحديات تحديد SCG ومضاعفات النزيف المحتملة ، يوصى أولا بممارسة تشريح SCG وإزالته على الفئران الجثة للتعرف على التشريح قبل إجراء جراحة البقاء على قيد الحياة التجريبية.
قد تتأثر هذه الطريقة أيضا بيد الجراح. الإجراء أسهل في التنفيذ على نفس جانب يد الجراح المهيمنة. على سبيل المثال ، عند إجراء SCGx على الجانب الأيمن من الماوس ، سيتم استخدام اليد اليسرى للجراح للإمساك بقاعدة العقدة ، وسيتم استخدام اليد اليمنى لتقشير العقدة ، مما يعني أن الجراحة تتطلب المزيد من البراعة باليد اليمنى. إذا كان سيتم إجراء SCGx الثنائي ، فقد يستغرق وقتا أطول ويتطلب مزيدا من التدريب لأداء الجانب غير المهيمن للجراح.
تتيح هذه التقنية الجراحية ل SCGx في نموذج الفئران إجراء دراسات تجريبية مستقبلية تدرس آثار الجهاز العصبي الودي في كل من إعدادات الأورام والفسيولوجية. يتمتع نموذج الماوس بمزايا متعددة مقارنة بالنماذج الأخرى في الجسم الحي ، بما في ذلك التكلفة المنخفضة ، وسهولة التعامل ، وقابلية التلاعب الجيني ، مما يتيح إنشاء نماذج تجريبية أكثر قوة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم Q. W. من قبل المعاهد الوطنية للصحة T32CA009685. تم دعم RJ W. من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01CA219534. تم دعم المرافق الأساسية لمركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان من قبل المعاهد الوطنية للصحة P30CA008748.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | EMD Millipore | AB152 | |
| Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | 59399-162-35 | |
| Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile | Covidien | 1806 | |
| Derf Needle Holder | Thomas Scientific | 1177K00 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ETHILON Nylon Suture | Ethicon | 698H | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Hypoallergenic Surgical Tape | 3M Blenderm | 70200419342 | |
| Induction Chamber, 2 Liter | VetEquip | 941444 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc | 40002957 | chemical hair removing agent |
| NORADRENALINE RESEARCH ELISA | Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics) | BA E-5200 | |
| NSG Mouse | Jackson Laboratory | JAX:005557 | |
| Povidone-Iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341 (6142), 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al.
- Zahalka, A. H., et al. Adrenergic nerves activate an angio-metabolic switch in prostate cancer. Science. 358 (6361), 321-326 (2017).
- Amit, M., et al. Loss of p53 drives neuron reprogramming in head and neck cancer. Nature. 578 (7795), 449-454 (2020).
- Renz, B. W., et al. Cholinergic signaling via muscarinic receptors directly and indirectly suppresses pancreatic tumorigenesis and cancer stemness. Cancer Discovery. 8 (11), 1458-1473 (2018).
- Lucido, C. T., et al. Innervation of cervical carcinoma is mediated by cancer-derived exosomes. Gynecologic Oncology. 154 (1), 228-235 (2019).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16 (4), 400-412 (2015).
- Maronde, E., Stehle, J. H. The mammalian pineal gland: Known facts, unknown facets. Trends in Endocrinology & Metabolism. 18 (4), 142-149 (2007).
- Yamazaki, S., et al.
- Huang, J., et al. S100+ cells: A new neuro-immune cross-talkers in lymph organs. Scientific Reports. 3 (1), 1114 (2013).
- Dieguez, H. H., et al. Melatonin protects the retina from experimental nonexudative age-related macular degeneration in mice. Journal of Pineal Research. 68 (4), 12643 (2020).
- Liu, H., et al. Bilateral superior cervical ganglionectomy attenuates the progression of β-aminopropionitrile-induced aortic dissection in rats. Life Sciences. 193, 200-206 (2018).
- Zhang, W., et al. The role of the superior cervical sympathetic ganglion in ischemia reperfusion-induced acute kidney injury in rats. Frontiers in Medicine. 9, 792000 (2022).
- Zhang, W., et al. Superior cervical ganglionectomy alters gut microbiota in rats. American Journal of Translational Research. 14 (3), 2037-2050 (2022).
- Wang, X., et al. β-Adrenergic signaling induces Notch-mediated salivary gland progenitor cell control. Stem Cell Reports. 16 (11), 2813-2824 (2021).
- Boyd, A., Aragon, I. V., Abou Saleh, L., Southers, D., Richter, W. The cAMP-phosphodiesterase 4 (PDE4) controls β-adrenoceptor- and CFTR-dependent saliva secretion in mice. Biochemical Journal. 478 (10), 1891-1906 (2021).
- Smith, B., Butler, M. The effects of long-term propranolol on the salivary glands and intestinal serosa of the mouse. The Journal of Pathology. 124 (4), 185-187 (1978).
- Sucharov, C. C., et al. β-Adrenergic receptor antagonism in mice: A model for pediatric heart disease. Journal of Applied Physiology. 115 (7), 979-987 (2013).
- Ding, C., Walcott, B., Keyser, K. T. The alpha1- and beta1-adrenergic modulation of lacrimal gland function in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1504-1510 (2007).
- Grisanti, L. A., et al. Prior β-blocker treatment decreases leukocyte responsiveness to injury. JCI Insight. 5 (9), 99485 (2019).
- Alito, A. E., et al. Autonomic nervous system regulation of murine immune responses as assessed by local surgical sympathetic and parasympathetic denervation. Acta Physiologica, Pharmacologica et Therapeutica Latinoamericana. 37 (3), 305-319 (1987).
- Yun, H., Lathrop, K. L., Hendricks, R. L. A central role for sympathetic nerves in herpes stromal keratitis in mice. Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1749-1756 (2016).
- Haug, S. R., Heyeraas, K. J. Effects of sympathectomy on experimentally induced pulpal inflammation and periapical lesions in rats. Neuroscience. 120 (3), 827-836 (2003).
- Savastano, L. E., et al. A standardized surgical technique for rat superior cervical ganglionectomy. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 22-33 (2010).
- Garcia, J. B., Romeo, H. E., Basabe, J. C., Cardinali, D. P. Effect of superior cervical ganglionectomy on insulin release by murine pancreas slices. Journal of the Autonomic Nervous System. 22 (2), 159-165 (1988).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2017).
- Getsy, P. M., Coffee, G. A., Hsieh, Y. H., Lewis, S. J. The superior cervical ganglia modulate ventilatory responses to hypoxia independently of preganglionic drive from the cervical sympathetic chain. Journal of Applied Physiology. 131 (2), 836-857 (2021).
- Dieguez, H. H., et al. Superior cervical gangliectomy induces non-exudative age-related macular degeneration in mice. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031641 (2018).
- Zhang, B., et al. Hyperactivation of sympathetic nerves drives depletion of melanocyte stem cells. Nature. 577 (7792), 676-681 (2020).
- Pirzgalska, R. M., et al. Sympathetic neuron-associated macrophages contribute to obesity by importing and metabolizing norepinephrine. Nature Medicine. 23 (11), 1309-1318 (2017).
- Kajimura, D., Paone, R., Mann, J. J., Karsenty, G. Foxo1 regulates Dbh expression and the activity of the sympathetic nervous system in vivo. Molecular Metabolism. 3 (7), 770-777 (2014).
