Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल बेहतर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि की पहचान और बचाव करके एड्रीनर्जिक संक्रमण के पृथक्करण के एक माउस मॉडल का वर्णन करता है।
Abstract
बढ़ते सबूत बताते हैं कि सहानुभूति तंत्रिका तंत्र कैंसर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एड्रीनर्जिक संक्रमण लार ग्रंथि स्राव, सर्कैडियन लय, मैकुलर अपघटन, प्रतिरक्षा समारोह और कार्डियक फिजियोलॉजी को नियंत्रित करता है। म्यूरिन सर्जिकल सिम्पैथेक्टोमी बार-बार फार्माकोलॉजिकल हस्तक्षेप और संबंधित दुष्प्रभावों की आवश्यकता से बचते हुए पूर्ण, एकतरफा एड्रीनर्जिक एब्लेशन की अनुमति देकर एड्रीनर्जिक संक्रमण के प्रभावों का अध्ययन करने की एक विधि है। हालांकि, चूहों में सर्जिकल सिम्पैथेक्टोमी बेहतर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि के छोटे आकार के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। यह अध्ययन सहानुभूति तंत्रिका तंत्र को नष्ट करने के लिए बेहतर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि को मज़बूती से पहचानने और निकालने के लिए एक शल्य चिकित्सा तकनीक का वर्णन करता है। गैंग्लियन की सफल पहचान और हटाने को ट्रांसजेनिक माउस का उपयोग करके फ्लोरोसेंट सिम्पेथेटिक गैन्ग्लिया की इमेजिंग करके, पोस्ट-रिसेक्शन हॉर्नर सिंड्रोम की पहचान करके, कटे हुए गैन्ग्लिया में एड्रीनर्जिक मार्करों के लिए धुंधला करके, और सिम्पैथेक्टोमी के बाद लक्ष्य अंगों में कम एड्रीनर्जिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस का अवलोकन करके मान्य किया जाता है। यह मॉडल कैंसर की प्रगति के साथ-साथ सहानुभूति तंत्रिका तंत्र द्वारा विनियमित अन्य शारीरिक प्रक्रियाओं के भविष्य के अध्ययन को सक्षम बनाता है।
Introduction
कई अध्ययनों ने बताया है कि ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में तंत्रिकाएं ट्यूमर की प्रगति का समर्थन करने में सक्रिय भूमिका निभाती हैं। एड्रीनर्जिक सहानुभूति तंत्रिकाओं के पृथक्करण को विवो 1,2,3 में प्रोस्टेट और गैस्ट्रिक कैंसर में ट्यूमर के विकास और प्रसार को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स की औषधीय नाकाबंदी सिर और गर्दनके कैंसर में ट्यूमर के विकास को रोकती है। अग्नाशय, गर्भाशय ग्रीवा और बेसल सेल कार्सिनोमा प्रगति 5,6,7 में सहानुभूति तंत्रिका भागीदारी का भी वर्णन किया गया है।
सहानुभूति तंत्रिका तंत्र के भीतर, बेहतर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि (एससीजी) सहानुभूति ट्रंक का एकमात्र नाड़ीग्रन्थि है जो सिर को आंतरिक करता है। एससीजी विभिन्न शारीरिक कार्यों को नियंत्रित करता है, जैसे लार स्राव और सर्कैडियन लय, और सीधे ग्रीवा लिम्फ नोड्स 8,9,10 को आंतरिक करता है। एससीजी को पैथोलॉजिक प्रक्रियाओं जैसे मैकुलर अपघटन11 और महाधमनी विच्छेदन12 की प्रगति में भी फंसाया गया है। इसके अतिरिक्त, एससीजी के अलग होने से इस्किमिया से प्रेरित तीव्र गुर्दे की चोट13 को बढ़ाने और चूहों में आंत माइक्रोबायोटा कोबदलने की सूचना मिली है।
एक माउस मॉडल में एससीजी का पूर्ण पृथक्करण कैंसर और स्वायत्त तंत्रिका तंत्र अनुसंधान को सक्षम करने के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक तकनीक का प्रतिनिधित्व करेगा। जबकि कई अध्ययनों ने फार्माकोलॉजिकल एड्रीनर्जिक रिसेप्टर नाकाबंदी का उपयोग एड्रीनर्जिक एब्लेशन 15,16,17,18,19,20 के रूप में किया है, सर्जिकल रिसेक्शन बार-बार फार्माकोलॉजिकल हस्तक्षेप और संबंधित दुष्प्रभावों 21,22,23 की आवश्यकता से बचते हुए पूर्ण, एकतरफा एड्रीनर्जिक एब्लेशन की अनुमति देता है।
एससीजी के सर्जिकल रिसेक्शन को चूहों24 में वर्णित किया गया है, और बेहतर ग्रीवा गैंग्लियनेक्टोमी (एससीजीएक्स) के प्रभाव का अध्ययन करने वाली अधिकांश रिपोर्टों ने चूहे के मॉडल को नियोजित किया है। चूहे के मॉडल की तुलना में, एससीजी के छोटे आकार के कारण एससीजीएक्स चूहों में तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, चूहों को संभालना अपेक्षाकृत आसान है, अधिक लागत प्रभावी है, और आनुवंशिक हेरफेर के लिए अधिक उत्तरदायी है। गार्सिया एट अल चूहों में एससीजीएक्स की रिपोर्ट करने वाले पहले लोगों में से एक थे, और यह इंसुलिन रिलीज25 को प्रभावित करने के लिए पाया गया था। हाल ही में, ज़िगलर एट अल ने चूहों24,26 के लिए वर्णित प्रकाशित तकनीक के आधार पर चूहों में एससीजीएक्स का वर्णन किया। यह और अन्य लेख एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जिसमें सामान्य कैरोटिड धमनी (सीसीए) को पहले पहचाना और विच्छेदित किया जाता है, और एससीजी को बाद में सीसीए21,22,27,28 के विभाजन से हटा दिया जाता है। इस लेख में, चूहों में एक कम आक्रामक और सुरक्षित तकनीक का वर्णन किया गया है जो सीसीए के विच्छेदन से बचता है, जिससे इस प्रक्रिया की सबसे गंभीर जटिलता कम हो जाती है - सीसीए की चोट से रक्तस्राव।
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Protocol
यहां वर्णित पशु प्रक्रियाओं को मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। यहां आठ सप्ताह के नर और मादा एनएसजी चूहों का इस्तेमाल किया गया। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। उपकरणों को निष्फल किया जाता है, सर्जिकल कामकाजी सतह को कीटाणुरहित किया जाता है, जानवर की त्वचा की सतह को कीटाणुरहित किया जाता है, और सर्जन पूरी प्रक्रिया के दौरान बाँझ दस्ताने पहनता है।
1. चूहों की तैयारी और प्रीऑपरेटिव सेटअप
- सर्जरी से एक दिन पहले, एक प्रेरण कक्ष में 2% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें (चौड़ाई में 3.75 x 9 गहराई में x 3.75 ऊंचाई में, सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: संज्ञाहरण का एक सर्जिकल विमान आमतौर पर 3-5 मिनट में प्राप्त किया जाता है, जो व्यक्तिगत जानवर पर निर्भर करता है। पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्तता का आकलन करें, और उपयुक्त रूप से आइसोफ्लुरेन प्रतिशत बढ़ाएं।- गर्दन के उदर पहलू को शेव करें या निर्माता के निर्देशों के अनुसार रासायनिक बाल हटाने वाले एजेंट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- सर्जरी के दिन, एक प्रेरण कक्ष में 2% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्तता का आकलन करें, और उपयुक्त रूप से आइसोफ्लुरेन प्रतिशत बढ़ाएं।
- प्रीमेप्टिव सिस्टमिक एनाल्जेसिया के लिए 2 मिलीग्राम / किलोग्राम मेलोक्सिकैम को चमड़े के नीचे प्रशासित करें। संज्ञाहरण के तहत ओकुलर चोटों और सूखापन को रोकने के लिए सामयिक नेत्र मरहम ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करें।
- माउस को उसके पृष्ठीय पक्ष पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और थर्मल समर्थन प्रदान करें। एक सटीक वेपोराइज़र और नाक शंकु का उपयोग करके 2% -2.5% आइसोफ्लुरेन के साथ इनहेलेशनल एनेस्थीसिया बनाए रखें। हाइपोएलर्जेनिक टेप के साथ दोनों अग्रअंगों को धीरे से सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- पोविडोन-आयोडीन के साथ गर्दन के मुड़े, उदर पहलू को साफ करें, और फिर 70% अल्कोहल से पोंछ लें। इस प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं। सुनिश्चित करें कि सर्जिकल साइट किसी भी ढीले बालों से मुक्त है।
नोट: छोटे घुमावदार बल की एक जोड़ी का भी उपयोग किया जा सकता है। इस सीमित स्थान में पर्याप्त रूप से काम करने के लिए ठीक या नेत्र बल की एक जोड़ी का उपयोग करना सुनिश्चित करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार अतिरिक्त प्री-ऑपरेटिव सेटअप को शामिल किया जा सकता है।
2. विच्छेदन
- ठोड़ी के नीचे लगभग 2 मिमी से लेकर उरोस्थि पायदान से 2 मिमी ऊपर तक छोटी कैंची का उपयोग करके गर्दन के उदर पहलू पर 1.5 सेमी मध्य रेखा त्वचा चीरा लगाएं।
- अंतर्निहित प्रावरणी और सबमैंडिबुलर लार ग्रंथियों को उजागर करने के लिए बल के साथ त्वचा के किनारों को पार्श्व में मोड़ें। प्रत्येक तरफ त्वचा के नीचे नुकीली कैंची डालकर और फैलाकर त्वचा को अंतर्निहित प्रावरणी से अलग करें। अंतर्निहित मांसपेशियों को प्रकट करने के लिए उप-मैंडिबुलर ग्रंथियों को बल के साथ नीचे खींचें।
- डिगैस्ट्रिक मांसपेशी और ओमोहियॉइड मांसपेशी के पीछे के पेट के जंक्शन का पता लगाएं (चित्रा 1 ए, काला सर्कल)। पूर्ववर्ती जुगुलर नस को अनुदैर्ध्य रूप से और ओमोहाइइड मांसपेशी के पार्श्व में चलते हुए देखा जाता है।
नोट: ओमोहाइइड मांसपेशी श्वासनली को अनुदैर्ध्य रूप से कवर करती है, जबकि डिगैस्ट्रिक मांसपेशी श्वासनली के कपाल पहलू पर अनुप्रस्थ रूप से स्थित होती है (चित्रा 1 सी)।- इस जंक्शन पर 45° कोण वाले बल की नोक डालें, जो पूर्ववर्ती जुगुलर नस के पार्श्व में है, ताकि गहरे ग्रीवा प्रावरणी में छेद किया जा सके और एक छिद्र फैलाया जा सके।
- चरण 2.3.1 में बनाई गई इस विंडो को 45° कोण बल के साथ खुला रखें। दूसरे हाथ में घुमावदार बल की एक जोड़ी के साथ फैलाने वाले युद्धाभ्यास करके इस उद्घाटन का विस्तार करें।
3. नाड़ीग्रन्थि की पहचान और लकीर
- प्रकट स्थान की पार्श्व दीवार पर बेहतर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि (एससीजी) का पता लगाएं। यह एक गोल, नाशपाती ऊतक के रूप में दिखाई देता है।
नोट: यदि एससीजी की पहचान नहीं की जाती है, तो इस स्थान में ऊतकों को अधिक पार्श्व और बेहतर रूप से जांच करने की आवश्यकता होती है। एससीजी को वसा के साथ आसानी से भ्रमित किया जा सकता है, जो अक्सर इस क्षेत्र में मौजूद होता है। वसा में थोड़ा पीला रंग होता है, जबकि इसके विपरीत, एससीजी मोती सफेद दिखाई देता है। - दूसरे हाथ से बल के साथ उद्घाटन को बनाए रखते हुए, धीरे से एससीजी को बल के साथ पकड़ें, और इसे बेहतर दृश्य में लाने के लिए इसे उद्घाटन से बाहर खींचें।
- एक बार एससीजी देखने के बाद, एससीजी के पार्श्व आधार को समझें, जहां यह अभी भी आसपास के ऊतकों से जुड़ा हुआ है। दूसरी ओर का उपयोग करते हुए, धीरे-धीरे और धीरे से एससीजी को उदर और पुच्छल दिशा में वापस ले लें।
- धीरे-धीरे गैंग्लियन को थोड़ा-थोड़ा करके उत्तेजित करने के लिए एससीजी को कई बार वापस लें। इस पैंतरेबाज़ी के दौरान नाड़ीग्रन्थि को बरकरार रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई अवशिष्ट नाड़ीग्रन्थि अवशेष पीछे न रह जाए।
नोट: नाड़ीग्रन्थि को धीरे से खींचें, क्योंकि इस चरण के दौरान रक्तस्राव हो सकता है। यदि मामूली रक्तस्राव होता है, तो ऑक्सीकृत पुनर्जीवित सेल्यूलोज या बाँझ धुंध की एक छोटी पट्टी का उपयोग 30 सेकंड से 1 मिनट के लिए उद्घाटन पर दबाव रखने के लिए करें। फिर, धीरे-धीरे धुंध उठाएं और फिर से आकलन करें। रक्तस्राव बंद होने तक आवश्यक रूप से उद्घाटन पर दबाव रखने की प्रक्रिया को दोहराएं।
- धीरे-धीरे गैंग्लियन को थोड़ा-थोड़ा करके उत्तेजित करने के लिए एससीजी को कई बार वापस लें। इस पैंतरेबाज़ी के दौरान नाड़ीग्रन्थि को बरकरार रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई अवशिष्ट नाड़ीग्रन्थि अवशेष पीछे न रह जाए।
- धीरे-धीरे नाड़ीग्रन्थि के आधार को पकड़ने वाले अन्य बलों को छोड़ दें। ब्लड पूलिंग की तलाश करके रक्तस्राव की जांच करें।
नोट: इस समय हल्का सा रक्तस्राव सामान्य है। निगरानी करें और सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया को बंद करने और समाप्त करने से पहले कोई लगातार या महत्वपूर्ण रक्तस्राव न हो। यदि ऐसा होता है, तो चरण 3.3.1 में वर्णित के रूप में उद्घाटन पर दबाव रखें। - लार ग्रंथियों को उनकी सामान्य शारीरिक स्थिति में वापस ले जाएं। सरल बाधित 5-0 नायलॉन सीवन का उपयोग करके त्वचा को अनुमानित और बंद करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- एनेस्थीसिया से पूर्ण वसूली की अनुमति देने के लिए माउस को एक साफ पिंजरे में रखें।
नोट: माउस को संज्ञाहरण से पूरी तरह से जागने में 5-15 मिनट लग सकते हैं। माउस को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। माउस को अन्य चूहों के साथ पिंजरे में न रखें जब तक कि यह पूरी तरह से ठीक न हो जाए। 72 घंटे के लिए हर 24 घंटे में कम से कम एक बार पोस्टसर्जिकल रिकवरी के लिए माउस का आकलन करें।
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Representative Results
यह प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल में एससीजी के सर्जिकल हटाने का वर्णन करता है। चित्रा 2 शारीरिक स्थलों को दर्शाता है, जिसमें सीसीए, पूर्ववर्ती जुगुलर नस और एससीजी शामिल हैं। विच्छेदन (चित्रा 2 ए) के साथ, श्वासनली की पार्श्व सीमा के साथ दाईं पूर्ववर्ती जुगुलर नस को देखा जा सकता है। चूंकि यह पूर्ववर्ती जुगुलर नस से अधिक गहरा स्थित है, बाएं सीसीए और आंतरिक कैरोटिड धमनी (आईसीए) और बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) में इसका विभाजन केवल नस के पार्श्व में देखा जाता है। एनएसजी में इसकी जांच करते समय। बी 6-पी0टीडी टमाटर ट्रांसजेनिक माउस (एक पी 0-क्री टीडीटोमेटो माउस जहां श्वान कोशिकाएं फ्लोरोसेंट लाल, अप्रकाशित काम होती हैं) एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत लाल फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स के साथ, फ्लोरोसेंट वेगस तंत्रिका को सीसीए के पार्श्व में देखा जा सकता है, और फ्लोरोसेंट एससीजी को सीसीए के विभाजन पर देखा जा सकता है, पूर्वकाल जुगुलर नस के पार्श्व (चित्रा 2 बी)।
एक सामान्य माउस और एक ट्रांसजेनिक माउस में एससीजी के अलग होने के बाद, गैर-फ्लोरोसेंट एससीजी नियंत्रण (चित्रा 3 ए) और टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग की तुलना में इसकी लाल प्रतिदीप्ति द्वारा कटे हुए ऊतक की पुष्टि की गई, जो एड्रीनर्जिक नसों के लिए एक मार्कर13,29 (चित्रा 3 बी) है।
यदि प्रक्रिया सही ढंग से की जाती है, तो माउस पूर्ण चेतना प्राप्त करने पर सर्जरी के तुरंत बाद हॉर्नर सिंड्रोम विकसित करताहै। पेटोसिस, पलक का झुकाव, देखा गया था, जो हॉर्नर सिंड्रोम (चित्रा 4 बी) का संकेत है।
सबमैंडिबुलर लार ग्रंथि एससीजी द्वारा आंतरिक ऊतकों में से एक है। सफल एससीजीएक्स को मान्य करने के लिए, टीएच के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग दाएं एससीजीएक्स के बाद दाईं सबमैंडिबुलर लार ग्रंथि पर किया गया था और अनुपस्थित टीएच तंत्रिका धुंधलापन (डॉटेड लाइन के दाईं ओर, चित्रा 5 ए) के साथ एड्रीनर्जिक सिग्नलिंग के सफल पृथक्करण की पुष्टि की गई थी। इसके विपरीत, बाएं नियंत्रण सबमैंडिबुलर ग्रंथि (कोई एससीजीएक्स नहीं) ने अपने एड्रीनर्जिक इनपुट और बरकरार टीएच तंत्रिका धुंधलापन (डॉटेड लाइन के बाईं ओर, चित्रा 5 ए) को बनाए रखा। इन निष्कर्षों की पुष्टि परिमाणीकरण (चित्रा 5 बी) द्वारा की गई थी। इन ऊतकों में नॉरपेनेफ्रिन 13,30,31 की एलिसा मात्रा ने आगे नियंत्रण शाम सर्जरी पक्ष के विपरीत एससीजीएक्स के पक्ष में सबमैंडिबुलर ग्रंथि में नॉरपेनेफ्रिन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी की पुष्टि की (चित्रा 6)। दोनों के लिए परिमाणीकरण का विश्लेषण एक अप्रकाशित, दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट द्वारा किया गया था।
चित्रा 1: बाएं पूर्वकाल जुगुलर नस एक शारीरिक मील का पत्थर के रूप में कार्य करती है। (ए) बाएं पूर्ववर्ती जुगुलर नस (नीला तीर) को अनुदैर्ध्य रूप से और ओमोहाइइड मांसपेशी के पार्श्व किनारे के साथ देखा जा सकता है। डिगैस्ट्रिक और ओमोहियॉइड मांसपेशियों के पीछे के पेट के कोण के बीच गहरी ग्रीवा प्रावरणी को छेदते समय, छेदना पूर्ववर्ती जुगुलर नस (काले घेरे) के पार्श्व में भी होना चाहिए। (बी) जब गहरी ग्रीवा प्रावरणी थोड़ी फैली होती है, तो वेगस तंत्रिका (सफेद तीर) और इसके विभाजन (लाल तीर) के साथ सामान्य कैरोटिड धमनी को भी देखा जा सकता है। (सी) (बी) का शैलीबद्ध चित्रण। स्केल बार = 100 μm. संक्षिप्त नाम: M = मांसपेशी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: एससीजी और फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स के साथ ट्रांसजेनिक माउस में शारीरिक स्थलों से इसका संबंध। (ए) लाल फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स के साथ एक ट्रांसजेनिक माउस में विच्छेदन, सही सामान्य कैरोटिड धमनी (लाल तीर इसके विभाजन की ओर इशारा करते हुए) और पूर्ववर्ती जुगुलर नस को दर्शाता है। सामान्य कैरोटिड धमनी बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) और आंतरिक कैरोटिड धमनी (आईसीए) में विभाजित होती है। पीला तीर सामान्य कैरोटिड धमनी को पार्श्व रूप से चलने वाली वेगस तंत्रिका को इंगित करता है। आम कैरोटिड धमनी और वेगस तंत्रिका के बीच की दूरी यहां व्यापक दिखाई देती है क्योंकि माउस के सिर को इस छवि में सभी संरचनाओं को पकड़ने के लिए मोड़ दिया जाता है। (बी) फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ एक ही विच्छेदन की जांच की गई। वेगस तंत्रिका (पीले तीर) में लाल प्रतिदीप्ति होती है और इसे फिर से आम कैरोटिड धमनी (लाल तीर इसके विभाजन की ओर इशारा करते हुए) तक पार्श्व रूप से दौड़ते हुए देखा जाता है। फ्लोरोसेंट एससीजी कैरोटिड धमनी (पीले तीर) के विभाजन पर स्थित है। पूर्ववर्ती जुगुलर नस (नीला तीर) सामान्य कैरोटिड धमनी के लिए औसत दर्जे का चलता है। इन संरचनाओं के ऊपर गहरी ग्रीवा प्रावरणी को इसके चमकदार प्रतिबिंब के साथ देखा जा सकता है। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: क्षतिग्रस्त नाड़ीग्रन्थि की सूक्ष्म छवियां । (ए) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत बेहतर ग्रीवा गैन्ग्लिया का पता चला। बाईं ओर एससीजी को एक सामान्य माउस से निकाला गया दिखाया गया है, जो गैर-फ्लोरोसेंट नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। दाईं ओर लाल फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स के साथ एक ट्रांसजेनिक माउस से एक फ्लोरोसेंट एससीजी दिखाया गया है। स्केल बार = 500 μm. (B) टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन, एड्रीनर्जिक नसों के लिए एक मार्कर, क्षतिग्रस्त लाल फ्लोरोसेंट गैंग्लियन (पी 0) में। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: एससीजीएक्स के बाद हॉर्नर सिंड्रोम का विकास। (ए) एससीजीएक्स से पहले एक सामान्य माउस। (बी) एससीजीएक्स के बाद पेटोसिस (काला तीर), पलक का सिकुड़ना, जो हॉर्नर सिंड्रोम का संकेत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: एससीजीएक्स बनाम शाम सर्जरी के बाद लक्ष्य ऊतक में एड्रीनर्जिक मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और संबंधित एच एंड ई धुंधलापन। (ए) एससीजीएक्स या शाम सर्जरी के बाद सबमैंडिबुलर लार ग्रंथि में टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) के लिए बाएं, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। दाएं, एक ही ऊतक का संबंधित एच एंड ई धुंधलापन। स्केल बार = 200 μm. (B) TH धुंधला होने का परिमाणीकरण। डेटा औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है। अप्रकाशित, दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट, पी < 0.0001 द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: एससीजीएक्स बनाम शाम सर्जरी के बाद लार ग्रंथि में नॉरपेनेफ्रिन की एलिसा परिमाणीकरण। डेटा औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है। अप्रकाशित, दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट, पी < 0.0001 द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल एससीजी इनपुट के सर्जिकल एकतरफा पृथक्करण के लिए एक माउस मॉडल का वर्णन करता है। यह तकनीक विभिन्न सेटिंग्स में एड्रीनर्जिक संक्रमण के प्रभावों का अध्ययन करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, इन विट्रो प्रयोगों के लिए 3 डी मैट्रिगेल संस्कृति में भी संकुचित सहानुभूति नाड़ीग्रन्थि को उगाया जा सकता है।
एससीजीएक्स से जुड़े अध्ययन ज्यादातर चूहों में किए गए हैं, क्योंकि उनकी बड़ी शारीरिक रचना आसान शारीरिक विज़ुअलाइज़ेशन और विच्छेदन की अनुमति देती है। जबकि चूहों में एससीजीएक्स को ज़िग्लर एट अल.26 द्वारा पहले वर्णित किया गया है और अन्य अध्ययनों में संक्षेप में 21,22,27,28 की रिपोर्ट की गई है, तकनीक चूहों में उपयोग की जाने वाली तकनीक पर आधारित थी, जिसमें एससीजी के शोधन से पहले सीसीए को उजागर और विच्छेदित किया जाता है। चूहे के मॉडल के विपरीत, चूहों में सीसीए छोटा और पतला होता है, जिससे विच्छेदन अधिक कठिन हो जाता है और इसलिए, सीसीए से प्रमुख रक्तस्राव की गंभीर जटिलता का खतरा अधिक होता है। इसके अतिरिक्त, सीसीए के संपर्क में अधिक व्यापक हेरफेर की आवश्यकता होती है, जिसमें स्टर्नोक्लेडोमास्टोइड मांसपेशी का विस्थापन, साथ ही लार ग्रंथि26 का विच्छेदन और पार्श्व रोटेशन शामिल है। इसके विपरीत, वर्तमान विधि शारीरिक मील का पत्थर के रूप में सीसीए के बजाय पूर्ववर्ती जुगुलर नस का उपयोग करती है। सीसीए की तुलना में, पूर्ववर्ती जुगुलर नस अधिक सतही रूप से स्थित होती है और आगे कपाल रूप से फैली होती है (चित्रा 2 ए)। यह कुछ फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, यह मील का पत्थर लार ग्रंथि और स्टर्नोक्लेडोमास्टोइड मांसपेशियों के विच्छेदन और विस्थापन के बिना अधिक आसानी से देखा जाता है, जिससे सर्जरी कम आक्रामक हो जाती है; इसलिए, इस प्रोटोकॉल को केवल लार को थोड़ा नीचे खींचने की आवश्यकता होती है (चरण 2.2)। न्यूनतम विच्छेदन भी सर्जरी के समय और जानवर के लिए संज्ञाहरण की अवधि को कम करता है। इसके अलावा, सीसीए के व्यापक विच्छेदन से बचने से, यह सीसीए को घायल करने की संभावना को कम करता है, जिससे गंभीर मामलों में प्रमुख और घातक रक्तस्राव हो सकता है। सीसीए में हेरफेर अपरिहार्य है, क्योंकि एससीजी सीसीए के विभाजन पर स्थित है, लेकिन सीसीए के ऊपर प्रावरणी को सीधे खोलने के बजाय पूर्ववर्ती जुगुलर नस के बगल में एक छेद के माध्यम से इस क्षेत्र के पास पहुंचने से, यह प्रोटोकॉल संपर्क को कम करता है और इसलिए, इस प्रमुख धमनी को चोट लगने का खतरा कम हो जाता है।
इस सर्जरी को करते समय दो प्रमुख चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। पहला एससीजी की सफल पहचान है, विशेष रूप से शारीरिक स्थलों के बहुत छोटे आकार और माउस मॉडल में नाड़ीग्रन्थि को देखते हुए। इसलिए, स्थलों का सावधानीपूर्वक विच्छेदन और पहचान आवश्यक है। चरण 2.3 में, डिगैस्ट्रिक और ओमोहाइड मांसपेशियों के पीछे के पेट के कोण पर गहरे ग्रीवा प्रावरणी को छेदने के लिए कोण बल डाला जाना चाहिए। इस चरण के दौरान, पूर्वकाल जुगुलर नस को आमतौर पर ओमोहाइइड मांसपेशी के पार्श्व किनारे के साथ चलते हुए देखा जाता है और इसे सम्मिलन बिंदु (चित्रा 1) तक रखा जाना चाहिए; यह एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर है और एससीजी को खोजने के लिए सही स्थान में प्रवेश करने में मदद करेगा। यदि एससीजी इस स्थान के पार्श्व क्षेत्र में नहीं देखा जाता है, तो ऊतकों को अधिक पार्श्व और बेहतर रूप से पता लगाने की आवश्यकता होती है। इस विच्छेदन के दौरान, कैरोटिड म्यान को आसपास के ऊतकों के रक्तस्राव से बचने और इस संरचना के लिए एससीजी उपचारात्मक की पहचान करने में मदद करने के लिए दृश्य के क्षेत्र के पार्श्व में देखा जाता है।
इस प्रक्रिया के लिए दूसरी बड़ी चुनौती रक्तस्राव के जोखिम का प्रबंधन कर रही है। एससीजी से सटे कई महत्वपूर्ण संवहनी संरचनाएं हैं, जिनमें सीसीए, बाहरी कैरोटिड धमनी और आंतरिक जुगुलर नस शामिल हैं। हमारे अनुभव में, यदि रक्तस्राव होता है, तो इसका सामना पोस्टऑपरेटिव के बजाय इंट्राऑपरेटिव रूप से किया जाता है। चरण 3.4 में बल को खोलने के चरण के दौरान रक्तस्राव का सामना करना पड़ सकता है। वाहिकाओं को चोट लगने की सबसे अधिक संभावना होती है जब आसपास के वाहिकाओं और ऊतकों से नाड़ीग्रन्थि को छीलने और धीरे से निकालने की कोशिश की जाती है। सक्रिय रक्तस्राव तुरंत नहीं देखा जा सकता है क्योंकि उस क्षेत्र में वाहिकाओं के पास बल की एक जोड़ी लगाई जाती है। इसलिए, बल जारी होने के बाद रक्तस्राव की पहचान की जा सकती है, और नाड़ीग्रन्थि को हटाने के बाद क्षेत्र का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। एक प्रमुख पोत में आंसू के कारण उत्सर्जन के दुर्लभ उदाहरण में, रक्तस्राव की तीव्र दर के कारण क्षेत्र पर दबाव रखना व्यर्थ है। इस स्थिति में, सर्जरी को समाप्त कर दिया जाना चाहिए, और माउस को इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए।
एससीजी पहचान और संभावित रक्तस्राव जटिलताओं की चुनौतियों को देखते हुए, प्रयोगात्मक उत्तरजीविता सर्जरी करने से पहले शरीर रचना विज्ञान से परिचित होने के लिए कैडवेरिक चूहों पर एससीजी विच्छेदन और हटाने का अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है।
यह विधि सर्जन की मनमानी से भी प्रभावित हो सकती है। प्रक्रिया सर्जन के प्रमुख हाथ के समान पक्ष पर प्रदर्शन करना आसान है। उदाहरण के लिए, माउस के दाईं ओर एससीजीएक्स करते समय, सर्जन के बाएं हाथ का उपयोग नाड़ीग्रन्थि के आधार को पकड़ने के लिए किया जाएगा, और दाहिने हाथ का उपयोग नाड़ीग्रन्थि को छीलने के लिए किया जाएगा, इस प्रकार इसका अर्थ है कि सर्जरी को दाहिने हाथ के साथ अधिक चालाकी की आवश्यकता होगी। यदि द्विपक्षीय एससीजीएक्स किया जाना है, तो यह अधिक समय लेने वाला हो सकता है और सर्जन के गैर-प्रमुख पक्ष पर प्रदर्शन करने के लिए अधिक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है।
एक मुराइन मॉडल में एससीजीएक्स की यह सर्जिकल तकनीक भविष्य के प्रयोगात्मक अध्ययनों को ऑन्कोलॉजिक और फिजियोलॉजिकल सेटिंग्स दोनों में सहानुभूति तंत्रिका तंत्र के प्रभावों की जांच करने में सक्षम बनाती है। माउस मॉडल में विवो मॉडल में अन्य पर कई फायदे हैं, जिसमें कम लागत, हैंडलिंग में आसानी और आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपयुक्तता शामिल है, इस प्रकार अधिक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल बनाने में सक्षम है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
Q. W. NIH T32CA009685 द्वारा समर्थित था। आर. जे. डब्ल्यू. को एनआईएच R01CA219534 द्वारा समर्थित किया गया था। मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर कोर सुविधाओं को एनआईएच P30CA008748 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | EMD Millipore | AB152 | |
| Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | 59399-162-35 | |
| Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile | Covidien | 1806 | |
| Derf Needle Holder | Thomas Scientific | 1177K00 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ETHILON Nylon Suture | Ethicon | 698H | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Hypoallergenic Surgical Tape | 3M Blenderm | 70200419342 | |
| Induction Chamber, 2 Liter | VetEquip | 941444 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc | 40002957 | chemical hair removing agent |
| NORADRENALINE RESEARCH ELISA | Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics) | BA E-5200 | |
| NSG Mouse | Jackson Laboratory | JAX:005557 | |
| Povidone-Iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 |
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