Summary
La ligature partielle du nerf sciatique induit une douleur neuropathique chronique de longue durée, caractérisée par des réponses exagérées aux stimuli thermiques et mécaniques. Ce modèle murin de douleur neuropathique est couramment utilisé pour étudier des thérapies innovantes pour la gestion de la douleur. Cet article décrit en détail l’intervention chirurgicale pour améliorer la standardisation et la reproductibilité.
Abstract
La gestion de la douleur chronique reste difficile à ce jour, et les traitements actuels sont associés à des effets indésirables, y compris la tolérance et la dépendance. La douleur neuropathique chronique résulte de lésions ou de maladies du système somatosensoriel. Pour étudier les thérapies potentielles avec des effets secondaires réduits, les modèles de douleur animale sont l’étalon-or dans les études précliniques. Par conséquent, des modèles bien caractérisés et bien décrits sont cruciaux pour le développement et la validation de thérapies innovantes.
La ligature partielle du nerf sciatique (pSNL) est une procédure qui induit une douleur neuropathique chronique chez la souris, caractérisée par une hypersensibilité mécanique et thermique, une douleur continue et des changements de température des membres, ce qui fait de ce modèle un excellent choix pour étudier la douleur neuropathique de manière préclinique. pSNL est un modèle avantageux pour étudier la douleur neuropathique car il reproduit de nombreux symptômes observés chez les humains souffrant de douleur neuropathique. De plus, l’intervention chirurgicale est relativement rapide et simple à réaliser. Le pSNL unilatéral d’un membre permet de comparer les pattes ipsilatérales et controlatérales, ainsi que d’évaluer la sensibilisation centrale.
Pour induire une hypersensibilité neuropathique chronique, un fil de nylon non résorbable 9-0 est utilisé pour ligaturer le tiers dorsal du nerf sciatique. Cet article décrit l’intervention chirurgicale et caractérise le développement de la douleur neuropathique chronique grâce à de multiples tests comportementaux couramment utilisés. Alors qu’une pléthore de thérapies innovantes sont actuellement à l’étude pour traiter la douleur chronique, cet article fournit des concepts cruciaux pour la normalisation et une description précise des chirurgies nécessaires pour induire une douleur neuropathique.
Introduction
La douleur chronique est un problème de santé important à travers le monde et est l’un des problèmes de santé les plus coûteux aux États-Unis. La douleur chronique est mieux gérée lorsque les modalités pharmacologiques et non pharmacologiques sont utilisées de manière multidisciplinaire1. La prise en charge de la douleur chronique est difficile et, dans certains cas, ne traite pas adéquatement la douleur2. Par conséquent, des méthodes nouvelles et complémentaires sont nécessaires pour améliorer la gestion de la douleur chronique, et les modèles animaux sont cruciaux pour étudier des thérapies innovantes.
La douleur neuropathique chronique résulte de lésions ou de maladies du système somatosensoriel, notamment le diabète, les infections, les compressions nerveuses ou les maladies auto-immunes3. La douleur neuropathique repose à la fois sur des mécanismes de sensibilisation périphériques et centraux et provient d’une lésion des nerfs. Cette douleur peut être caractérisée par une hyperalgésie et une allodynie évoquées au toucher et thermiques, une douleur continue et des changements de température du membre affecté4. Pour mieux comprendre les mécanismes et faire progresser de nouveaux traitements, plusieurs modèles ont été développés chez les rongeurs pour imiter les symptômes et les causes de la douleur neuropathique5. Par exemple, la douleur neuropathique peut être induite par des injections d’agents chimiothérapeutiques, la ligature du nerf rachidien (SNL), une lésion de constriction chronique (CCI) du nerf sciatique, une pSNL, une lésion nerveuse épargnée, une transsection du nerf sciatique et une trisection6 du nerf sciatique. Notamment, la ligature du nerf sciatique reproduit de multiples caractéristiques de la douleur neuropathique observée chez l’homme, telles que l’hypersensibilité mécanique et thermique, ou les changements de température du membre affecté, caractéristiques du syndrome douloureux régional complexe (SDRC)7. Ainsi, ce modèle est bien adapté à l’étude du SDRC ou de toute autre affection de lésion nerveuse qui induit une douleur neuropathique chronique. Le modèle a été développé pour la première fois par Seltzer en 19908 et est largement utilisé dans les études sur la douleur pour étudier de nouveaux composés analgésiques ou évaluer les effets cognitifs de la douleur chronique 9,10,11,12,13. Le modèle présente une reproductibilité élevée, et la ligature partielle préserve les réponses comportementales aux stimuli périphériques6.
Bon nombre des modèles actuellement utilisés présentent des lacunes qui n’ont pas été observées dans le pSNL. Le modèle CCI présente une variabilité beaucoup plus élevée des blessures entre chaque animal en fonction de la finesse du constricteur, et l’autotomie modifie les doigts de la patte postérieure, rendant le modèle impropre à l’analyse comportementale6. Le modèle SNL est une chirurgie beaucoup plus compliquée et plus longue qui nécessite non seulement des compétences techniques avancées, mais comporte également un risque élevé de déficits moteurs sévères3. Ces lacunes ne sont pas observées dans le modèle pSNL. La facilité de reproductibilité, la courte durée de la chirurgie et le risque réduit de déficits moteurs observés en postopératoire rendent ce modèle précieux pour l’étude de la douleur neuropathique périphérique 8,14. Néanmoins, la procédure de ligature partielle elle-même peut avoir une variabilité entre les expérimentateurs, ce qui entraîne moins de cohérence dans le nombre de fibres nerveuses ligaturées. Ainsi, la présentation des détails de la chirurgie est cruciale pour augmenter la reproductibilité entre les études.
Pour induire une neuropathie chronique, une suture en nylon non résorbable 9-0 est utilisée pour ligaturer un tiers de la largeur du nerf sciatique. Après la chirurgie, les réponses aux stimuli thermiques et mécaniques sont exagérées, commençant au jour 1 postopératoire et durant plus de 50 jours8. Ici, les sensibilités thermiques et mécaniques ont été évaluées sur 28 jours à l’aide de Hargreaves, de plaques chauffantes et de tests de filament de von Frey. Tous les tests comportementaux ont démontré la cohérence de l’hypersensibilité de longue durée. Il a été démontré que ce modèle a des effets dose-dépendants de la morphine et de l’ibuprofène, ce qui confirme qu’il est bien adapté aux études précliniques sur la douleur. Cet article décrit notamment les instructions pour un outil en verre unique fait à la main, appelé « crochet en verre nerveux ». Cet outil est utilisé à la place des forceps pour manipuler le nerf et prévenir les lésions nerveuses supplémentaires involontaires pendant la chirurgie.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Arizona et sont conformes aux directives pour l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (publication NIH no. 80-23, 1966). Des souris C57Bl6/J adultes exemptes d’agents pathogènes (poids au test : 22-28 g) ont été logées dans des cages de souris vivarium standard (cinq souris par cage) dans des pièces climatisées selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures et ont été autorisées à accéder à de la nourriture et à de l’eau ad libitum. Toutes les expériences comportementales ont été menées par des expérimentateurs aveugles aux conditions de traitement.
1. Base de référence : la mesure de la sensibilité mécanique
- À l’arrivée des souris, laissez-les s’habituer à l’animalerie pendant 1 semaine. Ensuite, habituez les animaux à la manipulation expérimentale pendant ≥7 jours par la suite.
- Habituer les souris à l’appareil d’essai von Frey pendant 1 h avant le test en les plaçant dans des boîtes en plexiglas transparent, sur un treillis métallique, dans la même pièce que la salle d’essai, de préférence avec l’expérimentateur présent dans la pièce pendant l’accoutumance.
- Établir le seuil de retrait de la patte de base par la méthode « haut et bas » à l’aide des filaments de von Frey décrits dans le tableau supplémentaire S1, en commençant par le filament de 3,61 (3,9 mN).
- Mesurer la réponse de retrait au sondage de la patte postérieure médiane plantaire à l’aide d’une série de monofilaments fins calibrés (von Frey). Appliquer chaque filament perpendiculairement une fois sur la surface plantaire de la patte postérieure ipsilatérale pSNL des animaux détenus dans des cages en treillis métallique suspendu. Évaluer la sensibilité mécanique à l’aide de la méthode « haut et bas »15 : déterminer le seuil de retrait en augmentant ou en diminuant séquentiellement la force de stimulation, correspondant à la taille du filament. Appliquez séquentiellement chaque filament une fois.
NOTE: L’expérimentateur doit éviter de stimuler l’un des repose-pieds pour obtenir des résultats cohérents entre les animaux. - Par exemple, si l’animal ne répond pas au filament 3,61, utilisez le filament plus épais de 4,08 (9,8 mN) (une réponse est notée visuellement comme le retrait, la secousse ou le léchage de la patte affectée); si l’animal a répondu la première fois, utiliser le filament plus mince de 3,22 (1,6 mN). Continuer à utiliser des filaments de plus en plus épais selon que l’animal a eu des réponses ultérieures positives ou négatives, respectivement. Indiquez les réponses négatives et positives dans la fiche technique présentée dans le tableau supplémentaire S1. Testez la même patte 4x avec différents filaments après la première réponse positive.
- Mesurer la réponse de retrait au sondage de la patte postérieure médiane plantaire à l’aide d’une série de monofilaments fins calibrés (von Frey). Appliquer chaque filament perpendiculairement une fois sur la surface plantaire de la patte postérieure ipsilatérale pSNL des animaux détenus dans des cages en treillis métallique suspendu. Évaluer la sensibilité mécanique à l’aide de la méthode « haut et bas »15 : déterminer le seuil de retrait en augmentant ou en diminuant séquentiellement la force de stimulation, correspondant à la taille du filament. Appliquez séquentiellement chaque filament une fois.
2. Base de référence : la mesure de la sensibilité thermique à l’aide du test de Hargreaves
- À l’arrivée des souris, laissez-les s’habituer à l’animalerie pendant 1 semaine. Ensuite, habituez les animaux à la manipulation expérimentale pendant ≥7 jours par la suite.
- Habituer les souris à l’appareil de test Hargreaves pendant 1 h avant le test en les plaçant dans des boîtes en plexiglas transparent, dans la même pièce que la salle d’essai, de préférence avec l’expérimentateur présent dans la pièce pendant l’accoutumance.
REMARQUE: Le test Hargreaves exige que l’animal reste immobile pendant quelques secondes. Chez les souris, l’accoutumance est la clé d’une expérience réussie. Ainsi, si les souris restent très actives après 1 h d’accoutumance, laissez-les s’acclimater plus longtemps au besoin.- Déterminer les latences de retrait des pattes telles que décrites par Hargreaves et coll.16. Acclimatez les souris dans des enclos en plexiglas sur une plaque de plexiglas transparent.
- Concentrez une source de chaleur rayonnante (lampe de projecteur à haute intensité) sur la surface plantaire de la patte postérieure ipsilatérale au pSNL. Ajustez l’intensité de la source de chaleur pour obtenir une latence de retrait de la patte de base d’environ 10 s. Ensuite, maintenez l’intensité constante pour le reste de l’expérience.
- Attendez qu’un détecteur de mouvement arrête automatiquement le stimulus et la minuterie lorsque la patte est retirée. Utilisez un seuil maximal de 33,5 s pour éviter les lésions tissulaires.
NOTE: La coupure est déterminée sur la base d’expériences et d’articles antérieurs pour éviter tout dommage cutané supplémentaire11,17,18. Avec l’intensité utilisée dans cette étude, 33,5 est le seuil, correspondant à une intensité de stimulus de 30 (50 W) en utilisant l’appareil de Hargreaves. Le comportement observé est un comportement réflexe, pas volontaire. - Établir les latences de retrait de la patte de base à l’aide de l’appareil de Hargreaves et en visant la surface plantaire de la patte postérieure ipsilatérale du pSNL. Démarrez la stimulation thermique et enregistrez la latence de retrait. Pour éviter d’affecter la température du stimulus thermique, nettoyez toute urine pendant les essais.
3. Ligne de base: la mesure de la sensibilité thermique à l’aide de l’essai de la plaque chauffante
- Habituer les animaux à la salle d’essai pendant 1 h avant le test.
NOTE: Comme la température ambiante est importante et peut affecter les réponses à l’essai de la plaque chauffante, assurez-vous que la température de la pièce est constamment autour de 22 ° C pendant la période d’accoutumance et pendant la période d’essai. - Réglez la plaque chauffante à 52 °C, car il a été démontré que cette température provoque idéalement une réponse thermique aversive19.
- Placez l’animal dans la chambre d’essai et démarrez un chronomètre.
- Observez les comportements nocifensifs (c.-à-d. retrait des pattes, léchage, tremblements). Comme la chirurgie pSNL affecte le membre postérieur, ne tenez pas compte des comportements observés dans les membres antérieurs (en particulier le léchage des membres antérieurs).
- Arrêtez le chronomètre dès qu’un comportement nocifensif est observé.
- Retirez l’animal de la chambre et notez la latence de ce comportement.
REMARQUE: Retirez les animaux de la chambre après un maximum de 30 s pour éviter les dommages tissulaires. De plus, il est important de noter que le comportement observé est un comportement réflexe et non volontaire. - Nettoyez la chambre d’essai avec 70% d’éthanol entre les animaux pour réduire l’impact comportemental des odeurs. Pour éviter d’affecter la température du stimulus thermique, nettoyez l’appareil de toute urine entre chaque animal testé.
- Pour confirmer les résultats, enregistrer des vidéos des animaux dans la chambre de la plaque chauffante pendant les tests pour examen après que les animaux ont été testés.
REMARQUE: En utilisant la révision vidéo pour quantifier les latences, l’expérimentateur peut observer à plusieurs reprises le test et analyser de près les comportements nocifensifs qui ont pu être manqués lors de l’observation en temps réel.
4. Préparation préopératoire
REMARQUE: Assurez-vous que des cages propres sont disponibles pour récupérer les souris après la chirurgie. Nettoyez la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70 %, désinfectez les mains avec de l’éthanol à 70 %, utilisez des gants stériles, portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié (blouse de laboratoire, filet à cheveux, couvre-chaussures) et pratiquez des techniques stériles tout au long de la chirurgie.
- Préparer les outils (Figure supplémentaire S1) et les ressources supplémentaires (gaze) à utiliser en chirurgie en les autoclavant au préalable.
- Induire l’anesthésie à l’aide d’isoflurane volatil et ajuster au besoin pour maintenir un plan chirurgical. Assurez-vous que l’oxygène est à un débit approprié.
- Pour vous assurer que l’animal est anesthésié, pincez les orteils sur une patte postérieure avec une pince à épiler pour vous assurer de l’absence de réflexe de patte et vérifiez le réflexe de clignement cornéen avant d’appliquer une pommade ophtalmique lubrifiante.
REMARQUE: Les analgésiques ne peuvent pas être proposés dans cette étude car ils peuvent modifier la voie de la douleur destinée à être analysée ou même neutraliser et invalider le comportement mesuré conformément aux objectifs de recherche sur la douleur20,21,22. - Après avoir choisi de quel côté effectuer la chirurgie (à gauche est illustré ici), rasez la patte postérieure de l’animal autour de la région de la cuisse, vers l’arrière de la gauche, vers la rotule, au-dessus de la hanche et au-dessus du fémur. Essuyer 3x avec de la chlorhexidine dans une direction avec trois gazes séparées, alternées avec une solution saline stérile chaude.
REMARQUE: À l’avenir, assurez-vous que chaque animal subit la chirurgie du même côté pour maintenir la cohérence. - Glissez la jambe à travers une fente faite dans un champ stérile de 10 cm x 10 cm pour créer un champ stérile autour de la jambe de votre choix.
5. Intervention chirurgicale
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux fins (figure supplémentaire S1F), faites une petite coupe de 2 mm de la peau dans la ligne médiane de la face latérale de la cuisse. Faites glisser les ciseaux sous la peau dans un mouvement circulaire pour percer le fascia et créer un dégagement, en agrandissant l’espace d’incision.
- À l’aide d’une pince à attacher (figure supplémentaire S1H), créez une incision nette verticalement à un angle de 90° dans les muscles de la cuisse, à 1 cm de profondeur.
- Insérez les petits ciseaux fins (figure supplémentaire S1G) dans la même incision, également à un angle de 90°, et ouvrez-les doucement pour séparer les muscles. Continuez à le faire jusqu’à ce que le nerf sciatique soit visualisé.
- Localisez le nerf sciatique, qui peut sembler brillant et mince, parallèle à la cuisse verticale, dans la direction de la hanche au genou. Retirez les ciseaux et les pinces à attacher du corps avant de continuer.
- Utilisez la pince extra fine (figure supplémentaire S1D) et le crochet en verre nerveux (figure supplémentaire S1E) pour isoler le nerf du dessous. Libérez soigneusement le nerf des tissus conjonctifs environnants à un site près du trochanter du fémur, qui est le plus proche de la hanche et le plus éloigné du genou.
- Laissez le nerf reposer sur la tige de verre et assurez-vous que l’extrémité de la tige empêche le nerf de rouler.
- Placez un nœud chirurgical pour attacher 1/3 de la largeur du nerf sciatique à l’aide d’une suture en nylon 9-0, avant de le diviser en branches communes des nerfs péronier, tibial et sural3.
REMARQUE: La ramification se produit lorsque le nerf sciatique descend le long du genou, loin de la hanche. Étant donné que ces trois branches du nerf ont trois innervations différentes, il est impératif de placer le nœud chirurgical avant la ramification pour assurer les mêmes déficits nerveux dans toutes les chirurgies animales. - Prenez soin de tenir les fils près du nœud lorsque vous tirez les fils serrés, afin de ne pas tirer sur le nerf avec une force excessive pour éviter de faire glisser le nerf de la tige de verre et éviter d’autres blessures d’étirement.
- Glissez soigneusement le nerf de la tige de verre une fois le nœud terminé et remettez-le à l’emplacement d’origine au niveau inférieur aux muscles séparés.
- Suturer l’incision musculaire à l’aide d’une suture polyglycolique résorbable 5-0. Séparément, suturez la peau à l’aide d’une suture en polypropylène 6-0 non résorbable.
- Notez le temps d’arrêt de la chirurgie et de l’anesthésie. Laissez la souris se réveiller, seule dans une cage de récupération, avant de la remettre dans une nouvelle cage propre.
REMARQUE : Tout au long de la chirurgie, pincez les orteils de l’animal pour confirmer le maintien adéquat de l’anesthésie et surveillez sa respiration et sa perfusion corporelle (rouge, rose, pâle). Si la respiration est considérablement réduite ou si l’animal semble pâle, envisagez de réduire le débit d’anesthésie ou d’augmenter le débit d’oxygène et ayez une seringue remplie de solution saline prête à être injectée par voie sous-cutanée pour réhydrater l’animal. En tout temps, l’animal devrait avoir une source de chaleur placée en dessous pour maintenir la chaleur corporelle.
6. Procédure de chirurgie fictive pour les animaux témoins
- Suivre les étapes 5.1-5.11 de l’intervention chirurgicale; Exclure les étapes 5.4 à 5.9.
7. Tests comportementaux postchirurgicaux
REMARQUE: Assurez-vous que l’expérimentateur est aveugle à tout traitement. La douleur neuropathique chronique se développera plus de 2 semaines après la chirurgie, après quoi des tests comportementaux peuvent être effectués après l’administration de composés d’intérêt.
- Utilisez le test de von Frey, Hargreaves ou la plaque chauffante pour évaluer l’hypersensibilité thermique et mécanique et son inversion potentielle.
- Retirer un animal de l’étude s’il répond aux critères d’évaluation décrits par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux.
- Euthanasier les animaux en suivant les procédures décrites par le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’établissement à la fin des tests comportementaux.
8. Analyse des données
- von Frey:
- Analyser les données en utilisant la méthode non paramétrique de Dixon, telle que décrite par Chaplan et ses collègues23, et exprimer les données comme le seuil de retrait moyen.
- Sur la page principale du logiciel référencé (voir Tableau des matériaux), sélectionnez tous les filaments utilisés pour l’étude (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 et 4.56). Dans le panneau de groupe , sélectionnez le filament correspondant à la dernière simulation. Dans la case vide , indiquez les réponses positives (X) et négatives (o). Notez les seuils indiqués dans l’encadré à gauche du modèle de réponses observé.
NOTE: Un exemple de modèle et de quantification est présenté à la figure supplémentaire S2.
- Sur la page principale du logiciel référencé (voir Tableau des matériaux), sélectionnez tous les filaments utilisés pour l’étude (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 et 4.56). Dans le panneau de groupe , sélectionnez le filament correspondant à la dernière simulation. Dans la case vide , indiquez les réponses positives (X) et négatives (o). Notez les seuils indiqués dans l’encadré à gauche du modèle de réponses observé.
- Analyser les données en utilisant la méthode non paramétrique de Dixon, telle que décrite par Chaplan et ses collègues23, et exprimer les données comme le seuil de retrait moyen.
- Hargreaves et plaque chauffante:
- Signalez les latences dans une feuille de calcul pour une analyse statistique plus approfondie.
- Tracer les résultats comme la moyenne des sensibilités (seuils ou latences) en fonction du temps.
9. Instructions sur la façon de fabriquer le crochet en verre nerveux
REMARQUE : Pratiquez la sécurité incendie tout au long de ce processus. Portez une protection adéquate, comme des gants résistants à la chaleur ou des lunettes au besoin.
- Allumez le brûleur Bunsen.
- Tenez une extrémité de la tige de verre (A) au feu dans une main. Au fur et à mesure que cette tige de verre fond, utilisez une autre tige de verre (B) dans l’autre main pour guider et tirer sur le verre fondu sur la tige A. Retirez la tige de verre A du feu et laissez l’extrémité de la partie fondue rouler naturellement vers l’intérieur pour former une petite forme de boule. Utilisez la tige de verre B pour guider cette forme.
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Representative Results
La douleur neuropathique chronique a été induite par ligature partielle du nerf sciatique de souris mâles C57Bl6/J (Figure 1A). La sensibilité mécanique a été évaluée à l’aide de filaments de von Frey et de la méthode « up-and-down ». La sensibilité thermique à la chaleur a été évaluée à l’aide des essais Hargreaves et sur plaque chauffante. Toutes les données ont été analysées avec une ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées avec correction de Geisser-Greenhouse pour comparer l’effet de la chirurgie pSNL sur les animaux simulés au fil du temps ou les effets de différentes doses de morphine et d’ibuprofène.
Les souris qui ont subi une chirurgie pSNL ont démontré des seuils de stimuli mécaniques inférieurs à ceux des animaux fictifs pendant 28 jours (Figure 1B). Des résultats similaires ont été obtenus avec l’évaluation de l’hypersensibilité thermique; les latences de retrait des pattes après exposition à un stimulus thermique radiant ont augmenté chez les animaux de pSNL (figure 1C), ainsi que les latences de retrait lorsque les animaux ont été placés sur une plaque à 52 °C (figure 1D).
Suite à la mise en place de douleurs neuropathiques chroniques, 14 jours après la chirurgie, nous avons évalué les effets antinociceptifs de différentes doses de morphine ou d’ibuprofène. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale avec une solution saline ou deux doses différentes de morphine (1 et 5 mg / kg). Les deux groupes injectés de morphine ont montré une inversion de l’hypersensibilité induite par le pSNL, qui a duré de 1 (1 mg/kg) à 2 h (5 mg/kg) (Figure 2A). L’hypersensibilité mécanique est revenue à la ligne de base 4 h après l’injection de morphine. Lorsque deux doses différentes d’ibuprofène (10 et 30 mg/kg) ont été administrées par voie intrapéritonéale aux souris, les résultats ont démontré une diminution de l’hypersensibilité mécanique par rapport aux souris injectées par une solution saline (Figure 2B). Les effets antinociceptifs de l’ibuprofène ont duré jusqu’à 2 h. Dans l’ensemble, les résultats ont démontré que la chirurgie pSNL induit une douleur neuropathique chronique de longue durée. De plus, nous avons pu démontrer que ce modèle est sensible à différentes doses d’analgésiques.
Figure 1 : Hypersensibilité thermique et mécanique de longue durée chez la souris due à une ligature partielle du nerf sciatique. La sensibilité thermique à la chaleur (test de Hargreaves et de plaque chauffante) et la sensibilité mécanique aux filaments de von Frey ont été évaluées pour examiner l’induction et la persistance de l’hypersensibilité dans un modèle de douleur neuropathique chronique (pSNL). Les valeurs initiales ont été mesurées avant la ligature du nerf sciatique et l’hypersensibilité a été évaluée plus de 28 jours après la chirurgie. (A) L’illustration représente la ligature partielle du nerf sciatique. (B) Les seuils de retrait mécanique ont été comparés entre les souris simulées et les souris pSNL à chaque point temporel. Des mesures répétées d’ANOVA bidirectionnelle avec correction de Geisser-Greenhouse ont révélé un effet significatif du pSNL (F(1, 10) = 222,3, p < 0,0001, n = 5-7 par condition). Le test de comparaisons multiples de Sidak a démontré une augmentation significative de l’hypersensibilité entre les jours 1 et 28 (p < 0,05). (C) Les latences de retrait thermique, mesurées par le test Hargreaves, ont été comparées entre des souris simulées et des souris pSNL. Des mesures répétées d’ANOVA bidirectionnelle avec correction de Geisser-Greenhouse ont révélé un effet significatif du pSNL (F(1, 8) = 113,8; p < 0,0001, n = 4-6 par condition). Le test de comparaisons multiples de Sidak a démontré une augmentation significative de l’hypersensibilité aux jours 2 et 14 (p < 0,05). (D) Les latences de retrait thermique, mesurées par l’essai de la plaque chauffante, ont été comparées entre des souris fictives et des souris pSNL. L’ANOVA bidirectionnelle ordinaire a révélé un effet significatif du pSNL (F(1, 32) = 19,10, p = 0,0001, n = 4-6 par condition). Le test de comparaisons multiples de Sidak a démontré une sensibilité significativement accrue à la chaleur 4 semaines après la chirurgie pSNL (p = 0,0026). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± S.E.M. Abréviations : pSNL = ligature partielle du nerf sciatique; BL = base de référence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Inversion dose-dépendante de l’hypersensibilité mécanique induite par pSNL par injection intrapéritonéale de morphine ou d’ibuprofène. L’hypersensibilité mécanique (à l’aide de filaments de von Frey) a été évaluée pour examiner les effets antinociceptifs potentiels de la morphine ou de l’ibuprofène dans un modèle murin de pSNL. Les valeurs initiales (pré-pSNL) ont été acquises avant la ligature du nerf sciatique. Après l’établissement de la douleur neuropathique chronique, le jour 14, les animaux ont été inclus une deuxième fois pour assurer une hypersensibilité induite par le pSNL (post-pSNL). Ensuite, deux doses de morphine (1/5 mg/kg) ou d’ibuprofène (10/30 mg/kg) ont été injectées par voie intrapéritonéale. L’inversion potentielle de l’hypersensibilité mécanique a été évaluée dans les 4 heures suivant les injections. (A) Les seuils de sevrage mécanique ont été comparés entre la solution saline et les deux doses de morphine. Des mesures répétées d’ANOVA bidirectionnelle avec correction de Geisser-Greenhouse ont révélé un effet significatif de 1 mg/kg de morphine (F(1, 11) = 11,16, p = 0,0066, n = 6-7 par condition) et un effet significatif de 5 mg/kg de morphine (F(1, 10) = 21,78, p = 0,0009, n = 6 par affection). Le test de comparaisons multiples de Sidak a démontré une diminution significative de l’hypersensibilité mécanique 1 h après l’injection pour les deux doses, mais seulement un effet significatif pour l’état de 5 mg / kg à 2 h (* p < 0,05). (B) Les seuils de retrait mécanique ont été comparés entre l’état saline et les deux doses d’ibuprofène. Des mesures répétées d’ANOVA bidirectionnelle avec correction Geisser-Greenhouse ont révélé un effet significatif de 10 mg/kg d’iburofène (F(1, 11) = 7,788, p = 0,0176, n = 6-7 par affection) et un effet significatif de 30 mg/kg d’ibuprofène (F(1, 10) = 18,79, p = 0,0015, n = 6 par affection). Le test de comparaisons multiples de Sidak a démontré une diminution significative de l’hypersensibilité mécanique 1 et 2 h après l’injection pour les deux doses (*p < 0,05). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± S.E.M. Abréviations : pSNL = ligature partielle du nerf sciatique; IP = intrapéritonéale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Outils chirurgicaux. Les deux images illustrent les différents outils utilisés pour la chirurgie. A) Porte-aiguille Castroviejo fin; B) porte-aiguille Castroviejo; C) Pinces Micro Adson; D) pinces Graefe extra-fines; E) crochet en verre nerveux; F) ciseaux fins (11,5 cm); G) ciseaux fins (9 cm); H) pinces attachantes; (I) pinces à iris. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Modèle représentatif des réponses de retrait des pattes mesurées par l’essai du filament de von Frey. Pour cet essai, la souris n’a pas répondu aux trois premières stimulations mais a retiré sa patte sur la quatrième stimulation avec le filament 4.56. Après une réponse positive (x), un filament plus mince a été utilisé (4,31), suivi de filaments de plus petite taille jusqu’à ce que la souris ne réponde pas à un autre filament (dans ce cas, 4,08). L’expérimentateur doit diminuer la taille des filaments, un par un, jusqu’à l’absence de réponse (o). Suite à une absence de réponse, l’expérimentateur a utilisé un filament plus épais jusqu’à obtenir une réponse positive et a diminué sa taille suite à la réponse positive (obtenue ici avec le filament 4.31). Quatre stimuli ont été menés après la première réponse positive; le schéma chronologique de chaque stimulation est annoté avec des chiffres en rouge dans le panneau A. Dans ce cas, les filaments 2.44 à 3.22 n’ont jamais été utilisés car l’animal n’a pas montré de réponse positive avec le filament 3.61. (B) Le modèle de réponses a ensuite été rempli dans le logiciel Allodynia, rapporté dans le même ordre que les filaments ont été appliqués (000xx0x0), dans la case surlignée en blanc. Le seuil résultant a ensuite été calculé par le logiciel (2,60839). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S1: Feuille de collecte des données pour les essais de von Frey. Ce tableau permet aux expérimentateurs de remplir des modèles de réponses lors de l’utilisation de filaments de von Frey. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le traitement de la douleur chronique nécessite souvent des médicaments à long terme, ce qui rend la gestion de la douleur difficile. Ainsi, les modèles précliniques sont un outil essentiel pour évaluer les bénéfices potentiels de thérapies innovantes reposant sur des approches pharmacologiques ou non pharmacologiques. Les nombreux modèles de douleur neuropathique chronique posent des défis en raison de la variabilité accrue des techniques chirurgicales entre les différents chercheurs, ce qui réduit la reproductibilité. Ainsi, il est essentiel de caractériser les effets antinociceptifs potentiels des nouvelles thérapies dans de multiples modèles bien caractérisés et standardisés.
Ce rapport démontre que la ligature partielle du nerf sciatique entraîne le développement d’une douleur neuropathique chronique de longue durée chez la souris en utilisant des méthodes relativement peu coûteuses. Le pSNL exagère les réponses aux stimuli thermiques et mécaniques, et le modèle répond à l’administration d’analgésiques couramment utilisés de manière dose-dépendante. Par conséquent, le modèle pSNL semble être un modèle pratique et sensible pour évaluer les avantages potentiels des nouveaux médicaments. Les principales caractéristiques de la douleur neuropathique sont l’hyperalgésie et l’allodynie. Ce rapport démontre comment l’allodynie mécanique et l’hyperalgésie thermique sont affectées. Cependant, l’hyperalgésie mécanique n’a pas été mesurée. Il existe une grande zone grise de chevauchement entre l’allodynie et l’hyperalgésie. Les deux sensations relèvent de l’hypersensibilité générale à un stimulus sensoriel24. Ainsi, la sensation stimulée pourrait être perçue comme une autre sensation, telle que la chaleur comme douleur froide ou le toucher comme sensation de brûlure. Par conséquent, l’hyperalgésie et l’allodynie sont souvent difficiles à distinguer, en particulier chez les modèles de douleur animale.
Le modèle pSNL a été utilisé dans de multiples études sur la douleur chronique pour évaluer l’effet des composés analgésiques, les mécanismes sous-jacents de la douleur chronique ou même l’impact cognitif de la douleur neuropathique de longue durée. La persistance de l’hypersensibilité mécanique jusqu’à 70 jours permet l’étude des effets à long terme des nouveaux médicaments25. Il est important de noter que la période optimale pour les tests comportementaux englobe les première, deuxième et troisième semaines suivant la chirurgie, une fois que la douleur chronique est établie 8,11,26,27. Pour évaluer la puissance et l’efficacité d’un médicament ou d’un traitement non pharmacologique, des traitements témoins positifs tels que la morphine ou l’ibuprofène doivent être envisagés, selon la conception expérimentale. Contrairement au test de la queue, le test de la plaque chauffante applique un stimulus à la patte qui intègre les voies supravertébrales19. Le test de la plaque chauffante a été largement utilisé pour caractériser les propriétés antinociceptives des médicaments dans des modèles de douleur neuropathique chronique dans des études récentes 19,28,29,30,31,32,33.
Ce modèle a été utilisé pour caractériser de nouveaux traitements non opioïdes et identifier une nouvelle voie de la douleur impliquant le récepteur de la neurotensine de type 211,13. Il a également été utilisé pour démontrer l’implication des modulations glycinergiques dans la douleur chronique12 et le développement de nouvelles thérapies et voies à l’intersection du sommeil et de la douleur10. Néanmoins, à ce jour, aucun article n’a présenté une explication détaillée de la chirurgie complétée par une vidéo descriptive.
Une critique courante du pSNL et des modèles similaires est la fiabilité de la cohérence du degré de dommages causés par la lésion nerveuse neuropathique chez les animaux6. Cet article décrit une procédure permettant de fondre et de mouler manuellement une tige de verre pour créer un crochet en verre nerveux spécial pour résoudre ce problème. La plupart des chirurgies animales utilisent des forceps pour ramasser les nerfs fins ou les vaisseaux. L’outil de crochet en verre nerveux permet une méthode plus sûre et moins sujette aux blessures pour manipuler le nerf. Bien que le but de ce modèle soit de créer une lésion nerveuse, il est prudent d’éviter des dommages supplémentaires au nerf autres que ceux causés par la suture placée à travers un tiers de la largeur du nerf sciatique. Le crochet en verre nerveux est une surface lisse et non dommageable sur laquelle le nerf peut reposer; De plus, la balle / crochet à l’extrémité permet une facilité de ramassage et de stabilisation. De plus, lors de la suture du nerf, la technique décrite ci-dessus (note 5.7 de la section protocolaire) recommande de maintenir les fils profondément à l’intérieur de la cavité corporelle, le plus près de l’endroit où le nœud apparaîtra. Cela évite de tirer à l’extrémité des sutures et favorise l’application d’une tension sur la suture la plus proche du nerf lors du resserrement du nœud. Cette technique prévient une lésion d’étirement supplémentaire si le nerf devait être retiré par inadvertance du crochet en verre nerveux, vers l’extérieur de la cavité en train de nouer le nœud plus serré. Un avantage supplémentaire est l’utilisation de ciseaux fins pour effectuer la coupe initiale. Cela permet un site d’incision beaucoup plus petit et donc une guérison plus rapide, par opposition aux coupes plus grandes faites avec des lames de scalpel.
Les méthodes décrites dans cet article présentent également certaines limites. Le développement de la douleur chronique dans le modèle pSNL est affecté par le sexe des animaux34. Par conséquent, il est essentiel que les études de recherche incluent les deux sexes dans leur analyse. Le but de ce rapport était de se concentrer sur une intervention chirurgicale et n’a pas caractérisé le dimorphisme sexuel du modèle de douleur. Il convient de mentionner que les mesures de sensibilité thermique chez la souris à l’aide du test Hargreaves sont difficiles; Les animaux doivent rester immobiles dans un petit enclos pendant quelques secondes pendant que le stimulus est appliqué. Ainsi, habituer les souris à l’enceinte en plexiglas est un facteur clé pour obtenir des résultats positifs. La mesure de la douleur évoquée nécessite également une formation minutieuse des expérimentateurs. Des tests comportementaux évoqués et spontanés sont recommandés pour évaluer la sensibilité thermique et mécanique, ainsi que la fonctionnalité du membre. De plus, dans cette étude, la morphine et l’ibuprofène ont été utilisés comme témoins positifs pour l’effet antinociceptif. Ces deux médicaments ont été choisis car ils sont couramment utilisés comme témoins positifs dans plusieurs modèles de douleur et permettent une meilleure comparaison entre les différents modèles. Néanmoins, il est important de mentionner que la prégabaline et la gabapentine sont souvent prescrites pour traiter la douleur neuropathique, et les études axées sur la gestion de la douleur neuropathique devraient inclure ces médicaments comme témoins positifs.
Ce rapport décrit avec précision une chirurgie couramment utilisée pour l’étude de la douleur neuropathique chronique. Permettre aux chercheurs et aux stagiaires de bénéficier d’une description visuelle de ce modèle murin facilitera le développement de projets de recherche axés sur la compréhension des mécanismes de la douleur chronique ou visant la caractérisation de thérapies innovantes. De plus, l’utilisation de modèles de douleur multiples est essentielle pour améliorer la reproductibilité, et ce rapport facilitera la mise en œuvre du modèle pSNL dans les nouveaux laboratoires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler. Aucun des auteurs du manuscrit n’a reçu de rémunération, de remboursement ou d’honoraires de quelque manière que ce soit. Les auteurs ne sont affiliés à aucun fournisseur ou société pharmaceutique associé à cette étude.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le National Center for Complementary and Integrative Health [R01AT009716, 2017] (M.M.I.), le Comprehensive Chronic Pain and Addiction Center-University of Arizona (M.M.I.) et le Medical Scientist Training Program (MSTP) de l’Université de l’Arizona, College of Medicine, Tucson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5/0, FS-2, 30" Undyed PGA Braided Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Suture | CP Medical | 421A | https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ |
| 6/0, P-1, 18" Blue Polypropylene Monofilament Non-Absorbable Suture | CP Medical | 8697P | https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ |
| 9/0 (0.3 metric) Nylon Black Monofilament Suture | Crestpoint Ophthalmics | MANI 1407 | https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html |
| Allodynia Software | National Instruments, LabView 2015 | Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data) | |
| C57Bl6/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Castroviejo needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14 |
| Cold Hot Plate Test | Bioseb | BIO-CHP | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html |
| Elevated metal mesh stand for Von Frey | Bioseb | BIO-STD2-EVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html |
| Extra fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110 |
| Fine Castroviejo needle holder | Simovision/Geuder | 17565 | https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf |
| Fine scissors (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14558-11 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11 |
| Fine scissors (9 cm) | Fine Science Tools | 14558-09 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09 |
| Iris forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07 |
| Micro Adson forceps | Fine Science Tools | 392487 | https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps |
| Modular holder cages for rats and mice | Bioseb | BIO-PVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html |
| Moretti/Effetre #240 Light Cobalt Blue glass rods 4 mm | Ebay | N/A | https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIzBYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA |
| Plantar Test for Thermal Stimulation - Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37570 | https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation |
| Touch-Test Sensory Evaluators, Set of 20 Monofilaments | North Coast Medical | NC12775-99 | https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html |
| Tying forceps | Duckworth & Kent | 2-504ER8 | https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/ |
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