Summary
Частичная перевязка седалищного нерва вызывает длительную хроническую невропатическую боль, характеризующуюся преувеличенной реакцией на тепловые и механические раздражители. Эта мышиная модель нейропатической боли обычно используется для изучения инновационных методов лечения боли. В этой статье подробно описывается хирургическая процедура для улучшения стандартизации и воспроизводимости.
Abstract
Лечение хронической боли остается сложной задачей и по сей день, и современные методы лечения связаны с побочными эффектами, включая толерантность и зависимость. Хроническая невропатическая боль возникает в результате поражений или заболеваний соматосенсорной системы. Для изучения потенциальных методов лечения с уменьшением побочных эффектов модели боли животных являются золотым стандартом в доклинических исследованиях. Таким образом, хорошо охарактеризованные и хорошо описанные модели имеют решающее значение для разработки и валидации инновационных методов лечения.
Частичное лигирование седалищного нерва (pSNL) - это процедура, которая вызывает хроническую невропатическую боль у мышей, характеризующуюся механической и термической гиперчувствительностью, постоянной болью и изменениями температуры конечностей, что делает эту модель отлично подходящей для доклинического изучения нейропатической боли. pSNL является выгодной моделью для изучения нейропатической боли, поскольку она воспроизводит многие симптомы, наблюдаемые у людей с нейропатической болью. Кроме того, хирургическая процедура относительно быстрая и простая в выполнении. Односторонняя pSNL одной конечности позволяет сравнивать ипсилатеральные и контралатеральные лапы, а также оценивать центральную сенсибилизацию.
Чтобы вызвать хроническую невропатическую гиперчувствительность, нерассасывающаяся нейлоновая нить 9-0 используется для перевязки дорсальной трети седалищного нерва. В этой статье описывается хирургическая процедура и описывается развитие хронической нейропатической боли с помощью нескольких широко используемых поведенческих тестов. Поскольку в настоящее время исследуется множество инновационных методов лечения хронической боли, в этой статье представлены важные концепции для стандартизации и точного описания операций, необходимых для вызывания нейропатической боли.
Introduction
Хроническая боль является серьезной проблемой здравоохранения во всем мире и является одной из самых дорогостоящих проблем со здоровьем в Соединенных Штатах. Хроническая боль лучше лечится, когда как фармакологические, так и нефармакологические методы используются междисциплинарным образом1. Лечение хронической боли является сложной задачей и, в некоторых случаях, не позволяет адекватно лечить боль2. Поэтому необходимы новые и взаимодополняющие методы для улучшения лечения хронической боли, а животные модели имеют решающее значение для исследования инновационных методов лечения.
Хроническая невропатическая боль возникает в результате поражений или заболеваний соматосенсорной системы, включая диабет, инфекции, сдавливание нервов или аутоиммунные заболевания3. Невропатическая боль зависит как от периферических, так и от центральных механизмов сенсибилизации и возникает из-за поражения нервов. Эта боль может характеризоваться как сенсорной, так и термической гипералгезией и аллодинией, продолжающейся болью и изменениями температуры пораженной конечности4. Чтобы лучше понять механизмы и продвинуть новые методы лечения, на грызунах было разработано несколько моделей, имитирующих симптомы и причины нейропатической боли5. Например, невропатическая боль может быть вызвана инъекциями химиотерапевтического агента, перевязкой спинномозгового нерва (SNL), хроническим сужением (CCI) седалищного нерва, pSNL, повреждением щадящего нерва, пересечением седалищного нерва и трисекцией6 седалищного нерва. Примечательно, что перевязка седалищного нерва воспроизводит множественные признаки нейропатической боли, наблюдаемой у человека, такие как механическая и термическая гиперчувствительность или изменения температуры пораженной конечности, характерные для комплексного регионарного болевого синдрома (КРБС)7. Таким образом, эта модель хорошо подходит для изучения КРБС или любых других повреждений нервов, которые вызывают хроническую невропатическую боль. Модель была впервые разработана Зельцером в 1990 году8 и широко используется в исследованиях боли для изучения новых анальгетических соединений или оценки когнитивных эффектов хронической боли 9,10,11,12,13. Модель демонстрирует высокую воспроизводимость, а частичное лигирование сохраняет поведенческие реакции на периферические стимулы6.
Многие из используемых в настоящее время моделей имеют недостатки, не наблюдаемые в pSNL. Модель CCI имеет гораздо более высокую вариабельность травм между каждым животным в зависимости от плотности констриктора, а аутотомия изменяет пальцы задней лапы, что делает модель непригодной для поведенческого анализа6. Модель SNL представляет собой гораздо более сложную и длительную операцию, которая не только требует передовых технических навыков, но и сопряжена с высоким риском тяжелого двигательного дефицита3. Эти недостатки не видны в модели pSNL. Легкость воспроизводимости, короткая продолжительность операции и снижение риска двигательного дефицита, наблюдаемого после операции, делают эту модель ценной для изучения периферической нейропатической боли 8,14. Тем не менее, сама процедура частичной лигировки может иметь вариабельность между экспериментаторами, что приводит к меньшей согласованности в количестве перевязанных нервных волокон. Таким образом, представление деталей операции имеет решающее значение для повышения воспроизводимости исследований.
Чтобы вызвать хроническую невропатию, используется нерассасывающийся нейлоновый шов 9-0 для перевязки трети ширины седалищного нерва. После операции реакция на тепловые и механические раздражители преувеличена, начиная с 1-го дня после операции и продолжаясь более 50 дней8. Здесь в течение 28 дней оценивали как термическую, так и механическую чувствительность с использованием тестов Харгривза, горячей плиты и нити накаливания фон Фрея. Все поведенческие анализы продемонстрировали постоянство длительной гиперчувствительности. Было показано, что эта модель обладает дозозависимыми эффектами как морфина, так и ибупрофена, что подтверждает, что она хорошо подходит для доклинических исследований боли. Примечательно, что в этой статье описывается инструкция к уникальному стеклянному инструменту ручной работы, называемому «нервным стеклянным крючком». Этот инструмент используется вместо щипцов для манипулирования нервом и предотвращения непреднамеренного дополнительного повреждения нерва во время операции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Аризоны и соответствуют рекомендациям по использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (публикация NIH No 80-23, 1966 г.). Взрослые мыши C57Bl6/J без патогенов (вес при тестировании: 22-28 г) были размещены в стандартных клетках для мышей вивария (пять мышей в клетке) в помещениях с контролируемым климатом в течение 12-часового цикла свет/темнота, и им был разрешен доступ к пище и воде ad libitum. Все поведенческие эксперименты проводились экспериментаторами, слепыми к условиям лечения.
1. Базовый уровень: мера механической чувствительности
- По прибытии мышей дайте им привыкнуть к животноводческому комплексу в течение 1 недели. Затем приучайте животных к работе с экспериментатором в течение ≥7 дней после этого.
- Приучайте мышей к испытательному аппарату фон Фрея в течение 1 часа перед тестированием, поместив их в прозрачные коробки из оргстекла на проволочной сетке в той же комнате, что и комната для тестирования, предпочтительно с экспериментатором, присутствующим в комнате во время привыкания.
- Установите исходный порог вывода лап с помощью метода «вверх-вниз» с использованием нитей фон Фрея, описанных в дополнительной таблице S1, начиная с нити 3,61 (3,9 мН).
- Измерьте реакцию на прощупывание средне-подошвенной задней лапы серией калиброванных тонких (фон Фрея) мононитей. Нанесите каждую нить перпендикулярно один раз на подошвенную поверхность ипсилатеральной задней лапы pSNL животных, содержащихся в подвешенных клетках из проволочной сетки. Оцените механическую чувствительность с помощью метода «вверх-вниз»15: определите порог снятия путем последовательного увеличения или уменьшения силы стимула, соответствующей размеру нити. Последовательно наносите каждую нить по одному разу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментатор должен избегать стимуляции каких-либо подушечек ног для получения стабильных результатов между животными. - Например, если животное не реагирует на нить 3,61, используйте более толстую нить 4,08 (9,8 мН) (реакция визуально отмечается как оттягивание, встряхивание или облизывание пораженной лапы); если животное ответило в первый раз, используйте более тонкую нить 3,22 (1,6 мН). Продолжайте использовать либо уменьшающиеся, либо все более толстые нити в зависимости от того, были ли у животного положительные или отрицательные последующие реакции соответственно. Сообщайте об отрицательных и положительных ответах в техническом описании, представленном в дополнительной таблице S1. Протестируйте одну и ту же лапу 4x с разными нитями после первого положительного ответа.
- Измерьте реакцию на прощупывание средне-подошвенной задней лапы серией калиброванных тонких (фон Фрея) мононитей. Нанесите каждую нить перпендикулярно один раз на подошвенную поверхность ипсилатеральной задней лапы pSNL животных, содержащихся в подвешенных клетках из проволочной сетки. Оцените механическую чувствительность с помощью метода «вверх-вниз»15: определите порог снятия путем последовательного увеличения или уменьшения силы стимула, соответствующей размеру нити. Последовательно наносите каждую нить по одному разу.
2. Базовый уровень: мера тепловой чувствительности с использованием теста Харгривза
- По прибытии мышей дайте им привыкнуть к животноводческому комплексу в течение 1 недели. Затем приучайте животных к работе с экспериментатором в течение ≥7 дней после этого.
- Приучайте мышей к испытательному аппарату Харгривза в течение 1 часа перед тестированием, поместив их в прозрачные коробки из плексигласа в той же комнате, что и комната для тестирования, предпочтительно с экспериментатором, присутствующим в комнате во время привыкания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест Харгривза требует, чтобы животное стояло неподвижно в течение нескольких секунд. У мышей привыкание является ключом к успешному эксперименту. Таким образом, если мыши остаются очень активными после 1 часа привыкания, позвольте им акклиматизироваться дольше по мере необходимости.- Определите задержки отведения лап, как описано Hargreaves et al.16. Акклиматизируйте мышей в корпусах из плексигласа на прозрачной пластине из плексигласа.
- Сфокусируйте лучистый источник тепла (лампу проектора высокой интенсивности) на подошвенной поверхности задней лапы ипсилалатерально по отношению к pSNL. Отрегулируйте интенсивность источника тепла, чтобы получить базовую задержку отрыва лапы примерно 10 с. Затем поддерживайте интенсивность постоянной до конца эксперимента.
- Подождите, пока датчик движения автоматически остановит стимул и таймер при отводе лапы. Используйте максимальное отсечку 33,5 с, чтобы предотвратить повреждение тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порог определяется на основе предыдущих экспериментов и статей, чтобы избежать каких-либо дополнительных повреждений кожи11,17,18. При интенсивности, используемой в этом исследовании, 33,5 является пороговым значением, соответствующим интенсивности стимула 30 (50 Вт) с использованием аппарата Харгривза. Наблюдаемое поведение является рефлекторным, а не произвольным. - Установите исходные задержки вывода лапы, используя аппарат Харгривза и нацеливаясь на подошвенную поверхность ипсилатеральной задней лапы pSNL. Начните тепловую стимуляцию и запишите задержку вывода. Чтобы избежать влияния на температуру теплового стимула, очистите мочу во время испытаний.
3. Базовый уровень: измерение тепловой чувствительности с использованием теста на нагревательную плиту
- Приучайте животных к комнате для тестирования за 1 час до тестирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку комнатная температура важна и может повлиять на реакцию на испытание с помощью горячей плиты, убедитесь, что температура в помещении постоянно составляет около 22 °C в течение периода привыкания и в течение всего периода тестирования. - Установите конфорку на 52 °C, так как эта температура, как было показано, в идеале вызывает неприятную тепловую реакцию19.
- Поместите животное в испытательную камеру и запустите хронометр.
- Наблюдайте за ноцифенсивным поведением (например, отдергиванием лап, облизыванием, встряхиванием). Поскольку операция pSNL затрагивает задние конечности, не обращайте внимания на любое поведение, наблюдаемое в передних конечностях (особенно облизывание передних конечностей).
- Остановите хронометр, как только будет замечено ноцифенсивное поведение.
- Извлеките животное из камеры и запишите задержку этого поведения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вынимайте животных из камеры максимум через 30 секунд, чтобы предотвратить повреждение тканей. Кроме того, важно отметить, что наблюдаемое поведение является рефлекторным, а не добровольным. - Очистите испытательную камеру 70% этанолом между животными, чтобы уменьшить поведенческое воздействие запахов. Чтобы избежать влияния на температуру теплового стимула, очистите аппарат от мочи между каждым испытуемым животным.
- Чтобы подтвердить результаты, запишите видео животных в камере с горячей плитой во время тестирования для просмотра после того, как животные были протестированы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя видеообзор для количественной оценки задержек, экспериментатор может многократно наблюдать за тестом и внимательно анализировать ноцифенсивное поведение, которое могло быть пропущено во время наблюдения в реальном времени.
4. Предоперационная подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте наличие чистых клеток для восстановления мышей после операции. Очистите операционную область 70% этанолом, продезинфицируйте руки 70% этанолом, используйте стерильные перчатки, носите надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) (лабораторный халат, сетка для волос, бахилы) и практикуйте стерильные методы на протяжении всей операции.
- Подготовьте инструменты (дополнительный рисунок S1) и дополнительные ресурсы (марля) для использования в хирургии, предварительно автоклавировав их.
- Индуцируйте анестезию с помощью летучего изофлурана и отрегулируйте по мере необходимости для поддержания хирургической плоскости. Убедитесь, что кислород имеет соответствующую скорость потока.
- Чтобы убедиться, что животное обезболито, защипните пинцетом пальцы на задней лапе, чтобы убедиться в отсутствии лапного рефлекса, и проверьте рефлекс моргания роговицы перед нанесением смазывающей офтальмологической мази.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анальгетики не могут быть предложены в этом исследовании, поскольку они могут изменить путь боли, предназначенный для анализа, или даже нейтрализовать и аннулировать поведение, измеряемое в соответствии с целями исследования боли20,21,22. - Выбрав, с какой стороны проводить операцию (слева показано здесь), побрейте заднюю ногу животного вокруг области бедра, ниже по направлению к коленной чашечке, вверху к бедру и выше бедренной кости. Протрите 3х хлоргексидином в одном направлении тремя отдельными марлями, чередуя с теплым стерильным физиологическим раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дальнейшем убедитесь, что каждое животное проходит операцию на одной стороне, чтобы сохранить последовательность. - Просуньте ногу через прорезь, сделанную в стерильной драпировке размером 10 см x 10 см, чтобы создать стерильное поле вокруг выбранной ноги.
5. Хирургическое вмешательство
- Используя тонкие хирургические ножницы (дополнительный рисунок S1F), сделайте небольшой разрез кожи толщиной 2 мм по средней линии боковой стороны бедра. Проведите ножницами под кожу круговыми движениями, чтобы пробить фасцию и создать зазор, увеличив пространство разреза.
- С помощью завязывающих щипцов (дополнительный рисунок S1H) сделайте острый разрез вертикально под углом 90° в мышцах бедра глубиной 1 см.
- Вставьте тонкие маленькие ножницы (дополнительный рисунок S1G) в тот же разрез, также под углом 90°, и аккуратно раздвиньте их, чтобы разделить мышцы. Продолжайте делать это до тех пор, пока седалищный нерв не будет визуализован.
- Найдите седалищный нерв, который может казаться глянцевым и тонким, идущим параллельно вертикальному бедру по направлению от бедра к колену. Прежде чем продолжить, снимите с тела ножницы и щипцы для завязывания.
- Используйте сверхтонкие щипцы (дополнительный рисунок S1D) и стеклянный крючок для нерва (дополнительный рисунок S1E), чтобы изолировать нерв снизу. Осторожно освободите нерв от окружающих соединительных тканей в месте рядом с вертелом бедренной кости, который находится ближе всего к бедру и наиболее удален от колена.
- Дайте нерву отдохнуть на стеклянном стержне и убедитесь, что конец стержня предотвращает скатывание нерва.
- Поместите хирургический узел, чтобы завязать 1/3 ширины седалищного нерва с помощью нейлонового шва 9-0, прежде чем он разделится на общую малоберцовую, большеберцовую и икроножную ветви3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разветвление происходит, когда седалищный нерв течет вниз по колену, от бедра. Поскольку эти три ветви нерва имеют три разные иннервации, крайне важно поместить хирургический узел до разветвления, чтобы обеспечить одинаковый дефицит нервов во всех операциях на животных. - Будьте осторожны, удерживая нити близко к узлу, когда натягиваете нити, чтобы не дергать за нерв с чрезмерным усилием, чтобы избежать соскальзывания нерва со стеклянного стержня и избежать дальнейших травм при растяжении.
- Осторожно снимите нерв со стеклянного стержня, как только узел будет завершен, и заправьте его обратно в исходное место на уровне ниже отделенных мышц.
- Зашить разрез мышцы с помощью рассасывающегося полигликолевого шва 5-0. Отдельно зашивают кожу с помощью нерассасывающегося полипропиленового шва 6-0.
- Запишите время окончания операции и анестезии. Дайте мыши проснуться в одиночестве в клетке для восстановления, прежде чем возвращать ее в новую чистую клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей операции зажимайте пальцы ног животного, чтобы подтвердить адекватное поддержание анестезии, и следите за его дыханием и перфузией тела (красный, розовый, бледный). Если дыхание значительно снижено или животное выглядит бледным, подумайте об уменьшении потока анестезии или увеличении потока кислорода и подготовьте шприц, наполненный физиологическим раствором, для подкожной инъекции для регидратации животного. Под животным всегда должен находиться источник тепла, чтобы поддерживать тепло тела.
6. Процедура фиктивной хирургии контрольных животных
- Выполните шаги 5.1-5.11 хирургической процедуры; Исключите шаги 5.4-5.9.
7. Послеоперационные поведенческие тесты
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что экспериментатор слеп к любому лечению. Хроническая невропатическая боль развивается в течение 2 недель после операции, после чего могут быть проведены поведенческие тесты после введения интересующих соединений.
- Используйте тест фон Фрея, Харгривза или тест с горячей плитой, чтобы оценить как термическую, так и механическую гиперчувствительность и ее потенциальное обращение.
- Исключите любое животное из исследования, если оно соответствует критериям конечной точки, как описано институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.
- Усыпьте животных в соответствии с процедурами, описанными институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в конце поведенческого тестирования.
8. Анализ данных
- фон Фрай:
- Проанализируйте данные с помощью непараметрического метода Диксона, как описано Чапланом и его коллегами23, и выразите данные в виде среднего порога вывода.
- На главной странице упомянутого программного обеспечения (см. Таблицу материалов) выберите все нити, которые использовались для исследования (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 и 4.56). На панели групп выберите нить, соответствующую последней симуляции. В пустом поле укажите положительные (X ) и отрицательные (o) ответы. Запишите пороговые значения, указанные в поле слева от наблюдаемой модели ответов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример паттерна и количественной оценки представлен на дополнительном рисунке S2.
- На главной странице упомянутого программного обеспечения (см. Таблицу материалов) выберите все нити, которые использовались для исследования (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 и 4.56). На панели групп выберите нить, соответствующую последней симуляции. В пустом поле укажите положительные (X ) и отрицательные (o) ответы. Запишите пороговые значения, указанные в поле слева от наблюдаемой модели ответов.
- Проанализируйте данные с помощью непараметрического метода Диксона, как описано Чапланом и его коллегами23, и выразите данные в виде среднего порога вывода.
- Харгривз и конфорка:
- Сообщайте о задержках в электронной таблице для дальнейшего статистического анализа.
- Постройте результаты как среднее значение чувствительности (пороговых значений или задержек) в зависимости от времени.
9. Инструкция, как сделать нервный стеклянный крючок
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте пожарную безопасность на протяжении всего этого процесса. При необходимости надевайте надлежащую защиту, например, термостойкие перчатки или очки.
- Включите горелку Бунзена.
- Держите один конец стеклянного стержня (А) к огню в одной руке. Когда этот стеклянный стержень расплавится, используйте другой стеклянный стержень (B) в другой руке, чтобы направлять и тянуть плавящееся стекло на стержне A. Снимите стеклянный стержень A с огня и позвольте концу расплавленной части естественным образом скатиться внутрь, образуя форму небольшого шара. Используйте стеклянный стержень B, чтобы направлять эту форму.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хроническая невропатическая боль была вызвана частичной перевязкой седалищного нерва самцов мышей C57Bl6/J (рис. 1A). Механическую чувствительность оценивали с помощью нитей фон Фрея и метода «вверх-вниз». Тепловую чувствительность к теплу оценивали с помощью тестов Харгривза и горячей плиты. Все данные были проанализированы с помощью повторных измерений двусторонней ANOVA с коррекцией Гейссера-Парникового эффекта, чтобы сравнить эффект операции pSNL на фиктивных животных с течением времени или эффекты различных доз морфина и ибупрофена.
Мыши, перенесшие операцию pSNL, продемонстрировали более низкие пороги механических стимулов по сравнению с фиктивными животными в течение 28 дней (рис. 1B). Аналогичные результаты были получены при оценке тепловой гиперчувствительности; Латентности изъятия лап после воздействия лучистого теплового стимула были увеличены у животных pSNL (рис. 1C), а также задержки вывода, когда животные были помещены на пластину с температурой 52 ° C (рис. 1D).
После установления хронической нейропатической боли, через 14 дней после операции, мы оценили антиноцицептивные эффекты различных доз морфина или ибупрофена. Мышам вводили внутрибрюшинно либо физиологический раствор, либо две разные дозы морфина (1 и 5 мг / кг). В обеих группах, получавших морфин, наблюдалась обратная гиперчувствительность, вызванная pSNL, которая длилась от 1 (1 мг/кг) до 2 ч (5 мг/кг) (рис. 2А). Механическая гиперчувствительность вернулась к исходному уровню через 4 ч после инъекции морфина. Когда две разные дозы ибупрофена (10 и 30 мг / кг) вводили мышам внутрибрюшинно, результаты продемонстрировали снижение механической гиперчувствительности по сравнению с мышами, которым вводили физиологический раствор (рис. 2B). Антиноцицептивные эффекты ибупрофена продолжались до 2 ч. В целом, результаты показали, что операция pSNL вызывает длительную хроническую невропатическую боль. Кроме того, мы смогли продемонстрировать, что эта модель чувствительна к различным дозам анальгетиков.
Рисунок 1: Длительная термическая и механическая гиперчувствительность у мышей из-за частичной перевязки седалищного нерва. Термическая чувствительность к теплу (тест Харгривза и горячей плиты) и механическая чувствительность к филаментам фон Фрея были оценены для изучения индукции и персистенции гиперчувствительности в модели хронической нейропатической боли (pSNL). Исходные значения были измерены до перевязки седалищного нерва, а гиперчувствительность оценивалась в течение 28 дней после операции. (А) На рисунке изображена частичная перевязка седалищного нерва. (B) Механические пороги абстиненции сравнивались между фиктивными мышами и мышами pSNL в каждый момент времени. Повторные измерения двусторонней ANOVA с коррекцией Гейссера-Парникового режима выявили значимое влияние pSNL (F(1, 10) = 222,3, p < 0,0001, n = 5-7 на условие). Тест множественных сравнений Сидака показал значительное увеличение гиперчувствительности между 1 и 28 днями (p < 0,05). (C) Задержки теплового отвода, измеренные с помощью теста Харгривза, сравнивались между фиктивными мышами и мышами pSNL. Повторные измерения двусторонней ANOVA с коррекцией Гейссера-Парника выявили значимое влияние pSNL (F(1 , 8) = 113,8; p < 0,0001, n = 4-6 на условие). Тест множественных сравнений Сидака продемонстрировал значительное увеличение гиперчувствительности на 2-й и 14-й дни (p < 0,05). (D) Задержки теплового отвода, измеренные с помощью теста с горячей плитой, сравнивались между фиктивными мышами и мышами pSNL. Обычная двусторонняя ANOVA выявила значимое влияние pSNL (F(1, 32) = 19,10, p = 0,0001, n = 4-6 на условие). Тест множественных сравнений Сидака продемонстрировал значительную повышенную чувствительность к теплу через 4 недели после операции pSNL (p = 0,0026). Данные представлены в виде средних ± сокращениями S.E.M.: PSNL = частичная перевязка седалищного нерва; BL = базовый уровень. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Дозозависимая реверсирование механической гиперчувствительности, вызванной pSNL, путем внутрибрюшинного введения морфина или ибупрофена. Механическая гиперчувствительность (с использованием филаментов фон Фрея) была оценена для изучения потенциальных антиноцицептивных эффектов морфина или ибупрофена в мышиной модели pSNL. Исходные значения (pre-pSNL) были получены до перевязки седалищного нерва. После установления хронической нейропатической боли на 14-й день животным вводили в исходный период второй раз, чтобы обеспечить гиперчувствительность, индуцированную pSNL (пост-pSNL). Затем две дозы морфина (1/5 мг/кг) или ибупрофена (10/30 мг/кг) вводили внутрибрюшинно. Потенциальное изменение механической гиперчувствительности оценивали в течение 4 ч после инъекций. (A) Механические пороги отмены сравнивались между физиологическим раствором и двумя дозами морфина. Повторные измерения двусторонней ANOVA с коррекцией Гейссера-Парникового режима выявили значимое влияние 1 мг/кг морфина (F(1, 11) = 11,16, p = 0,0066, n = 6-7 на условие) и значимое влияние 5 мг/кг морфина (F(1, 10) = 21,78, p = 0,0009, n = 6 на условие). Тест множественных сравнений Сидака продемонстрировал значительное снижение механической гиперчувствительности через 1 ч после инъекции для обеих доз, но только значительный эффект для состояния 5 мг / кг через 2 ч (* p < 0,05). (B) Механические пороги отмены сравнивались между физиологическим раствором и двумя дозами ибупрофена. Повторные измерения двусторонней ANOVA с коррекцией Гейссера-Парникового режима выявили значимый эффект 10 мг/кг ибурофена (F(1, 11) = 7,788, p = 0,0176, n = 6-7 на условие) и значимый эффект 30 мг/кг ибупрофена (F(1, 10) = 18,79, p = 0,0015, n = 6 на условие). Многократный сравнительный тест Сидака продемонстрировал значительное снижение механической гиперчувствительности через 1 и 2 ч после инъекции для обеих доз (*p < 0,05). Данные представлены в виде средних ± сокращениями S.E.M.: PSNL = частичная перевязка седалищного нерва; IP = внутрибрюшинный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Хирургические инструменты. На двух рисунках показаны различные инструменты, используемые для операции. а) тонкий иглодержатель Кастровьехо; b) иглодержатель Кастровьехо; (C) щипцы Micro Adson; (D) сверхтонкие щипцы Graefe; (E) нервный стеклянный крючок; (F) тонкие ножницы (11,5 см); (G) тонкие ножницы (9 см); h) завязывание щипцов; (I) щипцы для радужной оболочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Репрезентативная картина реакций на снятие лап, измеренная с помощью теста нити фон Фрея. В этом испытании мышь не реагировала на первые три стимуляции, но отдернула лапу при четвертой стимуляции нитью 4,56. После положительного ответа (x) использовали более тонкую нить (4,31), а затем нити меньших размеров до тех пор, пока мышь не реагировала на другую нить (в данном случае 4,08). Экспериментатор должен уменьшать размер нитей, одну за другой, до тех пор, пока не исчезнет ответ (o). После отсутствия ответа экспериментатор использовал более толстую нить до тех пор, пока не получил положительный ответ, и уменьшил их размер после положительного ответа (полученного здесь с нитью 4,31). Четыре стимула были проведены после первого положительного ответа; хронологический характер каждой стимуляции аннотирован цифрами, выделенными красным цветом на панели А. В этом случае нити с 2,44 по 3,22 никогда не использовались, так как животное не показало положительного ответа на нить 3,61. (B) Затем шаблон ответов заполнялся в программном обеспечении Allodynia, сообщая в том же порядке, в котором были применены нити (000xx0x0), в рамке, выделенной белым цветом. Полученный порог затем был рассчитан программным обеспечением (2,60839). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица S1: Лист сбора данных для тестирования фон Фрея. Эта таблица позволяет экспериментаторам заполнять паттерны ответов при использовании филаментов фон Фрея. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лечение хронической боли часто требует длительного приема лекарств, что затрудняет обезболивание. Таким образом, доклинические модели являются важным инструментом для оценки потенциальных преимуществ инновационных методов лечения, основанных на фармакологических или нефармакологических подходах. Многочисленные модели хронической невропатической боли создают проблемы из-за повышенной вариабельности хирургических методов среди различных исследователей, что приводит к снижению воспроизводимости. Таким образом, важно охарактеризовать потенциальные антиноцицептивные эффекты новых методов лечения в нескольких моделях, которые хорошо охарактеризованы и стандартизированы.
Этот отчет демонстрирует, что частичная перевязка седалищного нерва приводит к развитию длительной хронической нейропатической боли у мышей с использованием относительно недорогих методов. pSNL преувеличивает реакцию на тепловые и механические раздражители, и модель реагирует на введение обычно используемых анальгетиков дозозависимым образом. Таким образом, модель pSNL представляется удобной и чувствительной моделью для оценки потенциальных преимуществ новых лекарств. Основными характеристиками нейропатической боли являются гипералгезия и аллодиния. В этом отчете показано, как это влияет на механическую аллодинию и термическую гипералгезию. Однако механическая гипералгезия не измерялась. Существует большая серая область перекрытия между аллодинией и гипералгезией. Оба ощущения подпадают под общую гиперчувствительность к сенсорному стимулу24. Таким образом, стимулированное ощущение может восприниматься как другое ощущение, такое как тепло как холодная боль или прикосновение как чувство жжения. Поэтому гипералгезию и аллодинию часто трудно отличить, особенно в моделях боли у животных.
Модель pSNL использовалась в многочисленных исследованиях хронической боли для оценки эффекта анальгетических соединений, основных механизмов хронической боли или даже когнитивного воздействия длительной нейропатической боли. Персистенция механической гиперчувствительности до 70 дней позволяет изучать отдаленные эффекты новых препаратов25. Важно отметить, что оптимальный период для поведенческого тестирования охватывает первую, вторую и третью недели после операции, после установления хронической боли 8,11,26,27. Чтобы оценить активность и эффективность лекарственного средства или нефармакологической терапии, следует рассмотреть возможность положительного контроля, такого как морфин или ибупрофен, в зависимости от дизайна эксперимента. В отличие от теста на взмах хвостом, тест с горячей пластиной применяет стимул к лапе, который объединяет супраспинальные пути19. Тест с горячей пластиной широко использовался для характеристики антиноцицептивных свойств лекарств в моделях хронической нейропатической боли в недавних исследованиях 19,28,29,30,31,32,33.
Эта модель была использована для характеристики новых неопиоидных методов лечения и выявления нового болевого пути с участием рецептора нейротензина типа 211,13. Он также был использован для демонстрации участия глицинергических модуляций в хронической боли12 и разработки новых методов лечения и путей на пересечении сна и боли10. Тем не менее, по сей день ни в одной статье не представлено подробное объяснение операции, дополненное описательным видео.
Распространенной критикой pSNL и подобных моделей является достоверность согласованности степени повреждения, вызванного нейропатическим повреждением нерва у животных6. В этой статье описывается процедура ручного плавления и формования стеклянного стержня для создания специального нервного стеклянного крючка для решения этой проблемы. В большинстве операций на животных используются щипцы для захвата тонких нервов или сосудов. Инструмент для нервного стеклянного крючка позволяет использовать более безопасный и менее подверженный травмам метод обработки нерва. Хотя целью этой модели является повреждение нерва, разумно избегать дополнительных повреждений нерва, кроме тех, которые вызваны швом, наложенным через одну треть ширины седалищного нерва. Стеклянный крючок нерва представляет собой гладкую, не повреждающую поверхность, на которую опирается нерв; Кроме того, мяч / крюк на конце обеспечивает легкость захвата и стабилизации. Более того, при ушивании нерва описанная выше методика (примечание 5.7 к разделу протокола) рекомендует удерживать нити глубоко внутри полости тела, ближе всего к тому месту, где появится узел. Это позволяет избежать натяжения конца швов и способствует натяжению ближайшего к нерву шва при затягивании узла. Этот метод предотвращает дополнительную травму растяжения, если нерв будет непреднамеренно снят со стеклянного крючка нерва к внешней стороне полости в процессе более плотного завязывания узла. Одним из дополнительных преимуществ является использование тонких ножниц для первоначального разреза. Это позволяет получить гораздо меньший размер разреза и, следовательно, более быстрое заживление, в отличие от больших разрезов, сделанных лезвиями скальпеля.
Методы, описанные в этой статье, также имеют некоторые ограничения. На развитие хронической боли в модели pSNL влияет пол животных34. Поэтому важно, чтобы научные исследования включали в свой анализ оба пола. Цель этого отчета состояла в том, чтобы сосредоточиться на хирургическом вмешательстве и не характеризовать половой диморфизм модели боли. Стоит отметить, что измерения тепловой чувствительности у мышей с использованием теста Харгривза являются сложной задачей; Животные должны стоять неподвижно в небольшом вольере в течение нескольких секунд, пока применяется стимул. Таким образом, приучение мышей к вольеру из плексигласа является ключевым фактором для получения успешных результатов. Измерение вызванной боли также требует тщательной подготовки экспериментатора. Рекомендуются как вызванные, так и спонтанные поведенческие тесты для оценки тепловой и механической чувствительности, а также функциональности конечности. Кроме того, в этом исследовании морфин и ибупрофен использовались в качестве положительного контроля антиноцицептивного эффекта. Эти два препарата были выбраны, поскольку они обычно используются в качестве положительного контроля в нескольких моделях боли и позволяют лучше сравнивать различные модели. Тем не менее, важно отметить, что прегабалин и габапентин часто назначают для лечения нейропатической боли, и исследования, посвященные нейропатическому обезболиванию, должны включать эти препараты в качестве положительного контроля.
В этом отчете с точностью описывается операция, обычно используемая для изучения хронической нейропатической боли. Предоставление исследователям и стажерам возможности извлечь выгоду из визуального описания этой модели мыши облегчит разработку исследовательских проектов, направленных на понимание механизмов хронической боли или на характеристику инновационных методов лечения. Кроме того, использование нескольких моделей боли имеет важное значение для улучшения воспроизводимости, и этот отчет облегчит внедрение модели pSNL в новых лабораториях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы сообщить. Ни один из авторов рукописи не получил никакого вознаграждения или какого-либо возмещения или гонорара каким-либо иным образом. Авторы не связаны с каким-либо поставщиком или фармацевтической компанией, связанной с этим исследованием.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным центром комплементарного и интегративного здоровья [R01AT009716, 2017] (M.M.I.), Комплексным центром хронической боли и наркомании Университета Аризоны (M.M.I.) и Программой подготовки ученых-медиков (MSTP) в Университете Аризоны, Медицинский колледж, Тусон.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5/0, FS-2, 30" Undyed PGA Braided Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Suture | CP Medical | 421A | https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ |
| 6/0, P-1, 18" Blue Polypropylene Monofilament Non-Absorbable Suture | CP Medical | 8697P | https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ |
| 9/0 (0.3 metric) Nylon Black Monofilament Suture | Crestpoint Ophthalmics | MANI 1407 | https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html |
| Allodynia Software | National Instruments, LabView 2015 | Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data) | |
| C57Bl6/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Castroviejo needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14 |
| Cold Hot Plate Test | Bioseb | BIO-CHP | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html |
| Elevated metal mesh stand for Von Frey | Bioseb | BIO-STD2-EVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html |
| Extra fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110 |
| Fine Castroviejo needle holder | Simovision/Geuder | 17565 | https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf |
| Fine scissors (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14558-11 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11 |
| Fine scissors (9 cm) | Fine Science Tools | 14558-09 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09 |
| Iris forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07 |
| Micro Adson forceps | Fine Science Tools | 392487 | https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps |
| Modular holder cages for rats and mice | Bioseb | BIO-PVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html |
| Moretti/Effetre #240 Light Cobalt Blue glass rods 4 mm | Ebay | N/A | https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIzBYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA |
| Plantar Test for Thermal Stimulation - Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37570 | https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation |
| Touch-Test Sensory Evaluators, Set of 20 Monofilaments | North Coast Medical | NC12775-99 | https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html |
| Tying forceps | Duckworth & Kent | 2-504ER8 | https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/ |
References
- Hassett, A. L., Gevirtz, R. N. Nonpharmacologic treatment for fibromyalgia: patient education, cognitive-behavioral therapy, relaxation techniques, and complementary and alternative medicine. Rheumatic Disease Clinics of North America. 35 (2), 393-407 (2009).
- Hylands-White, N., Duarte, R. V., Raphael, J. H. An overview of treatment approaches for chronic pain management. Rheumatology International. 37 (1), 29-42 (2017).
- Campbell, J. N., Meyer, R. A.
- Colloca, L., et al.
- Colleoni, M., Sacerdote, P. Murine models of human neuropathic pain. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (10), 924-933 (2010).
- Challa, S. R. Surgical animal models of neuropathic pain: Pros and cons. International Journal of Neuroscience. 125 (3), 170-174 (2015).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43 (2), 205-218 (1990).
- Hasnie, F. S., Wallace, V. C., Hefner, K., Holmes, A., Rice, A. S. Mechanical and cold hypersensitivity in nerve-injured C57BL/6J mice is not associated with fear-avoidance-and depression-related behaviour. British Journal of Anaesthia. 98 (6), 816-822 (2007).
- Ito, H., et al. Suvorexant and mirtazapine improve chronic pain-related changes in parameters of sleep and voluntary physical performance in mice with sciatic nerve ligation. PLoS One. 17 (2), 0264386 (2022).
- Martin, L., et al. Conotoxin contulakin-G engages a neurotensin receptor 2/R-type calcium channel (Cav2.3) pathway to mediate spinal antinociception. Pain. 163 (9), 1751-1762 (2021).
- Peiser-Oliver, J. M., et al. Glycinergic modulation of pain in behavioral animal models. Frontiers in Pharmacology. 13, 860903 (2022).
- Ramiro, I. B. L., et al. Somatostatin venom analogs evolved by fish-hunting cone snails: From prey capture behavior to identifying drug leads. Science Advances. 8 (12), (2022).
- Chung, J. M. Encyclopedia of Pain. Schmidt, R. F., Willis, W. D. , Springer. Berlin Heidelberg. 1299-1300 (2007).
- Zahn, P. K., Brennan, T. J. Primary and secondary hyperalgesia in a rat model for human postoperative pain. Anesthesiology. 90 (3), 863-872 (1999).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Yeomans, D. C., Proudfit, H. K. Characterization of the foot withdrawal response to noxious radiant heat in the rat. Pain. 59 (1), 85-94 (1994).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of thermal pain sensation in rats and mice using the Hargreaves test. Bio-Protocol. 7 (16), 2506 (2017).
- Hook, M. A., et al. The impact of morphine after a spinal cord injury. Behavioural brain research. 179 (2), 281-293 (2007).
- Loram, L. C., et al. Prior exposure to repeated morphine potentiates mechanical allodynia induced by peripheral inflammation and neuropathy. Brain, behavior, and immunity. 26 (8), 1256-1264 (2007).
- Green-Fulgham, S. M., et al. Oxycodone, fentanyl, and morphine amplify established neuropathic pain in male rats. Pain. 160 (11), 2634-2640 (2019).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurology. 13 (9), 924-935 (2014).
- Malmberg, A. B., Gilbert, H., McCabe, R. T., Basbaum, A. I. Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA receptor antagonists conantokins G and T. Pain. 101 (1-2), 109-116 (2003).
- Nakamura, Y., et al. Neuropathic pain in rats with a partial sciatic nerve ligation is alleviated by intravenous injection of monoclonal antibody to high mobility group box-1. PLoS One. 8 (8), 73640 (2013).
- Sherman, K., et al. Heterogeneity in patterns of pain development after nerve injury in rats and the influence of sex. Neurobiology of Pain. 10, 100069 (2021).
- Ba, X., et al. Cinobufacini protects against paclitaxel-induced peripheral neuropathic pain and suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation in rats. Biomedicine Pharmacotherapy. 108, 76-84 (2018).
- Hao, Y., et al. Huachansu suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation to prevent oxaliplatin-induced peripheral neuropathic pain in rats. Gene. 680, 43-50 (2019).
- Guo, J., et al. Effects of resveratrol in the signaling of neuropathic pain involving P2X3 in the dorsal root ganglion of rats. Acta Neurologica Belgica. 121 (2), 365-372 (2021).
- Ni, W., Zheng, X., Hu, L., Kong, C., Xu, Q. Preventing oxaliplatin-induced neuropathic pain: Using berberine to inhibit the activation of NF-kappaB and release of pro-inflammatory cytokines in dorsal root ganglions in rats. Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (2), 135 (2021).
- Wang, J., et al. Selective activation of metabotropic glutamate receptor 7 blocks paclitaxel-induced acute neuropathic pain and suppresses spinal glial reactivity in rats. Psychopharmacology. 238 (1), 107-119 (2021).
- Sun, C., Wu, G., Zhang, Z., Cao, R., Cui, S. Protein tyrosine phosphatase receptor type D regulates neuropathic pain after nerve injury via the STING-IFN-I pathway. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 859166 (2022).
- Coyle, D. E., Sehlhorst, C. S., Mascari, C. Female rats are more susceptible to the development of neuropathic pain using the partial sciatic nerve ligation (PSNL) model. Neuroscience Letters. 186 (2-3), 135-138 (1995).
