Summary
延时显微镜是研究出芽酵母减数分裂的宝贵工具。该协议描述了一种结合细胞周期同步，延时显微镜和目标蛋白的条件耗竭的方法，以证明如何在减数分裂染色体分离期间研究特定蛋白质的功能。
Abstract
延时荧光显微镜通过提供成像固定细胞通常看不到的时间和空间数据，彻底改变了对减数分裂细胞周期事件的理解。芽酵母已被证明是研究减数分裂染色体分离的重要模式生物，因为许多减数分裂基因是高度保守的。出芽酵母减数分裂的延时显微镜可以监测不同的减数分裂突变体，以显示突变如何破坏减数分裂过程。然而，许多蛋白质在减数分裂的多个点起作用。因此，使用功能丧失或减数分裂零突变体会破坏早期过程，阻断或干扰后期过程，并且难以确定与每个个体角色相关的表型。为了规避这一挑战，该协议描述了如何在减数分裂的特定阶段有条件地从细胞核中耗尽蛋白质，同时使用延时显微镜监测减数分裂事件。具体来说，该协议描述了细胞如何在前期I中同步，如何使用锚移技术在特定减数分裂阶段从细胞核中去除蛋白质，以及如何使用延时成像来监测减数分裂染色体分离。作为该技术实用性的一个例子，在减数分裂期间的不同时间点从细胞核中去除了动粒蛋白Ctf19，并在减数分裂II结束时分析染色质质量的数量。总体而言，该方案可以适应于从细胞核中消耗不同的核蛋白，同时监测减数分裂。
Introduction
延时荧光显微镜是研究出芽酵母1，2中减数分裂染色体分离动力学的宝贵工具。通过饥饿关键营养素，可以诱导出芽酵母细胞发生减数分裂3。在减数分裂过程中，细胞经历一轮染色体分离，然后进行两次分裂，产生四种减数分裂产物，这些产物被包装成孢子（图1）。可以在减数分裂的每个阶段可视化单个细胞，从而生成固定细胞成像很容易错过的空间和时间数据。该协议显示了如何将延时荧光显微镜与两种先前建立的方法（诱导NDT80系统（NDT80-in）和锚移技术相结合，可用于研究不同减数分裂阶段特定蛋白质的功能。
NDT80-in系统是减数分裂细胞周期同步的强大工具，它依赖于中间减数分裂转录因子NDT80 4，5的诱导表达。第一阶段出口6，7需要NDT80表达。使用NDT80-in系统，NDT80在表达与雌激素受体（ Gal4-ER）融合的Gal4转录因子的细胞中的GAL1-10启动子的控制下4，5。由于Gal4-ER仅在与β-雌二醇结合时才进入细胞核，因此NDT80-in细胞在没有β-雌二醇的情况下在前期I中停滞，这允许前期I中的细胞同步（图1）。β-雌二醇加成促进Gal4-ER转录因子易位到细胞核中，在那里它结合GAL1-10以驱动NDT80的表达，导致同步进入减数分裂。虽然延时显微镜可以在没有同步的情况下进行，但使用同步的优点是能够在细胞处于减数分裂的特定阶段时添加抑制剂或药物。
锚移技术是一种可诱导系统，通过该系统，可以通过添加雷帕霉素8从细胞核中去除蛋白质。该技术非常适合在出芽酵母的细胞分裂过程中研究核蛋白，因为酵母细胞经历闭合的有丝分裂和减数分裂，其中核包膜不会分解。此外，该技术对于在整个减数分裂中具有多种功能的蛋白质非常有用。与缺失、突变等位基因或减数分裂无效等位基因不同，在特定阶段从细胞核中去除靶蛋白不会损害早期靶蛋白活性，从而可以更准确地解释结果。锚移系统利用核糖体成熟时核和细胞质之间核糖体亚基的穿梭8。为了从细胞核中去除靶蛋白，在核糖体亚基Rpl13A用FKBP12标记的菌株中用FKBP12标记靶蛋白12-雷帕霉素结合结构域（FRB）标记靶蛋白。没有雷帕霉素，FRB和FKBP12不会相互作用，FRB标记的蛋白质保留在细胞核中。雷帕霉素加成后，雷帕霉素与FKBP12和FRB形成稳定的复合物，并且由于与Rpl13A的相互作用，复合物从细胞核中穿梭出来（图1）。为了防止雷帕霉素加成后的细胞死亡，细胞含有TOR1基因的tor1-1突变。此外，这些细胞含有 fpr1Δ，这是酿酒酵母 FKBP12 蛋白的空等位基因，可防止内源性 Fpr1 在 FRB 和雷帕霉素结合方面竞争 Rpl13A-FKBP12。锚定背景突变，tor1-1和fpr1Δ，不影响减数分裂时间或染色体分离2。
为了证明该技术的有效性，动粒蛋白Ctf19在整个减数分裂过程中的不同时间点耗尽。Ctf19是动粒的一种成分，在有丝分裂中是可有可无的，但在减数分裂9，10，11，12，13中适当的染色体分离是必需的。在减数分裂中，动粒在前期I脱落，Ctf19对动粒重新组装很重要9，14。对于该协议，具有NDT80-in系统的细胞是同步的，并且使用锚移技术在前期I释放之前和之后以及减数分裂I染色体分离之后从细胞核中去除靶蛋白Ctf19（图1）。该协议可以适应在减数分裂和有丝分裂的任何阶段消耗其他感兴趣的蛋白质。
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Protocol
1. 准备必要的材料
- 准备酵母细胞生长和孢子形成的试剂。
注意：如果出芽酵母菌株是 ade2 -和 trp1-，则在步骤1.1.1-1.1.3中补充所有培养基，终浓度为0.01%腺嘌呤和0.01%色氨酸。如果通过高压灭菌器灭菌培养基，则仅在试剂高压灭菌并冷却至室温后添加这些氨基酸。- 对于营养生长，通过将 6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、2 g 完全氨基酸混合物和 20 g 葡萄糖溶解在 500 mL 水中来制备 2x 合成完全 + 葡萄糖培养基 （2XSC）。通过在121°C高压灭菌20分钟或通过0.2μm过滤器过滤来灭菌混合物。
- 对于孢子形成的第一步，通过将 6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、2 g 完全氨基酸混合物和 20 g 乙酸钾溶解在 500 mL 水中来制备 2x 合成完全 + 乙酸盐培养基 （2XSCA）。通过在121°C高压灭菌20分钟或通过0.2μm过滤器过滤来灭菌混合物。
- 对于孢子形成的最后一步，通过将 5 g KAc 溶解在 500 mL 水中来制备 1% 乙酸钾 （1% KAc）。通过在121°C高压灭菌20分钟或通过0.2μm过滤器过滤来灭菌混合物。
- 准备用于显微镜检查、同步和锚定的药物和试剂。
- 为了在延时成像期间将细胞粘附到盖玻片上，在 1x PBS 中制备 1 mg/mL 刀豆球蛋白 A （ConA）。使用0.2μm过滤器过滤灭菌，并将小（~10μL）等分试样储存在-20°C。
- 要使用 NDT80-in系统，将2 mL的1 mM β-雌二醇溶解在乙醇中。使用0.2μm过滤器过滤灭菌，并将等分试样（~500μL）储存在-20°C。
- 对于锚定离开系统，将 1 mg/mL 的雷帕霉素溶解在 DMSO 中。使用0.2μm过滤器过滤灭菌，并将小（~10μL）等分试样储存在-20°C。
注意：准备少量雷帕霉素，以避免药物的多次冻融循环。
- 生成含有NDT80-in系统的酵母菌株（P GAL1，10-NDT80/PGAL1，10-NDT80;GAL4-ER / GAL4-ER）和锚定遗传背景中用FRB标记的靶蛋白（tor1-1 / tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ;Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12）4，8.本研究使用了Ctf19-FRB。此外，用mCherry标记组蛋白Htb2的一个拷贝，以监测减数分裂进展和染色质分离。
- 为延时成像准备腔室
- 在成像前6小时-24小时开始准备腔室（图2）。使用加热的手术刀或其他锋利的刀片从移液器吸头盒插入物上切下 18 mm x 18 mm 的腔室。
- 使用塑料移液器吸头在腔室的底部边缘涂上一层薄薄的硅酮密封胶，以粘附在盖玻片上。添加足够的密封剂，使腔室的边缘完全覆盖（见 图2）。
- 将腔室轻轻地将密封剂面朝下放在盖玻片上，将腔室粘附在 24 mm x 50 mm 盖玻片上。确保密封剂中没有间隙，以免腔室泄漏。
- 将 8-10 μL ConA 涂抹在盖玻片上。将ConA分配到盖玻片的中间，并使用移液器吸头将ConA铺成薄薄的一层，使其覆盖被腔室包围的大部分盖玻片。
注意：塑料腔可以无限期地重复使用。延时成像完成后，使用剃须刀从盖玻片上取下腔室，从腔室中清洁硅酮密封剂，并将腔室浸没在 95% 乙醇中以备将来使用。
2. 酵母细胞的孢子化
- 执行以下步骤使酵母细胞饥饿以诱导减数分裂程序。
注意：这些步骤适用于W303酵母菌株的孢子化。其他菌株可能需要不同的方案15。不同菌株的孢子形成效率差异很大，W303的孢子形成效率为~60%16，17，18。- 从平板中取出适当的二倍体酵母菌株的单个菌落，接种2mL的2XSC，并在滚筒上以30°C生长12-24小时至饱和。
- 通过将步骤 2.1.1 中的 80 μL 培养物添加到 2 mL 的 2XSCA 中，将饱和培养物稀释到 2XSCA 中。让它在滚筒上在30°C下生长12-16小时。不要在2XSCA中放置超过16小时，因为细胞会生病或发出自发荧光。
- 通过在室温（25°C）下以800× g 旋转培养物1分钟，丢弃液体，然后将沉淀重悬于2mL无菌蒸馏水中来进行两次洗涤。
- 第二次洗涤后，除去液体并将沉淀重悬于2mL的1%KAc中，使其在滚筒上于25°C生长8-12小时。进入减数分裂的细胞将在前期I的厚皮烯中停滞。
- 第一阶段放行系统
- 将β-雌二醇直接添加到孢子培养物中至终浓度为1μM并快速涡旋培养管。β-雌二醇将从前期I释放细胞。
3. 使用锚移技术从细胞核中去除靶蛋白
- 将雷帕霉素添加到细胞中以在特定阶段从细胞核中去除FRB标记的蛋白质。
- 为了在前期I出口时从细胞核中去除蛋白质，在添加β-雌二醇的同时，将雷帕霉素的终浓度为1μg/mL添加到孢子培养管中。
- 为了在减数分裂的特定阶段从细胞核中去除蛋白质，请在添加β-雌二醇后60分钟开始监测细胞周期阶段。每 20 分钟，将 5 μL 培养物移液到 24 mm x 40 mm 盖玻片上，并用 18 mm x 18 mm 盖玻片覆盖细胞。在时间点之间保持培养物在25°C的辊筒上旋转。
- 使用A594 / mCherry滤光片和荧光显微镜的60倍物镜对细胞进行成像。将透射率百分比设置为 2%，将曝光时间设置为 250 ms。一个、两个或四个DNA质量的存在将表明细胞进展的减数分裂阶段。在感兴趣的减数分裂阶段加入雷帕霉素至终浓度为1μg/ mL。
- 保持细胞在25°C的滚筒上旋转，直到它们准备好成像。在雷帕霉素加注2，8后30-45分钟发生靶蛋白的核耗竭。
4. 延时荧光显微镜
- 制作一个琼脂垫，用于创建用于成像的单层细胞（参见步骤4.2）。
- 切下并丢弃 1.5 mL 微量离心管的盖子和底部 1/3 以形成圆柱体。圆筒将用作琼脂垫的模具。制作两个圆筒，以防琼脂在第一个圆筒中不能正确聚合。
- 将切割的微量离心管筒放在干净的载玻片上，管的顶部倒置在载玻片上。
- 在 50 mL 烧杯中制作 6 mL 的 5% 琼脂溶液（使用 1% KAc 作为溶剂），并用微波炉加热直至琼脂完全溶解。
注意：琼脂在微波炉中很容易沸腾;观察琼脂，当琼脂开始沸腾并旋转烧杯时，启动和停止微波炉。启动和停止微波炉几次以完全溶解琼脂。琼脂溶液的量超过确保琼脂完全溶解所需的量。 - 切下移液管的尖端以形成更大的开口，并将~500μL融化的琼脂移液到每个微量离心管筒中。让它在室温下静置，直到琼脂凝固（~10-12分钟）。
- 制备用于成像的酵母细胞
- 在 1 mL 微量离心管中以 800 x g 离心 200 μL 从步骤 3.2 旋转 2 μL 孢子培养物 2 分钟。取出并弃去 180 μL 上清液。通过旋转和轻弹试管将沉淀重悬于剩余的上清液中。
- 将 6 μL 浓缩细胞移液到步骤 1.4 中制成的腔室中间的盖玻片上。
- 用步骤4.1中制作的琼脂垫握住圆筒，然后小心地将其从载玻片上滑下。确保琼脂底部完全平坦，并使用移液器吸头的底部，对微量离心模具施加轻微的压力，使琼脂垫略高于管的边界。
- 倒置模具，使琼脂垫朝下朝向腔室。
- 使用镊子，轻轻地将琼脂垫（仍在微量离心管模具中）放在细胞顶部。使用移液器吸头在腔室周围轻轻滑动琼脂垫10-20次，以在盖玻片上形成单层细胞。
- 将琼脂垫留在腔室中12-15分钟。此步骤将允许细胞粘附在盖玻片上的ConA上。
- 将步骤 3.2 中的 2 mL 孢子培养物转移到两个微量离心管中，并以 15，700 x g 离心 2 分钟。将上清液转移到干净的微量离心管中，并以15，700× g 再次旋转2分钟。将上清液转移到干净的微量离心管中，以便在下一步中使用。
注意：重要的是将预处理的KAc上清液与β-雌二醇和雷帕霉素一起使用，以确保有效孢子形成和目标蛋白质的持续消耗。 - 琼脂垫在腔室中放置12-15分钟后，漂浮并在成像前取出琼脂垫。为此，将步骤4.2.7中的2mL上清液滴加到腔室中。一旦液体到达腔室顶部，琼脂垫很可能会漂浮。
注意：如果琼脂垫没有自动漂浮，请等待1-2分钟。如果琼脂垫仍然没有漂浮，请用镊子轻轻取出。理想情况下，琼脂垫会自行漂浮，因为在漂浮之前将其移除可能会导致细胞被移除。 - 琼脂垫漂浮后，用镊子轻轻取出并丢弃。将 24 mm x 50 mm 盖玻片放在腔室顶部，以防止成像过程中蒸发。
- 在显微镜上设置视频
注意：以下说明适用于装有载玻片支架的倒置显微镜，载玻片支架可容纳24 mm x 50 mm盖玻片（有关显微镜、相机和软件的详细信息，请参阅 材料表 ）。60倍油浸物镜用于图像采集。使用其他显微镜或其他载玻片支架时，可能需要更改此协议。执行步骤4.3.2至步骤4.3.16的确切步骤因所使用的显微镜和成像软件而异。有关不同显微镜的说明，请参见第4.4节。- 将盖玻片安装在载玻片支架内。将成型粘土粘附在盖玻片的侧面，以将其牢固地固定在载玻片支架中。
- 打开图像采集软件。使用航向和微调旋钮使用 DIC 或明场聚焦细胞。
- 在图像采集软件的主菜单上，单击文件 >采集（Resolve 3D）。将弹出三个窗口。
- 在名为Resolve 3D的窗口中，单击 锥形瓶 图标。这将打开一个名为 “设计/运行实验”的窗口，其中包含用于设置实验以设置延时摄影影片的控件。
- 在 “设计 ”选项卡下，导航到标有 “切片”的选项卡。选中 “Z 切片”旁边的框。按如下方式设置 z 堆栈：光学切片间距 = 1 μm，光学切片数 = 5，样品厚度 = 5.0 μm。
- 在 “频道 ”选项卡下，单击 + 图标，以便显示一个频道选项。选择适当的通道。对于这个实验，我们选择A594，它用于对mCherry进行成像。选择参考图像旁边的框，然后从下拉菜单中将 Z 位置设置为样品的中间。
- 从 %T 和 Exp. 旁边的下拉菜单中选择一个值，分别设置透射率和曝光时间百分比。在本实验中，A594通道使用2%透射率和250 ms曝光时间，明场使用10%透射率和500 ms曝光时间。
注意：曝光时间和透射率百分比因显微镜而异。为避免过度曝光，请使用尽可能低的透射率和最短的曝光时间，以便正确可视化感兴趣的蛋白质。 - 在“延时摄影”选项卡下，选中“延时摄影”旁边的框。在显示的表格中，在延时摄影行的最小列下输入 10，在总时间行的小时列下输入 10。这将运行一个时间过程，每 10 分钟拍摄一次图像，持续 10 小时。
- 选中“使用终极对焦保持对焦”旁边的框，以防止影片期间出现舞台漂移。在“点”选项卡下，选中“访问点列表”旁边的框。
- 在主菜单中，单击查看 >点列表。将弹出一个名为点列表的窗口。将载物台移动到显示单层细胞的腔室区域。单击点列表窗口中的 点标记 。
- 移动载物台以选择 25-30 个点，没有任何重叠，以避免单元格过度曝光。每个字段将在每个时间过程中成像。
- 在点列表窗口中，选择“全部校准”以为每个点设置最终焦点。在“设计/运行实验”窗口的“设计”选项卡下，在“访问点列表”旁边的框中输入点值范围（从点列表窗口获得）。在“运行”选项卡下，将文件保存到计算机上的相应目标。在“设计/运行实验”窗口中，选择“播放”按钮（绿色三角形图标）以启动影片。
- 可选方法：在显微镜上设置短片
注意：这些说明适用于装有载玻片支架的倒置显微镜，载玻片支架可容纳24 mm x 50 mm盖玻片。有关所用显微镜、相机和成像软件的规格，请参阅 材料表 。60倍油浸物镜用于图像采集。- 将盖玻片安装在载玻片支架内。打开图像采集软件。使用航向和微调旋钮使用 DIC 或明场聚焦细胞。在软件打开的窗口中单击鼠标右键。将出现一个下拉菜单。
- 单击“ 获取控制”>“获取”。单击 应用程序>定义/运行实验。这将打开一个标记为 ND 采集的窗口。
- 在打开的窗口中，选中 XY 旁边的框。将舞台移动到所需位置，然后单击 “点名称” 下的框以选择该位置作为点。重复此操作，直到选择 25-30 个点而没有任何重叠，以避免单元格过度曝光。每个字段将在每个时间过程中成像。
- 设置每个荧光通道的透射率百分比。由于菌株产生 Htb2-mCherry，因此此处使用 mCherry 过滤器。在步骤 4.3.3 中打开的采集窗口下，导航到 555 nm 按钮。通过调整 555 nm 按钮下方的滑动比例，直到读数为 5%，将百分比透射率设置为 5%。
- 设置每个荧光通道的曝光时间。在 采集 窗口下，从曝光下拉菜单中选择 200 毫秒 。
注意：曝光时间和透射率百分比因显微镜而异。为避免过度曝光，请使用尽可能低的透射率和最短的曝光时间，以便正确可视化感兴趣的蛋白质。 - 单击ND采集窗口中Z旁边的框。设置五个相距 1.2 μM 的酵母细胞 z 堆栈。
- 单击 λ 旁边的框。选择要用于实验的适当通道。对于 DIC，请确保从 Z pos 下的下拉菜单中选择 主页 。对于 mCherry，请确保从 Z pos 下的下拉菜单中选择 全部 。这可确保只有单个部分（在 z 堆栈的中间）用于 DIC。
- 在 ND 采集窗口中选中时间旁边的框。选中“阶段”下的框。在间隔下的下拉菜单中，选择 10 分钟。在“持续时间”下，选择 10 小时。这将运行时间过程，以便每 10 分钟拍摄一次图像，持续 10 小时。
5. 染色质分离分析
- 打开斐济软件。一次打开一个视野：对于每个场，打开 DIC 和 mCherry 通道。
- 采用 mCherry 通道的最大强度投影以获得单个图像：单击 图像> Z 项目的堆栈>， 从下拉菜单中选择 最大强度 。
- 将DIC和mCherry通道合并到一个图像中：单击图像> 颜色>合并通道。
- 跟随单个细胞通过减数分裂。减数分裂II完成后，记录DNA质量数。
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Representative Results
为了监测染色质分离，用mCherry标记组蛋白Htb2。在前期I中，染色质显示为单个Htb2肿块。同源染色体在第一次减数分裂中分离后，染色质显示为两个不同的肿块（图3A）。在姐妹染色单体分离后，染色质显示为四个肿块。如果某些染色体未能附着在纺锤体微管上，则在减数分裂I或减数分裂II后可以看到额外的肿块。
上述方法用于研究动粒成分 Ctf19 在确保出芽酵母减数分裂中适当染色体分离中的作用。使用NDT80-in系统（tor1-1; fpr1Δ;RPL13A-FKBP12;CTF19-FRB;GAL1-10推广NDT80;GAL4-ER）。作为对照，使用具有锚离菌株背景但没有FRB标记蛋白的NDT80-in菌株（tor1-1; fpr1Δ;RPL13A-FKBP12;GAL1-10推广NDT80;GAL4-ER）。通过添加β-雌二醇从前期I停滞中释放细胞。在释放时（动粒重组前）、释放后 45 分钟（动粒重组后但减数分裂 I 之前）或释放后 3 小时（减数分裂 II 之前）（图 3A-F）。加入雷帕霉素后，进行延时荧光显微镜检查，并在减数分裂的剩余持续时间内每10分钟获取一次图像。
成像后，使用开放式访问软件斐济打开图像并对显示时间进程的数字进行分析（图3A-F）。减数分裂II后的DNA质量数被计数在每种情况下至少100个正在经历减数分裂的细胞中。在具有锚点背景的野生型细胞中，减数分裂II末端通常有四个DNA团块，代表减数分裂的四种产物（图3A）。在一小部分细胞中，减数分裂II后仅可见三个肿块（图3B，G）。然而，三个肿块很可能是具有四种减数分裂产物的细胞的结果，但其中两个肿块在减数分裂II后一起出现。
当 Ctf19-FRB 在前期 I 出口释放时锚定时（t = 0 小时），大约 47% 的细胞在减数分裂完成后显示四个以上的 DNA 质量，表明动粒和微管的附着存在缺陷（图 3C，G）。在动粒组装后但在减数分裂I（t = 45分钟）或减数分裂II（t = 3小时）之前锚定Ctf19-FRB，大约16%的细胞显示出额外的DNA质量。这些结果支持这样的假设，即 Ctf19 在前期 I 释放时对动粒重新组装很重要，但在动粒重新组装后在染色体分离中就不那么重要了。
这里获得的结果表明，延时显微镜与细胞周期同步和目标蛋白的条件耗竭相结合，可以在特定的减数分裂阶段研究蛋白质。虽然 Ctf19 不是有丝分裂所必需的，但减数分裂动粒被广泛重组，并且 Ctf19 在前期I 退出 9、11、12 后动粒重组中起着至关重要的作用。图3中的结果表明，当Ctf19在动粒重组之前耗尽时，大部分细胞在减数分裂II后显示出额外的DNA质量。当 Ctf19 在动粒重组后但在减数分裂 I 或减数分裂 II 之前从细胞核中耗尽时，显示额外 DNA 质量的细胞较少。这些结果表明，Ctf19最重要的作用是在前期I结束时。染色体分离保真度与不同阶段 Ctf19 耗竭的差异突出了使用阶段特异性条件等位基因来研究减数分裂 I 或减数分裂 II 中蛋白质功能的重要性。减数分裂零突变体将显示严重缺陷，并且不会提供有关Ctf19在每个阶段的作用的信息。
此外，尽管CTF19不是必需基因，但在CTF19突变体19的营养生长过程中存在染色体传递保真度（CTF）表型。使用零等位基因或突变CTF19等位基因可能会产生可能无法正常经历减数分裂的非整倍体细胞群。使用锚移技术和NDT80-in同步系统通过在减数分裂I或减数分裂II之前从细胞核中精确耗尽Ctf19来规避这个问题，从而减少了对分析细胞是非整倍体的担忧。
图 1：实验概述。 显示一对同源染色体的酵母细胞卡通。 NDT80-in细胞进入减数分裂并在前期I时停滞。加入β-雌二醇后，细胞同步进入减数分裂。雷帕霉素的添加决定了目标蛋白（用星星标记）何时锚定。在该实验中，通过在前期I（在t = 0分钟时添加RAP添加），在前期I释放后（在t = 45分钟时添加RAP）和减数分裂I染色体分离后（在t = 3小时添加RAP）的同时添加雷帕霉素（RAP），将目标蛋白Ctf19锚定在三个不同的时间点。黑色粗箭头表示雷帕霉素加成的细胞周期阶段，因此表示靶蛋白耗竭。缩写：RAP = 雷帕霉素。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于延时成像实验 的腔室设置。 （A） 从移液器吸头支架插件（左）切割的可重复使用腔室（右）。移液器吸头支架插件用炽热刀片切割，以去除插入物的 4 方形 x 4 方形部分。虚线表示吸头支架的样品部分，可以切割成腔室。4 方形 x 4 方形切口内剩余的塑料隔板被修剪掉，并保留一个空心室（右）。（B）为了创建最终的腔室，将硅酮密封胶添加到腔室一侧的边缘，然后放置在盖玻片的顶部。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：Ctf19 锚定的时间会影响染色质分离。 （A-F）减数分裂期间表达Htb2-mCherry的细胞的代表性延时图像。每10分钟拍摄一次图像，在加入β-雌二醇后立即拍摄。比例尺= 5 μm。每个帧右上角的数字标记每个帧之间经过的时间，时间 0 表示染色质在减数分裂 I 中分离的帧。仅计数完成减数分裂的细胞。（A）野生型细胞（没有标记FRB的蛋白质），其中在KAc转移后12小时加入β-雌二醇。减数分裂II完成后，细胞包含四个DNA团块。（B）Ctf19-FRB细胞，其中在t = 0时加入雷帕霉素（同时添加β-雌二醇）。该细胞在减数分裂II后显示三个DNA质量。（C）Ctf19-FRB细胞，其中雷帕霉素在t = 0时加入（与β-雌二醇添加同时添加）。该细胞在减数分裂II后显示五个DNA质量。（D）Ctf19-FRB细胞，其中雷帕霉素在t = 0时加入（同时添加β-雌二醇）。该细胞在完成减数分裂II后死亡。（E）Ctf19-FRB细胞，其中雷帕霉素在加入β-雌二醇后45分钟加入。该细胞在减数分裂II后显示五个DNA质量。（F）Ctf19-FRB细胞，其中雷帕霉素在加入β-雌二醇后45分钟加入。减数分裂II后，存在六个DNA团块。（G）定量每种条件下至少100个细胞中的DNA质量数（每种情况分析两个电影）。t = 每个条形下方表示雷帕霉素添加相对于β-雌二醇添加的时间。缩写：MII = 减数分裂 II。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议结合了 NDT80-in系统以同步细胞，锚移技术以从细胞核中去除蛋白质，以及荧光延时显微镜以在减数分裂期间对出芽酵母细胞进行成像。 NDT80-in系统是一种用于减数分裂细胞周期同步的方法，它利用前期I阻滞和释放4，8。尽管单个细胞在随后的每个减数分裂阶段所花费的时间略有不同，但大多数细胞将在整个减数分裂过程中保持高度同步。
锚移技术是有丝分裂和减数分裂研究的适应性工具。通过改变锚定目标蛋白和雷帕霉素添加的时间，该方法可以适用于在出芽酵母减数分裂的任何阶段研究各种蛋白质。制造条件突变体以研究出芽酵母有丝分裂的常用方法并不总是适合减数分裂研究。例如，使用可抑制的启动子通常需要改变碳源以改变靶蛋白的表达，这可能会破坏减数分裂20。温度敏感突变体依靠温度的变化来降低或消除靶蛋白的活性。许多这些条件突变体不能用于减数分裂研究，因为营养条件或温度的变化会破坏减数分裂21，22，23。此外，缺失或突变体可能会限制减数分裂的研究，因为在减数分裂早期表达突变蛋白可能会阻断或对后期产生不利影响。锚移技术可以规避这些挑战，因为它不依赖于营养或温度的变化8。此外，蛋白质的耗竭可以在时间上得到调节，使得雷帕霉素添加的时间决定了蛋白质何时被锚定。
锚移技术的一个局限性是它可能不适用于非核蛋白，因为它依赖于Rpl13A核糖体亚基作为锚将目标蛋白运出细胞核。然而，锚定清除技术还有其他应用，通过改变蛋白质 - 蛋白质相互作用，这些相互作用在减数分裂期间也可能有用，例如将蛋白质锚定到复合物上或将它们拴在膜上8。先前的研究表明，靶蛋白的核耗竭发生在雷帕霉素加成2，8的30分钟内。然而，一些蛋白质可能需要更长或更短的时间才能从细胞核中穿梭出来。为了确保靶蛋白被穿梭出细胞核，可以用与GFP融合的FRB（FRB-GFP）标记靶蛋白，以监测雷帕霉素添加和核耗竭之间的时间长度。锚离开系统的另一个限制是一些蛋白质对C末端的FRB和FRB-GFP标签敏感。因此，用FRB标记目标蛋白的N端标记是锚定靶蛋白的替代策略。
为了监测染色质分离，出芽酵母细胞表达Htb2-mCherry。在该菌株中，Htb2蛋白在其内源性位点被标记，这确保了Htb2正常表达。其他荧光标记的蛋白质也可用于监测减数分裂的不同方面。在构建用于延时成像的菌株时，重要的是要考虑到某些蛋白质对C端荧光标签敏感。含有荧光标记蛋白的菌株的生长和孢子测定确保标签不会改变蛋白质的功能。延时荧光显微镜的一个挑战是将细胞暴露在足够的荧光下，以便检测荧光蛋白，同时避免细胞死亡或因过度暴露而减缓减数分裂。一个重要的故障排除步骤是找到合适的显微镜和相机设置来实现这种平衡。蛋白质之间所需的曝光时间会略有不同，因此应执行实验的多次迭代以确定适当的曝光时间。当使用此处描述的腔室方法进行延时成像实验时，一个特别敏感的步骤是实现要成像的单层细胞。没有单层，细胞会相互堆积，这对正确的成像和数据分析提出了挑战。使用琼脂垫，帮助细胞粘附在ConA上并在腔室周围散布细胞，是获得单层的一种廉价且有效的方法。移动琼脂垫以在腔室周围扩散细胞以实现单层可能具有挑战性。确保琼脂垫在移动过程中进行非常小的运动可以帮助创建单层。制造可重复使用的腔室可以廉价地生成延时成像数据。通过适当的清洁和消毒，此处描述的塑料室可以无限期地重复使用。最佳做法是在延时成像后立即将腔室从盖玻片上取下，并储存在95%乙醇中，直到下次使用。
延时成像提供有关固定细胞成像可能遗漏的细胞周期的信息1，2。例如，当监测减数分裂阶段的持续时间时，与固定细胞群相比，在对活细胞进行成像时可以更准确地检查单细胞之间的差异。由于酵母蛋白可以很容易地用荧光蛋白标记，因此将荧光延时成像与NDT80-in系统和锚点离开技术相结合可以适用于其他研究，例如监测单个染色体分离和特定减数分裂阶段的时间。当监测NDT80-in细胞中前期I释放后的细胞周期进程时，用荧光分子标记蛋白质至关重要，该荧光分子将标记减数分裂的阶段。通过整合表达LacI-GFP的细胞中染色体着丝粒附近的lac操纵子（LacO）的重复序列，可以在整个减数分裂过程中监测单个染色体。LacI-GFP与LacO紧密结合，并被可视化为明亮的焦点，可以通过延时显微镜24，25在整个减数分裂中跟踪。带有荧光标签的各种蛋白质已被用于监测减数分裂阶段的持续时间。这些包括Tub1，掺入微管的α-微管蛋白亚基;Zip1，突触复合物的组成部分;和Spc42，主轴极体组件1，2，26，27。
总之，该方法结合了减数分裂细胞周期同步、靶蛋白的条件耗竭和延时荧光显微镜来研究减数分裂染色体分离。通过在减数分裂期间对出芽酵母细胞进行成像，并使用仅影响减数分裂预期阶段的条件突变体，该方法可以提供有关减数分裂细胞周期的准确数据。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢印第安纳大学的光学显微镜成像中心。这项工作得到了美国国立卫生研究院（GM105755）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
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