Summary
Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.
Abstract
Hızlandırılmış floresan mikroskopi, genellikle sabit hücreleri görüntüleyerek görülmeyen zamansal ve mekansal veriler sağlayarak mayotik hücre döngüsü olaylarının anlaşılmasında devrim yaratmıştır. Tomurcuklanan maya, mayotik kromozom ayrışmasını incelemek için önemli bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır, çünkü birçok mayotik gen oldukça korunmuştur. Tomurcuklanan mayadaki mayozun hızlandırılmış mikroskopisi, mutasyonun mayotik süreçleri nasıl bozduğunu göstermek için farklı mayotik mutantların izlenmesine izin verir. Bununla birlikte, birçok protein mayozda birden fazla noktada işlev görür. Bu nedenle, fonksiyon kaybı veya mayotik null mutantların kullanımı, erken bir süreci bozabilir, daha sonraki süreci bloke edebilir veya rahatsız edebilir ve her bir bireysel rolle ilişkili fenotipleri belirlemeyi zorlaştırabilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, bu protokol, proteinlerin mayozun belirli aşamalarında çekirdekten şartlı olarak nasıl tükenebileceğini açıklarken, hızlandırılmış mikroskopi kullanarak mayotik olayları izler. Spesifik olarak, bu protokol, hücrelerin faz I'de nasıl senkronize edildiğini, çapa atma tekniğinin belirli mayotik aşamalarda çekirdekten proteinleri tüketmek için nasıl kullanıldığını ve mayotik kromozom ayrışmasını izlemek için hızlandırılmış görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar. Tekniğin yararlılığına bir örnek olarak, kinetochore proteini Ctf19, mayozis sırasında farklı zaman noktalarında çekirdekten tükenmiş ve mayoz II'nin sonunda kromatin kütlelerinin sayısı analiz edilmiştir. Genel olarak, bu protokol mayotik bölünmeleri izlerken çekirdekten farklı nükleer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.
Introduction
Hızlandırılmış floresan mikroskobu, tomurcuklanan maya 1,2'deki mayotik kromozom ayrışmasının dinamiklerini incelemek için değerli bir araçtır. Tomurcuklanan maya hücreleri, temel besin maddelerinin açlığı yoluyla mayoza uğramaya teşvik edilebilir3. Mayoz sırasında, hücreler bir tur kromozom ayrışmasına ve ardından sporlara paketlenmiş dört mayotik ürün oluşturmak için iki bölüme ayrılır (Şekil 1). Bireysel hücreler, mayozun her aşamasında görselleştirilebilir, bu da sabit hücreli görüntüleme ile kolayca kaçırılabilecek uzamsal ve zamansal veriler üretir. Bu protokol, hızlandırılmış floresan mikroskopisinin daha önce kurulmuş iki yöntemle, indüklenebilir NDT80 sistemi (NDT80-in) ve çapa uzaklaştırma tekniği ile birleştirilmesinin farklı mayotik aşamalardaki spesifik proteinlerin işlevini incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
NDT80-in sistemi, orta mayoz transkripsiyon faktörü NDT80 4,5'in indüklenebilir ekspresyonuna dayanan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için güçlü bir araçtır. NDT80 ifadesi faz I çıkış 6,7 için gereklidir. NDT80-in sistemi ile NDT80, bir östrojen reseptörüne (Gal4-ER) kaynaşmış Gal4 transkripsiyon faktörünü eksprese eden hücrelerde GAL1-10 promotörünün kontrolü altındadır4,5. Gal4-ER çekirdeğe sadece β-östradiol'e bağlandığında girdiğinden, NDT80-in hücreleri β-östradiol yokluğunda faz I'de durur ve bu da faz I'deki hücrelerin senkronizasyonuna izin verir (Şekil 1). β-östradiol ilavesi, Gal4-ER transkripsiyon faktörünün çekirdeğe translokasyonunu teşvik eder, burada NDT80'in ekspresyonunu sürmek için GAL1-10'u bağlar ve mayotik bölünmelere senkron girişe yol açar. Hızlandırılmış mikroskopi senkronizasyon olmadan yapılabilmesine rağmen, senkronizasyon kullanmanın avantajı, hücreler mayozun belirli bir aşamasındayken bir inhibitör veya ilaç ekleme yeteneğidir.
Çapa atma tekniği, rapamisin8 ilavesiyle bir proteinin çekirdekten tükenebileceği indüklenebilir bir sistemdir. Bu teknik, tomurcuklanan mayadaki hücre bölünmesi sırasında nükleer proteinleri incelemek için idealdir, çünkü maya hücreleri, nükleer zarfın parçalanmadığı kapalı mitoz ve mayoza uğrar. Ayrıca, bu teknik mayozda birden fazla işlevi olan proteinler için çok yararlıdır. Delesyonlardan, mutant alellerden veya mayotik null alellerin aksine, bir hedef proteinin belirli bir aşamada çekirdekten uzaklaştırılması, daha erken aşamalarda hedef protein aktivitesinden ödün vermez ve sonuçların daha doğru bir şekilde yorumlanmasına izin verir. Ankraj uzaklaştırma sistemi, ribozomal olgunlaşma üzerine ortaya çıkan çekirdek ve sitoplazma arasındaki ribozomal alt birimlerin titremesini kullanır8. Hedef proteini çekirdekten tüketmek için, hedef protein, ribozomal alt birim Rpl13A'nın FKBP12 ile etiketlendiği bir suşta FKBP12-rapamisin bağlayıcı etki alanı (FRB) ile etiketlenir. Rapamisin olmadan, FRB ve FKBP12 etkileşime girmez ve FRB etiketli protein çekirdekte kalır. Rapamisin ilavesi üzerine, rapamisin FKBP12 ve FRB ile kararlı bir kompleks oluşturur ve kompleks Rpl13A ile etkileşim nedeniyle çekirdekten dışarı atılır (Şekil 1). Rapatisin ilavesi üzerine hücre ölümünü önlemek için, hücreler TOR1 geninin tor1-1 mutasyonunu barındırır. Ek olarak, bu hücreler, endojen Fpr1'in FRB ve rapamisin bağlanması için Rpl13A-FKBP12'nin rekabet etmesini önleyen S. cerevisiae FKBP12 proteininin boş bir aleli olan fpr1Δ'yu içerir. Arka plan mutasyonlarını (tor1-1 ve fpr1Δ) uzaklaştırmak, mayotik zamanlamaları veya kromozom ayrışması2'yi etkilemez.
Bu tekniğin yararlılığını göstermek için, kinetochore proteini Ctf19, mayozda farklı zaman noktalarında tükenmiştir. Ctf19, mitozda dağıtılabilen ancak mayoz9,10,11,12,13'te uygun kromozom ayrışması için gerekli olan kinetochore'un bir bileşenidir. Mayozda, kinetochore faz I'de dökülür ve Ctf19, kinetochore yeniden montajı 9,14 için önemlidir. Bu protokol için, NDT80-in sistemine sahip hücreler senkronize edildi ve çapa uzaklaştırma tekniği, faz I'den salınmadan önce ve sonra ve mayoz I kromozom ayrışmasından sonra çekirdekten hedef protein Ctf19'u tüketmek için kullanıldı (Şekil 1). Bu protokol, mayoz ve mitozun herhangi bir aşamasında ilgilenilen diğer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gerekli malzemelerin hazırlanması
- Maya hücrelerinin büyümesi ve sporülasyonu için reaktifler hazırlayın.
NOT: Tomurcuklanan maya suşları ade2 - ve trp1- ise, 1.1.1-1.1.3 adımlarındaki tüm ortamları, %1 stoklardan %0,01 adenin ve %0,01 triptofan nihai konsantrasyonu ile tamamlayın. Ortamları otoklav ile sterilize ediyorsanız, bu amino asitleri ancak reaktifler otoklavlandıktan ve oda sıcaklığına soğumaya bırakıldıktan sonra ekleyin.- Vejetatif büyüme için, 500 mL suda 6.7 g maya azot bazını, 2 g tam amino asit karışımını ve 20 g dekstrozu amino asitler olmadan çözerek 2x sentetik tam + dekstroz ortamı (2XSC) hazırlayın. Karışımı 121 °C'de 20 dakika otoklavlayarak veya 0,2 μm'lik bir filtreden süzerek sterilize edin.
- Sporülasyonun ilk adımı için, 500 mL suda 6.7 g maya azot bazını, 2 g tam amino asit karışımını ve 20 g potasyum asetat amino asitsiz çözerek 2x sentetik tam + asetat ortamı (2XSCA) hazırlayın. Karışımı 121 °C'de 20 dakika otoklavlayarak veya 0,2 μm'lik bir filtreden süzerek sterilize edin.
- Sporülasyonun son adımı için, 5 g KAc'yi 500 mL suda çözerek% 1 potasyum asetat (% 1 KAc) hazırlayın. Karışımı 121 °C'de 20 dakika otoklavlayarak veya 0,2 μm'lik bir filtreden süzerek sterilize edin.
- İlaçları ve reaktifleri mikroskopi, senkronizasyon ve çapa için hazırlayın.
- Hızlandırılmış görüntüleme sırasında hücreleri kapak kaymasına yapıştırmak için, 1x PBS'de 1 mg / mL konkanavalin A (ConA) yapın. 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin ve -20 °C'de küçük (~10 μL) alikotları saklayın.
- NDT80-in sistemini kullanmak için, etanol içinde çözünmüş 2 mL 1 mM β-estradiol yapın. 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak filtre sterilize edin ve -20 °C'de alikotları (~ 500 μL) saklayın.
- Ankraj uzaklaştırma sistemi için, DMSO'da çözünmüş 1 mg / mL rapamisin yapın. 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin ve -20 °C'de küçük (~10 μL) alikotları saklayın.
NOT: İlacın çoklu donma-çözülme döngülerini önlemek için küçük rapamisin alikotları hazırlayın.
- NDT80-in sistemini içeren maya suşları oluşturun (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) ve çapa uzaklığındaki genetik arka planda FRB ile etiketlenmiş bir hedef protein (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Bu çalışmada Ctf19-FRB kullanılmıştır. Ek olarak, histon proteini Htb2'nin bir kopyası, mayotik progresyonun ve kromatin ayrışmasının izlenmesine izin vermek için mCherry ile etiketlendi.
- Hızlandırılmış görüntüleme için bir oda hazırlama
- Görüntülemeden 6 saat-24 saat önce odayı hazırlamaya başlayın (Şekil 2). Pipet ucu kutusu ucundan 18 mm x 18 mm'lik bir hazneyi ısıtılmış bir neşter veya başka bir keskin bıçak kullanarak kesin.
- Kapağın kapağına yapışacak olan odanın alt kenarlarının etrafına ince bir silikon dolgu macunu tabakası yaymak için plastik bir pipet ucu kullanın. Odanın kenarlarının tamamen kaplanması için yeterli sızdırmazlık maddesi ekleyin (bkz. Şekil 2).
- Odayı 24 mm x 50 mm'lik bir kapak kaymasına yapıştırın ve hazneyi yavaşça sızdırmazlık maddesini kapak kaymasına yerleştirin. Sızdırmazlık maddesinde boşluk olmadığından emin olun, böylece oda sızmaz.
- Kapak kapağına 8-10 μL ConA yayın. ConA'yı kapak kaymasının ortasına dağıtın ve ConA'yı odayla çevrili kapak kaymasının çoğunu kaplayacak şekilde ince bir tabakaya yaymak için bir pipet ucu kullanın.
NOT: Plastik hazneler süresiz olarak yeniden kullanılabilir. Hızlandırılmış görüntüleme tamamlandıktan sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak odayı kapak kapağından çıkarın, silikon dolgu macununu odadan temizleyin ve odaları ileride kullanmak üzere% 95 etanol içine batırılmış halde tutun.
2. Maya hücrelerinin sporülasyonu
- Mayotik programı indüklemek için maya hücrelerinin açlıktan ölmesi için aşağıdaki adımları uygulayın.
NOT: Bu adımlar, mayanın W303 suşunun sporülasyonu içindir. Diğer suşlar farklı protokoller gerektirebilir15. Sporülasyon verimliliği, laboratuvar suşları arasında oldukça değişkendir ve W303, ~% 60 16,17,18'lik bir sporülasyon verimliliği sergiler.- Bir plakadan uygun diploid maya suşunun tek bir kolonisini alın ve 2 mL 2XSC'yi aşılayın ve doygunluğa 12-24 saat boyunca bir makaralı tambur üzerinde 30 ° C'de büyümeye bırakın.
- Doymuş kültürü, 2.1.1 adımından 2 mL'lik 2XSCA'ya 80 μL kültür ekleyerek 2XSCA'ya seyreltin. 12-16 saat boyunca bir makaralı tambur üzerinde 30 ° C'de büyümesine izin verin. 2XSCA'da 16 saatten daha uzun süre bırakmayın, çünkü hücreler hastalanabilir veya otomatik floresan olabilir.
- Kültürü oda sıcaklığında (25 ° C) 800 x g'da 1 dakika boyunca döndürerek, sıvıyı atarak ve peleti 2 mL steril damıtılmış suda yeniden askıya alarak iki yıkama yapın.
- İkinci yıkamadan sonra, sıvıyı çıkarın ve peleti% 1 KAc'lik 2 mL'de yeniden askıya alın ve 8-12 saat boyunca bir makaralı tambur üzerinde 25 ° C'de büyümesine izin verin. Mayoza giren hücreler, faz I'in pakiteninde tutuklanacaktır.
- Profaze I serbest bırakma sistemi
- β-östradiol'ü doğrudan sporülasyon kültürüne 1 μM'lik bir son konsantrasyona ekleyin ve kültür tüpünü hızlı bir şekilde vorteksleyin. β-östradiol, hücreleri faz I'den serbest bırakacaktır.
3. Çapa atma tekniğini kullanarak hedef proteinin çekirdekten tükenmesi
- FRB etiketli proteini çekirdekten belirli bir aşamada tüketmek için hücrelere rapamisin ekleyin.
- Faz I çıkışında çekirdekten proteinleri tüketmek için, sporülasyon kültürü tüpüne 1 μg / mL'lik son konsantrasyona rapamisin, β-östradiol ilavesiyle aynı anda ekleyin.
- Belirli bir mayozun belirli bir aşamasında çekirdekteki proteinleri tüketmek için, β-östradiol ilavesinden 60 dakika sonra başlayan hücre döngüsü aşamasını izleyin. Her 20 dakikada bir, 24 mm x 40 mm'lik bir kapak kayması üzerine 5 μL kültür pipeti takın ve hücreleri 18 mm x 18 mm'lik bir kapak kayması ile örtün. Kültürlerin makaralı tambur üzerinde zaman noktaları arasında 25 °C'de dönmesini sağlayın.
- A594/mCherry filtresini ve floresan mikroskobun 60x hedefini kullanarak hücreleri görüntüleyin. Yüzde geçirgenliği %2'ye ve maruz kalma süresini 250 ms'ye ayarlayın. Bir, iki veya dört DNA kütlesinin varlığı, hücrelerin ilerlediği mayotik aşamayı gösterecektir. Rapamisin'i, ilgilenilen mayotik aşamada 1 μg / mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
- Hücreleri görüntülemeye hazır olana kadar makaralı tambur üzerinde 25 °C'de döndürün. Bir hedef proteinin nükleer tükenmesi, rapamisin ilavesi 2,8'den 30-45 dakika sonra meydana gelir.
4. Hızlandırılmış floresan mikroskopi
- Görüntüleme için tek katmanlı bir hücre oluşturmak için kullanılacak bir agar pedi yapın (bkz. adım 4.2).
- Bir silindir oluşturmak için 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünün kapağını ve alt 1/3'ünü kesin ve atın. Silindir, agar pedi için bir kalıp görevi görecektir. Agarın ilkinde düzgün bir şekilde polimerize olmaması durumunda fazladan iki silindir yapın.
- Kesilmiş mikrofüj tüpü silindirini, tüpün üst kısmı kızak üzerinde baş aşağı olacak şekilde temiz bir cam slayt üzerine yerleştirin.
- 50 mL'lik bir beherde %5'lik bir agar çözeltisinin 6 mL'sini (çözücü olarak %1 KAc kullanın) yapın ve agar tamamen çözünene kadar mikrodalgada pişirin.
NOT: Agar mikrodalgada kolayca kaynar; agar'ı izleyin ve agar kaynamaya ve beheri döndürmeye başladığında mikrodalgayı başlatın ve durdurun. Agar'ı tamamen çözmek için mikrodalgayı birkaç kez başlatın ve durdurun. Agar çözeltisi, agarın tamamen çözünmesini sağlamak için gereken miktardan fazla yapılır. - Daha büyük bir açıklık yapmak için pipetin ucunu kesin ve her bir mikrofüj tüpü silindirine ~ 500 μL erimiş agar pipetin. Agar katılaşana kadar oda sıcaklığında bekletin (~ 10-12 dakika).
- Maya hücrelerinin görüntüleme için hazırlanması
- 1 mL mikrosantrifüj tüplerinde 2 dakika boyunca 800 x g'de 3.2. adımdan itibaren sporülasyon kültürünün 200 μL'sini döndürün. Süpernatanın 180 μL'sini çıkarın ve atın. Pelet, tüpü döndürerek ve hafifçe vurarak kalan süpernatantta yeniden askıya alın.
- Pipet 6 μL konsantrasyondaki hücrelerin üzerine örtü kayması haznenin ortasındaki 1.4. adımda yapılır.
- Silindiri adım 4.1'de yapılan agar pedi ile tutun ve dikkatlice cam kızaktan kaydırın. Agarın altta tamamen düz olduğundan ve bir pipet ucunun tabanını kullandığından emin olun, mikrofüj kalıbına hafif bir basınç uygulayın, böylece agar pedi tüpün sınırının biraz üzerine itilir.
- Kalıbı, agar pedi odaya doğru aşağı bakacak şekilde ters çevirin.
- Forseps kullanarak, agar pedini (hala mikrofüj tüp kalıbında) hücrelerin üzerine yavaşça yerleştirin. Bir pipet ucu kullanarak agar pedini haznenin etrafında 10-20 kez nazikçe kaydırarak kapak kapağında tek katmanlı bir hücre tabakası oluşturun.
- Agar pedini 12-15 dakika odada bırakın. Bu adım, hücrelerin kapak kapağındaki ConA'ya yapışmasını sağlayacaktır.
- Adım 3.2'den iki mikrosantrifüj tüpüne 2 mL sporülasyon kültürü aktarın ve 2 dakika boyunca 15.700 x g'de döndürün. Süpernatantı temiz mikrofüj tüplerine aktarın ve 2 dakika boyunca 15.700 x g'de tekrar döndürün. Bir sonraki adımda kullanılacak mikrosantrifüj tüplerini temizlemek için süpernatantı aktarın.
NOT: İlgilenilen proteinin verimli sporülasyonunu ve sürekli tükenmesini sağlamak için önceden şartlandırılmış KAc süpernatantının β-estradiol ve rapamisin ile kullanılması önemlidir. - Agar pedi haznede 12-15 dakika oturduktan sonra, görüntülemeden önce agar pedini yüzdürün ve çıkarın. Bunu yapmak için, 4.2.7 adımından odaya damla yönünde 2 mL süpernatant ekleyin. Sıvı odanın tepesine ulaştığında, agar pedi büyük olasılıkla yüzecektir.
NOT: Agar pedi otomatik olarak yüzmezse, 1-2 dakika bekleyin. Agar pedi hala yüzmüyorsa, forsepslerle yavaşça çıkarın. İdeal olarak, agar pedi kendi kendine yüzer, çünkü yüzmeden önce çıkarılması hücrelerin çıkarılmasına yol açabilir. - Agar pedi yüzdükten sonra, forseps ile yavaşça çıkarın ve atın. Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için haznenin üstüne 24 mm x 50 mm'lik bir kapak kayması yerleştirin.
- Mikroskopta bir film ayarlama
NOT: Aşağıdaki talimatlar, 24 mm x 50 mm kapak kaymasını barındıran bir slayt tutucu ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop içindir (mikroskop, kamera ve yazılım ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakınız). Görüntü elde etmek için 60x yağa daldırma hedefi kullanılır. Diğer mikroskoplar veya diğer slayt tutucular kullanılırken bu protokolün değiştirilmesi gerekebilir. Adım 4.3.2'den adım 4.3.16'ya kadar olan adımları yürütmek için tam adımlar, kullanılan mikroskop ve görüntüleme yazılımına bağlı olarak değişecektir. Farklı bir mikroskop için talimatlar için bölüm 4.4'e bakın.- Kapak kapağını sürgü tutucunun içine yerleştirin. Kalıplama kilini, sürgü tutucuda güvende tutmak için kapak kapağının yan tarafına yapıştırın.
- Görüntü alma yazılımını açın. DIC veya brightfield kullanarak hücreleri odaklamak için kurs ve ince ayar düğmelerini kullanın.
- Görüntü alma yazılımının ana menüsünde, Dosya > Edinme (3D Çözümle) üzerine tıklayın. Üç pencere açılır.
- Resolve 3D adlı pencerede, Erlenmeyer Flask simgesine tıklayın. Bu, hızlandırılmış bir film ayarlamak için deneme oluşturmaya yönelik kontrolleri içeren Tasarla/Denemeyi Çalıştır başlıklı bir pencere açar.
- Tasarım sekmesinin altında, Bölümleme etiketli sekmeye gidin. Z Bölümleme'nin yanındaki kutuyu seçin. Z yığınlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: Optik kesit aralığı = 1 μm, Optik bölüm sayısı = 5, Numune kalınlığı = 5,0 μm.
- Kanallar sekmesinin altında, + simgesini tıklayın, böylece bir kanal seçeneği görünür. Uygun kanalı seçin. Bu deney için, mCherry'yi görüntülemek için kullanılan A594'ü seçtik. Referans Görüntü'nün yanındaki kutuyu seçin ve açılır menüden Z konumunu numunenin ortasına ayarlayın.
- Sırasıyla yüzde geçirgenliği ve pozlama süresini ayarlamak için %T ve Exp. öğelerinin yanındaki açılır menüden bir değer seçin. Bu deney için A594 kanalında %2 geçirgenlik ve 250 ms maruz kalma süresi, parlak alan için ise %10 geçirgenlik ve 500 ms maruz kalma süresi kullanılmıştır.
NOT: Maruz kalma süresi ve yüzde geçirgenliği farklı mikroskoplara göre değişecektir. Aşırı maruz kalmayı önlemek için, ilgilenilen proteinin uygun şekilde görselleştirilmesini sağlayan en düşük yüzde geçirgenliği ve mümkün olan en kısa maruz kalma süresini kullanın. - Hızlandırılmış çekim sekmesinin altında, Hızlandırılmış çekim'in yanındaki kutuyu seçin. Görüntülenen tabloda, hızlandırılmış satırdaki minimum sütunun altına 10 ve toplam zaman satırındaki saatler sütununun altına 10 girin. Bu, 10 saat boyunca her 10 dakikada bir görüntü alan bir zaman kursu çalıştıracaktır.
- Film sırasında sahne alanının kaymasını önlemek için Odağı Ultimate Focus ile Koru'nun yanındaki kutuyu seçin. Noktalar sekmesinin altında, Ziyaret Noktası Listesi'nin yanındaki kutuyu seçin.
- Ana menüde, > Noktası Listesini Görüntüle'ye tıklayın. Nokta listesi adlı bir pencere açılacaktır. Sahne alanını, odanın tek katmanlı bir hücre gösteren bir alanına taşıyın. Nokta listesi penceresinde Nokta İşareti'ne tıklayın.
- Hücrelerin aşırı pozlanmasını önlemek için herhangi bir çakışma olmadan 25-30 nokta seçmek için sahne alanını hareket ettirin. Her alan, her zaman kursu sırasında görüntülenecektir.
- Nokta listesi penceresinde, her nokta için nihai odağı ayarlamak üzere Tümünü Kalibre Et'i seçin. Desgin/Run Experiment (Desgin/Denemeyi Çalıştır) penceresindeki Tasarım sekmesinin altında, Nokta Listesini Ziyaret Et'in yanındaki kutuya nokta değerleri aralığını (nokta listesi penceresinden alınan) girin. Çalıştır sekmesi altında, dosyayı bilgisayardaki uygun hedefe kaydedin. Tasarla/Denemeyi Çalıştır penceresinde, filmi başlatmak için Oynat düğmesini (yeşil üçgen simgesi) seçin.
- İsteğe bağlı yöntem: Mikroskopta film ayarlama
NOT: Bu talimatlar, 24 mm x 50 mm'lik bir kapak kaymasını barındırabilen bir slayt tutucu ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop içindir. Kullanılan mikroskop, kamera ve görüntüleme yazılımı hakkında teknik özellikler için Malzeme Tablosu'na bakın. Görüntü elde etmek için 60x yağa daldırma hedefi kullanılır.- Kapak kapağını sürgü tutucunun içine yerleştirin. Görüntü alma yazılımını açın. DIC veya brightfield kullanarak hücreleri odaklamak için kurs ve ince ayar düğmelerini kullanın. Yazılımın açık penceresine sağ tıklayın. Bir açılır menü görünecektir.
- Edinme Kontrolleri > Edinme'ye tıklayın. Denemeyi Tanımla/Çalıştır > Application (Uygulama Tanımla/Çalıştır) seçeneğine tıklayın. Bu, ND Edinme etiketli bir pencere açacaktır.
- Açılan pencerede, XY'nin yanındaki kutuyu işaretleyin. Sahne alanını istediğiniz konuma taşıyın ve o konumu nokta olarak seçmek için Nokta Adı'nın altındaki kutuyu tıklatın. Hücrelerin aşırı pozlanmasını önlemek için herhangi bir örtüşme olmadan 25-30 nokta seçilene kadar bunu tekrarlayın. Her alan, her zaman kursu sırasında görüntülenecektir.
- Her floresan kanal için yüzde geçirgenliği ayarlayın. Suşlar Htb2-mCherry ürettiğinden, burada mCherry filtresi kullanılır. 4.3.3 adımında açılan Edinme penceresinin altında, 555 nm düğmesine gidin. 555 nm düğmesinin altındaki kayar ölçeği %5 okuyana kadar ayarlayarak yüzde geçirgenliği %5 olarak ayarlayın.
- Her floresan kanal için pozlama süresini ayarlayın. Edinme penceresinin altında, Pozlama açılır menüsünden 200 ms'yi seçin.
NOT: Maruz kalma süresi ve yüzde geçirgenliği farklı mikroskoplara göre değişecektir. Aşırı maruz kalmayı önlemek için, ilgilenilen proteinin uygun şekilde görselleştirilmesini sağlayan en düşük yüzde geçirgenliği ve mümkün olan en kısa maruz kalma süresini kullanın. - ND Edinme penceresinde Z'nin yanındaki kutuya tıklayın. Maya hücrelerinin 1.2 μM uzaklıktaki beş z-yığınını ayarlayın.
- λ'nun yanındaki kutuya tıklayın. Deneme için kullanılacak uygun kanalları seçin. DIC için, Z pos altındaki açılır menüden Ana Sayfa'nın seçili olduğundan emin olun. mCherry için, Z pos altındaki açılır menüden Tümü'nün seçili olduğundan emin olun. Bu, DIC için yalnızca tek bir bölümün (z-yığınının ortasında) alınmasını sağlar.
- ND Alma penceresinde Saat'in yanındaki kutuyu seçin. Aşama altındaki kutuyu seçin. Aralık altındaki açılır menüde 10 dakika'yı seçin. Süre altında, 10 saat(ler)i seçin. Bu, görüntülerin 10 saat boyunca her 10 dakikada bir çekileceği şekilde zaman çizelgesi çalışacaktır.
5. Kromatin ayrışmasının analizi
- Fiji yazılımını açın. Aynı anda bir görüş alanı açın: Her alan için DIC ve mCherry kanallarını açın.
- Tek bir görüntü elde etmek için mCherry kanalının maksimum yoğunluk projeksiyonunu alın: Image > Stacks > Z Project'e tıklayın, açılır menüden Maksimum Yoğunluk'u seçin.
- DIC ve mCherry kanallarını tek bir resimde birleştirin: Görüntü > Renk > Kanalları Birleştir'e tıklayın.
- Mayoz yoluyla tek bir hücreyi takip edin. Mayoz II tamamlandıktan sonra, DNA kütlelerinin sayısını kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kromatin ayrışmasını izlemek için, histon proteini Htb2 mCherry ile etiketlendi. Faz I'de, kromatin tek bir Htb2 kütlesi olarak görünür. Homolog kromozomlar ilk mayotik bölünmede ayrıldıktan sonra, kromatin iki ayrı kütle olarak ortaya çıkar (Şekil 3A). Kardeş kromatitler ayrıldıktan sonra, kromatin dört kütle olarak görünür. Bazı kromozomlar iğ mikrotübüllerine tutunamazsa, mayoz I veya mayoz II'den sonra ek kitleler görülebilir.
Yukarıda açıklanan yöntem, tomurcuklanan maya mayozunda uygun kromozom ayrışmasını sağlamada kinetochore bileşeni Ctf19'un rolünü incelemek için kullanılmıştır. FRB ile etiketlenmiş Ctf19'u ifade eden çapa uzak maya suşları, NDT80-in sistemi (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10, NDT80'i terfi ettirdi; GAL4-ER). Kontrol olarak, çapa uzaktaki gerinim arka planına sahip, ancak FRB etiketli protein içermeyen bir NDT80-in suşu kullanıldı (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10, NDT80'i terfi ettirdi; GAL4-ER). Hücreler, β-östradiol ilavesiyle faz I tutuklamasından serbest bırakıldı. Rapamisin, Ctf19-FRB'yi çekirdekten salınımda (kinetochore yeniden montajından önce), salınımdan 45 dakika sonra (kinetochore yeniden montajından sonra ancak mayoz I'den önce) veya salınımdan 3 saat sonra (mayoz II'den hemen önce) tüketmek için eklenmiştir (Şekil 3A-F). Rapamisin ilavesini takiben, hızlandırılmış floresan mikroskobu yapıldı ve kalan mayozis süresi boyunca her 10 dakikada bir görüntüler elde edildi.
Görüntülemeden sonra, görüntüleri açmak ve zaman ilerlemesini gösteren rakamlar için analiz yapmak için açık erişimli yazılım Fiji kullanıldı (Şekil 3A-F). Mayoz II'den sonra DNA kitlelerinin sayısı, durum başına mayoz geçiren en az 100 hücrede sayıldı. Çapa uzakta arka plana sahip vahşi tip hücrelerde, mayoz II'nin sonunda, mayozun dört ürününü temsil eden tipik olarak dört DNA kütlesi vardır (Şekil 3A). Hücrelerin küçük bir kısmında mayoz II sonrası sadece üç kütle görülür (Şekil 3B,G). Bununla birlikte, üç kütlenin, dört mayozis ürününe sahip bir hücrenin sonucu olması muhtemeldir, ancak bu kütlelerden ikisi mayoz II'den sonra birlikte ortaya çıkar.
Faz I çıkışının salınması sırasında Ctf19-FRB demirlendiğinde (t = 0 saat), hücrelerin yaklaşık% 47'si mayozun tamamlanmasından sonra dörtten fazla DNA kütlesi gösterir, bu da kinetochores ve mikrotübüllerin bağlanmasında bir kusur olduğunu düşündürür (Şekil 3C, G). Ctf19-FRB'nin ya kinetochore montajından sonra ancak mayoz I'den önce (t = 45 dakika) veya mayoz II'den önce (t = 3 saat) demirlenmesiyle, hücrelerin yaklaşık% 16'sı ek DNA kütleleri gösterir. Bu sonuçlar, Ctf19'un faz I salınımında kinetochore yeniden montajı için önemli olduğu, ancak kinetochore yeniden birleştirildikten sonra kromozom ayrışmasında daha az önemli olduğu hipotezini desteklemektedir.
Burada elde edilen sonuçlar, hücre döngüsü senkronizasyonu ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesi ile birleştirilen hızlandırılmış mikroskopinin, belirli bir mayotik aşamada bir proteinin incelenmesine izin verdiğini göstermektedir. Ctf19 mitoz için gerekli olmasa da, mayotik kinetochore kapsamlı bir şekilde yeniden düzenlenir ve Ctf19, faz Içıkışı 9,11,12'den sonra kinetochore yeniden montajında çok önemli bir role sahiptir. Şekil 3'teki sonuçlar, kinetochore yeniden montajından önce Ctf19 tükendiğinde, hücrelerin büyük bir kısmının mayoz II'den sonra ek DNA kütleleri gösterdiğini göstermektedir. Ctf19, kinetochore yeniden montajından sonra çekirdekten tükendiğinde, ancak mayoz I veya mayoz II'den önce, ek DNA kütleleri gösteren daha az hücre vardır. Bu sonuçlar, Ctf19 için en önemli rolün faz I'in sonunda olduğunu göstermektedir. Çeşitli aşamalarda Ctf19'un tükenmesiyle kromozom ayrışma sadakatindeki bu fark, özellikle mayoz I veya mayoz II'de proteinlerin işlevini incelemek için aşamaya özgü koşullu alellerin kullanılmasının önemini vurgulamaktadır. Mayotik bir null mutant ciddi bir kusur gösterecek ve her aşamada Ctf19'un rolü hakkında bilgi vermeyecekti.
Ek olarak, CTF19 esansiyel bir gen olmamasına rağmen, CTF19 mutantlarının vejetatif büyümesi sırasında bir kromozom iletim sadakati ( ctf ) fenotipi vardır19. Boş bir alel veya mutant CTF19 alelinin kullanılması, mayoza düzgün bir şekilde maruz kalmayabilecek bir anöploid hücre popülasyonu oluşturabilir. Ankraj uzaklaştırma tekniğinin ve NDT80-in senkronizasyon sisteminin kullanılması, mayozis I veya mayoz II'den hemen önce çekirdekten Ctf19'u kesin olarak tüketerek bu sorunu ortadan kaldırır ve analiz edilen hücrelerin anöploid olduğu endişesini azaltır.
Şekil 1: Denemeye genel bakış. Tek bir çift homolog kromozom gösteren maya hücresi karikatürü. NDT80-in hücreleri mayoza girer ve faz I'de tutuklanır. β-östradiol ilavesinden sonra, hücreler mayotik bölünmelere eşzamanlı olarak girerler. Rapatisin ilavesi, hedef proteinin (bir yıldızla işaretlenmiş) ne zaman demirlendiğini belirler. Bu deneyde, hedef protein Ctf19, faz I (t = 0 dakikada RAP ilavesi), faz I salınımından sonra (t = 45 dakikada RAP ilavesi) ve mayoz I kromozom ayrışmasından sonra (t = 3 saatte RAP ilavesi) aynı anda rapamisin (RAP) eklenerek üç farklı zaman noktasında demirlendi. Kalın siyah oklar, rapamisin ilavesinin hücre döngüsü aşamasını gösterir ve bu nedenle protein tükenmesini hedefler. Kısaltmalar: RAP = rapamicin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hızlandırılmış görüntüleme deneyleri için hazne kurulumu. (A) Pipet ucu tutucu yuvasından kesilmiş yeniden kullanılabilir bölme (sağda) (solda). Pipet ucu tutucu ucu, kesici ucun 4 kare x 4 kare kısmını çıkarmak için kırmızı-sıcak bir bıçakla kesilir. Kesikli çizgiler, uç tutucunun bir hazne yapmak için kesilebilen örnek bir bölümünü gösterir. 4 kare x 4 kare kesim içinde kalan plastik bölücüler kesilir ve içi boş bir oda kalır (sağda). (B) Son hazneyi oluşturmak için, haznenin bir tarafındaki kenarlara silikon dolgu macunu eklenir ve daha sonra bir kapak kaymasının üzerine yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ctf19'un demirlendiği zaman kromatin ayrışmasını etkiler. (A-F) Mayoz sırasında Htb2-mCherry eksprese eden hücrelerin temsili zaman atlamalı görüntüleri. Görüntüler, β-östradiol eklenmesinin hemen ardından her 10 dakikada bir çekildi. Ölçek çubukları= 5 μm. Her karenin sağ üst köşesindeki sayılar, her kare arasında geçen süreyi etiketler ve zaman 0, kromatinin mayoz I'de ayrıldığı kareyi gösterir. Sadece mayotik bölünmeleri tamamlayan hücreler sayıldı. (A) KAc transferinden 12 saat sonra β-estradiol eklendiği vahşi tip hücre (FRB ile etiketlenmiş protein yok). Hücre, mayoz II'nin tamamlanmasından sonra dört DNA kütlesi içerir. (B) Rapamisinin t = 0'da eklendiği Ctf19-FRB hücresi (β-östradiol ilavesi ile eş zamanlı olarak). Bu hücre mayoz II'den sonra üç DNA kütlesi gösterir. (C) Rapamisinin t = 0'da eklendiği Ctf19-FRB hücresi (β-östradiol ilavesi ile eş zamanlı olarak). Bu hücre mayoz II'den sonra beş DNA kütlesi gösterir. (D) Rapamisinin t = 0'da eklendiği Ctf19-FRB hücresi (β-östradiol ilavesi ile eş zamanlı olarak). Bu hücre mayoz II'yi tamamladıktan sonra ölür. (E) β-östradiol ilavesinden 45 dakika sonra rapamisinin eklendiği Ctf19-FRB hücresi. Bu hücre mayoz II'den sonra beş DNA kütlesi gösterir. (F) β-östradiol ilavesinden 45 dakika sonra rapamisinin eklendiği Ctf19-FRB hücresi. Mayoz II'den sonra altı DNA kütlesi mevcuttur. (G) Her koşul için en az 100 hücredeki DNA kütlelerinin sayısının ölçülmesi (her koşul için analiz edilen iki film). t = her çubuğun altında, β-östradiol ilavesine göre rapamisinin eklendiği zamanı gösterir. Kısaltmalar: MII = mayoz II. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, hücreleri senkronize etmek için NDT80-in sistemini, çekirdekten proteinleri tüketmek için çapa uzaklaştırma tekniğini ve mayoz sırasında tomurcuklanan maya hücrelerini görüntülemek için floresan hızlandırılmış mikroskopiyi birleştirir. NDT80-in sistemi, bir faz I tutuklaması ve 4,8'i serbest bırakan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için bir yöntemdir. Her ne kadar bireysel hücreler sonraki mayotik aşamaların her birinde harcanan zaman miktarında biraz değişse de, çoğu hücre mayotik bölünmeler boyunca yüksek derecede senkronizasyon sağlayacaktır.
Çapa atma tekniği, mitotik ve mayotik çalışmalar için uyarlanabilir bir araçtır. Çapayı hedef proteinden uzaklaştırarak ve rapamisin ilavesinin zamanını değiştirerek, bu yöntem tomurcuklanan maya mayozunun herhangi bir aşamasında çeşitli proteinleri incelemek için uyarlanabilir. Tomurcuklanan maya mitozunu incelemek için koşullu mutantlar yapmak için yaygın yöntemler mayotik çalışmalar için her zaman uygun değildir. Örneğin, önlenebilir bir promotörün kullanımı genellikle hedef proteinin ekspresyonunu değiştirmek için karbon kaynağında bir değişiklik gerektirir ve bu da mayoz20'yi bozabilir. Sıcaklığa duyarlı mutantlar, hedef proteinin aktivitesini azaltmak veya ortadan kaldırmak için sıcaklıktaki bir değişikliğe güvenir. Bu koşullu mutantların birçoğu mayotik çalışmalarda kullanılamaz, çünkü değişen besin koşulları veya sıcaklığı mayoz21,22,23'ü bozabilir. Ayrıca, delesyonlar veya mutantlar mayoz çalışmalarını sınırlayabilir, çünkü mayozun erken dönemlerinde mutant bir proteinin eksprese edilmesi daha sonraki aşamaları bloke edebilir veya olumsuz yönde etkileyebilir. Çapa atma tekniği bu zorlukların üstesinden gelebilir, çünkü beslenme veya sıcaklıktaki değişikliklere dayanmaz8. Dahası, proteinin tükenmesi geçici olarak düzenlenebilir, böylece rapamisin ilavesinin zamanı proteinin ne zaman demirleneceğini belirler.
Çapa uzaklaştırma tekniğinin bir sınırlaması, nükleer olmayan proteinler için uygun olmayabileceğidir, çünkü hedef proteini çekirdekten çıkarmak için bir çapa olarak Rpl13A ribozomal alt birimine dayanır. Bununla birlikte, mayozda da yararlı olabilecek protein-protein etkileşimlerini değiştirerek, proteinleri komplekslere sabitlemek veya membranlara bağlamak gibi çapa uzaklaştırma tekniğinin başka uygulamaları da vardır8. Önceki çalışmalar, hedef proteinlerin nükleer tükenmesinin, rapamisin ilavesi 2,8'den 30 dakika içinde gerçekleştiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bazı proteinlerin çekirdekten dışarı atılması için daha uzun veya daha kısa bir süreye ihtiyaç duyması mümkündür. Hedef proteinin çekirdekten dışarı atılmasını sağlamak için, hedef protein, rapamisin ilavesi ile nükleer tükenme arasındaki sürenin uzunluğunu izlemek için GFP'YE (FRB-GFP) kaynaştırılmış FRB ile etiketlenebilir. Ankraj uzaklaştırma sisteminin bir başka sınırlaması, bazı proteinlerin C-terminusundaki FRB ve FRB-GFP etiketlerine duyarlı olmasıdır. Bu nedenle, hedef proteinin FRB ile N-terminal etiketlemesi, bir hedef proteini uzaklaştırmak için alternatif bir stratejidir.
Kromatin ayrışmasını izlemek için, tomurcuklanan maya hücreleri Htb2-mCherry'yi eksprese etti. Bu suşta, Htb2 proteini endojen lokusunda etiketlenir ve bu da Htb2'nin normal şekilde eksprese edilmesini sağlar. Diğer floresan etiketli proteinler de mayozun farklı yönlerini izlemek için kullanılabilir. Hızlandırılmış görüntüleme için bir suş oluştururken, bazı proteinlerin C-terminal floresan etiketlerine duyarlı olduğunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Floresan olarak etiketlenmiş proteini barındıran suşun büyüme ve sporülasyon testleri, etiketin proteinin işlevini değiştirmemesini sağlar. Hızlandırılmış floresan mikroskobunun bir zorluğu, hücreleri yeterli floresana maruz bırakmaktır, böylece floresan proteinler hücre ölümünü önlerken veya mayozun aşırı maruziyetten yavaşlamasını önlerken tespit edilir. Önemli bir sorun giderme adımı, bu dengeyi sağlamak için uygun mikroskop ve kamera ayarlarını bulmaktır. Gerekli maruz kalma süresi proteinler arasında biraz değişecektir, bu nedenle uygun maruz kalma süresini belirlemek için bir deneyin çoklu yinelemeleri yapılmalıdır. Hızlandırılmış görüntüleme deneyleri için burada açıklanan oda yöntemini kullanırken, özellikle hassas bir adım, görüntülenecek tek katmanlı bir hücre elde etmektir. Tek katmanlı olmadan, hücreler birbirlerinin üzerinde birikir ve bu da uygun görüntüleme ve veri analizi için bir zorluk oluşturur. Hücrelerin ConA'ya yapışmasına yardımcı olan ve hücreleri odanın etrafına yayan bir agar pedi kullanmak, tek katmanlı maddeler elde etmenin ucuz ve etkili bir yoludur. Agar pedini, hücreleri odanın etrafına yaymak için hareket ettirmek, böylece tek katmanlı bir tabaka elde etmek zor olabilir. Hareketli işlem sırasında agar pedinin çok küçük hareketler yapmasını sağlamak, tek katmanlı bir tabaka oluşturmaya yardımcı olabilir. Yeniden kullanılabilir bir oda yapmak, hızlandırılmış görüntüleme verilerinin ucuz bir şekilde üretilmesini sağlar. Uygun temizlik ve dezenfekte ile burada açıklanan plastik odalar süresiz olarak yeniden kullanılabilir. Hızlandırılmış görüntülemenin hemen ardından haznelerin kapak kapağından çıkarılması ve bir sonraki kullanıma kadar% 95 etanol içinde saklanması en iyi uygulamadır.
Hızlandırılmış görüntüleme, sabit hücreleringörüntülenmesinden kaçırılabilecek hücre döngüsü hakkında bilgi sağlar 1,2. Örneğin, mayotik aşamaların süresini izlerken, canlı hücreleri görüntülerken sabit hücrelerin popülasyonlarına kıyasla tek hücreler arasındaki varyasyonlar daha doğru bir şekilde incelenebilir. Maya proteinleri floresan proteinleri ile kolayca etiketlenebildiğinden, floresan hızlandırılmış görüntülemenin NDT80-in sistemi ve çapa uzaklaştırma tekniği ile bağlanması, bireysel kromozom ayrışmasının izlenmesi ve spesifik mayotik aşamaların zamanlaması gibi ek çalışmalar için uyarlanabilir. NDT80-in hücrelerinde faz I salınımını takiben hücre döngüsü ilerlemesini izlerken, mayozun aşamalarını işaretleyecek bir floresan molekülü ile etiketlenmiş bir proteine sahip olmak çok önemlidir. Bireysel kromozomlar, LacI-GFP'yi eksprese eden hücrelerdeki bir kromozomun sentromerinin yakınındaki lak operonun (LacO) tekrarlarını entegre ederek mayoz boyunca izlenebilir. LacI-GFP, LacO'ya sıkıca bağlanır ve mayotik bölünmeler boyunca hızlandırılmış mikroskopi24,25 ile takip edilebilen parlak bir odak olarak görselleştirilir. Mayotik aşamaların süresini izlemek için floresan etiketli çeşitli proteinler kullanılmıştır. Bunlar arasında mikrotübüllere dahil olan α-tübülin alt birimi olan Tub1; Sinaptonemal kompleksin bir bileşeni olan Zip1; ve Spc42, bir iş mili kutup gövdesi bileşeni 1,2,26,27.
Sonuç olarak, bu yöntem mayotik kromozom ayrışmasını incelemek için mayotik hücre döngüsü senkronizasyonunu, bir hedef proteinin koşullu tükenmesini ve hızlandırılmış floresan mikroskopisini içerir. Mayoz sırasında tomurcuklanan maya hücrelerini görüntüleyerek ve mayozun sadece amaçlanan aşamalarını etkileyen koşullu mutantlar kullanarak, bu yöntem mayotik hücre döngüsü hakkında doğru veriler sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Indiana Üniversitesi Işık Mikroskobu Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (GM105755) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A.
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
