Summary
A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.
Abstract
A microscopia de fluorescência de lapso de tempo revolucionou a compreensão dos eventos do ciclo celular meiótico, fornecendo dados temporais e espaciais que muitas vezes não são vistos por imagens de células fixas. A levedura em brotamento provou ser um importante organismo modelo para estudar a segregação cromossômica meiótica, porque muitos genes meióticos são altamente conservados. A microscopia de lapso de tempo da meiose em levedura em brotamento permite o monitoramento de diferentes mutantes meióticos para mostrar como a mutação interrompe os processos meióticos. No entanto, muitas proteínas funcionam em vários pontos da meiose. O uso de mutantes nulos meióticos ou meióticos pode, portanto, interromper um processo precoce, bloqueando ou perturbando o processo posterior e dificultando a determinação dos fenótipos associados a cada papel individual. Para contornar esse desafio, este protocolo descreve como as proteínas podem ser condicionalmente esgotadas do núcleo em estágios específicos da meiose enquanto monitoram eventos meióticos usando microscopia de lapso de tempo. Especificamente, este protocolo descreve como as células são sincronizadas na prófase I, como a técnica de ancoragem é usada para esgotar proteínas do núcleo em estágios meióticos específicos e como a imagem de lapso de tempo é usada para monitorar a segregação cromossômica meiótica. Como exemplo da utilidade da técnica, a proteína cinetócora Ctf19 foi esgotada do núcleo em diferentes momentos durante a meiose, e o número de massas de cromatina foi analisado no final da meiose II. No geral, este protocolo pode ser adaptado para esgotar diferentes proteínas nucleares do núcleo enquanto monitora as divisões meióticas.
Introduction
A microscopia de fluorescência time-lapse é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica da segregação cromossômica meiótica em leveduras em brotamento 1,2. As células de levedura em brotamento podem ser induzidas a sofrer meiose através da fome de nutrientes essenciais3. Durante a meiose, as células passam por uma rodada de segregação cromossômica seguida de duas divisões para criar quatro produtos meióticos que são embalados em esporos (Figura 1). Células individuais podem ser visualizadas ao longo de cada estágio da meiose, o que gera dados espaciais e temporais que podem ser facilmente perdidos por imagens de células fixas. Este protocolo mostra como a combinação da microscopia de fluorescência de lapso de tempo com dois métodos previamente estabelecidos, o sistema induzível NDT80 (NDT80-in) e a técnica de anchor away, pode ser usada para estudar a função de proteínas específicas em estágios meióticos distintos.
O sistema NDT80-in é uma poderosa ferramenta para sincronização do ciclo celular meiótico que se baseia na expressão induzível do fator de transcrição da meiose média NDT80 4,5. A expressão NDT80 é necessária para a saída 6,7 da prófase I. Com o sistema NDT80-in, o NDT80 está sob o controle do promotor GAL1-10 em células que expressam o fator de transcrição Gal4 fundido a um receptor de estrogênio (Gal4-ER)4,5. Como a Gal4-ER só entra no núcleo quando ligada ao β-estradiol, as células NDT80-in param na prófase I na ausência de β-estradiol, o que permite a sincronização das células na prófase I (Figura 1). β adição de estradiol promove a translocação do fator de transcrição Gal4-ER para o núcleo, onde se liga à GAL1-10 para impulsionar a expressão de NDT80, levando à entrada síncrona nas divisões meióticas. Embora a microscopia de lapso de tempo possa ser realizada sem sincronização, a vantagem de usar a sincronização é a capacidade de adicionar um inibidor ou uma droga enquanto as células estão em um estágio específico da meiose.
A técnica de anchor away é um sistema induzível pelo qual uma proteína pode ser esgotada do núcleo com a adição de rapamicina8. Esta técnica é ideal para estudar proteínas nucleares durante a divisão celular em leveduras em brotamento, porque as células de levedura sofrem mitose e meiose fechadas, nas quais o envelope nuclear não se decompõe. Além disso, esta técnica é muito útil para proteínas que têm múltiplas funções ao longo da meiose. Ao contrário de deleções, alelos mutantes ou alelos nulos meióticos, a remoção de uma proteína-alvo do núcleo em um estágio específico não compromete a atividade da proteína-alvo em estágios anteriores, permitindo uma interpretação mais precisa dos resultados. O sistema de ancoragem afastada utiliza o deslocamento de subunidades ribossomais entre o núcleo e o citoplasma que ocorre na maturação ribossômica8. Para esgotar a proteína-alvo do núcleo, a proteína-alvo é marcada com o domínio de ligação à rapamicina FKBP12 (FRB) em uma cepa na qual a subunidade ribossomal Rpl13A é marcada com FKBP12. Sem rapamicina, FRB e FKBP12 não interagem, e a proteína marcada com FRB permanece no núcleo. Após a adição de rapamicina, a rapamicina forma um complexo estável com FKBP12 e FRB, e o complexo é transportado para fora do núcleo devido à interação com Rpl13A (Figura 1). Para evitar a morte celular após a adição de rapamicina, as células abrigam a mutação tor1-1 do gene TOR1 . Além disso, essas células contêm fpr1Δ , um alelo nulo da proteína S. cerevisiae FKBP12, que impede que a Fpr1 endógena supere a Rpl13A-FKBP12 para FRB e ligação à rapamicina. As mutações de fundo ancoradas afastadas, tor1-1 e fpr1Δ, não afetam os tempos meióticos ou a segregação cromossômica2.
Para demonstrar a utilidade desta técnica, a proteína cinetócora Ctf19 foi esgotada em diferentes momentos ao longo da meiose. Ctf19 é um componente do cinetócoro que é dispensável na mitose, mas necessário para a segregação cromossômica adequada na meiose 9,10,11,12,13. Na meiose, o cinetócoro é eliminado na prófase I, e o Ctf19 é importante para a remontagem do cinetócoro 9,14. Para este protocolo, as células com o sistema NDT80-in foram sincronizadas, e a técnica de anchor away foi utilizada para esgotar a proteína-alvo Ctf19 do núcleo antes e após a liberação da prófase I e após a segregação cromossômica da meiose I (Figura 1). Este protocolo pode ser adaptado para esgotar outras proteínas de interesse em qualquer estágio da meiose e mitose.
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Protocol
1. Preparação dos materiais necessários
- Preparar reagentes para o crescimento e esporulação de células de levedura.
NOTA: Se as cepas de levedura em brotamento forem ade2 - e trp1-, complemente todos os meios nas etapas 1.1.1-1.1.3 com uma concentração final de 0,01% de adenina e 0,01% de triptofano de 1% de estoques. Se o meio esterilizante por autoclave, adicione estes aminoácidos somente depois que os reagentes tiverem sido autoclavados e deixados esfriar até a temperatura ambiente.- Para o crescimento vegetativo, prepare 2x meio sintético completo + dextrose (2XSC) dissolvendo 6,7 g de levedura nitrogenada base sem aminoácidos, 2 g de mistura completa de aminoácidos e 20 g de dextrose em 500 mL de água. Esterilizar a mistura por autoclave durante 20 minutos a 121 °C ou filtrando através de um filtro de 0,2 μm.
- Para a primeira etapa da esporulação, prepare 2x meio sintético completo + acetato (2XSCA) dissolvendo 6,7 g de levedura à base de nitrogênio sem aminoácidos, 2 g de mistura completa de aminoácidos e 20 g de acetato de potássio em 500 mL de água. Esterilizar a mistura por autoclave durante 20 minutos a 121 °C ou filtrando através de um filtro de 0,2 μm.
- Para a etapa final da esporulação, prepare acetato de potássio a 1% (1% de KAc) dissolvendo 5 g de KAc em 500 mL de água. Esterilizar a mistura por autoclave durante 20 minutos a 121 °C ou filtrando através de um filtro de 0,2 μm.
- Prepare medicamentos e reagentes para microscopia, sincronização e ancoragem.
- Para aderir células ao coverslip durante a imagem de lapso de tempo, faça 1 mg/mL de concanavilina A () em 1x PBS. Esterilizar o filtro utilizando um filtro de 0,2 μm e armazenar alíquotas pequenas (~10 μL) a -20 °C.
- Para usar o sistema NDT80-in, faça 2 mL de 1 mM β-estradiol dissolvido em etanol. Esterilizar o filtro utilizando um filtro de 0,2 μm e armazenar alíquotas (~500 μL) a -20 °C.
- Para o sistema de ancoragem afastada, produzir 1 mg/mL de rapamicina dissolvida em DMSO. Esterilizar o filtro utilizando um filtro de 0,2 μm e armazenar alíquotas pequenas (~10 μL) a -20 °C.
NOTA: Prepare pequenas alíquotas de rapamicina para evitar múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento da droga.
- Gerar cepas de levedura contendo o sistema NDT80-in (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) e uma proteína-alvo marcada com FRB no fundo genético da âncora (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. O Ctf19-FRB foi utilizado para este estudo. Além disso, uma cópia da proteína histona Htb2 foi marcada com mCherry para permitir o monitoramento da progressão meiótica e da segregação da cromatina.
- Preparar uma câmara para imagens de lapso de tempo
- Iniciar o preparo da câmara 6 h-24 h antes da imagem (Figura 2). Corte uma câmara de 18 mm x 18 mm da inserção da caixa de ponta da pipeta usando um bisturi aquecido ou outra lâmina afiada.
- Use uma ponta de pipeta de plástico para espalhar uma fina camada de selante de silicone ao redor das bordas inferiores da câmara que aderirá à tampa. Adicionar selante suficiente para que as arestas da câmara fiquem completamente cobertas (ver figura 2).
- Aderir a câmara a uma folha de cobertura de 24 mm x 50 mm, colocando suavemente a câmara, de lado para baixo, na folha de cobertura. Certifique-se de que não há lacunas no selante para que a câmara não vaze.
- Espalhe 8-10 μL de na folha de cobertura. Dispense o no meio da tampa e use uma ponta de pipeta para espalhar o em uma camada fina de tal forma que cubra a maior parte do deslizamento da tampa que é cercado pela câmara.
NOTA: As câmaras de plástico podem ser reutilizadas indefinidamente. Após a conclusão da imagem de lapso de tempo, remova a câmara da lâmina de cobertura usando uma navalha, limpe o selante de silicone da câmara e mantenha as câmaras submersas em etanol a 95% para uso futuro.
2. Esporulação de células de levedura
- Execute os seguintes passos para a fome de células de levedura para induzir o programa meiótico.
NOTA: Estes passos destinam-se à esporulação da estirpe de levedura W303. Outras cepas podem exigir protocolos diferentes15. A eficiência de esporulação é altamente variável entre as cepas de laboratório, com W303 exibindo uma eficiência de esporulação de ~60%16,17,18.- Pegue uma única colônia da cepa de levedura diploide apropriada de uma placa e inocular 2 mL de 2XSC e deixe crescer a 30 °C em um tambor de rolo por 12-24 h até a saturação.
- Diluir a cultura saturada em 2XSCA adicionando 80 μL da cultura da etapa 2.1.1 a 2 mL de 2XSCA. Deixe crescer a 30 °C em um tambor de rolo por 12-16 h. Não deixe em 2XSCA por mais de 16 h porque as células podem ficar doentes ou auto-fluorescentes.
- Realizar duas lavagens girando a cultura a 800 x g à temperatura ambiente (25 °C) por 1 min, descartando o líquido e ressuspendendo o pellet em 2 mL de água destilada estéril.
- Após a segunda lavagem, retire o líquido e ressuscite o pellet em 2 mL de KAc a 1% e deixe-o crescer a 25 °C em um tambor de rolo por 8-12 h. As células que entraram na meiose irão parar no paquiteno da prófase I.
- Sistema de liberação Prophase I
- Adicionar β-estradiol diretamente à cultura de esporulação a uma concentração final de 1 μM e vórtice o tubo de cultura rapidamente. O β-estradiol liberará células da prófase I.
3. Depleção da proteína-alvo do núcleo usando a técnica de ancoragem afastada
- Adicione rapamicina às células para esgotar a proteína marcada com FRB do núcleo em um estágio específico.
- Para esgotar as proteínas do núcleo na saída da prófase I, adicione rapamicina a uma concentração final de 1 μg/mL ao tubo de cultura de esporulação ao mesmo tempo que a adição de β-estradiol.
- Para esgotar as proteínas do núcleo em um estágio específico da meiose, monitore o estágio do ciclo celular a partir de 60 minutos após a adição de β-estradiol. A cada 20 minutos, pipete 5 μL de cultura para uma tampa de 24 mm x 40 mm e cubra as células com uma tampa de 18 mm x 18 mm. Mantenha as culturas girando no tambor do rolo a 25 °C entre os pontos de tempo.
- Fotografe as células usando o filtro A594/mCherry e a objetiva de 60x de um microscópio de fluorescência. Defina a porcentagem de transmitância para 2% e o tempo de exposição para 250 ms. A presença de uma, duas ou quatro massas de DNA indicará o estágio meiótico em que as células progrediram. Adicionar rapamicina a uma concentração final de 1 μg/ml na fase meiótica de interesse.
- Mantenha as células girando no tambor do rolo a 25 °C até que estejam prontas para a geração de imagens. A depleção nuclear de uma proteína-alvo ocorre 30-45 min após a adição de rapamicina 2,8.
4. Microscopia de fluorescência de lapso de tempo
- Faça uma almofada de ágar que será usada para criar uma monocamada de células para geração de imagens (consulte a etapa 4.2).
- Corte e descarte a tampa e o fundo 1/3 de um tubo de microfuga de 1,5 mL para criar um cilindro. O cilindro servirá como um molde para a almofada de ágar. Faça dois cilindros para ter um extra caso o ágar não polimerize adequadamente no primeiro.
- Coloque o cilindro do tubo de microfuga cortado em uma lâmina de vidro limpa com a parte superior do tubo de cabeça para baixo sentada no slide.
- Faça 6 mL de uma solução de ágar a 5% (use 1% de KAc como solvente) em um copo de 50 mL e coloque-o no micro-ondas até que o ágar esteja totalmente dissolvido.
NOTA: O ágar ferverá facilmente no micro-ondas; observe o ágar e inicie e pare o micro-ondas quando o ágar começar a ferver e girar o béquer. Inicie e pare o micro-ondas várias vezes para dissolver completamente o ágar. A solução de ágar é feita em excesso da quantidade necessária para garantir que o ágar se dissolva completamente. - Corte a ponta do pipete para fazer uma abertura maior e pipete ~500 μL de ágar derretido em cada cilindro de tubo de microfuga. Deixe descansar à temperatura ambiente até que o ágar se solidifique (~10-12 min).
- Preparação de células de levedura para imagens
- Gire 200 μL da cultura de esporulação a partir do passo 3.2 a 800 x g por 2 min em tubos de microcentrífuga de 1 mL. Remover e eliminar 180 μL do sobrenadante. Ressuspeite a pastilha no sobrenadante restante girando e agitando o tubo.
- Pipetar 6 μL das células concentradas para a tampa no meio da câmara feita na etapa 1.4.
- Segure o cilindro com a almofada de ágar feita na etapa 4.1 e deslize-a cuidadosamente para fora da lâmina de vidro. Certifique-se de que o ágar esteja completamente plano na parte inferior e, usando a parte inferior de uma ponta de pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão no molde de microfuga, de modo que a almofada de ágar seja empurrada ligeiramente acima do limite do tubo.
- Inverta o molde de modo que a almofada de ágar esteja voltada para baixo em direção à câmara.
- Usando fórceps, coloque suavemente a almofada de ágar (ainda no molde do tubo de microfuga) em cima das células. Use uma ponta de pipeta para deslizar suavemente a almofada de ágar ao redor da câmara 10-20 vezes para criar uma monocamada de células na tampa.
- Deixe a almofada de ágar na câmara por 12-15 min. Esta etapa permitirá que as células adiram ao na folha de cobertura.
- Transferir 2 mL de cultura de esporulação da etapa 3.2 para dois tubos de microcentrífuga e girar a 15.700 x g por 2 min. Transfira o sobrenadante para tubos de microfuga limpos e gire novamente a 15.700 x g por 2 min. Transfira o sobrenadante para tubos de microcentrífuga limpos a serem usados na próxima etapa.
NOTA: É importante usar o sobrenadante KAc pré-condicionado com o β-estradiol e rapamicina para garantir uma esporulação eficiente e depleção contínua da proteína de interesse. - Depois que a almofada de ágar tiver ficado na câmara por 12-15 minutos, flutue e remova a almofada de ágar antes da imagem. Para o fazer, adicionar 2 ml do sobrenadante da etapa 4.2.7 dropwise à câmara. Uma vez que o líquido tenha atingido o topo da câmara, a almofada de ágar provavelmente flutuará.
NOTA: Se a almofada de ágar não flutuar automaticamente, aguarde 1-2 min. Se a almofada de ágar ainda não flutuar, remova-a suavemente com fórceps. Idealmente, a almofada de ágar flutuaria por conta própria, porque removê-la antes de flutuar poderia levar à remoção das células. - Depois que a almofada de ágar flutuar, remova-a suavemente com pinça e descarte-a. Coloque uma tampa de 24 mm x 50 mm na parte superior da câmara para evitar a evaporação durante a imagem.
- Configurando um filme no microscópio
NOTA: As instruções abaixo são para um microscópio invertido equipado com um suporte de lâmina que acomoda a tampa de 24 mm x 50 mm (consulte a Tabela de Materiais para detalhes do microscópio, da câmera e do software). Uma objetiva de imersão em óleo de 60x é usada para aquisição de imagens. Este protocolo pode precisar ser alterado ao usar outros microscópios ou outros suportes de lâminas. As etapas exatas para executar as etapas 4.3.2 a 4.3.16 variam dependendo do microscópio e do software de imagem usado. Ver secção 4.4 para instruções para um microscópio diferente.- Encaixe a tampa dentro do suporte deslizante. Cole a argila de moldagem ao lado da tampa para mantê-la segura no suporte da corrediça.
- Abra o software de aquisição de imagens. Use os botões de ajuste fino e de curso para focar as células usando DIC ou campo brilhante.
- No menu principal do software de aquisição de imagens, clique em Arquivo > Adquirir (Resolve 3D). Três janelas irão aparecer.
- Na janela chamada Resolve 3D, clique no ícone do Erlenmeyer Flask . Isso abrirá uma janela intitulada Design/Run Experiment, que contém os controles para configurar um experimento para configurar um filme de lapso de tempo.
- Na guia Design , navegue até a guia Seccionamento. Marque a caixa ao lado de Seção Z. Defina as pilhas z da seguinte forma: Espaçamento óptico entre seções = 1 μm, Número de seções ópticas = 5, Espessura da amostra = 5,0 μm.
- Na guia Canais , clique no ícone + para que uma opção de canal apareça. Selecione o canal apropriado. Para este experimento, selecionamos A594, que é usado para criar imagens mCherry. Marque a caixa ao lado de Imagem de referência e defina a posição Z para o meio da amostra no menu suspenso.
- Selecione um valor no menu suspenso adjacente a %T e Exp. para definir a porcentagem de transmitância e o tempo de exposição, respectivamente. Para este experimento, 2% de transmitância e 250 ms de tempo de exposição são usados no canal A594, e 10% de transmitância e 500 ms de tempo de exposição são usados para campo brilhante.
NOTA: O tempo de exposição e a porcentagem de transmitância variam com diferentes microscópios. Para evitar a superexposição, use a menor porcentagem de transmitância e o menor tempo de exposição possível, o que permita a visualização adequada da proteína de interesse. - Na guia Time-lapse, marque a caixa ao lado de Time-lapse. Na tabela exibida, insira 10 na coluna min na linha de lapso de tempo e 10 na coluna de horas na linha de tempo total. Isso executará um curso de tempo tirando imagens a cada 10 minutos por 10 h.
- Marque a caixa ao lado de Manter o foco com foco final para evitar desvios de palco durante o filme. Na guia Pontos , marque a caixa ao lado de Visitar Lista de Pontos.
- No menu principal, clique em Exibir > Lista de Pontos. Uma janela chamada lista de pontos será exibida. Mova o palco para uma área da câmara que mostre uma monocamada de células. Clique em Marcar ponto na janela da lista de pontos.
- Mova o palco para selecionar de 25 a 30 pontos sem qualquer sobreposição para evitar a superexposição das células. Cada campo será fotografado durante cada curso de tempo.
- Na janela da lista de pontos, selecione Calibrar tudo para definir o foco final para cada ponto. Na guia Design na janela Desgin/Run Experiment , insira o intervalo de valores de ponto (obtidos na janela da lista de pontos) na caixa ao lado de Visitar Lista de Pontos. Na guia Executar , salve o arquivo no destino apropriado no computador. Na janela Design/Executar experimento , selecione o botão Reproduzir (ícone de triângulo verde) para iniciar o filme.
- Método opcional: Configurando um filme em um microscópio
NOTA: Estas instruções destinam-se a um microscópio invertido equipado com um suporte de lâmina que pode acomodar uma tampa de 24 mm x 50 mm. Consulte Tabela de materiais para obter especificações sobre o microscópio, a câmera e o software de imagem usados. Uma objetiva de imersão em óleo de 60x é usada para aquisição de imagens.- Encaixe a tampa dentro do suporte deslizante. Abra o software de aquisição de imagens. Use botões de ajuste fino e de curso para focar células usando DIC ou campo brilhante. Clique com o botão direito do mouse na janela aberta do software. Um menu suspenso será exibido.
- Clique em Controles de Aquisição > Aquisição. Clique em Aplicativo > Definir/Executar Experimento. Isso abrirá uma janela chamada ND Acquisition.
- Na janela que se abre, marque a caixa ao lado de XY. Mova o palco para o local desejado e clique na caixa em Nome do ponto para selecionar esse local como um ponto. Repita isso até que 25-30 pontos sejam selecionados sem qualquer sobreposição para evitar a superexposição das células. Cada campo será fotografado durante cada curso de tempo.
- Defina a porcentagem de transmitância para cada canal fluorescente. Como as cepas produzem Htb2-mCherry, o filtro mCherry é usado aqui. Na janela Aquisição aberta na etapa 4.3.3, navegue até o botão de 555 nm. Defina a porcentagem de transmitância para 5% ajustando a escala deslizante sob o botão de 555 nm até que ela leia 5%.
- Defina o tempo de exposição para cada canal fluorescente. Na janela Aquisição , selecione 200 ms no menu suspenso Exposição.
NOTA: O tempo de exposição e a porcentagem de transmitância variam com diferentes microscópios. Para evitar a superexposição, use a menor porcentagem de transmitância e o menor tempo de exposição possível, o que permita a visualização adequada da proteína de interesse. - Clique na caixa ao lado de Z na janela ND Acquisition . Defina cinco z-stacks das células de levedura que estão separadas por 1,2 μM.
- Clique na caixa ao lado de λ. Selecione os canais apropriados a serem usados para o experimento. Para DIC, certifique-se de que Home está selecionado no menu suspenso em Z pos. Para mCherry, certifique-se de que Tudo está selecionado no menu suspenso em Z pos. Isso garante que, apenas uma única seção (no meio da pilha z) seja tomada para DIC.
- Marque a caixa ao lado de Hora na janela Aquisição de ND . Marque a caixa em Fase. No menu suspenso em Intervalo, selecione 10 min. Em Duração, selecione 10 hora(s). Isso irá executar o curso de tempo de tal forma que as imagens são tiradas a cada 10 minutos por 10 h.
5. Análise da segregação da cromatina
- Abra o software Fiji. Abra um campo de visão de cada vez: para cada campo, abra os canais DIC e mCherry.
- Pegue a projeção de intensidade máxima do canal mCherry para obter uma única imagem: clique em Imagem > Pilhas > Projeto Z, selecione Intensidade Máxima no menu suspenso.
- Mescle os canais DIC e mCherry em uma imagem: clique em Imagem > Cor > Mesclar canais.
- Siga uma única célula através da meiose. Após a conclusão da meiose II, registre o número de massas de DNA.
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Representative Results
Para monitorar a segregação da cromatina, a proteína histona Htb2 foi marcada com mCherry. Na prófase I, a cromatina aparece como uma única massa de Htb2. Após os cromossomos homólogos se segregarem na primeira divisão meiótica, a cromatina aparece como duas massas distintas (Figura 3A). Depois que as cromátides irmãs se segregam, a cromatina aparece como quatro massas. Se alguns cromossomos não se ligarem aos microtúbulos fusiformes, massas adicionais podem ser vistas após a meiose I ou meiose II.
O método descrito acima foi utilizado para estudar o papel do componente cinetócoro Ctf19 em garantir a segregação cromossômica adequada na meiose de levedura em brotamento. As cepas de levedura que afastam a âncora expressando Ctf19 marcadas com FRB foram sincronizadas na prófase I usando o sistema NDT80-in (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 promoveu NDT80; GAL4-ER). Como controle, foi utilizada uma cepa NDT80-in com o fundo da cepa ancorada afastada, mas sem a proteína marcada com FRB (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10 promoveu NDT80; GAL4-ER). As células foram liberadas da parada da prófase I pela adição de β-estradiol. A rapamicina foi adicionada para esgotar o Ctf19-FRB do núcleo na liberação (antes da remontagem do cinetócoro), 45 min após a liberação (após a remontagem do cinetócoro, mas antes da meiose I) ou 3 h após a liberação (pouco antes da meiose II) (Figura 3A-F). Após a adição de rapamicina, foi realizada microscopia de fluorescência de lapso de tempo e as imagens foram adquiridas a cada 10 minutos durante o período restante da meiose.
Após a imagem, utilizou-se o software de acesso aberto Fiji para abrir as imagens e realizar a análise das figuras que mostravam a progressão do tempo (Figura 3A-F). O número de massas de DNA após a meiose II foi contado em pelo menos 100 células que estavam passando por meiose por condição. Em células do tipo selvagem com o fundo de ancoragem, há tipicamente quatro massas de DNA no final da meiose II, representando os quatro produtos da meiose (Figura 3A). Em uma pequena fração das células, apenas três massas são visíveis após a meiose II (Figura 3B,G). No entanto, é provável que três massas sejam o resultado de uma célula que tem quatro produtos de meiose, mas duas dessas massas aparecem juntas após a meiose II.
Quando o Ctf19-FRB é ancorado no momento da liberação da saída da prófase I (t = 0 h), aproximadamente 47% das células exibem mais de quatro massas de DNA após a conclusão da meiose, sugerindo um defeito na fixação de cinetocoros e microtúbulos (Figura 3C,G). Com a ancoragem de Ctf19-FRB após a montagem do cinetócoro, mas antes da meiose I (t = 45 min) ou antes da meiose II (t = 3 h), aproximadamente 16% das células exibem massas adicionais de DNA. Esses resultados apoiam a hipótese de que o Ctf19 é importante para a remontagem do cinetócoro na liberação da prófase I, mas é menos importante na segregação cromossômica uma vez que o cinetócoro tenha sido remontado.
Os resultados aqui obtidos mostram que a microscopia de lapso de tempo combinada com a sincronização do ciclo celular e a depleção condicional de uma proteína-alvo permitem o estudo de uma proteína em um estágio meiótico específico. Embora o Ctf19 não seja essencial para a mitose, o cinetócoro meiótico é extensivamente reorganizado, e o Ctf19 tem um papel crucial na remontagem do cinetócoro após a saídada prófase I 9,11,12. Os resultados da Figura 3 mostram que, quando a Ctf19 é esgotada antes da remontagem do cinetócoro, uma grande fração de células exibe massas adicionais de DNA após a meiose II. Quando a Ctf19 é esgotada do núcleo após a remontagem do cinetócoro, mas antes da meiose I ou da meiose II, há menos células que exibem massas adicionais de DNA. Esses resultados sugerem que o papel mais importante para a Ctf19 é no final da prófase I. Essa diferença na fidelidade de segregação cromossômica com depleção de Ctf19 em vários estágios destaca a importância do uso de alelos condicionais específicos de estágio para estudar a função de proteínas especificamente na meiose I ou meiose II. Um mutante nulo meiótico teria apresentado um defeito grave e não teria fornecido informações sobre o papel do Ctf19 em cada estágio.
Além disso, embora o CTF19 não seja um gene essencial, existe um fenótipo de fidelidade de transmissão cromossômica (ctf) durante o crescimento vegetativo de mutantes do CTF19 19. O uso de um alelo nulo ou alelo CTF19 mutante pode criar uma população de células aneuploides que podem não sofrer meiose adequadamente. O uso da técnica de anchor away e do sistema de sincronização NDT80-in contorna esse problema esgotando precisamente o Ctf19 do núcleo pouco antes da meiose I ou meiose II, reduzindo a preocupação de que as células analisadas fossem aneuploides.
Figura 1: Visão geral do experimento. Desenho animado de célula de levedura mostrando um único par de cromossomos homólogos. As células NDT80-in entram em meiose e param na prófase I. Após a adição de β-estradiol, as células entram nas divisões meióticas de forma síncrona. A adição de rapamicina determina quando a proteína-alvo (marcada com uma estrela) está ancorada. Neste experimento, a proteína-alvo Ctf19 foi ancorada em três momentos diferentes pela adição de rapamicina (RAP) ao mesmo tempo que a prófase I (adição de RAP em t = 0 min), após a liberação da prófase I (adição de RAP em t = 45 min) e após a segregação cromossômica da meiose I (adição de RAP em t = 3 h). As setas pretas espessas indicam o estágio do ciclo celular da adição de rapamicina e, portanto, a depleção da proteína alvo. Abreviaturas: RAP = rapamicina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração da câmara para experimentos de imagem de lapso de tempo. (A) Câmara reutilizável (direita) cortada de uma inserção de suporte de ponta de pipeta (esquerda). A inserção do suporte da ponta da pipeta é cortada com uma lâmina em brasa para remover uma porção de 4 quadrados x 4 quadrados da pastilha. As linhas tracejadas indicam uma seção de amostra do suporte da ponta que pode ser cortada para formar uma câmara. Os divisores de plástico restantes dentro do recorte de 4 quadrados x 4 quadrados são aparados e uma câmara oca permanece (à direita). (B) Para criar a câmara final, o selante de silicone é adicionado às bordas de um lado da câmara e, em seguida, colocado em cima de um deslizamento da tampa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O tempo em que o Ctf19 está ancorado afeta a segregação da cromatina. (A-F) Imagens representativas de lapso de tempo de células expressando Htb2-mCherry durante a meiose. As imagens foram tiradas a cada 10 min, imediatamente após a adição de β-estradiol. Barras de escala= 5 μm. Os números no canto superior direito de cada quadro rotulam o tempo decorrido entre cada quadro, e o tempo 0 indica o quadro no qual a cromatina segrega na meiose I. Apenas as células que completaram as divisões meióticas foram contadas. (A) Célula do tipo selvagem (sem proteína marcada com FRB) na qual β-estradiol foi adicionado 12 h após a transferência de KAc. A célula contém quatro massas de DNA após a conclusão da meiose II. (B) Célula Ctf19-FRB na qual a rapamicina foi adicionada a t = 0 (simultaneamente com a adição de β-estradiol). Esta célula mostra três massas de DNA após a meiose II. (C) Célula Ctf19-FRB na qual a rapamicina foi adicionada a t = 0 (simultaneamente com a adição de β-estradiol). Esta célula mostra cinco massas de DNA após a meiose II. (D) Célula Ctf19-FRB na qual a rapamicina foi adicionada a t = 0 (simultaneamente com a adição de β-estradiol). Esta célula morre após completar a meiose II. (E) Célula Ctf19-FRB na qual a rapamicina foi adicionada 45 min após a adição de β-estradiol. Esta célula mostra cinco massas de DNA após a meiose II. (F) Célula de Ctf19-FRB na qual a rapamicina foi adicionada 45 min após a adição de β-estradiol. Após a meiose II, seis massas de DNA estão presentes. (G) Quantificação do número de massas de DNA em pelo menos 100 células para cada condição (dois filmes analisados para cada condição). t = sob cada barra indica o momento em que a rapamicina foi adicionada em relação à adição de β-estradiol. Abreviaturas: MII = meiose II. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo combina o sistema NDT80-in para sincronizar células, a técnica de ancoragem para esgotar proteínas do núcleo e a microscopia de lapso de tempo de fluorescência para visualizar células de levedura em brotamento durante a meiose. O sistema NDT80-in é um método de sincronização do ciclo celular meiótico que utiliza uma prófase I de parada e liberação 4,8. Embora as células individuais variem ligeiramente na quantidade de tempo gasto em cada um dos estágios meióticos subsequentes, a maioria das células manterá um alto grau de sincronia ao longo das divisões meióticas.
A técnica de anchor away é uma ferramenta adaptável para estudos mitóticos e meióticos. Ao alterar a proteína alvo da âncora e o tempo de adição de rapamicina, este método pode ser adaptado para estudar várias proteínas durante qualquer estágio da meiose de levedura em brotamento. Métodos comuns para fazer mutantes condicionais para estudar a mitose de levedura em brotamento nem sempre são adequados para estudos meióticos. Por exemplo, o uso de um promotor repressível geralmente requer uma mudança na fonte de carbono para alterar a expressão da proteína-alvo, o que pode interromper a meiose20. Os mutantes sensíveis à temperatura dependem de uma mudança de temperatura para reduzir ou abolir a atividade da proteína alvo. Muitos desses mutantes condicionais não podem ser usados em estudos meióticos porque a mudança de condições nutricionais ou de temperatura pode perturbar a meiose21,22,23. Além disso, deleções ou mutantes podem limitar os estudos de meiose porque a expressão de uma proteína mutante no início da meiose pode bloquear ou afetar adversamente estágios posteriores. A técnica de anchor away pode contornar esses desafios, pois não depende de mudanças na nutrição ou na temperatura8. Além disso, a depleção da proteína pode ser regulada temporalmente de tal forma que o tempo de adição de rapamicina determina quando a proteína será ancorada.
Uma limitação da técnica de ancoragem é que ela pode não ser adequada para proteínas não nucleares porque depende da subunidade ribossomal Rpl13A como uma âncora para transportar a proteína-alvo para fora do núcleo. No entanto, existem outras aplicações da técnica de ancoragem, alterando as interações proteína-proteína que também podem ser úteis durante a meiose, como ancorar proteínas em complexos ou amarrá-las a membranas8. Estudos prévios mostram que a depleção nuclear das proteínas-alvo ocorre dentro de 30 min da adição de rapamicina 2,8. No entanto, é possível que algumas proteínas precisem de um período mais longo ou mais curto para serem transportadas para fora do núcleo. Para garantir que a proteína-alvo está sendo transportada para fora do núcleo, a proteína-alvo pode ser marcada com FRB fundido ao GFP (FRB-GFP) para monitorar o período de tempo entre a adição de rapamicina e a depleção nuclear. Outra limitação do sistema de ancoragem é que algumas proteínas são sensíveis às etiquetas FRB e FRB-GFP no terminal C. Como tal, a marcação N-terminal da proteína-alvo com FRB é uma estratégia alternativa para ancorar uma proteína-alvo.
Para monitorar a segregação da cromatina, as células de levedura em brotamento expressaram Htb2-mCherry. Nesta estirpe, a proteína Htb2 é marcada em seu locus endógeno, o que garante que o Htb2 seja expresso normalmente. Outras proteínas marcadas fluorescentemente também podem ser usadas para monitorar diferentes aspectos da meiose. Ao construir uma cepa para imagens de lapso de tempo, é importante considerar que algumas proteínas são sensíveis a tags fluorescentes C-terminais. Ensaios de crescimento e esporulação da cepa que abriga a proteína marcada fluorescentemente garantem que a etiqueta não esteja alterando a função da proteína. Um desafio da microscopia de fluorescência de lapso de tempo é expor as células a fluorescência suficiente para que as proteínas fluorescentes sejam detectadas, evitando a morte celular ou a desaceleração da meiose devido ao excesso de exposição. Uma etapa importante de solução de problemas é encontrar as configurações apropriadas do microscópio e da câmera para alcançar esse equilíbrio. O tempo de exposição necessário variará ligeiramente entre as proteínas, de modo que várias iterações de um experimento devem ser realizadas para determinar o tempo de exposição apropriado. Ao usar o método de câmara descrito aqui para experimentos de imagem de lapso de tempo, um passo especialmente sensível é alcançar uma monocamada de células a serem fotografadas. Sem uma monocamada, as células se acumulam umas sobre as outras, o que representa um desafio para a análise adequada de imagens e dados. Usar uma almofada de ágar, que ajuda as células a aderir ao e espalha as células ao redor da câmara, é uma maneira barata e eficiente de obter monocamadas. Mover a almofada de ágar para espalhar as células ao redor da câmara de modo que uma monocamada seja alcançada pode ser um desafio. Garantir que a almofada de ágar esteja fazendo movimentos muito pequenos durante o processo de movimentação pode ajudar na criação de uma monocamada. Fazer uma câmara reutilizável permite a geração barata de dados de imagem de lapso de tempo. Com a devida limpeza e desinfecção, as câmaras de plástico aqui descritas podem ser reutilizadas indefinidamente. É uma prática recomendada que as câmaras sejam removidas da folha de cobertura imediatamente após a imagem de lapso de tempo e armazenadas em etanol a 95% até o próximo uso.
A imagem de lapso de tempo fornece informações sobre o ciclo celular que podem ser perdidas a partir da imagem de células fixas 1,2. Por exemplo, ao monitorar a duração dos estágios meióticos, as variações entre células individuais podem ser examinadas com mais precisão ao visualizar células vivas em comparação com populações de células fixas. Como as proteínas de levedura podem ser facilmente marcadas com proteínas fluorescentes, o acoplamento de imagens de lapso de tempo de fluorescência com o sistema NDT80-in e a técnica de ancoragem podem ser adaptados para estudos adicionais, como o monitoramento da segregação cromossômica individual e o tempo de estágios meióticos específicos. Ao monitorar a progressão do ciclo celular após a liberação da prófase I em células NDT80-in, é crucial ter uma proteína marcada com uma molécula fluorescente que marcará os estágios da meiose. Cromossomos individuais podem ser monitorados ao longo da meiose integrando repetições do operon lac (LacO) perto do centrômero de um cromossomo em células que expressam LacI-GFP. O LacI-GFP liga-se firmemente ao LacO e é visualizado como um foco brilhante, que pode ser seguido ao longo das divisões meióticas por microscopia de lapso de tempo24,25. Várias proteínas com etiquetas fluorescentes têm sido usadas para monitorar a duração dos estágios meióticos. Estes incluem Tub1, a subunidade α-tubulina que se incorpora aos microtúbulos; Zip1, um componente do complexo sinaptonemal; e Spc42, um componente do corpo do polofusiforme 1,2,26,27.
Em conclusão, este método incorpora a sincronização do ciclo celular meiótico, a depleção condicional de uma proteína-alvo e a microscopia de fluorescência de lapso de tempo para estudar a segregação cromossômica meiótica. Ao visualizar células de levedura em brotamento durante a meiose e usando mutantes condicionais que afetam apenas os estágios pretendidos da meiose, este método pode fornecer dados precisos sobre o ciclo celular meiótico.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Centro de Imagem de Microscopia de Luz da Universidade de Indiana. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa dos Institutos Nacionais de Saúde (GM105755).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
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