Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एस सेरेविसिया में अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन की टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी और स्टेज-विशिष्ट परमाणु कमी का उपयोग

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64580
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Indiana University, 2Stowers Institute for Biomedical Research
* These authors contributed equally

Summary

टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी नवोदित खमीर में अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। यह प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करता है जो सेल-चक्र सिंक्रनाइज़ेशन, टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी और लक्ष्य प्रोटीन की सशर्त कमी को जोड़ती है ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि मियोटिक क्रोमोसोम अलगाव के दौरान एक विशिष्ट प्रोटीन के कार्य का अध्ययन कैसे किया जाए।

Abstract

टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ने अस्थायी और स्थानिक डेटा प्रदान करके मियोटिक सेल-चक्र घटनाओं की समझ में क्रांति ला दी है जो अक्सर इमेजिंग फिक्स्ड कोशिकाओं द्वारा नहीं देखी जाती है। नवोदित खमीर मियोटिक गुणसूत्र अलगाव का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव साबित हुआ है क्योंकि कई मिओटिक जीन अत्यधिक संरक्षित हैं। नवोदित खमीर में अर्धसूत्रीविभाजन की टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी विभिन्न मियोटिक उत्परिवर्ती की निगरानी की अनुमति देती है ताकि यह दिखाया जा सके कि उत्परिवर्तन मायोटिक प्रक्रियाओं को कैसे बाधित करता है। हालांकि, कई प्रोटीन अर्धसूत्रीविभाजन में कई बिंदुओं पर कार्य करते हैं। इसलिए लॉस-ऑफ-फंक्शन या मियोटिक नल उत्परिवर्ती का उपयोग एक प्रारंभिक प्रक्रिया को बाधित कर सकता है, बाद की प्रक्रिया को अवरुद्ध या परेशान कर सकता है और प्रत्येक व्यक्तिगत भूमिका से जुड़े फेनोटाइप को निर्धारित करना मुश्किल बना सकता है। इस चुनौती को दरकिनार करने के लिए, यह प्रोटोकॉल बताता है कि टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अर्धसूत्रीविभाजन के विशिष्ट चरणों में प्रोटीन को नाभिक से सशर्त रूप से कैसे समाप्त किया जा सकता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल बताता है कि प्रोफ़ेज़ I में कोशिकाओं को कैसे सिंक्रनाइज़ किया जाता है, विशिष्ट मिओटिक चरणों में नाभिक से प्रोटीन को कम करने के लिए एंकर दूर तकनीक का उपयोग कैसे किया जाता है, और मीओटिक क्रोमोसोम अलगाव की निगरानी के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग कैसे किया जाता है। तकनीक की उपयोगिता के एक उदाहरण के रूप में, अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर किनेटोकोर प्रोटीन सीटीएफ 19 नाभिक से समाप्त हो गया था, और अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय के अंत में क्रोमैटिन द्रव्यमान की संख्या का विश्लेषण किया गया था। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल को मायोटिक डिवीजनों की निगरानी करते हुए नाभिक से विभिन्न परमाणु प्रोटीन को कम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोकॉपी नवोदित खमीर 1,2 में मियोटिक गुणसूत्र अलगाव की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। नवोदित खमीर कोशिकाओं को प्रमुख पोषक तत्वों की भुखमरी के माध्यम से अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरने के लिए प्रेरित किया जा सकताहै। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, कोशिकाएं क्रोमोसोम अलगाव के एक दौर से गुजरती हैं, जिसके बाद चार अर्धसूत्री उत्पादों को बनाने के लिए दो विभाजन होते हैं जिन्हें बीजाणुओं में पैक किया जाता है (चित्रा 1)। अर्धसूत्रीविभाजन के प्रत्येक चरण में व्यक्तिगत कोशिकाओं की कल्पना की जा सकती है, जो स्थानिक और लौकिक डेटा उत्पन्न करती है जिसे फिक्स्ड-सेल इमेजिंग द्वारा आसानी से याद किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे दो पहले से स्थापित तरीकों, इंड्यूसेबल एनडीएटी 80 सिस्टम (एनडीएटी 80-इन) और एंकर अवे तकनीक के साथ टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के संयोजन का उपयोग अलग-अलग मियोटिक चरणों में विशिष्ट प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

NDT80-in प्रणाली मियोटिक सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जो मध्य अर्धसूत्रीविभाजन प्रतिलेखन कारक NDT80 4,5 की इंड्यूसेबल अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। प्रोफ़ेज़ I निकास 6,7 के लिए NDT80 अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। NDT80-in प्रणाली के साथ, NDT80 एक एस्ट्रोजन रिसेप्टर (Gal4-ER)4,5 से जुड़े Gal4 प्रतिलेखन कारक को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में GAL1-10 प्रमोटर के नियंत्रण में है। चूंकि गैल 4-ईआर केवल नाभिक में प्रवेश करता है जब β-एस्ट्राडियोल से बंधे होते हैं, एनडीटी 80-इन कोशिकाएं β-एस्ट्राडियोल की अनुपस्थिति में प्रोफ़ेज़ I में गिरफ्तार होती हैं, जो प्रोफ़ेज़ I में कोशिकाओं के सिंक्रनाइज़ेशन की अनुमति देती है (चित्रा 1)। β-एस्ट्राडियोल जोड़ नाभिक में गैल 4-ईआर प्रतिलेखन कारक के स्थानांतरण को बढ़ावा देता है, जहां यह एनडीटी 80 की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए जीएएल 1-10 को बांधता है, जिससे मियोटिक डिवीजनों में तुल्यकालिक प्रवेश होता है। यद्यपि टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी को सिंक्रनाइज़ेशन के बिना किया जा सकता है, सिंक्रनाइज़ेशन का उपयोग करने का लाभ एक अवरोधक या दवा जोड़ने की क्षमता है जबकि कोशिकाएं अर्धसूत्रीविभाजन के एक विशिष्ट चरण में होती हैं।

एंकर अवे तकनीक एक इंड्यूसेबल सिस्टम है जिसके द्वारा रैपामाइसिन8 के अतिरिक्त नाभिक से एक प्रोटीन को समाप्त किया जा सकता है। यह तकनीक नवोदित खमीर में कोशिका विभाजन के दौरान परमाणु प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए आदर्श है क्योंकि खमीर कोशिकाएं बंद माइटोसिस और अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरती हैं, जिसमें परमाणु लिफाफा टूटता नहीं है। इसके अलावा, यह तकनीक प्रोटीन के लिए बहुत उपयोगी है जिसमें अर्धसूत्रीविभाजन में कई कार्य होते हैं। विलोपन, उत्परिवर्ती एलील, या मियोटिक नल एलील्स के विपरीत, एक विशिष्ट चरण में नाभिक से एक लक्ष्य प्रोटीन को हटाने से पहले चरणों में लक्ष्य प्रोटीन गतिविधि से समझौता नहीं होता है, जिससे परिणामों की अधिक सटीक व्याख्या की अनुमति मिलती है। एंकर अवे सिस्टम नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच राइबोसोमल सबयूनिट्स के शटलिंग का उपयोग करता है जो राइबोसोमल परिपक्वता8 पर होता है। नाभिक से लक्ष्य प्रोटीन को कम करने के लिए, लक्ष्य प्रोटीन को एफकेबीपी 12-रेपामाइसिन-बाइंडिंग डोमेन (एफआरबी) के साथ टैग किया जाता है जिसमें राइबोसोमल सबयूनिट आरपीएल 13 ए को एफकेबीपी 12 के साथ टैग किया जाता है। रैपामाइसिन के बिना, एफआरबी और एफकेबीपी 12 बातचीत नहीं करते हैं, और एफआरबी-टैग किया गया प्रोटीन नाभिक में रहता है। रैपामाइसिन के अलावा, रैपामाइसिन एफकेबीपी 12 और एफआरबी के साथ एक स्थिर परिसर बनाता है, और आरपीएल 13 ए (चित्रा 1) के साथ बातचीत के कारण परिसर को नाभिक से बाहर निकाल दिया जाता है। रैपामाइसिन जोड़ पर कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए, कोशिकाएं टीओआर 1 जीन के टोर 1-1 उत्परिवर्तन को परेशान करती हैं। इसके अतिरिक्त, इन कोशिकाओं में एफपीआर 1 ए होता है, जो एस सेरेविसिया एफकेबीपी 12 प्रोटीन का एक शून्य एलील है, जो एफआरबी और रैपामाइसिन बाइंडिंग के लिए एंडोजेनस एफपीआर 1 को प्रतिस्पर्धी आरपीएल 13 ए-एफकेबीपी 12 से रोकता है। पृष्ठभूमि उत्परिवर्तन, टोर 1-1 और एफपीआर 1 ए को दूर करने वाले एंकर, मियोटिक समय या गुणसूत्र अलगाव2 को प्रभावित नहीं करते हैं।

इस तकनीक की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, किनेटोकोर प्रोटीन सीटीएफ 19 को अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर समाप्त कर दिया गया था। सीटीएफ 19 किनेटोकोर का एक घटक है जो माइटोसिस में अपरिहार्य है लेकिन अर्धसूत्रीविभाजन 9,10,11,12,13 में उचित गुणसूत्र पृथक्करण के लिए आवश्यक है। अर्धसूत्रीविभाजन में, किनेटोकोर को प्रोफ़ेज़ I में बहा दिया जाता है, और Ctf19 किनेटोकोररी-असेंबली 9,14 के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल के लिए, एनडीएटी 80-इन सिस्टम वाली कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ किया गया था, और प्रोफ़ेज़ I से रिलीज से पहले और बाद में नाभिक से लक्ष्य प्रोटीन सीटीएफ 19 को कम करने के लिए एंकर अवे तकनीक का उपयोग किया गया था, और अर्धसूत्रीविभाजन I क्रोमोसोम अलगाव के बाद (चित्रा 1)। इस प्रोटोकॉल को अर्धसूत्रीविभाजन और माइटोसिस के किसी भी चरण में रुचि के अन्य प्रोटीनों को कम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. आवश्यक सामग्री की तैयारी

  1. खमीर कोशिकाओं के विकास और स्पोरुलेशन के लिए अभिकर्मक तैयार करें।
    नोट: यदि उभरते खमीर उपभेद एडीई 2- और टीआरपी 1-हैं, तो चरण 1.1.1-1.1.3 में सभी मीडिया को 1% स्टॉक से 0.01% एडेनिन और 0.01% ट्रिप्टोफैन की अंतिम एकाग्रता के साथ पूरक करें। यदि आटोक्लेव द्वारा मीडिया को स्टरलाइज़ किया जाता है, तो इन अमीनो एसिड को केवल तभी जोड़ें जब अभिकर्मकों को आटोक्लेव किया गया हो और कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दी गई हो।
    1. वनस्पति विकास के लिए, अमीनो एसिड के बिना 6.7 ग्राम खमीर नाइट्रोजन बेस, 2 ग्राम पूर्ण अमीनो एसिड मिश्रण और 500 एमएल पानी में 20 ग्राम डेक्सट्रोज को भंग करके 2एक्स सिंथेटिक पूर्ण + डेक्सट्रोज माध्यम (2एक्सएससी) तैयार करें। मिश्रण को 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करके या 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करके निष्फल करें।
    2. स्पोरुलेशन के पहले चरण के लिए, अमीनो एसिड के बिना 6.7 ग्राम खमीर नाइट्रोजन बेस, 2 ग्राम पूर्ण अमीनो एसिड मिश्रण और 500 एमएल पानी में 20 ग्राम पोटेशियम एसीटेट को भंग करके 2एक्स सिंथेटिक पूर्ण + एसीटेट माध्यम (2एक्सएससीए) तैयार करें। मिश्रण को 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करके या 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करके निष्फल करें।
    3. स्पोरुलेशन के अंतिम चरण के लिए, 500 एमएल पानी में 5 ग्राम केएसी को भंग करके 1% पोटेशियम एसीटेट (1% केएसी) तैयार करें। मिश्रण को 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करके या 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करके निष्फल करें।
  2. माइक्रोस्कोपी, सिंक्रनाइज़ेशन और लंगर के लिए दवाएं और अभिकर्मक तैयार करें।
    1. टाइम-लैप्स इमेजिंग के दौरान कवरस्लिप के लिए कोशिकाओं का पालन करने के लिए, 1x PBS में 1 mg/mL concanavalin A (CONA) बनाएं। 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके स्टरलाइज़ करें और -20 °C पर छोटे (~ 10 μL) एलिकोट स्टोर करें।
    2. NDT80-in प्रणाली का उपयोग करने के लिए, इथेनॉल में घुले 1 mM β-एस्ट्राडियोल के 2 एमएल बनाएं। 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके स्टरलाइज़ करें और -20 °C पर एलिकोट (~ 500 μL) स्टोर करें।
    3. एंकर अवे सिस्टम के लिए, डीएमएसओ में घुलने वाले रैपामाइसिन का 1 मिलीग्राम / एमएल बनाएं। 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके स्टरलाइज़ करें और -20 °C पर छोटे (~ 10 μL) एलिकोट स्टोर करें।
      नोट: दवा के कई फ्रीज-पिघलने चक्रों से बचने के लिए रैपामाइसिन के छोटे एलिकोट तैयार करें।
  3. एनडीटी 80-इन सिस्टम (पीजीएएल 1,10-एनडीटी 80 / पी जीएएल 1,10-एनडीटी 80) युक्त खमीर उपभेदों को उत्पन्न करें; GAL4-ER / GAL4-ER) और एक लक्ष्य प्रोटीन जो आनुवंशिक पृष्ठभूमि (tor1-1/tor1-1; fpr1E / fpr1E; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. इस अध्ययन के लिए सीटीएफ 19-एफआरबी का उपयोग किया गया था। इसके अतिरिक्त, हिस्टोन प्रोटीन एचटीबी 2 की एक प्रति को एमचेरी के साथ टैग किया गया था ताकि मियोटिक प्रगति और क्रोमैटिन अलगाव की निगरानी की अनुमति मिल सके।
  4. टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक कक्ष तैयार करें
    1. इमेजिंग से पहले कक्ष 6 एच -24 घंटे तैयार करना शुरू करें (चित्रा 2)। एक गर्म स्केलपेल या अन्य तेज ब्लेड का उपयोग करके पिपेट टिप बॉक्स से 18 मिमी x 18 मिमी कक्ष काटें।
    2. कक्ष के निचले किनारों के चारों ओर सिलिकॉन सीलेंट की एक पतली परत फैलाने के लिए एक प्लास्टिक पिपेट टिप का उपयोग करें जो कवरस्लिप का पालन करेगा। पर्याप्त सीलेंट जोड़ें ताकि कक्ष के किनारों को पूरी तरह से कवर किया जा सके ( चित्रा 2 देखें)।
    3. कक्ष को 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप पर धीरे से रखकर कक्ष का पालन करें, सीलेंट-साइड-डाउन, कवरस्लिप पर। सुनिश्चित करें कि सीलेंट में कोई अंतराल नहीं है ताकि कक्ष लीक न हो।
    4. कवरस्लिप पर कोना के 8-10 μL फैलाएं। कवरस्लिप के बीच में कोना वितरित करें और कोना को एक पतली परत में फैलाने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें ताकि यह कक्ष से घिरे अधिकांश कवरस्लिप को कवर कर सके।
      नोट: प्लास्टिक कक्षों को अनिश्चित काल तक पुन: उपयोग किया जा सकता है। टाइम-लैप्स इमेजिंग पूरी होने के बाद, रेजर का उपयोग करके कवरस्लिप से कक्ष को हटा दें, कक्ष से सिलिकॉन सीलेंट को साफ करें, और भविष्य के उपयोग के लिए कक्षों को 95% इथेनॉल में डुबोकर रखें।

2. खमीर कोशिकाओं का स्पोरुलेशन

  1. मीओटिक कार्यक्रम को प्रेरित करने के लिए खमीर कोशिकाओं की भुखमरी के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
    नोट: ये कदम खमीर के डब्ल्यू 303 तनाव के स्पोरुलेशन के लिए हैं। अन्य उपभेदों को विभिन्न प्रोटोकॉल15 की आवश्यकता हो सकती है। प्रयोगशाला उपभेदों के बीच स्पोरुलेशन दक्षता अत्यधिक परिवर्तनशील है, जिसमें डब्ल्यू 303 ~ 60% 16,17,18 की स्पोरुलेशन दक्षता का प्रदर्शन करता है।
    1. एक प्लेट से उपयुक्त द्विगुणित खमीर तनाव की एक एकल कॉलोनी लें और 2XSC के 2 एमएल को टीका लगाएं और 12-24 घंटे के लिए रोलर ड्रम पर 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें।
    2. 2XSCA के चरण 2.1.1 से 2 mL तक संस्कृति के 80 μL जोड़कर संतृप्त संस्कृति को 2XSCA में पतला करें। इसे 12-16 घंटे के लिए रोलर ड्रम पर 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें। 2XSCA में 16 घंटे से अधिक समय तक न छोड़ें क्योंकि कोशिकाएं बीमार या ऑटो-फ्लोरोसेंट बन सकती हैं।
    3. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर 800 x g पर कल्चर को घुमाकर, तरल को त्यागकर, और 2 एमएल बाँझ आसुत पानी में गोली को फिर से निलंबित करके दो वॉश करें।
    4. दूसरे धोने के बाद, तरल को हटा दें और गोली को 1% केएसी के 2 एमएल में फिर से निलंबित करें और इसे 8-12 घंटे के लिए रोलर ड्रम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें। अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करने वाली कोशिकाएं प्रोफ़ेज़ I के पचीटेन में गिरफ्तार होंगी।
  2. प्रोफ़ेज़ I रिलीज़ सिस्टम
    1. β-एस्ट्राडियोल को सीधे स्पोरुलेशन कल्चर में 1 μM की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और कल्चर ट्यूब को जल्दी से भंवर करें। β-एस्ट्राडियोल प्रोफ़ेज़ I से कोशिकाओं को छोड़ देगा।

3. एंकर दूर तकनीक का उपयोग करके नाभिक से लक्ष्य प्रोटीन की कमी

  1. एक विशेष चरण में नाभिक से एफआरबी-टैग किए गए प्रोटीन को कम करने के लिए कोशिकाओं में रैपामाइसिन जोड़ें।
    1. प्रोफ़ेज़ I निकास पर नाभिक से प्रोटीन को कम करने के लिए, रैपामाइसिन को स्पोरुलेशन कल्चर ट्यूब में 1 μg / mL की अंतिम सांद्रता में उसी समय जोड़ें जब β-एस्ट्राडियोल जोड़।
    2. अर्धसूत्रीविभाजन के एक विशेष चरण में नाभिक से प्रोटीन को कम करने के लिए, β-एस्ट्राडियोल जोड़ने के बाद 60 मिनट से शुरू होने वाले सेल चक्र चरण की निगरानी करें। हर 20 मिनट में, 24 मिमी x 40 मिमी कवरस्लिप पर 5 μL संस्कृति और 18 मिमी x 18 मिमी कवरस्लिप के साथ कोशिकाओं को कवर करें। समय बिंदुओं के बीच 25 डिग्री सेल्सियस पर रोलर ड्रम पर संस्कृतियों को घुमाते रहें।
    3. ए 594 / एमचेरी फिल्टर और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के 60x उद्देश्य का उपयोग करके कोशिकाओं को चित्रित करें। प्रतिशत संप्रेषण को 2% और एक्सपोजर समय को 250 एमएस पर सेट करें। एक, दो, या चार डीएनए द्रव्यमान की उपस्थिति उस मिओटिक चरण को इंगित करेगी जिस पर कोशिकाएं प्रगति कर चुकी हैं। रुचि के मियोटिक चरण में 1 μg / mL की अंतिम एकाग्रता में रैपामाइसिन जोड़ें।
  2. कोशिकाओं को रोलर ड्रम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर घूमते रहें जब तक कि वे इमेजिंग के लिए तैयार न हों। एक लक्ष्य प्रोटीन की परमाणु कमी रैपामाइसिन 2,8 जोड़ने के 30-45 मिनट बाद होती है।

4. टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

  1. एक एगर पैड बनाएं जिसका उपयोग इमेजिंग के लिए कोशिकाओं का मोनोलेयर बनाने के लिए किया जाएगा (चरण 4.2 देखें)।
    1. सिलेंडर बनाने के लिए 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब के कैप और नीचे 1/3 को काट लें और छोड़ दें। सिलेंडर आगर पैड के लिए एक मोल्ड के रूप में काम करेगा। यदि एगर पहले एक में ठीक से पॉलीमराइज नहीं होता है तो एक अतिरिक्त सिलेंडर बनाने के लिए दो सिलेंडर बनाएं।
    2. कटे हुए माइक्रोफ्यूज ट्यूब सिलेंडर को एक साफ ग्लास स्लाइड पर रखें जिसमें ट्यूब का शीर्ष स्लाइड पर उल्टा बैठ जाए।
    3. 50 एमएल बीकर में 5% एगर घोल का 6 एमएल बनाएं (विलायक के रूप में 1% केएसी का उपयोग करें) और इसे तब तक माइक्रोवेव करें जब तक कि आगर पूरी तरह से भंग न हो जाए।
      नोट: आगर आसानी से माइक्रोवेव में उबल जाएगा; अगर को देखें और माइक्रोवेव शुरू करें और बंद करें जब आगर उबलने लगे और बीकर को घुमाएं। आगर को पूरी तरह से भंग करने के लिए माइक्रोवेव को कई बार शुरू करें और रोकें। आगर का घोल आवश्यक मात्रा से अधिक मात्रा में बनाया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आगर पूरी तरह से घुल जाए।
    4. पाइप की नोक को काट दें ताकि प्रत्येक माइक्रोफ्यूज ट्यूब सिलेंडर में पिघला हुआ आगर का एक बड़ा उद्घाटन और पाइप ~ 500 μL पिघला हुआ आगर बनाया जा सके। इसे कमरे के तापमान पर बैठने दें जब तक कि एगर जम न जाए (~ 10-12 मिनट)।
  2. इमेजिंग के लिए खमीर कोशिकाओं की तैयारी
    1. 1 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 2 मिनट के लिए चरण 3.2 से 800 x g पर स्पोरुलेशन संस्कृति के 200 μL को घुमाएं। सतह पर तैरने वाले के 180 μL को निकालें और त्याग दें। ट्यूब को घुमाकर और फ्लिक करके शेष सतह पर तैरने वाले में गोली को फिर से निलंबित करें।
    2. चरण 1.4 में बनाए गए कक्ष के बीच में कवरस्लिप पर केंद्रित कोशिकाओं का पाइपेट 6 μL।
    3. चरण 4.1 में बने एगर पैड के साथ सिलेंडर को पकड़ें और इसे ग्लास स्लाइड से सावधानीपूर्वक स्लाइड करें। सुनिश्चित करें कि एगर नीचे पूरी तरह से सपाट है और पिपेट टिप के निचले हिस्से का उपयोग करके, माइक्रोफ्यूज मोल्ड पर थोड़ी मात्रा में दबाव लागू करें ताकि अगर पैड को ट्यूब की सीमा से थोड़ा ऊपर धकेल दिया जाए।
    4. मोल्ड को इस तरह से मोड़ें कि आगर पैड कक्ष की ओर नीचे की ओर है।
    5. फोर्सप्स का उपयोग करके, धीरे से कोशिकाओं के शीर्ष पर आगर पैड (अभी भी माइक्रोफ्यूज ट्यूब मोल्ड में) रखें। कवरस्लिप पर कोशिकाओं का मोनोलेयर बनाने के लिए कक्ष के चारों ओर एगर पैड को धीरे से स्लाइड करने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें।
    6. आगर पैड को 12-15 मिनट के लिए कक्ष में छोड़ दें। यह कदम कोशिकाओं को कवरस्लिप पर कोना का पालन करने की अनुमति देगा।
    7. चरण 3.2 से दो माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 2 एमएल स्पोरुलेशन कल्चर स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए 15,700 x g पर स्पिन करें। सुपरनैटेंट को साफ माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए 15,700 x g पर फिर से स्पिन करें। अगले चरण में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को साफ करने के लिए सतह पर तैरने वाले को स्थानांतरित करें।
      नोट: कुशल स्पोरुलेशन और रुचि के प्रोटीन की निरंतर कमी सुनिश्चित करने के लिए β-एस्ट्राडियोल और रैपामाइसिन के साथ पूर्व-वातानुकूलित केएसी सुपरनैटेंट का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
    8. एगर पैड के 12-15 मिनट के लिए कक्ष में बैठने के बाद, इमेजिंग से पहले एगर पैड को तैरें और हटा दें। ऐसा करने के लिए, कक्ष में चरण 4.2.7 ड्रॉपवाइज से सुपरनैटेंट के 2 एमएल जोड़ें। एक बार जब तरल कक्ष के शीर्ष पर पहुंच जाता है, तो एगर पैड तैरने की सबसे अधिक संभावना होगी।
      नोट: यदि एगर पैड स्वचालित रूप से तैरता नहीं है, तो 1-2 मिनट प्रतीक्षा करें। यदि एगर पैड अभी भी तैरता नहीं है, तो इसे बल के साथ धीरे से हटा दें। आदर्श रूप से, एगर पैड अपने आप तैर जाएगा क्योंकि तैरने से पहले इसे हटाने से कोशिकाओं को हटाया जा सकता है।
    9. अगर पैड तैरने के बाद, इसे बल के साथ धीरे से हटा दें और इसे छोड़ दें। इमेजिंग के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए कक्ष के शीर्ष पर 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप रखें।
  3. माइक्रोस्कोप पर एक फिल्म सेट करना
    नोट: नीचे दिए गए निर्देश स्लाइड धारक के साथ फिट किए गए उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए हैं जो 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप को समायोजित करता है (माइक्रोस्कोप, कैमरा और सॉफ्टवेयर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। छवि अधिग्रहण के लिए 60x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया जाता है। अन्य माइक्रोस्कोप या अन्य स्लाइड धारकों का उपयोग करते समय इस प्रोटोकॉल को बदलने की आवश्यकता हो सकती है। चरण 4.3.2 से चरण 4.3.16 तक निष्पादित करने के लिए सटीक चरण माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग के आधार पर अलग-अलग होंगे। एक अलग माइक्रोस्कोप के निर्देशों के लिए अनुभाग 4.4 देखें।
    1. स्लाइड होल्डर के अंदर कवरस्लिप फिट करें। स्लाइड होल्डर में सुरक्षित रखने के लिए कवरस्लिप के किनारे मोल्डिंग मिट्टी का पालन करें।
    2. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। डीआईसी या ब्राइटफील्ड का उपयोग करके कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कोर्स और ठीक समायोजन नॉब्स का उपयोग करें।
    3. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के मुख्य मेनू पर, फ़ाइल > अधिग्रहण (3 डी हल करें) पर क्लिक करें। तीन खिड़कियां पॉप-अप होंगी।
    4. रिज़ॉल्व 3 डी नामक विंडो में, एर्लेनमेयर फ्लास्क आइकन पर क्लिक करें। रन एक्सपेरिमेंट नामक एक विंडो खुलेगी, जिसमें टाइम-लैप्स मूवी सेट करने के लिए एक प्रयोग स्थापित करने के लिए नियंत्रण शामिल हैं।
    5. डिज़ाइन टैब के तहत , अनुभागिंग लेबल वाले टैब पर नेविगेट करें। Z अनुभागिंग के बगल में स्थित बॉक्स का चयन करें. z स्टैक्स को निम्नानुसार सेट करें: ऑप्टिकल सेक्शन स्पेसिंग = 1 μm, ऑप्टिकल सेक्शन की संख्या = 5, नमूना मोटाई = 5.0 μm।
    6. चैनल टैब के तहत , + आइकन पर क्लिक करें जैसे कि एक चैनल विकल्प दिखाई देता है। उपयुक्त चैनल का चयन करें। इस प्रयोग के लिए, हम A594 का चयन करते हैं, जिसका उपयोग mCherry की छवि बनाने के लिए किया जाता है। संदर्भ छवि के बगल में स्थित बॉक्स का चयन करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से नमूने के मध्य में जेड स्थिति सेट करें।
    7. प्रतिशत संप्रेषण और एक्सपोजर समय सेट करने के लिए % T और Exp से सटे ड्रॉपडाउन मेनू से मान का चयन करें. इस प्रयोग के लिए, ए 594 चैनल में 2% संप्रेषण और 250 एमएस एक्सपोजर समय का उपयोग किया जाता है, और ब्राइटफील्ड के लिए 10% ट्रांसमिशन और 500 एमएस एक्सपोज़र समय का उपयोग किया जाता है।
      नोट: एक्सपोजर समय और प्रतिशत संप्रेषण विभिन्न माइक्रोस्कोप के साथ भिन्न होगा। ओवरएक्सपोजर से बचने के लिए, सबसे कम प्रतिशत संप्रेषण और सबसे कम एक्सपोजर समय का उपयोग करें जो रुचि के प्रोटीन के उचित विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
    8. टाइम-लैप्स टैब के तहत, टाइम-लैप्स के बगल में स्थित बॉक्स का चयन करें। दिखाई देने वाली तालिका में, टाइम-लैप्स पंक्ति में न्यूनतम स्तंभ के तहत 10 और कुल समय पंक्ति में घंटे कॉलम के तहत 10 दर्ज करें। यह 10 घंटे के लिए हर 10 मिनट में चित्र लेने का एक टाइम कोर्स चलाएगा।
    9. मूवी के दौरान स्टेज बहाव को रोकने के लिए अल्टीमेट फोकस के साथ फोकस बनाए रखने के बगल में स्थित बॉक्स का चयन करें। अंक टैब के अंतर्गत, विज़िट पॉइंट सूची के बगल में स्थित बॉक्स का चयन करें.
    10. मुख्य मेनू में, दृश्य > बिंदु सूची पर क्लिक करें। बिंदु सूची नामक एक विंडो पॉप अप होगी। मंच को कक्ष के एक क्षेत्र में ले जाएं जो कोशिकाओं का एक मोनोलेयर दिखाता है। बिंदु सूची विंडो में पॉइंट मार्क पर क्लिक करें।
    11. कोशिकाओं को अतिरंजित करने से बचने के लिए बिना किसी ओवरलैप के 25-30 बिंदुओं का चयन करने के लिए चरण को स्थानांतरित करें। प्रत्येक समय पाठ्यक्रम के दौरान प्रत्येक क्षेत्र की छवि बनाई जाएगी।
    12. बिंदु सूची विंडो में, प्रत्येक बिंदु के लिए अंतिम फ़ोकस सेट करने के लिए कैलिब्रेट ऑल का चयन करें। Desgin/Run Experiment विंडो में डिज़ाइन टैब के अंतर्गत, विज़िट पॉइंट सूची के बगल वाले बॉक्स में बिंदु मानों की श्रेणी (बिंदु सूची विंडो से प्राप्त) दर्ज करें. चलाएँ टैब के अंतर्गत, फ़ाइल को कंप्यूटर पर उपयुक्त गंतव्य पर सहेजें। डिज़ाइन/रन प्रयोग विंडो पर, चलचित्र प्रारंभ करने के लिए प्ले बटन (हरा त्रिकोण चिह्न) का चयन करें।
  4. वैकल्पिक विधि: माइक्रोस्कोप पर एक चलचित्र सेट करना
    नोट: ये निर्देश स्लाइड धारक के साथ फिट किए गए उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए हैं जो 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप को समायोजित कर सकता है। माइक्रोस्कोप, कैमरा और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के बारे में विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें। छवि अधिग्रहण के लिए 60x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया जाता है।
    1. स्लाइड होल्डर के अंदर कवरस्लिप फिट करें। छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। डीआईसी या ब्राइटफील्ड का उपयोग करके कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पाठ्यक्रम और ठीक समायोजन नॉब्स का उपयोग करें। सॉफ़्टवेयर की खुली विंडो में राइट क्लिक करें. एक ड्रॉप-डाउन मेनू दिखाई देगा।
    2. अधिग्रहण नियंत्रण > अधिग्रहण पर क्लिक करें। प्रयोग को परिभाषित > अनुप्रयोग पर क्लिक करें। यह एनडी अधिग्रहण लेबल वाली एक विंडो खोलेगा।
    3. खुलने वाली विंडो में, XY के बगल में स्थित बॉक्स चेक करें। चरण को वांछित स्थान पर ले जाएँ और उस स्थान को बिंदु के रूप में चुनने के लिए बिंदु नाम के तहत बॉक्स पर क्लिक करें। इसे तब तक दोहराएं जब तक कि कोशिकाओं को अतिरंजित करने से बचने के लिए बिना किसी ओवरलैप के 25-30 अंकों का चयन न किया जाए। प्रत्येक समय पाठ्यक्रम के दौरान प्रत्येक क्षेत्र की छवि बनाई जाएगी।
    4. प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए प्रतिशत संप्रेषण निर्धारित करें। क्योंकि उपभेद एचटीबी 2-एमचेरी का उत्पादन करते हैं, एमचेरी फिल्टर का उपयोग यहां किया जाता है। चरण 4.3.3 में खुलने वाली अधिग्रहण विंडो के तहत, 555 एनएम बटन पर नेविगेट करें। 555 एनएम बटन के तहत स्लाइडिंग स्केल को समायोजित करके प्रतिशत ट्रांसमिशन को 5% पर सेट करें जब तक कि यह 5% न पढ़ ले।
    5. प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए एक्सपोज़र समय सेट करें। अधिग्रहण विंडो के तहत , एक्सपोज़र ड्रॉप-डाउन मेनू से 200 एमएस का चयन करें।
      नोट: एक्सपोजर समय और प्रतिशत संप्रेषण विभिन्न माइक्रोस्कोप के साथ भिन्न होगा। ओवरएक्सपोजर से बचने के लिए, सबसे कम प्रतिशत संप्रेषण और सबसे कम एक्सपोजर समय का उपयोग करें जो रुचि के प्रोटीन के उचित विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
    6. एनडी अधिग्रहण विंडो में जेड के बगल में बॉक्स पर क्लिक करें। खमीर कोशिकाओं के पांच जेड-स्टैक सेट करें जो 1.2 μM अलग हैं।
    7. λ के बगल में बॉक्स पर क्लिक करें। प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले उपयुक्त चैनलों का चयन करें। डीआईसी के लिए, सुनिश्चित करें कि होम को जेड पीओएस के तहत ड्रॉप-डाउन मेनू से चुना गया है। एमचेरी के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी को जेड पीओएस के तहत ड्रॉप-डाउन मेनू से चुना गया है। यह सुनिश्चित करता है कि, डीआईसी के लिए केवल एक खंड (जेड-स्टैक के बीच में) लिया जाता है।
    8. ND अधिग्रहण विंडो में समय के बगल में स्थित बॉक्स का चयन करें। चरण के अंतर्गत बॉक्स का चयन करें. अंतराल के अंतर्गत ड्रॉप-डाउन मेनू में, 10 मिनट का चयन करें. अवधि के अंतर्गत, 10 घंटे (ओं) का चयन करें। यह समय पाठ्यक्रम इस तरह से चलेगा कि छवियों को 10 घंटे के लिए हर 10 मिनट में लिया जाता है।

5. क्रोमैटिन अलगाव का विश्लेषण

  1. Fiji सॉफ्टवेयर खोलें। एक समय में दृश्य का एक क्षेत्र खोलें: प्रत्येक फ़ील्ड के लिए, डीआईसी और एमचेरी चैनल खोलें।
  2. एकल छवि प्राप्त करने के लिए एमचेरी चैनल की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण लें: जेड प्रोजेक्ट > छवि > स्टैक्स पर क्लिक करें, ड्रॉपडाउन मेनू से मैक्स तीव्रता का चयन करें।
  3. डीआईसी और एमचेरी चैनलों को एक छवि में मर्ज करें: इमेज > कलर > मर्ज चैनल पर क्लिक करें।
  4. अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से एक एकल कोशिका का पालन करें। अर्धसूत्रीविभाजन II पूरा होने के बाद, डीएनए द्रव्यमान की संख्या रिकॉर्ड करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

क्रोमैटिन अलगाव की निगरानी के लिए, हिस्टोन प्रोटीन एचटीबी 2 को एमचेरी के साथ टैग किया गया था। प्रोफ़ेज़ I में, क्रोमैटिन एक एकल एचटीबी 2 द्रव्यमान के रूप में दिखाई देता है। पहले मिओटिक विभाजन में समरूप गुणसूत्रों के अलग होने के बाद, क्रोमैटिन दो अलग-अलग द्रव्यमानों के रूप में दिखाई देता है (चित्रा 3 ए)। बहन क्रोमैटिड अलग होने के बाद, क्रोमैटिन चार द्रव्यमान के रूप में दिखाई देता है। यदि कुछ गुणसूत्र स्पिंडल सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़ने में विफल रहते हैं, तो अर्धसूत्रीविभाजन I या अर्धसूत्रीविभाजन II के बाद अतिरिक्त द्रव्यमान देखा जा सकता है।

ऊपर वर्णित विधि का उपयोग नवोदित खमीर अर्धसूत्रीविभाजन में उचित गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने में किनेटोकोर घटक सीटीएफ 19 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया गया था। एफआरबी के साथ टैग किए गए सीटीएफ 19 को व्यक्त करने वाले खमीर उपभेदों को एनडीएटी 80-इन सिस्टम (tor1-1; fpr1E; fpr1E) का उपयोग करके प्रोफ़ेज़ I में सिंक्रनाइज़ किया गया था। आरपीएल 13 ए-एफकेबीपी 12; सीटीएफ 19-एफआरबी; जीएएल 1-10 ने एनडीटी 80 को बढ़ावा दिया; GAL4-ER)। एक नियंत्रण के रूप में, एक एनडीटी 80-इन तनाव के साथ एंकर दूर तनाव पृष्ठभूमि लेकिन एफआरबी-टैग किए गए प्रोटीन के बिना उपयोग किया गया था (tor1-1; fpr1E; आरपीएल 13 ए-एफकेबीपी 12; जीएएल 1-10 ने एनडीटी 80 को बढ़ावा दिया; GAL4-ER)। β-एस्ट्राडियोल के अलावा प्रोफ़ेज़ आई गिरफ्तारी से कोशिकाओं को रिहा किया गया था। रैपामाइसिन को नाभिक से सीटीएफ 19-एफआरबी को कम करने के लिए जोड़ा गया था या तो रिलीज पर (किनेटोकोर पुनर्संयोजन से पहले), रिलीज के 45 मिनट बाद (किनेटोकोर पुनर्संयोजन के बाद लेकिन अर्धसूत्रीविभाजन I से पहले), या रिलीज के 3 घंटे बाद (अर्धसूत्रीविभाजन II से ठीक पहले) (चित्रा 3 ए-एफ)। रैपामाइसिन के अतिरिक्त, टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया था, और अर्धसूत्रीविभाजन की शेष अवधि के लिए हर 10 मिनट में छवियां प्राप्त की गई थीं।

इमेजिंग के बाद, ओपन-एक्सेस सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग छवियों को खोलने और समय की प्रगति दिखाने वाले आंकड़ों के लिए विश्लेषण करने के लिए किया गया था (चित्रा 3 ए-एफ)। अर्धसूत्रीविभाजन II के बाद डीएनए द्रव्यमान की संख्या कम से कम 100 कोशिकाओं में गिनी गई थी जो प्रति स्थिति अर्धसूत्रीविभाजन से गुजर रही थीं। एंकर दूर पृष्ठभूमि के साथ वाइल्डटाइप कोशिकाओं में, आमतौर पर अर्धसूत्रीविभाजन II के अंत में चार डीएनए द्रव्यमान होते हैं, जो अर्धसूत्रीविभाजन के चार उत्पादों का प्रतिनिधित्व करते हैं (चित्रा 3 ए)। कोशिकाओं के एक छोटे से अंश में, अर्धसूत्रीविभाजन II (चित्रा 3 बी, जी) के बाद केवल तीन द्रव्यमान दिखाई देते हैं। हालांकि, यह संभावना है कि तीन द्रव्यमान एक कोशिका का परिणाम हैं जिसमें अर्धसूत्रीविभाजन के चार उत्पाद हैं लेकिन इनमें से दो द्रव्यमान अर्धसूत्रीविभाजन II के बाद एक साथ दिखाई देते हैं।

जब प्रोफ़ेज़ I निकास (t = 0 h) की रिहाई के समय Ctf19-FRB को दूर रखा जाता है, तो लगभग 47% कोशिकाएं अर्धसूत्रीविभाजन के पूरा होने पर चार से अधिक डीएनए द्रव्यमान प्रदर्शित करती हैं, जो किनेटोकोर्स और सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा 3 सी, जी) के लगाव में दोष का सुझाव देती हैं। सीटीएफ 19-एफआरबी को या तो किनेटोकोर असेंबली के बाद लेकिन अर्धसूत्रीविभाजन I (टी = 45 मिनट) या अर्धसूत्रीविभाजन II (टी = 3 घंटे) से पहले, लगभग 16% कोशिकाएं अतिरिक्त डीएनए द्रव्यमान प्रदर्शित करती हैं। ये परिणाम इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि सीटीएफ 19 प्रोफ़ेज़ आई रिलीज पर किनेटोकोर री-असेंबली के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन किनेटोकोर को फिर से इकट्ठा करने के बाद क्रोमोसोम अलगाव में कम महत्वपूर्ण है।

यहां प्राप्त परिणाम बताते हैं कि सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन और लक्ष्य प्रोटीन की सशर्त कमी के साथ संयुक्त टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी एक विशिष्ट मायोटिक चरण में प्रोटीन के अध्ययन की अनुमति देती है। यद्यपि माइटोसिस के लिए सीटीएफ 19 आवश्यक नहीं है, लेकिन मियोटिक किनेटोकोर को बड़े पैमाने पर पुनर्गठित किया जाता है, और प्रोफ़ेज़ 1 9,11,12 से बाहर निकलने के बाद कीनेटोकोर री-असेंबली में सीटीएफ19 की महत्वपूर्ण भूमिका है। चित्रा 3 के परिणाम बताते हैं कि जब सीटीएफ 19 को किनेटोकोर री-असेंबली से पहले समाप्त कर दिया जाता है, तो कोशिकाओं का एक बड़ा अंश अर्धसूत्रीविभाजन II के बाद अतिरिक्त डीएनए द्रव्यमान प्रदर्शित करता है। जब सीटीएफ 19 को किनेटोकोर पुनर्संयोजन के बाद नाभिक से समाप्त कर दिया जाता है, लेकिन अर्धसूत्रीविभाजन I या अर्धसूत्रीविभाजन II से पहले, कम कोशिकाएं होती हैं जो अतिरिक्त डीएनए द्रव्यमान प्रदर्शित करती हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि सीटीएफ 19 के लिए सबसे महत्वपूर्ण भूमिका प्रोफ़ेज़ I के अंत में है। विभिन्न चरणों में सीटीएफ 19 की कमी के साथ गुणसूत्र पृथक्करण निष्ठा में यह अंतर विशेष रूप से अर्धसूत्रीविभाजन I या अर्धसूत्रीविभाजन II में प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए चरण-विशिष्ट सशर्त एलील्स का उपयोग करने के महत्व पर प्रकाश डालता है। एक मियोटिक नल उत्परिवर्ती ने एक गंभीर दोष प्रदर्शित किया होगा और प्रत्येक चरण में सीटीएफ 19 की भूमिका के बारे में जानकारी प्रदान नहीं की होगी।

इसके अतिरिक्त, हालांकि सीटीएफ 19 एक आवश्यक जीन नहीं है, सीटीएफ 19 उत्परिवर्ती 19 के वनस्पति विकास के दौरान एक गुणसूत्र संचरण निष्ठा (सीटीएफ)फेनोटाइप है। एक शून्य एलील या उत्परिवर्ती सीटीएफ 19 एलील का उपयोग एन्यूप्लोइड कोशिकाओं की आबादी बना सकता है जो अर्धसूत्रीविभाजन से ठीक से नहीं गुजर सकते हैं। एंकर अवे तकनीक और एनडीएटी 80-इन सिंक्रनाइज़ेशन सिस्टम का उपयोग अर्धसूत्रीविभाजन I या अर्धसूत्रीविभाजन II से ठीक पहले नाभिक से Ctf19 को ठीक से कम करके इस समस्या को दरकिनार करता है, इस चिंता को कम करता है कि विश्लेषण की गई कोशिकाएं एन्यूप्लोइड थीं।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोग का अवलोकन। खमीर कोशिका का कार्टून जो समरूप गुणसूत्रों की एक जोड़ी दिखाता है। एनडीटी 80-इन कोशिकाएं अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करती हैं और प्रोफ़ेज़ I पर गिरफ्तार होती हैं। β-एस्ट्राडियोल के अलावा, कोशिकाएं समकालिक रूप से मियोटिक डिवीजनों में प्रवेश करती हैं। रैपामाइसिन के अतिरिक्त यह निर्धारित करता है कि लक्ष्य प्रोटीन (एक तारे के साथ चिह्नित) को कब दूर रखा जाता है। इस प्रयोग में, लक्ष्य प्रोटीन सीटीएफ 19 को तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्रोफेज़ आई (टी = 0 मिनट पर आरएपी जोड़), प्रोफ़ेज़ आई रिलीज के बाद (टी = 45 मिनट पर आरएपी जोड़), और अर्धसूत्रीविभाजन के बाद क्रोमोसोम अलगाव (टी = 3 एच पर आरएपी जोड़) के रूप में रैपामाइसिन (आरएपी) जोड़कर तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर लंगर डाला गया था। मोटे काले तीर रैपामाइसिन जोड़ के सेल चक्र चरण को इंगित करते हैं और इसलिए, प्रोटीन की कमी को लक्षित करते हैं। संक्षेप: आरएपी = रैपामाइसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: टाइम-लैप्स इमेजिंग प्रयोगों के लिए कक्ष सेट-अप. (A) पुन: प्रयोज्य कक्ष (दाएं) पिपेट टिप होल्डर से काटा गया (बाएं). पिपेट टिप होल्डर इंसर्ट को इंसर्ट के 4 वर्ग x 4 वर्ग भाग को हटाने के लिए लाल-गर्म ब्लेड से काटा जाता है। डैश की गई लाइनें टिप धारक के एक नमूना खंड को इंगित करती हैं जिसे चैंबर बनाने के लिए काटा जा सकता है। 4 वर्ग x 4 वर्ग कट-आउट के भीतर शेष प्लास्टिक डिवाइडर को काट दिया जाता है और एक खोखला कक्ष (दाएं) रहता है। (बी) अंतिम कक्ष बनाने के लिए, सिलिकॉन सीलेंट को कक्ष के एक तरफ किनारों पर जोड़ा जाता है, और फिर कवर स्लिप के शीर्ष पर रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: जिस समय Ctf19 को दूर रखा जाता है, वह क्रोमैटिन अलगाव को प्रभावित करता है। (A-F) अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान Htb2-mCherry को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की प्रतिनिधि समय चूक छवियां। β-एस्ट्राडियोल को जोड़ने के तुरंत बाद, हर 10 मिनट में छवियां ली गईं। स्केल सलाखों = 5 μm. प्रत्येक फ्रेम के ऊपरी-दाएं कोने में संख्याएं प्रत्येक फ्रेम के बीच बीत चुके समय को लेबल करती हैं, और समय 0 उस फ्रेम को इंगित करता है जिसमें क्रोमैटिन अर्धसूत्रीविभाजन I में अलग होता है। केवल उन कोशिकाओं की गणना की गई जो मियोटिक विभाजन को पूरा करती थीं। (ए) वाइल्डटाइप सेल (एफआरबी के साथ टैग किया गया कोई प्रोटीन नहीं) जिसमें केएसी स्थानांतरण के 12 घंटे बाद β-एस्ट्राडियोल जोड़ा गया था। अर्धसूत्रीविभाजन II के पूरा होने के बाद कोशिका में चार डीएनए द्रव्यमान होते हैं। (बी) सीटीएफ 19-एफआरबी सेल जिसमें रैपामाइसिन को टी = 0 पर जोड़ा गया था (साथ ही β-एस्ट्राडियोल जोड़ के साथ)। यह कोशिका अर्धसूत्रीविभाजन II के बाद तीन डीएनए द्रव्यमान दिखाती है। (सी) सीटीएफ 19-एफआरबी सेल जिसमें रैपामाइसिन को टी = 0 (साथ ही β-एस्ट्राडियोल जोड़ के साथ) पर जोड़ा गया था। यह कोशिका अर्धसूत्रीविभाजन II के बाद पांच डीएनए द्रव्यमान दिखाती है। (डी) सीटीएफ 19-एफआरबी सेल जिसमें रैपामाइसिन को टी = 0 पर जोड़ा गया था (साथ ही β-एस्ट्राडियोल जोड़ के साथ)। अर्धसूत्रीविभाजन II को पूरा करने के बाद यह कोशिका मर जाती है। (ई) सीटीएफ 19-एफआरबी सेल जिसमें रैपामाइसिन को β-एस्ट्राडियोल जोड़ने के 45 मिनट बाद जोड़ा गया था। यह कोशिका अर्धसूत्रीविभाजन II के बाद पांच डीएनए द्रव्यमान दिखाती है। (एफ) सीटीएफ 19-एफआरबी सेल जिसमें रैपामाइसिन को β-एस्ट्राडियोल जोड़ने के 45 मिनट बाद जोड़ा गया था। अर्धसूत्रीविभाजन II के बाद, छह डीएनए द्रव्यमान मौजूद हैं। (जी) प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम 100 कोशिकाओं में डीएनए द्रव्यमान की संख्या का परिमाणीकरण (प्रत्येक स्थिति के लिए विश्लेषण की गई दो फिल्में)। टी = प्रत्येक बार के नीचे उस समय को इंगित करता है जिस पर रैपामाइसिन को β-एस्ट्राडियोल जोड़ के सापेक्ष जोड़ा गया था। संक्षिप्तरूप: एमआईआई = अर्धसूत्रीविभाजन II। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए एनडीटी 80-इन सिस्टम को जोड़ता है, नाभिक से प्रोटीन को कम करने के लिए एंकर दूर तकनीक, और अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान नवोदित खमीर कोशिकाओं की छवि के लिए प्रतिदीप्ति टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी। एनडीटी 80-इन सिस्टम मियोटिक सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन के लिए एक विधि है जो प्रोफ़ेज़ आई गिरफ्तारी और रिलीज 4,8 का उपयोग करता है। यद्यपि व्यक्तिगत कोशिकाएं बाद के प्रत्येक मियोटिक चरणों में बिताए गए समय की मात्रा में थोड़ी भिन्न होंगी, अधिकांश कोशिकाएं पूरे मियोटिक डिवीजनों में उच्च स्तर की सिंक्रनाइज़ बनाए रखेंगी।

एंकर दूर तकनीक माइटोटिक और मिओटिक अध्ययन के लिए एक अनुकूलनीय उपकरण है। लंगर को लक्ष्य प्रोटीन और रैपामाइसिन जोड़ने के समय को बदलकर, इस विधि को नवोदित खमीर अर्धसूत्रीविभाजन के किसी भी चरण के दौरान विभिन्न प्रोटीनों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। नवोदित खमीर माइटोसिस का अध्ययन करने के लिए सशर्त उत्परिवर्ती बनाने के सामान्य तरीके हमेशा अर्धसूत्री अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं। उदाहरण के लिए, एक दमनकारी प्रमोटर के उपयोग के लिए अक्सर लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बदलने के लिए कार्बन स्रोत में बदलाव की आवश्यकता होती है, जो अर्धसूत्रीविभाजन20 को बाधित कर सकती है। तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती लक्ष्य प्रोटीन की गतिविधि को कम करने या समाप्त करने के लिए तापमान में बदलाव पर भरोसा करते हैं। इनमें से कई सशर्त उत्परिवर्ती का उपयोग अर्धसूत्री अध्ययनों में नहीं किया जा सकता है क्योंकि पोषक तत्वों की स्थिति या तापमान बदलने से अर्धसूत्रीविभाजन 21,22,23 बाधित हो सकता है। इसके अलावा, विलोपन या उत्परिवर्ती अर्धसूत्रीविभाजन के अध्ययन को सीमित कर सकते हैं क्योंकि अर्धसूत्रीविभाजन में उत्परिवर्ती प्रोटीन को व्यक्त करने से बाद के चरणों को अवरुद्ध या प्रतिकूल रूप से प्रभावित किया जा सकता है। एंकर अवे तकनीक इन चुनौतियों को दरकिनार कर सकती है क्योंकि यह पोषण या तापमान8 में परिवर्तन पर निर्भर नहीं करती है। इसके अलावा, प्रोटीन की कमी को अस्थायी रूप से विनियमित किया जा सकता है जैसे कि रैपामाइसिन जोड़ने का समय निर्धारित करता है कि प्रोटीन कब दूर होगा।

एंकर दूर तकनीक की एक सीमा यह है कि यह गैर-परमाणु प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है क्योंकि यह लक्ष्य प्रोटीन को नाभिक से बाहर ले जाने के लिए एक लंगर के रूप में आरपीएल 13 ए राइबोसोमल सबयूनिट पर निर्भर करता है। हालांकि, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को बदलकर एंकर दूर तकनीक के अन्य अनुप्रयोग हैं जो अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान भी उपयोगी हो सकते हैं, जैसे कि प्रोटीन को कॉम्प्लेक्स में लंगर डालना या उन्हें झिल्ली8 से जोड़ना। पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि लक्ष्य प्रोटीन की परमाणु कमी रैपामाइसिन के 30 मिनट के भीतरहोती है। हालांकि, यह संभव है कि कुछ प्रोटीनों को नाभिक से बाहर निकलने के लिए लंबी या छोटी अवधि की आवश्यकता होती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि लक्ष्य प्रोटीन को नाभिक से बाहर निकाला जा रहा है, लक्ष्य प्रोटीन को एफआरबी के साथ जीएफपी (एफआरबी-जीएफपी) से जोड़ा जा सकता है ताकि रैपामाइसिन जोड़ और परमाणु कमी के बीच समय की लंबाई की निगरानी की जा सके। एंकर अवे सिस्टम की एक और सीमा यह है कि कुछ प्रोटीन सी-टर्मिनस पर एफआरबी और एफआरबी-जीएफपी टैग के प्रति संवेदनशील होते हैं। इस प्रकार, एफआरबी के साथ लक्ष्य प्रोटीन की एन-टर्मिनल टैगिंग एक लक्ष्य प्रोटीन को दूर करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति है।

क्रोमैटिन अलगाव की निगरानी के लिए, नवोदित खमीर कोशिकाओं ने एचटीबी 2-एमचेरी व्यक्त किया। इस तनाव में, एचटीबी 2 प्रोटीन को इसके अंतर्जात लोकस पर टैग किया जाता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि एचटीबी 2 सामान्य रूप से व्यक्त किया जाता है। अर्धसूत्रीविभाजन के विभिन्न पहलुओं की निगरानी के लिए अन्य फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन का भी उपयोग किया जा सकता है। टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक तनाव का निर्माण करते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि कुछ प्रोटीन सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग के प्रति संवेदनशील हैं। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन को परेशान करने वाले तनाव की वृद्धि और स्पोरुलेशन परख यह सुनिश्चित करती है कि टैग प्रोटीन के कार्य को नहीं बदल रहा है। टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की एक चुनौती कोशिकाओं को पर्याप्त प्रतिदीप्ति के लिए उजागर कर रही है ताकि कोशिका मृत्यु से बचने या अतिरिक्त जोखिम से अर्धसूत्रीविभाजन को धीमा करते हुए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाया जा सके। एक महत्वपूर्ण समस्या निवारण कदम इस संतुलन को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त माइक्रोस्कोप और कैमरा सेटिंग्स ढूंढना है। प्रोटीन के बीच आवश्यक एक्सपोजर समय थोड़ा भिन्न होगा, इसलिए उचित एक्सपोज़र समय निर्धारित करने के लिए एक प्रयोग के कई पुनरावृत्तियों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। टाइम-लैप्स इमेजिंग प्रयोगों के लिए यहां वर्णित कक्ष विधि का उपयोग करते समय, एक विशेष रूप से संवेदनशील कदम छवि के लिए कोशिकाओं के मोनोलेयर को प्राप्त कर रहा है। एक मोनोलेयर के बिना, कोशिकाएं एक दूसरे के ऊपर जमा होती हैं, जो उचित इमेजिंग और डेटा विश्लेषण के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करती हैं। एक एगर पैड का उपयोग करना, जो कोशिकाओं को कोना का पालन करने में मदद करता है और कक्ष के चारों ओर कोशिकाओं को फैलाता है, मोनोलेयर प्राप्त करने का एक सस्ता और कुशल तरीका है। कक्ष के चारों ओर कोशिकाओं को फैलाने के लिए एगर पैड को स्थानांतरित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है ताकि एक मोनोलेयर प्राप्त किया जा सके। यह सुनिश्चित करना कि आगर पैड चलती प्रक्रिया के दौरान बहुत छोटे आंदोलन कर रहा है, मोनोलेयर बनाने में सहायता कर सकता है। पुन: प्रयोज्य कक्ष बनाने से टाइम-लैप्स इमेजिंग डेटा की सस्ती पीढ़ी की अनुमति मिलती है। उचित सफाई और कीटाणुरहित करने के साथ, यहां वर्णित प्लास्टिक कक्षों को अनिश्चित काल तक पुन: उपयोग किया जा सकता है। यह सबसे अच्छा अभ्यास है कि कक्षों को टाइम-लैप्स इमेजिंग के तुरंत बाद कवरस्लिप से हटा दिया जाता है और अगले उपयोग तक 95% इथेनॉल में संग्रहीत किया जाता है।

टाइम-लैप्स इमेजिंग सेल चक्र के बारे में जानकारी प्रदान करता है जिसे इमेजिंग फिक्स्ड सेल 1,2 से याद किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जब मीओटिक चरणों की अवधि की निगरानी की जाती है, तो निश्चित कोशिकाओं की आबादी की तुलना में जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग करते समय एकल कोशिकाओं के बीच भिन्नताओं की अधिक सटीक जांच की जा सकती है। क्योंकि खमीर प्रोटीन को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ आसानी से टैग किया जा सकता है, एनडीटी 80-इन सिस्टम और एंकर अवे तकनीक के साथ युग्मन फ्लोरेसेंस टाइम-लैप्स इमेजिंग को अतिरिक्त अध्ययनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि व्यक्तिगत गुणसूत्र अलगाव की निगरानी और विशिष्ट मायोटिक चरणों का समय। एनडीटी 80-इन कोशिकाओं में प्रोफ़ेज़ आई रिलीज के बाद सेल चक्र की प्रगति की निगरानी करते समय, एक फ्लोरोसेंट अणु के साथ टैग किया गया प्रोटीन होना महत्वपूर्ण है जो अर्धसूत्रीविभाजन के चरणों को चिह्नित करेगा। लेकी-जीएफपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में क्रोमोसोम के सेंट्रोमियर के पास लैक ऑपेरॉन (एलएसीओ) के दोहराव को एकीकृत करके पूरे अर्धसूत्रीविभाजन में व्यक्तिगत गुणसूत्रों की निगरानी की जा सकती है। LacI-GFP LacO को कसकर बांधता है और इसे एक उज्ज्वल फोकस के रूप में देखा जाता है, जिसका पालन टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी24,25 द्वारा पूरे मिओटिक डिवीजनों में किया जा सकता है। मेयोटिक चरणों की अवधि की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट टैग के साथ विभिन्न प्रोटीनों का उपयोग किया गया है। इनमें टुब 1, α-ट्यूबुलिन सबयूनिट शामिल है जो सूक्ष्मनलिकाएं में शामिल होता है; ज़िप 1, सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स का एक घटक; और एसपीसी 42, एक स्पिंडल पोल बॉडी घटक 1,2,26,27।

अंत में, इस विधि में मायोटिक सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन, लक्ष्य प्रोटीन की सशर्त कमी, और मायोटिक क्रोमोसोम अलगाव का अध्ययन करने के लिए टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी शामिल हैं। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान नवोदित खमीर कोशिकाओं की इमेजिंग करके और सशर्त उत्परिवर्ती का उपयोग करके जो केवल अर्धसूत्रीविभाजन के इच्छित चरणों को प्रभावित करते हैं, यह विधि अर्धसूत्री कोशिका चक्र के बारे में सटीक डेटा प्रदान कर सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम इंडियाना विश्वविद्यालय में लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सेंटर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (जीएम 105755) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-estradiol Millipore Sigma E8875 Make 1mM stocks in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter Millipore Sigma S2GPT02RE
100% EtOH Fisher Scientific 22-032-601
10X PBS Fisher Scientific BP399500 Dilute 1:10 to use as solvent for ConA
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 VWR North American 48393241
25 mm x 75 mm microscope slides VWR North American 48300-026
Adenine hemisulfate salt Millipore Sigma A9126 To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Bacto Agar BD 214030
Concanavialin A Mllipore Sigma C2010 Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera Photometrics Used in Section 4.3
D-glucose Fisher Scientific D16-10
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids BD 291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma D5879
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope Nikon Used in Section 4.4
Fiji NIH Download from https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope Applied Precision Used in Section 4.3
L-Tryptophan  Millipore Sigma T0254 To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Modeling Clay Crayola  2302880000 To secure coverslip in slide holder
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software Nikon Used in Section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera Hamamatsu C15440-20UP Used in Section 4.4
Plastic pipette tip holder Dot Scientific LTS1000-HR Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. 
Pottassium Acetate Fisher Scientific BP264
Rapamycin Fisher Scientific BP29631 Make 1mg/mL stocks in DMSO
Silicone Sealant Aqueon 100165001 Also known as aquarium glue.
SoftWorx7.0.0  Imaging Software Applied Precision Used in Section 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser)  Formedium DSCK2500
Type N immersion oil  Nikon MXA22166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
  2. Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
  3. van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
  4. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  5. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  6. Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
  7. Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
  8. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  9. Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
  10. Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
  11. Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
  12. Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
  13. Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
  14. Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
  15. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
  16. Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
  17. Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
  18. Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
  19. Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
  20. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  21. Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
  22. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
  23. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  24. Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
  25. Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
  26. Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
  27. Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).

Tags

जीव विज्ञान अंक 188
<em>एस सेरेविसिया</em> में अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन की टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी और स्टेज-विशिष्ट परमाणु कमी का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cairo, G., MacKenzie, A., Tsuchiya,… More

Cairo, G., MacKenzie, A., Tsuchiya, D., Lacefield, S. Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64580, doi:10.3791/64580 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter