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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

मानव ट्यूमर वाले मानवकृत माउस मॉडल में कैंसर इम्यूनोथेरेप्यूटिक्स का परीक्षण

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64606
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 2, 1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

यह प्रोटोकॉल इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए मानव प्रतिरक्षा प्रणाली (एचआईएस) चूहों की पीढ़ी को रेखांकित करता है। इस मॉडल में प्रत्यारोपित मानव ट्यूमर पर मानव इम्यूनोथेरेप्यूटिक्स के परीक्षण के लिए इस मॉडल के उपयोग में निर्देश और विचार ट्यूमर के लिए मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया को चिह्नित करने पर जोर देने के साथ प्रस्तुत किए गए हैं।

Abstract

इम्यूनोथेरेपी दवाओं के साथ कैंसर के सफल उपचार के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की इम्यूनोसप्रेसिव प्रकृति को उलटना महत्वपूर्ण है। मुराइन कैंसर मॉडल अपनी विविधता में बेहद सीमित हैं और क्लिनिक में खराब अनुवाद से पीड़ित हैं। इम्यूनोथेरेपी अध्ययनों के लिए अधिक शारीरिक प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में सेवा करने के लिए, इस प्रोटोकॉल को मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ पुनर्गठित माउस में मानव ट्यूमर के उपचार का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया है। यह अनूठा प्रोटोकॉल मानव प्रतिरक्षा प्रणाली (एचआईएस, "मानवीकृत") चूहों के विकास को प्रदर्शित करता है, इसके बाद एक मानव ट्यूमर का आरोपण होता है, या तो एक सेल-लाइन व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (सीडीएक्स) या एक रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स)। एचआईएस चूहों को गर्भनाल रक्त से पृथक सीडी 34 + मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं को नवजात बीआरजीएस (बीएएलबी / सी रैग 2 - आईएल 2 आर सी - / - एनओडीएसआईआरपी) अत्यधिक इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों में इंजेक्ट करके उत्पन्न किया जाता है जो एक ज़ेनोजेनिक ट्यूमर को स्वीकार करने में भी सक्षम हैं। कैनेटीक्स के महत्व और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास और ट्यूमर आरोपण की विशेषताओं पर जोर दिया जाता है। अंत में, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का गहन मूल्यांकन वर्णित है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले कई अध्ययनों में, यह पाया गया कि व्यक्तिगत ट्यूमर के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को एचआईएस-पीडीएक्स चूहों में पुन: उत्पन्न किया जाता है; "गर्म" ट्यूमर बड़ी प्रतिरक्षा घुसपैठ का प्रदर्शन करते हैं जबकि "ठंडे" ट्यूमर नहीं करते हैं। यह मॉडल मानव ट्यूमर की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए संयोजन इम्यूनोथेरेपी के लिए एक परीक्षण मैदान के रूप में कार्य करता है और व्यक्तिगत चिकित्सा की खोज में एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

माउस कैंसर मॉडल ट्यूमर के विकास और प्रतिरक्षा पलायन के बुनियादी तंत्र स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, माउस मॉडल में कैंसर उपचार अध्ययनों ने सीमित सिंजेनिक मॉडल और प्रजाति-विशिष्ट अंतर 1,2 के कारण क्लिनिक में परिमित अनुवाद प्राप्त किया है। ट्यूमर को नियंत्रित करने के लिए एक प्रमुख दृष्टिकोण के रूप में प्रतिरक्षा उपचारों के उद्भव ने कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ एक इनविवो मॉडल की आवश्यकता को दोहराया है। पिछले एक दशक में मानव प्रतिरक्षा प्रणाली चूहों (एचआईएस चूहों) में प्रगति ने विवो में इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी का अध्ययन करने के लिए कैंसर के प्रकारों और इम्यूनोथेरेप्यूटिकएजेंटों की एक विस्तृत विविधता में अध्ययन करना संभव बना दिया है। सेल-लाइन व्युत्पन्न और रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (सीडीएक्स और पीडीएक्स, क्रमशः) सहित मानव ट्यूमर मॉडल, एचआईएस चूहों में अच्छी तरह से बढ़ते हैं और ज्यादातर मामलों में मानव हेमटोपोइएटिक एनग्राफमेंट 7,8 की कमी वाले इम्यूनोडेफिशिएंसी मेजबान में उनके विकास के लगभग समान होते हैं। इस प्रमुख खोज के आधार पर, शोधकर्ता मानव इम्यूनोथेरेपी का अध्ययन करने के लिए एचआईएस माउस मॉडल का उपयोग कर रहे हैं, जिसमें इम्यूनोसप्रेशन को कम करने और इस प्रकार प्रतिरक्षा-निर्देशित ट्यूमर हत्या को बढ़ाने के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) को बदलने के लिए डिज़ाइन किए गए संयोजन उपचार शामिल हैं। ये प्रीक्लिनिकल मॉडल मानव कैंसर की विषमता के मुद्दों को संबोधित करने में मदद करते हैं, और उपचार की सफलता की भविष्यवाणी करने के साथ-साथ प्रतिरक्षा संबंधी दवा विषाक्तता 9,10 की निगरानी भी कर सकते हैं।

मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं की शुरूआत के माध्यम से मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ एक माउस मॉडल के उत्पादन के लिए एक प्राप्तकर्ता इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस की आवश्यकता होती है जो जेनोग्राफ्ट को अस्वीकार नहीं करेगा। वर्तमान एचआईएस माउस मॉडल इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस उपभेदों से प्राप्त होते हैं जो 30 साल पहले रिपोर्ट किए गए थे। वर्णित पहला इम्यूनोडेफिशिएंट माउस स्ट्रेन एससीआईडी चूहों था जिसमें टी और बी कोशिकाओं11 की कमी थी, इसके बाद मानव कोशिकाओं के लिए माउस मैक्रोफेज सहिष्णुता के लिए जिम्मेदार एसआईआरपी बहुरूपता के साथ एक हाइब्रिड एनओडी-एससीआईडी था, जिसके कारण मानव सीडी 47 अणु12,13 के लिए एनओडी एसआईआरपी एलील के लिए बढ़ते बंधन के कारण। 2000 के दशक की शुरुआत में, बीएएलबी /सी और एनओडी इम्यूनोडेफिशिएंसी उपभेदों दोनों पर आईएल -2 रिसेप्टर (आईएल -2 आर सी) की सामान्य गामा श्रृंखला का विलोपन मानव एनग्राफमेंट को बढ़ाने के लिए एक गेम चेंजर था, क्योंकि आनुवंशिक विलोपन मेजबान एनके सेल विकास 14,15,16,17 को रोकता था। वैकल्पिक मॉडल, जैसे कि बीआरजी और एनआरजी चूहे, टी और बी सेल रिसेप्टर जीन पुनर्व्यवस्था के लिए आवश्यक राग 1 या रैग 2 जीन के विलोपन के माध्यम से टी और बी सेल की कमी को प्राप्त करते हैं और इस प्रकार लिम्फोसाइटों की परिपक्वता और अस्तित्व18,19। यहां इस्तेमाल किया गया बीआरजीएस (BALB/c-Rag2nullIl2RaCnullSirpαNOD) माउस IL-2R श्रृंखला की कमी और RAG2-/- पृष्ठभूमि पर NOD SIRP के एलील को जोड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप T, B, या NK कोशिकाओं के बिना एक अत्यधिक इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस होता है, फिर भी पर्याप्त शक्ति और स्वास्थ्य के साथ 30 सप्ताह13 से अधिक की दीर्घकालिक वृद्धि की अनुमति मिलती है।

एचआईएस चूहों को कई तरीकों से उत्पन्न किया जा सकता है, जिसमें मानव पीबीएमसी इंजेक्शन सबसे प्रत्यक्ष विधि 15,18,20 है। हालांकि, इन चूहों में सक्रिय मानव टी कोशिकाओं का एक स्पष्ट विस्तार होता है जिसके परिणामस्वरूप 12 सप्ताह की उम्र तक ग्राफ्ट बनाम होस्ट रोग (जीवीएचडी) होता है, जो दीर्घकालिक अध्ययन को रोकता है। वैकल्पिक रूप से, गर्भनाल रक्त (सीबी), अस्थि मज्जा और भ्रूण के यकृत से मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं का उपयोग मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के एन्ग्राफमेंट और उत्पादन के लिए भी किया जा सकता है। इस प्रणाली में, हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल टी, बी और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पीढ़ी के साथ एक बहु-वंश मानव प्रतिरक्षा प्रणाली का उत्पादन करते हैं जो पीबीएमसी चूहों की तुलना में माउस होस्ट के लिए महत्वपूर्ण रूप से सहिष्णु होते हैं जो ज्यादातर टी कोशिकाओं को विकसित करते हैं। इसलिए, जीवीएचडी अनुपस्थित या बहुत देरी से होता है, और अध्ययन को 10 महीने की उम्र तक चूहों तक बढ़ाया जा सकता है। सीबी सीडी 34 + मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं का एक आसान, सुलभ और गैर-प्रमुख स्रोत प्रदान करता है जो आनुवंशिक रूप से समान प्रतिरक्षा प्रणाली 17,18,20,21 के साथ कई एचआईएस चूहों के एन्ग्राफ्टमेंट की सुविधा प्रदान करता है। पिछले कुछ वर्षों में, एचआईएस माउस मॉडल का उपयोग इम्यूनोथेरेपी और टीएमई 3,4,5,6 का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। इन चूहों में मानव व्युत्पन्न प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के बावजूद, मानव जेनोग्राफ्ट ट्यूमर नियंत्रण इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों की तुलना में समान दर से बढ़ते हैं और कैंसर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच जटिल अंतःक्रिया की अनुमति देते हैं, जो एनग्राफ्टेड पीडीएक्स 3,7,8 के माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। . इस प्रोटोकॉल का उपयोग पीडीएक्स और सीडीएक्स के साथ एचआईएस-बीआरजीएस चूहों में उपचार का परीक्षण करने के लिए 50 से अधिक अध्ययन करने के लिए किया गया है। एक महत्वपूर्ण निष्कर्ष यह है कि एचआईएस चूहों में मानव ट्यूमर प्रारंभिक रोगी के नमूने और प्रतिरक्षा घुसपैठ विशेषताओं 3,22,23 के सापेक्ष ट्यूमर के आणविक मूल्यांकन द्वारा परिभाषित अपने अद्वितीय टीएमई को बनाए रखते हैं। हमारा समूह बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके प्रतिरक्षा अंगों और ट्यूमर दोनों में एचआईएस के गहन मूल्यांकन पर केंद्रित है। यहां, हम बीआरजीएस चूहों के मानवीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, चिमेरिज्म का मूल्यांकन, मानव ट्यूमर का आरोपण, ट्यूमर विकास माप, कैंसर उपचार प्रशासन, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एचआईएस कोशिकाओं का विश्लेषण।

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Protocol

कोलोराडो डेनवर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी प्रोटोकॉल # 00593 और # 00021) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के तहत सभी पशु कार्य किए गए थे। कोलोराडो विश्वविद्यालय डेनवर एंशुट्ज़ मेडिकल कैंपस में अमेरिकन एसोसिएशन फॉर लेबोरेटरी एनिमल केयर द्वारा एक मान्यता प्राप्त सुविधा, प्रयोगशाला पशु संसाधन कार्यालय (ओएलएआर) के अनुसार सभी जानवरों का काम किया गया था। सभी मानव कॉर्ड रक्त के नमूने गैर-पहचाने गए दाताओं से दान के रूप में प्राप्त किए गए थे और इस प्रकार मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदन के अधीन नहीं हैं।

नोट: प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी मीडिया और समाधानों की रचनाएं पूरक फ़ाइल 1 में शामिल हैं। चित्रा 1 एचआईएस-बीआरजीएस चूहों में ट्यूमर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के उत्पादन और विश्लेषण के लिए समग्र प्रोटोकॉल को दर्शाता है।

1. एचआईएस चूहों की पीढ़ी

  1. BALB/c-Rag2null Il2R2Cशून्य SirpøNOD (BRGS) चूहों के माउस पालन
    नोट: यह तनाव बेहद इम्यूनोडेफिशिएंसी है, जिसमें कोई टी, बी या एनके कोशिकाएं नहीं हैं। इसलिए, अवसरवादी संक्रमण को रोकने के लिए कठोर उपायों का उपयोग किया जाना चाहिए। कॉलोनी को सामान्य आहार के साथ वैकल्पिक 2 सप्ताह के कार्यक्रम पर ट्राइमेथोप्रिम और सल्फाडियाज़िन युक्त आहार पर बनाए रखें। एहतियात आवास कक्ष के उच्चतम स्तर में बनाए रखें (उदाहरण के लिए, सीमित पहुंच के साथ एक बाधा शॉवर-इन सुविधा)।
    1. बीएएलबी/सी-रैग2नल आईएल2आरआरओसीनल सिर्पएनओडी (बीआरजीएस) और बीएएलबी/सी रैग2नल आईएल2आरओसीशून्य सिरपाबाल्ब/सी (बीआरजी) होमोजीगस चूहों की कॉलोनियों को ब्रीडर्स के रूप में बनाए रखें।
    2. बीआरजीएसबी/एन पिल्ले उत्पन्न करने के लिए बीआरजीएस एन/एन×बीआरजी बी/बी का प्रजनन करें, जिनका उपयोग मानव स्टेम कोशिकाओं के प्राप्तकर्ता के रूप में किया जाता है। इस कॉलोनी में, बीआरजीएसबी /एन बीआरजीएसएन / एन की तुलना में स्वस्थ हैं, और समकक्ष स्तरों (बीआरजी से अधिक) पर एनग्राफ्ट हैं।
  2. CD34+ गर्भनाल CB से मानव स्टेम सेल अलगाव
    नोट: इस प्रक्रिया के लिए कोई एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग नहीं किया जाता है। इसलिए, अच्छी बाँझ तकनीक अनिवार्य है।
    1. एक निष्फल जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रैक, साथ ही 3x15 एमएल और ~ 10x 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रखें। 70% इथेनॉल के साथ एक रक्त संग्रह बैग स्प्रे करें और इसे बीएससी में सूखने दें।
    2. सीबी घनत्व प्रवणता अलगाव = सीबी वॉल्यूम/15 के लिए आवश्यक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों की संख्या की गणना करें। प्रति ट्यूब रक्त की मात्रा की गणना करें = सीबी मात्रा / ट्यूबों की संख्या। प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब में सीबी बैग से सावधानीपूर्वक रक्त डालें; यह प्रति ट्यूब अधिकतम 15 एमएल है। ऊपर और नीचे पाइप करके बाँझ पीबीएस के साथ रक्त को 1: 1 मिलाने के लिए एक स्वचालित पिपेटर और 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
    3. इंटरफ़ेस को परेशान किए बिना कमरे के तापमान (आरटी) 1.077 ग्राम / एमएल घनत्व ढाल समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ धीरे-धीरे रक्त को कम करने के लिए कम गति पर एक स्वचालित पिपेटर और 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। पिपेट टिप को ट्यूब के तल को छूने से रोकें। सभी ट्यूबों के लिए दोहराएं। फिर घनत्व ढाल के रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए आरटी पर 850 x g पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, बिना ब्रेकिंग के।
    4. 1.077 ग्राम / एमएल घनत्व ढाल के शीर्ष पर सेलुलर बफी कोट को एक बादल सफेद परत के रूप में कल्पना करें। 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट और एक स्वचालित पाइपेटर का उपयोग करके बफी कोट के ऊपर लगभग 10 एमएल तक प्लाज्मा परत को हटा दें और छोड़ दें।
    5. बाँझ स्थानांतरण या सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ बफी कोट इकट्ठा करें। कोशिकाओं को ऊपर खींचने के लिए बल्ब (या धीरे-धीरे पाइपिंग) जारी करते समय शंक्वाकार ट्यूब के किनारे से कोशिकाओं को खुरचने के लिए स्पैटुला की तरह पिपेट का उपयोग करें। दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों से बफी कोट को एक नई 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में मिलाएं।
    6. प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब में 2% एफबीएस युक्त बाँझ एचबीएसएस के 45 एमएल डालकर कोशिकाओं को धोएं। आरटी पर 360 x g पर 11 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    7. सभी ट्यूबों में वॉश मीडिया को पेलेट तक एस्पिरेट करें। 2% एफबीएस युक्त एचबीएसएस के 10 एमएल में पहली गोली को फिर से निलंबित करने के लिए 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट और एक स्वचालित पिपेटर का उपयोग करें। प्रत्येक गोली को एचबीएसएस के एक ही 10 एमएल में पुन: निलंबित करें, और सभी कोशिकाओं को एक ही ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए अतिरिक्त 10 एमएल एचबीएसएस के साथ प्रत्येक ट्यूब को कुल्ला करें।
    8. शंक्वाकार ट्यूब में 2% एफबीएस युक्त बाँझ एचबीएसएस के 45 एमएल डालें। सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 360 x g पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    9. वॉश बफर को सेल पेलेट तक एस्पिरेट करें और 20 एमएल चुंबकीय सेल विभाजक बफर में गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। मेथिलीन नीले रंग में 1:20 कमजोर पड़ने पर हेमसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक छोटा एलिकोट निकालें। नीले और सफेद कोशिकाओं की संख्या जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 360 x g पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए।
      नोट: यह प्रोटोकॉल चुंबकीय मोती प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटोकॉल को सीडी 34 + स्टेम कोशिकाओं की पर्याप्त शुद्धता और उपज के साथ किसी भी सेल-पृथक्करण तकनीक के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है।
    10. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और कॉर्ड रक्त से अलग किए गए सीडी 34 + सेल पेलेट को प्रति 1 x 108 कोशिकाओं में चुंबकीय सेल विभाजक बफर के 300 μL में पुन: निलंबित करें। पहले एफसीआर ब्लॉकिंग अभिकर्मक के 100 μL जोड़ें, और फिर प्रति 1 x 108 कोशिकाओं में CD34+ चुंबकीय मोती के 100 μL जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (कोई बर्फ नहीं)।
    11. प्रति 1 x 108 कोशिकाओं में 5 एमएल चुंबकीय सेल विभाजक बफर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 360 x g पर स्पिन करें। वॉश स्टेप को दोहराएं और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्रति 1 x 108 कोशिकाओं में चुंबकीय सेल विभाजक बफर के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    12. दो और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को "सीडी 34-" और "सीडी 34+" लेबल करें। तीन 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों (अनफ्रैक्शनेटेड, सीडी 34-, और सीडी 34+) को क्रमशः ए 1, बी 1 और सी 1 स्लॉट में कूलिंग रैक पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। निर्माता के उपकरण निर्देशों के अनुसार, बीएससी में एक स्वचालित चुंबकीय सेल विभाजक ( सामग्री की तालिका देखें) पर दो-कॉलम सकारात्मक चयन कार्यक्रम का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें।
  3. सीडी 34+ मानव स्टेम कोशिकाओं का विस्तार और फ्रीजिंग
    1. हेमोसाइटोमीटर स्लाइड पर बरामद सीडी 34 + सेल सस्पेंशन (2 एमएल) का एलिकोट 10 μL और 10x आवर्धन के तहत कोशिकाओं की गणना करें। सेल गणना को 2 x 10 4 से गुणा करकेCD34+ कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें। फ्रीज करने के लिए शीशियों की संख्या की गणना करने के लिए कुल सीडी 34 + सेल संख्या को 250,000 से विभाजित करें ( इन विट्रो विस्तार से पहले प्रति माउस पिल्ला 50,000 कोशिकाएं)।
    2. सीबी मीडियम इस्कोव के 10% एफसीएस (फ़िल्टरिंग हानि के लिए अतिरिक्त 1 एमएल) तैयार करें, जिसे 40 एनजी / एमएल स्टेम सेल फैक्टर, 20 एनजी / एमएल एफएल 3 एल, और 10 एनजी / एमएल आईएल -6 के साथ पूरक किया जाता है, और 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित किया जाता है। सीडी 34 + कोशिकाओं को सीबी माध्यम के 100,000 प्रति एमएल पर पुन: निलंबित किया गया, और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। दिन 3 पर, कोशिकाओं वाले फ्लास्क में साइटोकिन्स के बिना सीबी माध्यम की बराबर मात्रा जोड़ें और साइटोकिन्स के साथ सीबी माध्यम।
      नोट: सीबी माध्यम में इन साइटोकिन्स को जोड़ना भेदभाव को रोकने के दौरान सीडी 34 + कोशिकाओं के अस्तित्व और विस्तार को बढ़ावा देता है।
    3. 5 वें दिन विस्तारित सीडी 34 + कोशिकाओं की कटाई करें। पिपेट सेल निलंबन को ऊपर और नीचे करें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। फ्लास्क के निचले हिस्से को कवर करने के लिए पर्याप्त सीबी माध्यम जोड़ें। सेल स्क्रैपर का उपयोग करके, फ्लास्क के पूरे तल को खुरचें। सभी मीडिया को एक ही 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें, और 11 मिनट के लिए 360 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सीबी माध्यम के 2 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। गिनती के लिए पिपेट से अंतिम बूंद को 96-वेल प्लेट में सहेजें। ट्राइपैन ब्लू में कोशिकाओं को 1: 1 पतला करें और हेमसाइटोमीटर में 10 μL जोड़ें, फिर चार चतुर्थांशों से कोशिकाओं की गणना और औसत करें। सेल गिनती को 4 x10 4 से गुणा करके सीडी 34 + कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें, और व्यवहार्यता रिकॉर्ड करें।
    5. फ्रीजिंग माध्यम का एन + 1 एमएल बनाएं, जहां चरण 1.3.1 में गणना की गई फ्रीजिंग शीशियों की संख्या एन है। एफबीएस में 10% (वी / वी) डीएमएसओ जोड़कर ठंड माध्यम तैयार करें और बर्फ पर रखें। क्रायोवियल्स को सीबी #, सीडी 34 + डी 5, और दिनांक के साथ लेबल करें।
    6. सीडी 34 + कोशिकाओं को 360 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। माध्यम को गोली तक नीचे रखें और ठंड माध्यम में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। प्रत्येक शीशी पर सेल निलंबन के 1 एमएल को एलिकोट करें और शीशियों के बीच समान रूप से किसी भी शेष को विभाजित करें। शीशियों को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा एक आइसोप्रोपेनॉल सेल फ्रीजर में जोड़ें, -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और >90 दिनों के लिए स्टोर करने के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  4. माउस पिल्ले का विकिरण
    1. जन्म के 1-3 दिन बाद बीआरजीएसबी /एन पिल्लों को पैडिंग के साथ एक आटोक्लेव प्लास्टिक बॉक्स में इकट्ठा करें। पिल्ले के साथ बिस्तर की एक छोटी मात्रा जोड़ें। पिंजरे की संख्या और पिल्ले की संख्या के साथ बॉक्स को लेबल करें।
    2. 300 रैड की खुराक के लिए इरेडिएटर ( सामग्री की तालिका देखें) सेट करें। पिल्ले के बॉक्स को इरेडिएटर में सेट करें और उन्हें 300 रैड में उजागर करें। पिल्लों को अपने पिंजरे में वापस ले जाएं, उन्हें एक ढेर में रखें, और बिस्तर के साथ कवर करें।
  5. पुप इंजेक्शन और सीडी 34+ सेल तैयार करना
    1. सीडी 34 + सेल तैयारी शुरू करें ~ 3 घंटे बाद विकिरण। 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सीबी मीडिया के 10 एमएल गर्म करें। बाँझ बीएससी में सभी चरणों का प्रदर्शन करें।
    2. इंजेक्शन लगाने के लिए प्रत्येक चार से छह पिल्ले के लिए इन विट्रो विस्तारित और जमे हुए सीडी 34 + कोशिकाओं की एक शीशी प्राप्त करें। 55 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से पिघलें, जब तक कि बर्फ की थोड़ी मात्रा दिखाई न दे, और कोशिकाओं को गर्म सीबी माध्यम में जोड़ें (शीशी अभी भी स्पर्श के लिए ठंडा होना चाहिए। प्रत्येक शीशी को कुल्ला करने के लिए 1 एमएल माध्यम का उपयोग करें और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए 360 x g पर घुमाएं।
      नोट: 55 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से पिघलने से 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघलने की तुलना में बेहतर सेल व्यवहार्यता (90% -95%) मिली।
    3. माध्यम को सावधानी से रखें। सीबी मीडिया के 2 एमएल में (छोटे) गोली को फिर से निलंबित करें, धीरे से मिलाएं, और एक गिनती प्लेट में एक कुएं में सेल निलंबन के ~ 30 μL जोड़ें। ट्रिपैन ब्लू में 1: 1 पतला करें, फिर हेमोसाइटोमीटर में 10 μL जोड़ें और चार चतुर्थांशों से कोशिकाओं की गणना और औसत करें।
    4. सेल गिनती को 4 x10 4 से गुणा करके सीडी 34 + कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें और फिर व्यवहार्यता रिकॉर्ड करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए 360 x g पर स्पिन करें।
    5. माध्यम को सावधानी से एस्पिरेट करें और इंजेक्शन लगाने के लिए प्रति एन + 1 पिल्ले प्रति एन + 1 पिल्ले के 100 μL बाँझ पीबीएस में सेल पेलेट को पुन: निलंबित करें, जिसके परिणामस्वरूप प्रति माउस 250,000-450,000 सीडी 34+ कोशिकाएं होती हैं। शंक्वाकार ट्यूब को एक परिवहन कंटेनर में बर्फ पर रखें और प्यूप इंजेक्शन के लिए विवेरियम की यात्रा करें।
    6. विवेरियम बीएससी में बाँझ कंटेनरों में एक हीट लैंप, डायपर, 1 एमएल सिरिंज, 18 जी सुई, 30 जी सुई और सीडी 34 + सेल तैयारी लाएं। हीट लैंप के नीचे एक बाँझ डायपर ~ 2 फीट रखें। इंजेक्शन के लिए कूड़े के साथ पिंजरे को पुनः प्राप्त करें और बीएससी में रखें।
    7. सिरिंज को 18 ग्राम की सुई के साथ इकट्ठा करें। सुई के बेवेल के साथ शंक्वाकार ट्यूब के कोण का मिलान करते हुए, धीरे से मिलाएं और सेल निलंबन को खींचें। पिल्ले को गर्म करने के लिए डायपर पर रखें (ओवरहीटिंग के लिए देखें)। सिरिंज से हवा निकालें और 18 जी सुई को 30 जी सुई के साथ बदलें, और फिर सिरिंज को सावधानीपूर्वक धक्का दें जब तक कि सेल सस्पेंशन सुई की नोक पर न हो।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग किया जा सकता है।
    8. हीट लैंप से दूर डायपर के किनारे पर एक बार में एक पिल्ला ले जाएं। अंगूठे और फोरफिंगर के नीचे अपनी तरफ पिल्ले को स्थिर करें, जिससे चेहरे का स्पष्ट दृश्य हो सके। गाल के पार की नस पर ध्यान दें जहां कान होगा। सुई को आंख के निकटतम नस (IV) में उथले रूप से डालें, और धीरे-धीरे 50 μL कोशिकाओं को इंजेक्ट करें।
    9. जांचें कि क्या चमड़े के नीचे इंजेक्शन से एक बुलबुला बन रहा है। यदि हां, तो सुई को गहराई से डालें और कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के लिए आगे बढ़ें। सफल होने पर रक्त / हेमेटोमा की एक छोटी बूंद दिखाई देगी।
      नोट: पप इंजेक्शन के संबंध में गोम्बश लैम्पे एट अल.24 द्वारा प्रक्रिया का संदर्भ लें।
    10. पिल्ला अभी भी स्थिर होने के साथ, एक इंट्राहेपेटिक इंजेक्शन (आईएच) का प्रदर्शन करें जिसमें एक और 50 μL कोशिकाएं (IV + IH के प्रति पिल्ला 100 μL कुल) हैं। यकृत को सफेद दूध बैंड और वक्ष पिंजरे के बीच एक अंधेरे स्थान के रूप में देखा जा सकता है। इंजेक्शन वाले पिल्ले और गर्मी से दूर एक डायपर पर इंजेक्ट किए गए पिल्ले को रखें।
      नोट: IV इंजेक्शन के परिणामस्वरूप अकेले आईएच इंजेक्शन25 की तुलना में बेहतर दीर्घकालिक चिमेरिज्म होता है, लेकिन IV इंजेक्शन हमेशा सफल नहीं होते हैं। इसलिए, आईवी और आईएच के बीच इंजेक्शन को विभाजित करना चूहों के एक बड़े प्रतिशत में एनग्राफमेंट सुनिश्चित करता है।
    11. सभी पिल्लों के लिए चेहरे की नस और आईएच इंजेक्शन दोनों को दोहराएं। किसी भी रक्त को साफ करें, पिल्ले को अपने पिंजरे में घोंसले में वापस करें, और बिस्तर के साथ कवर करें।

2. रक्त में मानव चिमेरिज्म का परीक्षण

  1. 10 और 14 सप्ताह की उम्र में एचआईएस चूहों के रक्त में चिमेरिज्म का परीक्षण करें। रेट्रो-ऑर्बिटल नस के माध्यम से या वैकल्पिक आईएसीयूसी-अनुमोदित विधि का उपयोग करके 50 μL रक्त एकत्र करें।
    1. रेट्रो-ऑर्बिटल ब्लीड्स के लिए, चूहों को आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र के साथ 1-2 मिनट के लिए 5 पर सेट किया जाता है और फिर वेपोराइज़र सेटिंग को 4 तक बदल दिया जाता है। एनेस्थीसिया के तहत चूहों को पर्याप्त ऑक्सीजन युक्त रहने की अनुमति देने के लिए आवश्यकतानुसार वेपोराइज़र को बंद कर दें। चूहों को 5 मिनट से अधिक समय तक आइसोफ्लुरेन के तहत न रखें।
    2. एनेस्थेटाइज्ड माउस की नाक को आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र नाक शंकु अनुलग्नक में रखें और आंख पर एनाल्जेसिक (0.5% प्रोपैराकेन एचसीएल ऑप्थेल्मिक समाधान यूएसपी) की एक बूंद रखें।
    3. 1 मिनट के बाद, एक बाँझ धुंध का उपयोग करके प्रोपराकेन को हटा दें, आंख को प्रोपटोस करें, और 50 μL रक्त एकत्र करने के लिए रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से 75 मिमी हेपरिनाइज्ड हेमटोक्रिट ट्यूब डालें। रक्त को 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में इंजेक्ट करें जिसमें 50 μL हेपरिन होता है और धीरे से मिलाएं।
    4. रक्तस्राव को रोकने के लिए बाँझ धुंध के साथ बंद आंख को पिंच करें और प्रोपैराकेन की एक बूंद लागू करें। माउस को आइसोफ्लुरेन से निकालें और एक साफ पिंजरे में ठीक हो जाएं।
  2. माउस के रक्त से पीबीएमसी अलगाव
    1. 1.077 ग्राम/एमएल घनत्व प्रवणता के 500 μL के ऊपर धीरे-धीरे ऊपर और नीचे और धीरे-धीरे ऊपर की ओर घुमाकर रक्त/हेपरिन को मिलाएं, इस बात का ध्यान रखें कि इंटरफ़ेस को परेशान न किया जाए। बिना ब्रेक के आरटी में 20 मिनट के लिए 1,220 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. प्लाज्मा के नीचे, 1.077 ग्राम / एमएल घनत्व ढाल के शीर्ष पर एक बादल परत के रूप में सेलुलर बफी कोट की कल्पना करें। 200 μL पिपेट के साथ बफी कोट से जितना संभव हो उतनी कोशिकाओं को हटा दें और 750 μL फसल माध्यम वाले नए 1.5 mL ट्यूबों में जोड़ें। आरटी पर 11 मिनट के लिए 360 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. मध्यम को 50 μL तक गिराएं और 750 μL फसल माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 360 x g पर, और फिर से 50 μL तक नीचे। कोशिकाएं सतह के दाग में पुन: निलंबित होने के लिए तैयार हैं।
  3. सतह धुंधला होना और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण
    1. धुंधला पैनल वर्कशीट भरें (तालिका 1; माउस नंबर के साथ "स्पेक्ट्रल फ्लो ब्लीड पैनल" वर्कशीट और स्टेनिंग बफर (पूरक फ़ाइल 1) में सभी फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी जोड़कर एंटीबॉडी धुंधला कॉकटेल तैयार करें। नमूने को 96-वेल यू-बॉटम प्लेट में जोड़ने के लिए एक प्लेट लेआउट बनाएं। एक स्थायी मार्कर का उपयोग करके कुओं के तल को चिह्नित करें। उपयुक्त एकाग्रता निर्धारित करने के लिए धुंधला होने से पहले एक मानक प्रक्रिया का उपयोग करके एंटीबॉडी कोटाइटरेट करें।
    2. 96-वेल यू-बॉटम प्लेट के प्रत्येक कुएं में सतह दाग कॉकटेल का 62 μL जोड़ें। ट्यूब में शेष 50 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और प्रत्येक नमूने को इसके संबंधित कुएं में जोड़ें। नमूने के साथ दाग लगाने के लिए एक सकारात्मक धुंधला नियंत्रण (मानव पीबीएमसी + माउस स्प्लेनोसाइट्स, 1 x 106 कोशिकाएं प्रत्येक) के लिए एक कुआं शामिल करें। पिपेट करके मिलाएं और मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. सेंट्रीफ्यूज 680 x g पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाले को हटाने के लिए प्लेट को सिंक में फेंक दें, और ~ 10x को धीरे से पाइप करके 150 μL धुंधला बफर में पुन: निलंबन करके कोशिकाओं को धोएं। प्रत्येक कुएं को 150 μL धुंधला बफर में स्पिन और पुन: निलंबित करें।
    4. प्रवाह साइटोमीटर पर प्रत्येक नमूने के 100 μL के लिए डेटा प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें) और .fcs फ़ाइलों को निर्यात करें। प्रवाह डेटा संपादन सॉफ़्टवेयर में .fcs फ़ाइलें आयात करें ( सामग्री तालिका देखें). किसी भी मलबे को छोड़कर, कोशिकाओं के आसपास एफएससी-ए एक्स एसएससी-ए प्लॉट पर एक बहुभुज गेट लागू करें। गेट के भीतर कक्षों का चयन करें ( तालिका 1 देखें; "वर्णक्रमीय प्रवाह रक्तस्राव गेटिंग" वर्कशीट)।
    5. अक्षों को (एफएससी-ए एक्स एफएससी-एच) में बदलें और रैखिक विकर्ण पर निहित कोशिकाओं को गेट करें, जिसमें रेखा से निकलने वाले डबल्स शामिल नहीं हैं। इन कक्षों का चयन करें और अक्षों को (hCD45 x mCD45) में परिवर्तित करें।
    6. एचसीडी 45+ आबादी के लिए एक बहुभुज गेट लागू करें और "मानव" नाम लागू करें। mCD45+ आबादी के लिए एक बहुभुज गेट लागू करें और "माउस" नाम लागू करें। मानव और माउस आबादी दोनों के लिए एक गिनती आंकड़ा बनाएं।
    7. मानव आबादी का चयन करें और अक्षों को (CD19 x CD3) में बदलें। सीडी 19 + कोशिकाओं पर एक बहुभुज गेट लागू करें और इसे "बी कोशिकाओं" नाम दें। सीडी 3 + आबादी के लिए एक बहुभुज गेट लागू करें और इसे "टी कोशिकाओं" नाम दें। दोहरी नकारात्मक आबादी के लिए एक बहुभुज द्वार लागू करें और इसे "NonTB" नाम दें।
    8. T सेल जनसंख्या का चयन करें और अक्षों को (CD8 x CD4) में परिवर्तित करें। सीडी 4 और सीडी 8 सकारात्मक आबादी के लिए एक बहुभुज गेट लागू करें और उन्हें क्रमशः "सीडी 4 +" और "सीडी 8 +" नाम दें।
    9. NonTB जनसंख्या का चयन करें और अक्षों को (CD56 x माइलॉयड) में बदलें। डबल पॉजिटिव घटनाओं सहित कुल सीडी 56 पॉजिटिव आबादी पर एक बहुभुज गेट लागू करें और इसे "एनके कोशिकाओं" नाम दें। सीडी 56 नकारात्मक और माइलॉयड पॉजिटिव आबादी पर एक बहुभुज गेट लागू करें और इसे "माइलॉयड" नाम दें।
    10. प्रतिशत के लिए एक तालिका बनाएं और सभी आबादी के आंकड़ों की गणना करें और स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर को निर्यात करें ( सामग्री की तालिका देखें)। %hCD45 चिमेरिज्म = %hCD45/(%hCD45 + mCD45) की गणना करें।
    11. आगे के प्रयोगों के लिए उन चूहों को बाहर रखें जो <20% एचसीडी 45 + (एमसीडी 45 + एचसीडी 45) हैं।
      नोट: इस अध्ययन में, पीबीएमसी को क्लीनर आरबीसी कमी के लिए 1.077 ग्राम / एमएल घनत्व ढाल पृथक्करण का उपयोग करके तैयार किया गया था। इस प्रक्रिया ने पीबीएमसी परत से मानव और माउस ग्रैनुलोसाइट्स को बाहर रखा। वैकल्पिक रूप से, आरबीसी लाइसिस का उपयोग किया जा सकता है।

3. चूहों में ट्यूमर का इंजेक्शन

  1. ट्यूमर इंजेक्शन से पहले, 14 सप्ताह के रक्तस्राव डेटा से टी सेल संख्या की पुष्टि करें। ट्यूमर को 20-26 सप्ताह के बीच फसल के लिए तैयार होने के लिए इंजेक्ट किया जाता है यदि टी कोशिकाएं >20% हैं, और 24-28 सप्ताह के बीच यदि टी कोशिकाएं कुल प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का <20% हैं। यह इंजेक्शन समय सुनिश्चित करता है कि चूहे 20-28 सप्ताह की उम्र के हैं और अध्ययन के अंत में पर्याप्त संख्या में टी कोशिकाएं हैं।
  2. सेल-लाइन व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (सीडीएक्स) का इंजेक्शन
    नोट: प्रक्रिया को एमडीए-एमबी -231 स्तन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक उदाहरण के रूप में वर्णित किया गया है।
    1. जमे हुए कोशिकाओं के एक एलिकोट को पिघलाएं, 10% एफबीएस, 1% पेनस्ट्रेप और 1% गैर-अमीनो एसिड के साथ पूरक डीएमईएम के 10 एमएल में पुन: निलंबन करके 1 एक्स धोएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 360 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। मध्यम को एस्पिरेट करें और डीएमईएम के 10 एमएल में पुन: निलंबित करें, जो टी 25 फ्लास्क में 10% एफबीएस, 1% पेनस्ट्रेप और 1% गैर-अमीनो एसिड के साथ पूरक है और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है।
      नोट: सही सेल प्रकार सुनिश्चित करने के लिए सेल लाइनों को पीसीआर द्वारा प्रमाणित किया जाता है। इंजेक्शन से पहले जैव रासायनिक परख के माध्यम से माइकोप्लाज़्मा के लिए सेल सुपरनैटेंट का परीक्षण किया जाता है।
    2. लगभग 80% स्थिरता पर घातीय विकास चरण के दौरान कोशिकाओं को पारित करना और विस्तारित करना।
      1. माध्यम को एस्पिरेट करें, कोशिकाओं को 5-10 एमएल बाँझ पीबीएस (पीएच 7.2) के साथ कुल्ला करें, और 1-5 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं फ्लास्क से अलग न हो जाएं।
      2. उसी DMEM का 5 mL जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। सेल निलंबन के पूरे 6 एमएल को एक नई ऊतक संस्कृति में पारित करें, जिसमें टी 75 फ्लास्क (1: 3 कमजोर पड़ने) का इलाज किया गया है और डीएमईएम का अतिरिक्त 10 एमएल जोड़ा गया है।
      3. कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए डीएमईएम में 1: 3 तनुकरण प्लेटिंग पर 80% कंफ्लुएंसी पर हर 2-3 दिनों में कोशिकाओं को पारित करें।
    3. छह मार्गों के भीतर घातीय विकास चरण के दौरान 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को काटें और पीबीएस के साथ धोएं। पीबीएस और बेसमेंट झिल्ली निकालने ( सामग्री की तालिका देखें) को 1: 1 अनुपात में मिलाएं और 5 x 107 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर कोशिकाओं में जोड़ें।
    4. चरण 2.1.1 में वर्णित आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। चमड़े के नीचे 23 जी सुई का उपयोग करके प्रत्येक फ्लैंक में ट्यूमर सेल निलंबन के 100 μL (5 x 106 कोशिकाएं) इंजेक्ट करें।
  3. ट्रोकार्स का उपयोग करके रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) का इंजेक्शन करें। पीडीएक्स मॉडल के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया और अन्य विकास और रखरखाव निर्देश साहित्य27 में उपलब्ध हैं।

4. ट्यूमर विकास माप

  1. ट्यूमर के विकास के लिए फ्लैंक के साथ महसूस करके प्रत्यारोपण के बाद सप्ताह में एक बार ट्यूमर की प्रगति की जांच करें। एक बार जब ट्यूमर स्पष्ट हो जाते हैं, तो चूहों को आइसोफ्लुरेन (जैसा कि चरण 2.1.1 में वर्णित है) के साथ एनेस्थेटाइज करें और प्रत्येक फ्लैंक पर एक इलेक्ट्रिक ट्रिमर के साथ शेव करें, ट्यूमर के बढ़ने के साथ अल्सरेशन को रोकने के लिए ट्यूमर के चारों ओर देखभाल करें।
    नोट: ट्यूमर के आसपास की त्वचा पर चोटों को रोकने के लिए ट्यूमर इंजेक्शन से पहले चूहों को मुंडाया जा सकता है; हालांकि, बालों के पुन: विकास की दर ट्यूमर माप में बाधा डाल सकती है।
  2. कैलिपर्स का उपयोग करके प्रति सप्ताह दो बार ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई को मापें और मिमी में माप रिकॉर्ड करें। सूत्र का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा (मिमी3) के रूप में ट्यूमर माप की रिपोर्ट करेंEquation 1। ध्यान रखें कि ट्यूमर के बोझ को 2,000 मिमी 3 प्रति एकल ट्यूमर या 3,000 मिमी 3 की संयुक्त मात्रा से अधिक नहोने दें।
    नोट: कैंसर अनुसंधान में चूहों के उपयोग के लिए दिशानिर्देश स्थान के अनुसार भिन्न होते हैं। कृपया शोधकर्ता के संस्थान में पशु देखभाल और उपयोग नीतियों को देखें।

5. दवा उपचार

  1. एचआईएस चूहों को एचसीडी 45 चिमेरिज्म, एचसीडी 3 चिमेरिज्म और एचसीडी 8 चिमेरिज्म के आधार पर समकक्ष उपचार समूहों में आवंटित करें। एक बार जब ट्यूमर औसतन 100 मिमी3 तक पहुंच जाता है, तो दवा उपचार शुरू करें।
    नोट: प्रति समूह चूहों की संख्या सीबी से उत्पन्न एचआईएस चूहों की संख्या पर आधारित है। प्रति समूह कम से कम चार चूहों की सिफारिश की जाती है। गैर-द्विपक्षीय मल्टीग्रुप मिलान (उदाहरण के लिए, आर-विवो मनीला सॉफ्टवेयर में) इस समूह28 के लिए उपयोगी है।
  2. दवा मार्ग और आवृत्ति
    1. एकल उपचार के लिए प्रति सप्ताह 30 मिलीग्राम / किग्रा 1x या 20 मिलीग्राम / किग्रा 2x प्रति सप्ताह, या संयोजन उपचार के लिए प्रति सप्ताह 10-15 मिलीग्राम / किग्रा 2x पर एंटी-पीडी -1 इनहिबिटर (निवोलुमैब, पेम्ब्रोलिज़ुमैब) इंट्रापेरिटोनियल (यानी) इंजेक्ट करें।
    2. प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार, लक्षित उपचार, केमोथेरेपी और विकिरण जैसे संयोजन उपचारों को खुराक दें। लक्षित उपचार और कीमोथेरेपी मौखिक गैवेज, यानी इंजेक्शन, या भोजन के माध्यम से दी जा सकती है।
      नोट: प्रकाशित डेटा और ट्यूमर मॉडल के अनुसार खुराक को विविध और अनुकूलित किया जा सकता है। खुराक अध्ययन अक्सर एचआईएस माउस अध्ययन से पहले इम्यूनोडेफिशिएंसी प्राप्तकर्ताओं में परीक्षण किया जाता है।
  3. वजन घटाने, ढीले मल, झुकी हुई मुद्रा, कम गतिशीलता और फर हानि जैसे स्वास्थ्य परिवर्तनों के लिए प्रति सप्ताह कम से कम 3 गुना चूहों की निगरानी करें। कुछ लक्षण दवा विषाक्तता या जीवीएचडी के संकेत हो सकते हैं, और दवा की खुराक को कम या बंद करने की आवश्यकता हो सकती है। पशु देखभाल और उपयोग नीतियों के अनुसार आवश्यकतानुसार चूहों को इच्छामृत्यु करें।

6. अध्ययन के अंत में माउस ऊतकों और ट्यूमर की कटाई

  1. 2.75 एल / मिनट की प्रवाह दर के साथ संपीड़ित सीओ2 गैस का उपयोग करके संस्थागत और पशु चिकित्सा दिशानिर्देशों के अनुसार चूहों को अकेले इच्छामृत्यु दें। मृत्यु के बाद 1 मिनट के लिए सीओ2 में रखे गए चूहों की निगरानी करें और फिर इच्छामृत्यु के द्वितीयक रूप के रूप में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करें।
  2. रक्त संग्रह
    1. इंट्राकार्डियक पंचर के माध्यम से रक्त एकत्र करें। माउस को एक सीधी स्थिति में पकड़ें और मध्य रेखा के ठीक बाईं ओर और पसलियों के नीचे एक रेखा से सीधे दिल में 25 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज डालें। रक्त को एक लंबे ड्रॉ के माध्यम से आदर्श रूप से एक सिरिंज में इकट्ठा करें और लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: देखभाल के साथ फेफड़ों की गुहा के कोनों से अतिरिक्त रक्त एकत्र करने के लिए अतिरिक्त सुई सम्मिलन किया जा सकता है।
    2. रक्त को 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें, फिर 7,800 x g पर 6 मिनट के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में रक्त को सेंट्रीफ्यूज करें। रक्त इंटरफ़ेस के ऊपर स्पष्ट तरल (सेरा) को एक दूसरे साफ और लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए सीरम को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जैसे कि मानव और माउस भड़काऊ साइटोकिन या इम्युनोग्लोबुलिन टिटर्स।
  3. ऊतक विच्छेदन
    1. चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन और विकास और दवा उपचार के प्रशासन के बाद, ऊतकों की कटाई करें। चूहों को फोम विच्छेदन बोर्ड पर रखें, उन्हें पकड़ने के लिए पिन के साथ, और हाथ और पैर 45 डिग्री कोण पर बढ़े हुए हैं। धड़ के बीच में एक चीरा लगाएं, श्रोणि के पास शुरू करें और ठोड़ी तक फैले, पेरिटोनियम को काटने से बचने की कोशिश करें (हालांकि यह आवश्यक नहीं है)। त्वचा को किनारे पर खींचें और पिन के साथ जगह पर पकड़ें।
    2. निम्नलिखित क्रम में ठीक बल का उपयोग करके लिम्फ नोड्स (LNs) निकालें: इंगुइनल, एक्सिलरी, सर्वाइकल, मेसेंटेरिक, हिएटल।
      नोट: उनके चूहों में, एलएन अक्सर बहुत छोटे होते हैं, जो एनलेज से मिलते जुलते हैं, या जंगली प्रकार के माउस के विपरीत एक अलग उपस्थिति के साथ "सूजन" होते हैं। इसलिए, प्रत्येक साइट से LNs जैसा दिखने वाला ऊतक लिया जाता है। परिधीय LNs अक्सर तरल पदार्थ से भरे "गेंदों" के रूप में दिखाई देते हैं, जबकि मेसेंटेरिक LNs अधिक घने होते हैं। मेसेंटेरिक एलएन सबसे स्पष्ट और सुसंगत हैं और एक स्ट्रिंग के विपरीत एक या दो अलग-अलग सघन नोड्स के रूप में देखे जाते हैं।
    3. पेट्री डिश में 8 एमएल फसल माध्यम में फ्रॉस्टेड ग्लास स्लाइड के एक तरफ एलएन रखें। ठंढे किनारों के साथ लंबवत कोणों पर स्लाइड्स को पकड़ते हुए, धीरे से ऊतकों को दबाएं जब तक कि सेलुलर सामग्री जारी न हो जाए।
    4. कोशिकाओं की अधिकतम मात्रा को छोड़ने के लिए स्लाइडों को अलग और एक साथ खींचकर कई बार कुल्ला करें। ग्लास पिपेट में 5 के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें 9 इंच कपास-प्लग किए गए पिपेट के माध्यम से लेबल 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें।
    5. पेट के ऊपरी बाईं ओर से प्लीहा को दो जोड़ी बल या बल और कैंची का उपयोग करके निकालें। रिसस्पेंशन मीडिया की मात्रा के अनुमान के रूप में प्लीहा के आकार पर ध्यान दें। ठंढ वाले ग्लास स्लाइड का उपयोग करके यांत्रिक पाचन द्वारा प्लीहा को इकट्ठा और फ़िल्टर करें, जैसा कि एलएन के साथ होता है।
      नोट: एकल सेल निलंबन के लिए ऊतकों की तैयारी के लिए किसी भी तकनीक का उपयोग किया जा सकता है।
    6. नीचे वर्णित ऊतक के नमूनों से कोशिकाओं की गिनती और पुन: निलंबन करें।
      1. लिम्फ कोशिकाओं को 360 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। तरल को एस्पिरेट करें और डीनेस के साथ 1 एमएल फसल माध्यम में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
      2. 3 मिनट के लिए आरटी पर 3 एमएल एसीके लाइसिस बफर के साथ इंजेक्शन करके तिल्ली कोशिकाओं से एरिथ्रोसाइट्स को हटा दें, इसके बाद 10 एमएल फसल माध्यम / तिल्ली कोशिकाओं को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें, और प्लीहा के आकार के आधार पर 1-10 एमएल फसल मीडिया / डीनेस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (उदाहरण के लिए, बहुत छोटी तिल्ली के लिए 1 एमएल और सबसे बड़ी तिल्ली के लिए 10 एमएल तक)।
      3. 90 μL मीडिया में सेल सस्पेंशन का 10 μL एलिकोट जोड़ें और हेमोसाइटोमीटर पर गिनती करें। LN और प्लीहा कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले कणों को उत्तेजित करें, और 1 x 10 8 कोशिकाओं / mL, या न्यूनतम80 μL की एकाग्रता पर फसल माध्यम में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. ट्यूमर निकालें।
      1. ट्यूमर को खुले फ्लैंक से हटा दें, जबकि ट्यूमर को बल के साथ पकड़कर हटा दें, जबकि धीरे-धीरे विच्छेदन कैंची के साथ ट्यूमर मार्जिन पर स्निपिंग करें।
      2. एक बार ट्यूमर को हटा दिए जाने के बाद, इसे तौलें और आरएनए और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) प्रसंस्करण के लिए 1/4 हटा दें। 1/4 ट्यूमर को आधे में विभाजित करें; एक क्रायोवियल में एक आधा (पूरे ट्यूमर का 1/8) रखें, तरल एन2 में फ्लैश फ्रीज करें, और डाउनस्ट्रीम जीनोमिक अध्ययन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      3. ट्यूमर के अन्य 1/8 को एक लेबल नमूना ट्यूब में रखें जिसमें 10% फॉर्मेलिन हो। अगले दिन, भविष्य के उपयोग तक 70% इथेनॉल में ऊतक को कुल्ला और पुन: निलंबित करें। ट्यूमर के शेष 3/4 को 6 सेमी डिश में रखें और स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके ~ 1 मिमी टुकड़ों में कीमा डालें।
      4. ट्यूमर के टुकड़ों को एक पृथक्करण ट्यूब में ले जाएं ( सामग्री की तालिका देखें), डिश को 5 एमएल अपूर्ण ट्यूमर घुसपैठ ल्यूकोसाइट (टीआईएल) माध्यम के साथ कुल्ला करें, और पृथक्करण ट्यूब में जोड़ें।
        नोट: >0.4 ग्राम वजन वाले ट्यूमर के लिए, डिश को 10 एमएल टीआईएल अपूर्ण मीडिया के साथ कुल्ला करें और पृथक्करण ट्यूब में जोड़ें।
      5. पृथक्करण ट्यूब में ऊतक में 50 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर कोलेजनेज तैयारी ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। ट्यूमर की दृढ़ता के आधार पर 30 मिनट से 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर यांत्रिक पृथक्करण का उपयोग करके ऊतक को अलग करें।
      6. पृथक्करण के बाद, निलंबन को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 100 μm फ़िल्टर पर पास करें और फ़िल्टर को 10 एमएल टीआईएल पूर्ण मीडिया के साथ कुल्ला करें। इस मीडिया में सीरम कोलेजनेज प्रतिक्रिया को रोक देगा और कोशिकाओं को आगे के क्षरण से बचाएगा।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 360 x g पर एकल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। डीनेस के साथ केवल पर्याप्त फसल माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें ताकि सेल निलंबन आसानी से पी 1000 पिपेट टिप से गुजर सके और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए मात्रा रिकॉर्ड कर सके।
        नोट: एक छोटी मात्रा ट्यूमर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संग्रह को बढ़ाती है लेकिन प्रवाह साइटोमीटर क्लॉग के लिए अतिसंवेदनशील होती है।

7. सेल धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण

  1. दाग तैयार करना और सेल चढ़ाना
    1. धुंधला कॉकटेल तैयार करें: फसल के दिन, धुंधला वर्कशीट में नमूनों की संख्या जोड़ें (तालिका 2; "पारंपरिक प्रवाह ए पैनल", "स्पेक्ट्रल फ्लो बी पैनल", और "पारंपरिक फ्लो सी पैनल" वर्कशीट) सभी दाग और प्रिंट के लिए। स्टेनिंग बफर (एसबी) में दाग ए और बी के लिए सतह दाग कॉकटेल तैयार करें, प्रत्येक एंटीबॉडी को एक नई टिप के साथ व्यक्तिगत रूप से जोड़कर, प्रत्येक अभिकर्मक को चलते-फिरते चिह्नित करके, और आवश्यकता होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एज़ाइड-मुक्त पीबीएस में उपयुक्त व्यवहार्यता रंजक तैयार करें और आवश्यकता होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (उपयोग से पहले आरटी को गर्म करें)। एसबी में दिन 2 पर सतह दाग सी कॉकटेल तैयार करें, साथ ही इंट्रासेल्युलर दाग बी और सी उनके संबंधित परमेबिलाइजेशन बफर में।
    2. धुंधला वर्कशीट में सभी नमूनों के लिए एक प्लेट लेआउट बनाएं और कुओं में एज़ाइड-मुक्त पीबीएस के 100 μL का एलिकोट करें। प्रत्येक ऊतक और दाग (वर्णक्रमीय साइटोमेट्री के लिए) के लिए बिना दाग वाले नियंत्रण शामिल करें।
    3. कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में जोड़ें जिसमें 50 μL PBS होता है। दाग ए के लिए, प्रत्येक ऊतक समूह को उचित मात्रा में पुन: निलंबित करें, जैसा कि धुंधला वर्कशीट पर उल्लेख किया गया है, और उसी दिन प्रवाह साइटोमीटर पर अधिग्रहण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। दाग बी और सी के लिए, पीबीएस वाले कुओं में 25 μL लिम्फ और 60 μL गैर-लिम्फ ऊतक सेल निलंबन जोड़ें।
    4. स्टेन सी का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर धुंधला द्वारा पता लगाने के लिए साइटोकिन्स की इन विट्रो उत्तेजना करें।
      1. चरण 7.1.3 से 680 x g पर दाग C 96-वेल प्लेट को 3 मिनट के लिए 4 °C पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्रत्येक कुएं में टीआईएल पूर्ण मीडिया (आरपीएमआई 1640, 10 एमएम एचईपीईएस [पीएच 7], 10% एफबीएस) के 200 μL जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन के साथ प्लेट स्टोर करें।
      2. अगली सुबह, पूर्ण टीआईएल मीडिया में सेल उत्तेजना कॉकटेल ( सामग्री की तालिका देखें) 1:500 को पतला करें। कोशिकाओं को पेलेट करने और मीडिया को हटाने के लिए फ्लिक करने के लिए 680 x g पर सेल निलंबन युक्त प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। तैयार सेल उत्तेजना कॉकटेल के 200 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      3. पूर्ण टीआईएल मीडिया में 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर मोनेसिन युक्त प्रोटीन ट्रांसपोर्ट इनहिबिटर समाधान का 25 μL जोड़ें, कोशिकाओं को मिलाएं, और साइटोकिन्स के इंट्रासेल्युलर संचय की अनुमति देने के लिए अतिरिक्त 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. सेल धुंधला करें।
      1. दाग ए और बी (दिन 1) के लिए, और दाग सी (दिन 2) के लिए, सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 680 x g पर। प्लेटों को फ्लिक करें और कुओं में उपयुक्त व्यवहार्यता रंजक जोड़ें। मल्टीचैनल पिपेट के साथ धीरे-धीरे ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से मिलाएं और आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      2. प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें (चरण 7.1.5.1 में), फिर प्लेटों में उपयुक्त सतह के दाग जोड़ें और मल्टी-चैनल पिपेट के साथ पाइपिंग करके धीरे से मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। प्लेटों को फ्लिक करें, कोशिकाओं को धीरे-धीरे 150 μL SB, और सेंट्रीफ्यूज के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके धोएं।
      3. प्लेटों को फ्लिक करें, 150 μL SB के साथ धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके धोने को दोहराएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 680 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। दाग ए के लिए, प्रत्येक ऊतक समूह को उचित मात्रा में पुन: निलंबित करें, जैसा कि धुंधला वर्कशीट पर उल्लेख किया गया है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। स्टेन बी के लिए, आरटी पर 30 मिनट के लिए फॉक्सपी 3 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर किट फिक्सेटिव ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ ठीक करें। दाग सी के लिए, आरटी पर 30 मिनट के लिए एसबी में 1% (वी / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड में तय करें।
      4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 480 x g पर निश्चित प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें। एसबी में 1x धो लें। स्टेन बी के लिए, कोशिकाओं को रात भर छोड़ा जा सकता है।
      5. कोशिकाओं को स्थिर करें: दाग B के लिए फॉक्सपी3 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर किट परमेबिलाइजेशन बफर के 150 μL में कुओं को फिर से निलंबित करें और स्टेन C के लिए SB में 0.5% (w/v) सैपोनिन में। RT पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 480 x g पर निश्चित प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें।
      6. प्लेटों को फ्लिक करें और आरटी में 30 मिनट के लिए स्टेन बी और स्टेन सी के लिए संबंधित इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग कॉकटेल जोड़ें।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 480 x g पर स्थिर प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें और प्लेटों को फ्लिक करें। कोशिकाओं को संबंधित परमेबिलाइजेशन बफर (स्टेन बी, फॉक्सपी 3 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर किट परमेबिलाइजेशन बफर; स्टेन सी, सैपोनिन) के 150 μL के साथ धोएं।
      8. प्लेटों को फ्लिक करें और 150 μL SB में ऊपर और नीचे पाइप करके धोएं। सेंट्रीफ्यूज 480 x g पर 3 मिनट के लिए 4 °C पर। प्लेटों को फ्लिक करें और स्टेनिंग वर्कशीट पर नोट किए गए उपयुक्त वॉल्यूम में ऊतक समूह द्वारा एसबी में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
        नोट: नमूने अब वर्णक्रमीय प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अधिग्रहण के लिए तैयार हैं।
      9. प्रत्येक दाग के लिए उपयुक्त एकल दाग वाले नियंत्रण ों के साथ प्रवाह साइटोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) सेट करें और अनमिक्सिंग के दौरान ऑटोफ्लोरेसेंस में अंतर के लिए प्रत्येक ऊतक समूह के लिए बिना दाग वाले नमूने। धुंधला कार्यपत्रक (तालिका 2) में परिभाषित प्रति ऊतक समूह उपयुक्त वॉल्यूम प्राप्त करें और .fcs फ़ाइलों को निर्यात करें।
  2. फ्लो साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण
    1. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), एक नया कार्यस्थान बनाएँ। प्रत्येक अंग (एलएन, प्लीहा और टीआईएल) के लिए नए समूह बनाएं। समूह में प्रत्येक अंग के लिए .fcs फ़ाइलें आयात करें.
    2. एक द्विभिन्नरूपी डॉट प्लॉट बनाएं, अक्षों को (एफएससी-ए एक्स एसएससी-ए) पर सेट करें, और किनारों (सभी कोशिकाओं के गेट) पर घटनाओं से बचते हुए सेलुलर घटनाओं के लिए एक बहुभुज गेट लागू करें। सेलुलर घटनाओं का चयन करें, अक्षों को (एफएससी-ए एक्स एफएससी-एच) में बदलें, और रैखिक विकर्ण पर घटनाओं के लिए एक बहुभुज द्वार लागू करें, उन घटनाओं को छोड़कर जो "सिंगल्स" गेट उत्पन्न करने के लिए विकर्ण से विचलित होती हैं। "सिंगलेट्स" गेट का चयन करें और अक्षों को (hCD45 x mCD45) में बदलें। एचसीडी 45 और एमसीडी 45 सकारात्मक घटनाओं के लिए बहुभुज द्वार लागू करें, और उन्हें क्रमशः "मानव" और "माउस" नाम दें।
    3. मानव आबादी का चयन करें और वाई-अक्ष को लाइव / डेड एक्वा में बदलें। जीवित / मृत नकारात्मक, एचसीडी 45 सकारात्मक आबादी के लिए एक बहुभुज द्वार लागू करें और इसे "जीवित मानव" नाम दें। माउस की आबादी का चयन करें और X-अक्ष को Live/Dead Aqua में बदलें. मृत नकारात्मक, mCD45 सकारात्मक आबादी के लिए एक बहुभुज गेट लागू करें और इसे "लाइव माउस" नाम दें।
    4. इसी तरह, संकेतित आबादी (जैसे, मानव बी कोशिकाओं, सक्रिय टी कोशिकाओं) को अलग करने के लिए "पारंपरिक फ्लो ए गेटिंग", "स्पेक्ट्रल फ्लो बी गेटिंग", और "पारंपरिक फ्लो सी गेटिंग" वर्कशीट (तालिका 2) में उल्लिखित मूल गेट और एक्स- और वाई-अक्षों का चयन करें।
      नोट: प्रत्येक दाग (ब्लीड, ए, बी, सी) के लिए प्रतिनिधि गेटिंग पूरक फ़ाइल 2 में शामिल है।
    5. सभी आबादी के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर में गिनती और आवृत्ति निर्यात तालिकाएं बनाएं और स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर को निर्यात करें। आवृत्तियों के लिए मूल जनसंख्या तालिका 2 में दर्शाई गई है।
    6. प्रयोगात्मक उपचार समूहों के आधार पर ग्राफ़ उत्पन्न करने के लिए डेटा का उपयोग करें।
      नोट: विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आर पैकेज का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण भी किया जा सकता है। विश्लेषण किए जाने वाले सभी नमूनों से एक एकल .fcs फ़ाइल कॉन्केनेट सुविधा का उपयोग करके बनाई जा सकती है। ऊतक प्रकार और उपचार समूह के लिए कीवर्ड पैरामीटर जोड़ते समय इस डेटा को टी-एसएनई एल्गोरिदम के साथ आयामी रूप से कम किया जा सकता है। फ्लोसोम एल्गोरिदम का उपयोग तब क्लस्टर आबादी के लिए किया जा सकता है और क्लस्टर एक्सप्लोरर टूल का उपयोग आबादी की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। नोवेल सेल आबादी को इस तरह से पहचाना जा सकता है, नेत्रहीन रूप से तुलना की जा सकती है, और उपचार समूहों के बीच या विभिन्न ऊतकों के भीतर मात्रा निर्धारित की जा सकती है।
    7. एक ही उपचार समूह के भीतर ट्यूमर के लिए प्रतिरक्षा मापदंडों को सहसंबंधित करें, उस ट्यूमर के लिए इम्यूनोटाइप को परिभाषित करने के लिए विकास के साथ जो ट्यूमर विकास निषेध के साथ सहसंबंधित है। उस ट्यूमर के लिए विशिष्ट विकास दर (एसजीआर) द्वारा ट्यूमर के विकास की मात्रा निर्धारित करें, एक माप जो एक निर्दिष्ट समय में ट्यूमर की मात्रा में अंतर को ध्यान में रखता है। यह माप माउस स्वास्थ्य और उपचार शुरू होने की तारीखों के कारण अलग-अलग दिनों में काटे गए ट्यूमर को सामान्य करता है।
      Equation 2

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Representative Results

फ्लैंक ट्यूमर प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक समयरेखा (चित्रा 1) के बाद, लक्षित टायरोसिन किनेज इनहिबिटर (टीकेआई) थेरेपी और निवोलुमैब संयोजन उपचार के लिए ट्यूमर की वृद्धि और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन दो अलग-अलग मानव कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) पीडीएक्स में किया गया था। ट्यूमर के विकास का मूल्यांकन करने के लिए इम्यूनोडेफिशिएंसी मेजबानों में टीकेआई दवाओं का अध्ययन किया गयाहै। इस मॉडल ने अकेले टीकेआई की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में परिवर्तन के अध्ययन को सक्षम किया, और इससे भी महत्वपूर्ण बात, एंटी-पीडी -1 के साथ संयोजन में। यह अध्ययन दो अलग-अलग प्रयोगों में इलाज किए गए समूहों के संयोजन पर केंद्रित था जो एचआईएस-बीआरजीएस चूहों और तकनीकी रूप से त्रुटिपूर्ण प्रयोग का उपयोग करके एक सफल मूल्यांकन का प्रतिनिधित्व करते हैं। पीडीएक्स सीआरसी 307 पी के लिए, संयोजन उपचार ने ट्यूमर के विकास को धीमा कर दिया, जैसा कि समय के साथ ट्यूमर के विकास की मात्रा, फसल पर ट्यूमर वजन और एसजीआर (चित्रा 2 ए-सी) द्वारा निर्धारित किया गया है। दूसरी ओर, एक ही रोगी, पीडीएक्स सीआरसी 307 एम से मेटास्टैटिक ट्यूमर से विकसित पीडीएक्स की वृद्धि, एचआईएस-बीआरजीएस चूहों के एक अलग समूह में परीक्षण की गई, एचआईएस-बीआरजीएस चूहों में एक ही संयोजन उपचार से कम प्रभावित थी (चित्रा 2 डी)।

ट्यूमर प्रत्यारोपण से पहले रक्त में समग्र मानव (एचसीडी 45+) और मानव टी सेल (एचसीडी 3+) चिमेरिज्म के आधार पर समकक्ष प्रयोगात्मक समूहों में एचआईएस-बीआरजीएस चूहों के आवंटन के बावजूद (चित्रा 3 ए-सी), परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली (तिल्ली) और ट्यूमर-घुसपैठ करने वाले ल्यूकोसाइट्स (टीआईएल) में दोनों मापदंडों में वृद्धि हुई, जो सीआरसी 307 पी-असर चूहों का इलाज करते हैं, लेकिन सीआरसी 307 एम मॉडल (चित्रा 3 डी-एफ) नहीं। ). विशेष रूप से, हालांकि एचआईएस-बीआरजीएस दोनों समूहों में ट्यूमर प्रत्यारोपण से पहले रक्त में तुलनीय मानव और टी सेल चिमेरिज्म था, सीआरसी 307 एम कॉहोर्ट में बहुत कम लिम्फ नोड चिमेरिज्म था और इलाज किए गए कोहोर्ट में प्लीहा में टी कोशिकाओं के सराहनीय स्तर को विकसित करने में विफल रहा (चित्रा 3 डी-एफ)। सीआरसी 307 एम प्रयोग समग्र अपर्याप्त स्प्लेनिक टी सेल चिमेरिज्म और लिम्फ नोड चिमेरिज्म के कारण तकनीकी रूप से त्रुटिपूर्ण उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है। हम एचआईएस चूहों के बहिष्करण का सुझाव देते हैं जिनके पास अध्ययन के अंत में लिम्फ नोड्स में तिल्ली और / या <1.5 x 106 एचसीडी 45 + कोशिकाओं में <20% एचसीडी 3 + चिमेरिज्म है। सीआरसी 307 एम मॉडल के लिए, अधिकांश चूहों को बाहर रखा गया था, ज्यादातर बहुत छोटे लिम्फ नोड्स के कारण, प्रति समूह केवल दो चूहों को छोड़ दिया गया था।

मानव टी कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) की आगे की जांच में सीआर 307 पी ट्यूमर में अधिक सक्रिय (एचएलए-डीआर +) टी कोशिकाओं का पता चला, लेकिन संयोजन-उपचारित चूहों से लिम्फ नहीं (चित्रा 4 बी)। सीआरसी 307 एम "नकारात्मक" प्रयोग में, सभी चूहों का विश्लेषण करते समय इलाज किए गए एचआईएस-बीआरजीएस चूहों के टीआईएल में एचएलए-डीआर + टी कोशिकाओं की कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं हुई, यह सुझाव देते हुए कि इस गैर-इष्टतम एचआईएस-बीआरजीएस कॉहोर्ट ने एचआईएस चूहों के कारण डेटा महत्व को प्रभावित किया, जिसमें बहुत कम टी कोशिकाएं थीं और कोई सक्रियण नहीं था (चित्रा 4 बी))। दरअसल, सीआरसी 307 एम मॉडल में टीआईएल में एचएलए-डीआर + टी कोशिकाओं में वृद्धि कम टी सेल चिमेरिज्म एचआईएस-बीआरजीएस चूहों (चित्रा 4 बी) को छोड़कर महत्व तक पहुंच गई। इसके अलावा, संयोजन-उपचारित सीआरसी 307 पी ट्यूमर में अधिक प्रभावक मेमोरी सीडी 8 + टी कोशिकाएं और कम टीआईएम -3 + (टर्मिनल रूप से समाप्त) टी कोशिकाएं थीं, जबकि यह अंतर सीआरसी 307 एम मॉडल (चित्रा 4 सी, डी) में नोट नहीं किया गया था। इस प्रयोग में, संयोजन-उपचारित चूहों के बीच साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं (ग्रैनजाइम बी + या आईएफएन + टीएनएफ +) आबादी की आवृत्तियों में कोई बदलाव नहीं देखा गया था, हालांकि उच्च साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं को अनुपचारित (चित्रा 4 ई) या लिम्फ नोड्स के सापेक्ष इलाज (डेटा नहीं दिखाया गया) ट्यूमर में देखा गया था। महत्वपूर्ण रूप से, हालांकि टी सेल आबादी के बीच आवृत्तियों में कोई अंतर नहीं था, लेकिन इलाज किए गए एचआईएस-सीआरसी 307 पी-बीआरजीएस चूहों के ट्यूमर में साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं की उच्च संख्या देखी गई, जिसमें उच्च आवृत्तियों (चित्रा 3 बी) और ट्यूमर में मानव टी कोशिकाओं की संख्या थी। दूसरी ओर, इस संयोजन उपचार ने सीआरसी 307 पी लिम्फ अंगों या ट्यूमर में ट्रेग की आवृत्तियों पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया, हालांकि सीआरसी 307 एम डेटा ने कम ट्रेग की प्रवृत्ति दिखाई जिसे एक और प्रयोग (चित्रा 4 एफ) में मान्य करने की आवश्यकता होगी।

मानव प्रतिरक्षा प्रणाली से पूछताछ करने के अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं पर प्रतिरक्षा से संबंधित परिवर्तनों का भी फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 5 ए) का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। प्रोटोकॉल में वर्णित ईपीकैम + कोशिकाओं पर गेटिंग करके, सीआरसी 307 पी ट्यूमर कोशिकाओं पर एमएचसी क्लास 1 (एचएलए-एबीसी) और क्लास II (एचएलए-डीआर) दोनों की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति पाई गई थी। सीआरसी 307 एम मॉडल में, इसी दवा उपचार ने ट्यूमर कोशिकाओं पर एचएलए क्लास द्वितीय अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, हालांकि सीआरसी 307 पी मॉडल (चित्रा 5 सी) की तुलना में कम डिग्री तक। इस प्रकार, संयोजन उपचार टी सेल घुसपैठ (चित्रा 5 बी, सी) से स्वतंत्र एमएचसी वर्ग द्वितीय के अपरेग्यूलेशन को प्रेरित करता प्रतीत होता है। विशेष रूप से, ट्यूमर कोशिकाओं पर एमएचसी अभिव्यक्ति मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तुलना में कम थी, मानव ट्यूमर रिपोर्ट (चित्रा 5 बी) के अनुरूप एक खोज। इसी तरह, संयोजन-उपचार के परिणामस्वरूप ईपीकैम + सीआरसी 307 पी ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 5 डी) पर पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई।

अंत में, ट्यूमर के विकास के साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के सहसंबंधों की जांच ट्यूमर बनाम प्रतिरक्षा मापदंडों के एसजीआर को प्लॉट करके की गई थी। यद्यपि अनुपचारित चूहों के ट्यूमर में सीडी 4 + टी कोशिकाओं की आवृत्ति ने ट्यूमर के विकास के साथ कोई संबंध नहीं दिखाया, सीडी 4 + टी कोशिकाओं में वृद्धि ने छोटे ट्यूमर के विकास के साथ एक महत्वपूर्ण (चित्रा 6 ए) सहसंबंध दिखाया, और विशेष रूप से एचएलए-डीआर + सक्रिय टी कोशिकाओं (चित्रा 6 बी), एचआईएस चूहों का इलाज किया।

Figure 1
चित्रा 1: एचआईएस-बीआरजीएस चूहों की पीढ़ी और कैंसर इम्यूनोथेरेपी अध्ययन के लिए मानव सीडीएक्स या पीडीएक्स ट्यूमर के आरोपण को दर्शाने वाला योजनाबद्ध चित्रण। टी कोशिकाओं की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए समयरेखा महत्वपूर्ण है जिन्हें सीबी-व्युत्पन्न एचआईएस चूहों में एनग्राफ्ट करने में महीनों लगते हैं। Biorender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ट्यूमर के विकास का विश्लेषण। नियंत्रण (काला) या संयोजन उपचारित (लाल) एचआईएस-बीआरजीएस चूहों के लिए ट्यूमर विकास माप समय के साथ (ए) मात्रा, (बी) अध्ययन के अंत में वजन, या (सी) विशिष्ट विकास दर (एसजीआर) द्वारा निर्धारित किया गया है। (घ) सीआरसी 307 एम पीडीएक्स के लिए एसजीआर। डेटा में छह वाहन एचआईएस-बीआरजीएस चूहों के दोनों किनारों में प्रत्यारोपित ट्यूमर, सीआरसी 307 पी के लिए सात संयोजन-उपचारित बीआरजीएस चूहे और उच्च बहिष्करण दर के कारण सीआरसी 307 एम के लिए केवल दो वाहन और संयोजन-उपचारित चूहे शामिल हैं। दो स्वतंत्र समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण अप्रकाशित, पैरामीट्रिक दो-समूह वेल्च के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। ** पी < 0.01, ***पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: सीआरसी पीडीएक्स ट्यूमर-असर एचआईएस-बीआरजीएस चूहों के लिम्फ अंगों और ट्यूमर में मानव प्रतिरक्षा और टी सेल चिमेरिज्म। (ए) ट्यूमर प्रत्यारोपण से पहले परिधीय रक्त (पीबीएमसी) में मानव (एचसीडी 45) और माउस (एमसीडी 45) हेमटोपोइएटिक और मानव टी (सीडी 3) कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण, और अध्ययन के अंत में एलएन और ट्यूमर (टीआईएल) में। (बी, सी) एचआईएस-बीआरजीएस चूहों में 14 सप्ताह में रक्त में समकक्ष मानव और टी सेल चिमेरिज्म बाद में (बी) सीआरसी 307 पी या (सी) सीआरसी 307 एम पीडीएक्स के साथ इंजेक्ट किया गया और संयोजन इम्यूनोथेरेपी (टीएक्स) के साथ अनुपचारित या इलाज किया गया। (डी-एफ) एचआईएस-बीआरजीएस-सीआरसी 307 पी चूहों के लिम्फ अंगों और ट्यूमर (टीआईएल) में मानव टी कोशिकाओं में वृद्धि हुई, लेकिन एचआईएस-बीआरजीएस-सीआरसी 307 एम चूहों में नहीं। डेटा अध्ययन के अंत में व्यक्तिगत चूहों के (डी) लिम्फ नोड्स (एलएन), (ई) तिल्ली (एसपी), और (एफ) ट्यूमर में माता-पिता की आबादी के प्रतिशत के रूप में वाई-अक्ष पर मानव और टी सेल आवृत्तियों को दिखाता है। दो स्वतंत्र समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण अप्रकाशित, पैरामीट्रिक दो-समूह वेल्च के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: परिधीय लिम्फ अंगों में फ्लो साइटोमेट्री द्वारा टी सेल सक्रियण का विश्लेषण और एचआईएस-बीआरजीएस चूहों वाले सीआरसी पीडीएक्स के ट्यूमर। (ए) निम्नलिखित आबादी को मापने वाले एचआईएस-बीआरजीएस चूहों से प्राप्त एलएन, तिल्ली (एसपी), और ट्यूमर (टीआईएल) में टी कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण: सक्रिय टी कोशिकाएं (एचएलए-डीआर +), भोले टी कोशिकाएं (सीडी 45 आरए + सीसीआर 7 +), टेम (सीडी 45 आरए -, सीडी 45 आरए-, CCR7-), ट्रेग्स (CD25+, FoxP3+), और साइटोटोक्सिक T कोशिकाएं (Granzyme B+, TNF+, और/ या IFN+)। (बी-डी) एचआईएस-सीआरसी 307पी-बीआरजीएस और एचआईएस-सीआरसी 307 एम-बीआरजीएस चूहों के लिम्फ अंगों या टीआईएल में संकेतित टी सेल आबादी की आवृत्तियों: (बी) एचएलए-डीआर + सक्रिय टी-कोशिकाएं, (सी) सीसीआर 7-सीडी 45आरए-टेम सीडी 8 + टी कोशिकाएं, (डी) निरोधात्मक रिसेप्टर टीआईएम -3 सीडी 8 + टी कोशिकाएं, (ई) ग्रैनजाइम बी सीडी 8 + टी कोशिकाएं, और (एफ) सीडी 25 + फॉक्सपी 3 + सीडी 4 + ट्रेग्स। एचआईएस-सीआरसी 307 एम-बीआरजीएस चूहों के लिए (बी) में, पहला डेटा सेट फसल पर विश्लेषण किए गए सभी चूहों को दिखाता है, जबकि दूसरे डेटा सेट में केवल पर्याप्त एलएन और स्प्लेनिक टी सेल चिमेरिज्म वाले शामिल हैं। सभी ग्राफ़ में, 307 एम के लिए भरे हुए प्रतीक पर्याप्त चिमेरिज्म वाले चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि खुले प्रतीकों को एचआईएस चूहों से बाहर रखा गया है। दो स्वतंत्र समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण अप्रकाशित, पैरामीट्रिक दो-समूह वेल्च के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: HIS-BRGS चूहों में मानव ट्यूमर पर MHC वर्ग I, II और PD-L1 का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (A) प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री डॉट प्लॉट, जो HIS-BRGS चूहों में उपकला (EPCAM+) मानव ट्यूमर पर MHC वर्ग I (HLA-ABC), वर्ग II (HLA-DR), और PD-L1 के अभिव्यक्ति स्तर को मापने के लिए गेटिंग रणनीति को दर्शाता है। (बी-डी) एचआईएस-बीआरजीएस चूहों से अलग किए गए सीआरसी 307 पी (बी, डी) या सीआरसी 307 एम (सी) पीडीएक्स से मानव (एचसीडी 45+) और ट्यूमर (ईपीकैम +) कोशिकाओं पर एचएलए-एबीसी (बी), एचएलए-डीआर (बी, सी), और पीडी-एल 1 (डी) की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई)। दो स्वतंत्र समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण अप्रकाशित, पैरामीट्रिक दो-समूह वेल्च के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। *p <0.05, **p<0.01, ***p<0.0001. संक्षिप्त नाम: Tx = उपचार कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिक्रिया के इम्यूनोसहसंबंधों का विश्लेषण। अनुपचारित (वीएच) या संयोजन इम्यूनोथेरेपी-उपचारित (टीएक्स) एचआईएस-बीआरजीएस चूहों के फ्लैंक में सीआरसी 307 पी ट्यूमर के विकास के एसजीआर को प्रतिरक्षा मापदंडों के संकेतक के रूप में (ए) सीडी 4 + या (बी) एचएलए-डीआर + टी कोशिकाओं की आवृत्ति के खिलाफ प्लॉट किया गया था जो कम ट्यूमर विकास (यानी, छोटे एसजीआर) के साथ सहसंबंधित हैं। महत्वपूर्ण सहसंबंधों को इंगित करने के लिए एक सरल रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण किया गया था। आर2 मान सहसंबंध की डिग्री को इंगित करते हैं। * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पिछले 6 वर्षों में, इम्यूनोलॉजी और मानवकृत चूहों दोनों में हमारी विशेषज्ञता का उपयोग करते हुए, हमारी शोध टीम ने विभिन्न प्रकार के मानव ट्यूमर 3,7,30,31 पर इम्यूनोथेरेपी का परीक्षण करने के लिए एक बहुत आवश्यक प्रीक्लिनिकल मॉडल विकसित किया है। यह प्रोटोकॉल इम्यूनोथेरेपी-केंद्रित मानव टी सेल आबादी पर विशेष ध्यान देने के साथ मॉडल की परिवर्तनशीलता पर विचार करने पर जोर देता है। इस प्रोटोकॉल में, एचआईएस चूहों की पीढ़ी का वर्णन किया गया है, साथ ही साथ उनके लिम्फ अंगों और ट्यूमर दोनों का प्रतिरक्षा विश्लेषण भी किया गया है। पारंपरिक मुआवजा-आधारित साइटोमीटर और वर्णक्रमीय साइटोमीटर के लिए विकसित फ्लो साइटोमेट्री प्रोटोकॉल को भी शामिल किया गया है। बड़े ट्यूमर के नमूनों के साथ-साथ परिधि में प्रतिरक्षा प्रणाली में परिवर्तन से पूछताछ करने की क्षमता, इस प्रीक्लिनिकल मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करती है। इस प्रणाली के लिए एक अतिरिक्त लाभ यह है कि एक ही अद्वितीय मानव ट्यूमर को आश्रय देने वाले कई चूहों को अलग-अलग समूहों में आवंटित किया जा सकता है और इम्यूनोथेरेपी दवाओं के विभिन्न संयोजनों के साथ इलाज किया जा सकता है, अनिवार्य रूप से "मिनी" दवा परीक्षण किया जाता है। संयुक्त रूप से, ये दो कारक प्रस्तावित (संयोजन) इम्यूनोथेरेपी की कार्रवाई और प्रतिरोध के तंत्र में जांच को सक्षम करते हैं। मॉडल में विभिन्न प्रकार के मानव ट्यूमर और प्रतिरक्षा-लक्षित उपचारों की एक विस्तृत विविधता पर दवा के समय और खुराक का परीक्षण करने की क्षमता है, जिसमें लक्षित उपचार, जीवविज्ञान, केमोथेरेपी, विकिरण और यहां तक कि सेल-आधारित उपचार भी शामिल हैं।

एचआईएस चूहों चिमेरिज्म में अंतर्निहित परिवर्तनशीलता के कारण, एक विशिष्ट सिंजेनिक ट्यूमर मॉडल की तुलना में प्रति उपचार समूह चूहों की अधिक संख्या की आवश्यकता होती है। इन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, प्रति उपचार हाथ पांच से सात एचआईएस-बीआरजीएस चूहों के समूह प्रतिरक्षा मापदंडों में सांख्यिकीय अंतर प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं। चिमेरिज्म में यह परिवर्तनशीलता इस मॉडल में एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करती है और इस पर विचार किया जाना चाहिए। सीआरसी पीडीएक्स के संयोजन उपचार पर ट्यूमर के विकास और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दोनों का प्रदर्शन करने वाला एक प्रयोगात्मक उदाहरण यहां दिखाया गया है, साथ ही एक उदाहरण जिसमें एक अलग सीआरसी पीडीएक्स के लिए एक ही उपचार ने समान मजबूत प्रतिक्रिया नहीं दिखाई। प्रयोगात्मक परिणाम में यह अंतर विभिन्न पीडीएक्स (एक ही रोगी लेकिन मेटास्टैटिक बनाम प्राथमिक) और / या चिमेरिज्म के कारण हो सकता है। दूसरे प्रयोग में, उपचार समूह में अधिकांश चूहों की तिल्ली में बहुत कम टी कोशिकाएं थीं, साथ ही साथ बहुत छोटे एलएन भी थे; कई प्रयोगशालाओं ने दिखाया है कि एचआईएस-मॉडल के बीच सबसे बड़ी बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता टी सेल आवृत्तियों 20,32,33 हैं। हमने यह भी दिखाया है कि LNs में मानव एनग्राफ्टमेंट टी सेल चिमेरिज्म32 के साथ अत्यधिक संबंधित है। 40 से अधिक प्रयोगों में, हमने उपचार से संबंधित प्रतिरक्षा परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पर्याप्त चिमेरिज्म के लिए तिल्ली में 20% टी कोशिकाओं की आवश्यकता पर ध्यान दियाहै। बलिदान पर, महत्वपूर्ण टी सेल पुनर्गठन सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है, जिसे हम प्लीहा में उल्लेखनीय एलएन विकास (>1.5 x 106 एचसीडी 45 कोशिकाओं) और >20% टी कोशिकाओं (एचसीडी 45+ कोशिकाओं) के रूप में परिभाषित करते हैं। उनके चूहे जो इस आवश्यकता को पूरा नहीं करते हैं, उन्हें डेटा सेट से हटा दिया जाता है। ट्यूमर प्रत्यारोपण से पहले रक्त में चिमेरिज्म इस पैरामीटर की भविष्यवाणी करने में मदद करता है; हालांकि, समय के साथ अलग-अलग चूहों में टी सेल के विकास में अंतर हैं जिन्हें अध्ययन के अंत में सबसे अच्छा माना जाता है। सौभाग्य से, इस मॉडल में, एचआईएस-बीआरजीएस-चूहों के लगभग 95% समूह इम्यूनोथेरेपी अध्ययन के लिए पर्याप्त टी सेल चिमेरिज्म विकसित करते हैं। यह जोर दिया जाना चाहिए कि अध्ययन के अंत में डेटा विश्लेषण में हमेशा परिधीय लिम्फ अंगों में चिमेरिज्म की पूछताछ शामिल होनी चाहिए और एचआईएस चूहों को हटा देना चाहिए जो मानव और टी सेल चिमेरिज्म से नहीं मिलते हैं। इस समायोजन के बाद प्रति कोहोर्ट चार से कम एचआईएस चूहों के साथ प्रयोगों में, परिणामों को एक अलग सीबी से प्राप्त एक अलग एचआईएस-बीआरजीएस कॉहोर्ट के साथ मान्य किया जाना चाहिए।

यद्यपि हमारे समूह ने बीआरजीएस माउस मॉडल प्राप्तकर्ता पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन दुनिया भर में कई मॉडल उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, एनएसजी (NOD.Cg-प्रकडीसीस्सिडIl2rgtm1Wjl/SzJ) प्राप्तकर्ता सबसे व्यापक रूप से विशेषता वाला मॉडल है और NOG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/Jic) और यहां तक कि NRG (NOD-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl/SzJ) मॉडल के समान है, जो एससीआईडी म्यूटेशन20 के बजाय माउस टी और बी कोशिकाओं के आनुवंशिक पृथक्करण के लिए रैग म्यूटेशन का उपयोग करता है। ये मॉडल सभी एनओडी पृष्ठभूमि तनाव पर हैं और इस प्रकार एसआईआरपीएएनओडी एलील है, जो मेजबान मैक्रोफेज13 द्वारा मानव कोशिकाओं के फागोसाइटोसिस से बचने में महत्वपूर्ण है। रिपोर्टों से पता चलता है कि इन "बुनियादी" मानवकृत माउस मॉडल में बीआरजीएस मॉडल के समान चिमेरिज्म है, जिसमें पहले कुछ महीनों में ज्यादातर मानव बी कोशिकाएं हैं, इसके बाद मानव टी कोशिकाओं 32,34,35 के साथ एनग्राफमेंट होता है। इन मॉडलों में, एनके और माइलॉयड कोशिकाओं को मानव36,37 के सापेक्ष कम दर्शाया जाता है। "अगली पीढ़ी" मानवकृत माउस प्राप्तकर्ताओं के कई पुनरावृत्तियां हैं जो मानव-विशिष्ट साइटोकिन्स की शुरूआत के माध्यम से वंश-विशिष्ट विकास में सुधार कर सकती हैं। उदाहरण के लिए, NSG-SGM3 (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl Tg (CMV-IL3, CSF2, KITLG)1Eav/MloySzJ) चूहों में मानव IL-3, GM-CSF, और SCF साइटोकिन्स होते हैं और मानव एचएलए पर चयन के लिए मानव माइलोपोइजिस37, या मानव एचएलए ट्रांसजेन (जैसे, NSG-HLA-A2 या BRGS-HLA-A2/38, 38, 38) होते हैं। इस विषय पर व्यापक समीक्षा 20,21 पाठकों के लिए अनुशंसित हैं। उनके माउस मॉडल को मानव स्टेम कोशिकाओं के अपने स्रोत के साथ प्रत्येक प्रयोगशाला में मान्य किया जाना चाहिए। इस सत्यापन में मानव बी, टी, एनके और माइलॉयड कोशिकाओं सहित मानव चिमेरिज्म को निर्धारित करना शामिल होना चाहिए, समय के साथ रक्त में और 16-20 सप्ताह के बीच और फिर 24-28 सप्ताह के बीच एलएन, प्लीहा, अस्थि मज्जा और थाइमस में। टी सेल चिमेरिज्म सहित बहु-वंश एनग्राफमेंट पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, ट्यूमर की वृद्धि दर को एक ही तनाव के गैर-मानवीकृत चूहों के सापेक्ष एचआईएस चूहों में परीक्षण किया जाना चाहिए। यह प्रशंसनीय है कि एचआईएस माउस मॉडल में महत्वपूर्ण सुधार के परिणामस्वरूप ट्यूमर की अस्वीकृति हो सकती है। संसाधन-बचत के प्रयास के रूप में, इन विकास वक्रों को अक्सर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया डेटा विश्लेषण के साथ एक साथ किया जाता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एचआईएस चूहों में रक्त से व्यापक चिमेरिज्म डेटा के साथ-साथ अन्य समूहों के अन्य अंगों में चिमेरिज्म के संदर्भ शामिल होने चाहिए।

मानव सीडीएक्स या पीडीएक्स के लिए एचआईएस चूहों में ट्यूमर के विकास और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को मानक प्रयोगशाला पद्धतियों और प्रतिरक्षाविज्ञानी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। एचआईएस चूहों की पीढ़ी, जिसमें स्टेम कोशिकाओं का अलगाव, इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में इंजेक्शन और रक्त में मानव चिमेरिज्म का परीक्षण शामिल है, सभी अपेक्षाकृत सरल प्रयोगशाला प्रक्रियाएं हैं। इस प्रक्रिया के आसपास के तार्किक मुद्दे, जिसमें अत्यधिक इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस उपभेदों का प्रजनन, मानव एचएससी का एक विश्वसनीय स्रोत प्राप्त करना आदि शामिल हैं, प्रोटोकॉल का सबसे बोझिल घटक हैं। प्रक्रियात्मक रूप से, प्रयोगात्मक डिजाइन पर अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए, जिसमें ट्यूमर प्रत्यारोपण का समय (आमतौर पर 19-21 सप्ताह जब पर्याप्त टी कोशिकाएं मौजूद होती हैं), दवा की खुराक और अध्ययन के अंत का समय शामिल है। ट्यूमर माप डेटा प्राप्त करना एक और नियमित प्रक्रिया है। हालांकि, चूंकि प्रतिरक्षा डेटा अक्सर इस प्रणाली में ट्यूमर विकास डेटा की तुलना में अधिक जानकारीपूर्ण होता है, इसलिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण प्रासंगिक डेटा प्रदान कर सकते हैं। फ्लो साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं का धुंधला होना एक और सीधी प्रक्रिया है, क्योंकि यह सीख रहा है कि प्रवाह साइटोमीटर कैसे चलाया जाए। हालांकि, इस डेटा के विश्लेषण और व्याख्या के लिए अद्वितीय विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। जबकि यह पांडुलिपि एचआईएस चूहों में इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन करने के लिए रीढ़ की हड्डी के रूप में कार्य करती है, प्रत्येक प्रोटोकॉल चरण को एक नई प्रयोगशाला के भीतर अनुकूलित किया जाना चाहिए। अनुभव से, चूहों के स्वास्थ्य को बनाए रखना, सीबी इकाइयों से पर्याप्त एचएससी प्राप्त करना, और पर्याप्त टी कोशिकाओं के लिए ट्यूमर इंजेक्शन का समय सबसे अधिक ध्यान देने और समस्या निवारण की आवश्यकता होती है।

एचआईएस-बीआरजीएस चूहे कई मानव ट्यूमर में देखे गए समान चरम प्रतिरक्षा दमन का प्रदर्शन करते हैं। यह प्रतिरक्षा दमन उल्लेखनीय है, क्योंकि पीडी -1 और टीआईजीआईटी के उच्च अभिव्यक्ति स्तर, फिर भी कम टीआईएम -3, एचआईएस-बीआरजीएस चूहों 3,7 के परिधीय प्रतिरक्षा अंगों में टी कोशिकाओं पर देखे जाते हैं। ये टी कोशिकाएं प्रतिरक्षा सक्रियण के मार्कर भी दिखाती हैं, जिसमें एचएलए-डीआर की उच्च अभिव्यक्ति और सीसीआर 7 और सीडी 45 आरए की कम अभिव्यक्ति शामिल है, जो टी प्रभावक कोशिकाओं का संकेत है, जैसा कि चित्र 4 और संदर्भ 3,7 में दिखाया गया है। यह गुणवत्ता प्रणाली के लिए एक केंद्रीय विरोधाभास है; इम्यूनोसप्रेशन एक एलोजेनिक एचआईएस की उपस्थिति में एलोजेनिक मानव ट्यूमर के विकास की अनुमति देता है, गैर-मानवकृत बीआरजीएस या नग्न (एनयू / जे) चूहों के समान या उससे भी तेज दरों पर 3,7,23। हालांकि, प्रतिरक्षा उत्तेजनाओं को इस इम्यूनोसप्रेशन को दूर करने और ट्यूमर 7,8 को अस्वीकार करने में सक्षम दिखाया गया है। यद्यपि वाहन और इलाज किए गए चूहों के बीच ट्यूमर के विकास में महत्वपूर्ण परिवर्तन हमेशा नहीं देखे जाते हैं, प्रतिरक्षा फेनोटाइप में महत्वपूर्ण अंतर अधिक बार पाए गए हैं, इसलिए प्रतिरक्षा फेनोटाइप से संबंधित ट्यूमर विकास दर का विश्लेषण करने का सुझाव दिया जाता है। इस विश्लेषण में, प्रतिरक्षा पैरामीटर पाए गए जो कम ट्यूमर के विकास के साथ महत्वपूर्ण रूप से सहसंबंधितहैं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि विशेष "इम्यूनोकोरिलेट्स" उपचार से संबंधित हैं और ट्यूमर नियंत्रण में भाग लेते हैं। इस प्रकार, एचआईएस माउस मॉडल में प्रतिरक्षा फेनोटाइप के साथ संयुक्त ट्यूमर विकास माप अद्वितीय मानव ट्यूमर के लिए ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के संबंध में महत्वपूर्ण प्रीक्लिनिकल डेटा प्रदान करते हैं। किसी भी प्रीक्लिनिकल मॉडल के लिए चुनौती नैदानिक परिणामों के साथ सहसंबंध है। एचआईएस माउस ऑन्कोलॉजी क्षेत्र में नैदानिक सहसंबंध के कई उदाहरण हैं: 1) हमने और दूसरों ने दिखाया है कि मानव प्रतिरक्षा घुसपैठ ट्यूमर प्रकार 3,22,23,40 के साथ संबंधित है; 2) हमने एसीसी लिंच सिंड्रोम पीडीएक्स में एंटी-पीडी -1 के साथ सफल उपचार दिखाया है, जो बाद में इस चिकित्सा का जवाब देने वालेरोगी से लिया गया था। और 3) हमने सीआरसी एमएसएस हाय पीडीएक्स के लिए बेहतर प्रतिक्रियाएं दिखाई हैं, कुख्यात रूप से खराब प्रतिक्रिया वाले सीआरसी एमएसएस पीडीएक्स7 पर क्लिनिक में उच्च प्रतिक्रिया दर वाला कैंसर। इन विट्रो और विवो मॉडल में अन्य के साथ, ये डेटा क्लिनिक में अनुवाद के लिए एक गठजोड़ प्रदान करते हैं।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

हम अपने चूहों की देखभाल के लिए पशु अनुसंधान सुविधा (ओएलएआर) और हमारे संस्थान में कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट (पी 30सीए046934) द्वारा समर्थित फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन दोनों को हमारे सभी काम में उनकी अपार मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम अपने एचआईएस-बीआरजीएस मॉडल में मानव पीडीएक्स के इम्यूनोथेरेपी का अध्ययन करने वाले हमारे उद्घाटन सहयोग के लिए गेल एकहार्ट और अन्ना कैपासो दोनों को भी स्वीकार करते हैं। इस अध्ययन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ पी 30सीए06934 कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट द्वारा पीएचआईएसएम (प्री-क्लिनिकल ह्यूमन इम्यून सिस्टम माउस मॉडल) साझा संसाधन, आरआरआईडी: SCR_021990 और फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन, आरआरआईडी: SCR_022035 के उपयोग के साथ समर्थित किया गया था। इस शोध को अनुबंध संख्या 75एन93020सी00058 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के एनआईएआईडी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe w/needles McKesson 1031815
15 mL tubes Grenier Bio-One 188271
2-mercaptoethanol Sigma M6250
50 mL tubes Grenier Bio-One 227261
AutoMACS Pro Separator Miltenyi 130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin BD Bioscience BDB563792
BSA Fisher Scientific BP1600100
Cell Stim Cocktail Life Technologies 509305
Chill 15 Rack Miltenyi 130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes Fisher Scientific 13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract R&D Systems 363200502
Cytek Aurora Cytek
DNase Sigma 9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set Invitrogen 00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS Gibco 10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume Grenier Bio-One 616201
Excel Microsoft
FBS Benchmark 100-106 500mL
Ficoll Hypaque GE Healthcare 45001752
FlowJo Software BD Biosciences
Forceps - fine Roboz Surgical  RS5045
Forceps normal Dumont RS4919
Formaldehyde Fisher F75P1GAL
Frosted Glass Slides Corning 1255310
Gentlemacs C-Tubes Miltenyi    130-096-334
GentleMACS Dissociator Miltenyi 130-093-235
glass pipettes DWK Life Sciences 63A53
Glutamax Gibco 11140050
HBSS w/ Ca & Mg Sigma 55037C
HEPES Corning MT25060CI
IgG standard Sigma I2511
IgM standard Sigma 401108
IMDM Gibco 12440053
Liberase DL Roche 5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue Thermo L23105
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MEM Gibco 1140050
mouse anti-human IgG-AP Southern Biotech JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled Southern Biotech H2
mouse anti-human IgM-AP Southern Biotech UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled Southern Biotech SA-DA4
MultiRad 350 Precision X-Ray
PBS Corning 45000-446
Pen Strep Gibco 15140122
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713A
p-nitrophenyl substrate Thermo 34045
PRISM Graphpad
Rec Hu FLT3L R&D systems 308-FK-005/CF
Rec Hu IL6 R&D systems 206-IL-010/CF
Rec Hu SCF R&D systems 255SC010
RPMI 1640 Corning 45000-39
Saponin Sigma 8047-15-2
Scissors McKesson 862945
Serological pipettes 25 mL Fisher Scientific 1367811
Sterile filter Nalgene 567-0020
Sterile molecular water Sigma 7732-18-5
Yeti Cell Analyzer Bio-Rad 12004279
Zombie Green biolegend 423112

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कैंसर अनुसंधान अंक 190

Erratum

Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 05/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

मानव ट्यूमर वाले मानवकृत माउस मॉडल में कैंसर इम्यूनोथेरेप्यूटिक्स का परीक्षण
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Lanis, J. M., Lewis, M. S.,… More

Lanis, J. M., Lewis, M. S., Strassburger, H., Larsen, K., Bagby, S. M., Dominguez, A. T. A., Marín-Jiménez, J. A., Pelanda, R., Pitts, T. M., Lang, J. Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. J. Vis. Exp. (190), e64606, doi:10.3791/64606 (2022).

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