Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Testing av kreftimmunterapi i en humanisert musemodell som bærer menneskelige svulster

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64606
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 2, 1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen skisserer genereringen av mus av humant immunsystem (HIS) for immunonkologistudier. Instruksjoner og betraktninger i bruken av denne modellen for testing av humane immunterapier på humane svulster implantert i denne modellen presenteres med vekt på å karakterisere responsen av det humane immunsystemet til svulsten.

Abstract

Reversering av den immunosuppressive naturen til tumormikromiljøet er kritisk for vellykket behandling av kreft med immunterapimedisiner. Murine kreftmodeller er ekstremt begrenset i sitt mangfold og lider av dårlig oversettelse til klinikken. For å tjene som en mer fysiologisk preklinisk modell for immunterapistudier, har denne protokollen blitt utviklet for å evaluere behandlingen av humane svulster i en mus rekonstituert med et humant immunsystem. Denne unike protokollen demonstrerer utviklingen av humant immunsystem (HIS, "humanisert") mus, etterfulgt av implantasjon av en human tumor, enten en cellelinjeavledet xenograft (CDX) eller en pasientavledet xenograft (PDX). HIS mus genereres ved å injisere CD34+ humane hematopoietiske stamceller isolert fra navlestrengsblod inn i neonatale BRGS (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NOD SIRPα) svært immundefekte mus som også er i stand til å akseptere en xenogen tumor. Betydningen av kinetikken og egenskapene til det menneskelige immunsystemutviklingen og tumorimplantasjonen understrekes. Til slutt beskrives en grundig evaluering av tumormikromiljøet ved hjelp av flowcytometri. I mange studier ved bruk av denne protokollen ble det funnet at tumormikromiljøet til individuelle svulster rekapituleres i HIS-PDX-mus; "Varme" svulster utviser stor immuninfiltrasjon, mens "kalde" svulster ikke gjør det. Denne modellen fungerer som et testområde for kombinasjonsimmunterapier for et bredt spekter av humane svulster og representerer et viktig verktøy i jakten på personlig medisin.

Introduction

Musekreftmodeller er viktige for å etablere grunnleggende mekanismer for tumorvekst og immunflukt. Imidlertid har kreftbehandlingsstudier i musemodeller gitt endelig oversettelse til klinikken på grunn av begrensede syngene modeller og artsspesifikke forskjeller 1,2. Fremveksten av immunterapier som en dominerende tilnærming til å kontrollere svulster har gjentatt behovet for en in vivo-modell med et funksjonelt humant immunsystem. Fremskritt i humane immunsystemmus (HIS mus) i løpet av det siste tiåret har gjort det mulig å studere immunonkologi in vivo i et bredt spekter av krefttyper og immunterapeutiske midler 3,4,5,6. Humane tumormodeller, inkludert cellelinjeavledede og pasientavledede xenotransplantater (henholdsvis CDX og PDX), vokser godt i HES-mus og er i de fleste tilfeller nesten identiske med veksten i den immundefekte verten som mangler human hematopoietisk engraftment 7,8. Basert på dette nøkkelfunnet har forskere brukt HIS-musemodellen til å studere humane immunterapier, inkludert kombinasjonsterapier designet for å endre tumormikromiljøet (TME) for å redusere immunsuppresjon og dermed forbedre immunrettet tumordrap. Disse prekliniske modellene bidrar til å løse problemene med heterogenitet av humane kreftformer, og kan også forutsi behandlingssuksess, samt overvåke immunrelaterte legemiddeltoksisiteter 9,10.

Produksjonen av en musemodell med et humant immunsystem gjennom innføring av humane hematopoietiske stamceller krever en mottakerimmundefekt mus som ikke vil avvise xenograft. Nåværende HIS musemodeller er avledet fra immundefekte musestammer som ble rapportert for over 30 år siden. Den første immundefekte musestammen som ble beskrevet var SCID-mus som manglet T- og B-celler11, etterfulgt av en hybrid NOD-SCID med en SIRPα-polymorfisme som var ansvarlig for musemakrofagtoleranse for humane celler, på grunn av økt binding for NOD SIRPα-allelen til det humane CD47-molekylet12,13. På begynnelsen av 2000-tallet var slettingen av den vanlige gammakjeden til IL-2-reseptoren (IL-2Rγc) på både BALB / c og NOD immundefekte stammer en spillveksler for forbedret menneskelig engraftment, på grunn av genetiske delesjoner som forbyr vert NK-celleutvikling14,15,16,17. Alternative modeller, som BRG- og NRG-mus, oppnår T- og B-cellemangel gjennom delesjon av Rag1- eller Rag2-genet, som kreves for T- og B-cellereseptorgenomorganiseringer og dermed modning og overlevelse av lymfocytter18,19. BRGS (BALB / c -Rag2 null Il2R γCnullSirpαNOD) mus som brukes her kombinerer IL-2Rγ kjedemangel og NOD SIRPα allel påRag2-/- bakgrunnen, noe som resulterer i en svært immundefekt mus uten T-, B- eller NK-celler, men med tilstrekkelig kraft og helse til å tillate langsiktig engraftment på mer enn 30 uker13.

HIS mus kan genereres på flere måter, med human PBMC-injeksjon som den mest direkte metoden15,18,20. Imidlertid har disse musene en uttalt utvidelse av aktiverte humane T-celler som resulterer i graft versus host disease (GVHD) ved 12 ukers alder, og forhindrer langsiktige studier. Alternativt kan humane hematopoietiske stamceller fra navlestrengsblod (CB), benmarg og fosterlever også brukes til engraftment og produksjon av det humane immunsystemet de novo. I dette systemet produserer de hematopoietiske stamcellene et humant immunsystem med flere linjer med generering av T, B og medfødte immunceller som er viktig tolerante for museverten, sammenlignet med PBMC-musene som hovedsakelig utvikler T-celler. Derfor er GVHD fraværende eller sterkt forsinket, og studier kan utvides til mus opp til 10 måneder. CB gir en enkel, tilgjengelig og ikke-invasiv kilde til CD34 + humane hematopoietiske stamceller som letter engraftment av flere HIS-mus med genetisk identiske immunsystemer 17,18,20,21. I løpet av de siste årene har HIS musemodeller blitt brukt mye for å studere immunterapi og TME 3,4,5,6. Til tross for utviklingen av humant avledet immunsystem i disse musene, vokser humane xenografttumorer med tilsvarende hastigheter sammenlignet med kontrollimmundefektmusene og tillater det komplekse samspillet mellom kreftcellene og immuncellene, noe som er viktig for å opprettholde mikromiljøet til den transplanterte PDX 3,7,8 . Denne protokollen har blitt brukt til å utføre over 50 studier som tester behandlinger i HIS-BRGS-mus med PDX og CDX. En viktig konklusjon er at humane svulster i HIS-musene opprettholder sin unike TME som definert ved molekylær evaluering av svulsten i forhold til den første pasientprøven og immuninfiltrategenskapene 3,22,23. Vår gruppe fokuserer på dybdeevaluering av HIS i både immunorganer og svulst ved hjelp av multiparameter flowcytometri. Her beskriver vi en protokoll for humanisering av BRGS-mus, evaluering av kimerisme, implantasjon av humane svulster, tumorvekstmålinger, kreftbehandlingsadministrasjon og analyse av HIS-cellene ved flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt dyrearbeid ble utført under dyreprotokoller godkjent av University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC protokoller #00593 og #00021). Alt dyrearbeid ble utført i samsvar med Office of Laboratory Animal Resources (OLAR), et akkreditert anlegg av American Association for Laboratory Animal Care, ved University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus. Alle navlestrengsblodprøver fra mennesker ble innhentet som donasjoner fra avidentifiserte givere og er derfor ikke underlagt godkjenning av Human forskningsetisk komité.

MERK: Sammensetninger av alle medier og løsninger som er nevnt i protokollen, er inkludert i tilleggsfil 1. Figur 1 illustrerer den overordnede protokollen for generering og analyse av immunresponser mot svulster i HIS-BRGS-mus.

1. Generasjon av HIS mus

  1. Musehold av BALB/c -Rag2 null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) mus
    MERK: Denne stammen er ekstremt immundefekt, uten T-, B- eller NK-celler. Derfor må strenge tiltak brukes for å forhindre opportunistiske infeksjoner. Opprettholde kolonien på en diett som inneholder trimetoprim og sulfadiazin på en vekslende 2 ukers tidsplan med et normalt kosthold. Oppretthold på det høyeste nivået av forsiktighetsregler som er mulig (f.eks. et barrieredusjanlegg med begrenset tilgang).
    1. Opprettholde kolonier av BALB/c -Rag2 null Il2RγC null Sirpα NOD (BRGS) og BALB/c Rag2 null Il2RγC null SirpaBalb/c (BRG) homozygote mus som oppdrettere.
    2. Ras BRGS N/N×BRG B/Bfor å generere BRGSB/N valper, som skal brukes som mottakere av humane stamceller. I denne kolonien er BRGSB / N sunnere enn BRGS N/ N, og engraft på tilsvarende nivåer (mer enn BRG).
  2. CD34+ human stamcelleisolasjon fra navlestreng CB
    MERK: Ingen antibiotika brukes til denne prosedyren. Derfor er god steril teknikk avgjørende.
    1. Plasser et 50 ml konisk rørstativ, samt 3x 15 ml og ~ 10x 50 ml koniske rør i et sterilisert biosikkerhetsskap (BSC). Spray en blodoppsamlingspose med 70% etanol og la den tørke i BSC.
    2. Beregn antall 50 ml koniske rør som kreves for CB-tetthetsgradientisolasjon = CB-volum/15, avrundet opp og til et jevnt rørnummer. Beregn blodvolum per rør = CB-volum / antall rør. Hell blod forsiktig fra CB-posen i hvert konisk rør; Dette er maksimalt 15 ml per rør. Bruk en automatisk pipettor og en 25 ml serologisk pipette til å blande blodet 1:1 med steril PBS ved å pipettere opp og ned.
    3. Bruk en automatisk pipettor på lav hastighet og en 10 ml serologisk pipette til langsomt å legge blodet under med romtemperatur (RT) 1,077 g/ml gradientløsning (se materialfortegnelse) uten å forstyrre grensesnittet. Unngå at pipettespissen berører bunnen av røret. Gjenta for alle rør. Deretter sentrifuge i 30 min ved 850 x g, uten bremsing, ved RT for å sikre vedlikehold av tetthetsgradienten.
    4. Visualiser den cellulære buffy pelsen på toppen av 1,077 g / ml tetthetsgradienten som et overskyet hvitt lag. Fjern og kast plasmalaget ned til ca. 10 ml over buffy-pelsen ved hjelp av en 25 ml serologisk pipette og en automatisk pipettor.
    5. Samle buffy coat med en steril overføring eller serologisk pipette. Bruk pipetten som en slikkepott til å skrape cellene av siden av det koniske røret mens du slipper pæren (eller pipetterer sakte) for å trekke cellene opp. Kombiner buffy strøkene fra to 50 ml koniske rør til ett nytt 50 ml konisk rør.
    6. Vask cellene ved å helle 45 ml steril HBSS inneholdende 2% FBS i hvert konisk rør. Sentrifuge i 11 min ved 360 x g ved RT.
    7. Aspirer vaskemediet ned til pelleten i alle tuber. Bruk en 10 ml serologisk pipette og en automatisk pipettor til å resuspendere den første pelleten i 10 ml HBSS inneholdende 2 % FBS. Resuspender hver pellet i samme 10 ml HBSS, og skyll hvert rør med ytterligere 10 ml HBSS for å samle alle cellene i et enkelt rør.
    8. Hell 45 ml steril HBSS inneholdende 2% FBS i det koniske røret. Sentrifuge i 10 minutter ved 360 x g, ved 4 °C.
    9. Aspirer vaskebufferen ned til cellepelleten og resuspender pelleten i 20 ml magnetisk celleseparatorbuffer (se materialtabell). Fjern en liten alikot for å telle cellene med et hemacytometer ved en 1:20 fortynning i metylenblått. Legg til antall blå og hvite celler. Sentrifuge ved 360 x g, i 10 minutter ved 4 °C.
      MERK: Denne protokollen bruker magnetisk perleteknologi (se Materialfortegnelse). Protokollen kan modifiseres for bruk med hvilken som helst celleseparasjonsteknologi, med tilstrekkelig renhet og utbytte av CD34+ stamceller.
    10. Aspirer supernatanten og resuspender CD34+ cellepelleten isolert fra navlestrengsblod i 300 μL magnetisk celleseparatorbuffer per 1 x 108 celler. Tilsett 100 μL FcR-blokkerende reagens først, og deretter 100 μL CD34+ magnetiske perler per 1 x 108 celler. Inkuber ved 4 °C i 30 minutter (uten is).
    11. Tilsett 5 ml magnetisk celleseparatorbuffer per 1 x 108 celler og spinn ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Gjenta vasketrinnet og resuspender pelleten i 500 μL magnetisk celleseparatorbuffer per 1 x 108 celler i et 15 ml konisk rør merket "ufraksjonert".
    12. Merk ytterligere to 15 ml koniske rør "CD34-" og "CD34+". Plasser de tre koniske rørene på 15 ml (ufraksjonert, CD34- og CD34+) til henholdsvis spor A1, B1 og C1 på et kjølestativ (se Materialfortegnelse). Separer cellene ved hjelp av det to-kolonne positive seleksjonsprogrammet på en automatisk magnetisk celleseparator (se materialfortegnelse) i en BSC, i henhold til produsentens instrumentinstruksjoner.
  3. Ekspanderende og frysing av CD34+ humane stamceller
    1. Aliquot 10 μL av den gjenvunnede CD34+ cellesuspensjonen (2 ml) på et hemocytometerlysbilde og teller cellene under 10x forstørrelse. Beregn totalt antall CD34+-celler ved å multiplisere celletallet med 2 x 104. Del det totale CD34+-celletallet på 250 000 for å beregne antall hetteglass som skal fryses (50 000 celler per musevalp før in vitro-ekspansjon ).
    2. Forbered CB-medium Iscoves 10% FCS (pluss 1 ml ekstra for filtreringstap), supplert med 40 ng / ml stamcellefaktor, 20 ng / ml Flt3L og 10 ng / ml IL-6, og pass gjennom et 0,22 μm filter. Resuspender CD34+-cellene ved 100 000 per ml CB-medium, og inkuber ved 37 °C. På dag 3, tilsett et tilsvarende volum CB-medium uten cytokiner til kolben som inneholder cellene og CB-mediet med cytokiner.
      MERK: Tilsetning av disse cytokinene til CB-mediet fremmer overlevelse og utvidelse av CD34+-cellene samtidig som differensiering forhindres.
    3. Høst de utvidede CD34+-cellene på dag 5. Pipetter cellesuspensjonen opp og ned og samles opp i en 50 ml konisk slange. Tilsett nok CB-medium til å dekke bunnen av kolben. Bruk en celleskraper, skrap hele bunnen av kolben. Samle alle mediene i samme 50 ml rør, og sentrifuger ved 360 x g i 11 minutter.
    4. Resuspender cellene i 2 ml CB-medium. Lagre den siste dråpen fra pipetten i en 96-brønnsplate for telling. Fortynn cellene 1: 1 i trypanblått og tilsett 10 μL til hemacytometeret, og tell deretter og gjennomsnittlig celler fra fire kvadranter. Beregn totalt antall CD34+-celler ved å multiplisere celleantallet med 4 x 104, og registrer levedyktigheten.
    5. Lag n+1 ml frysemedium, der n er antall hetteglass med frysing beregnet i trinn 1.3.1. Forbered frysemedium ved å legge til 10% (v / v) DMSO til FBS og hold på is. Merk kryovialene med CB#, CD34+ d5 og dato.
    6. Spinn ned CD34+-cellene ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Aspirer mediet ned til pelleten og resuspender cellepelleten i frysemedium. Aliquot 1 ml cellesuspensjon til hvert hetteglass og fordel eventuelle rester jevnt mellom hetteglassene. Tilsett hetteglassene i en isopropanolcellefryser nedkjølt til 4 °C, sett ved -80 °C, og overfør til flytende nitrogen for oppbevaring i >90 dager.
  4. Bestråling av musevalper
    1. Samle BRGSB/ N-valpene, 1-3 dager etter fødselen, i en autoklavert plastboks med polstring. Legg til en liten mengde sengetøy med valpene. Merk boksen med burnummer og antall valper.
    2. Sett opp bestråleren (se materialfortegnelse) for en dose på 300 rad. Sett boksen med valper inn i bestråleren og utsett dem for 300 rad. Ta valpene tilbake til buret, legg dem i en haug og dekk til med sengetøy.
  5. Ungeinjeksjoner og CD34+ celleforberedelse
    1. Begynn CD34 + cellepreparasjon ~ 3 timer etter bestråling. Varm 10 ml CB-medier i et 50 ml konisk rør. Utfør alle trinnene i en steril BSC.
    2. Hent ett hetteglass med in vitro utvidede og frosne CD34+-celler for hver fjerde til seks valper som skal injiseres. Tine raskt ved 55 °C, til bare en liten mengde is er synlig, og tilsett cellene til det oppvarmede CB-mediet (hetteglasset skal fortsatt være kjølig å ta på.) Bruk 1 ml medium til å skylle hvert hetteglass og roter cellene ved 360 x g i 12 minutter ved 4 °C.
      MERK: Rask tining ved 55 °C ble funnet å gi bedre cellelevedyktighet (90%-95%) enn tining ved 37 °C.
    3. Aspirer mediet forsiktig. Resuspender den (lille) pelleten i 2 ml CB-medier, bland forsiktig og tilsett ~30 μL av cellesuspensjonen til en enkelt brønn i en telleplate. Fortynn 1: 1 i trypanblått, tilsett deretter 10 μL til et hemocytometer og telle og gjennomsnittlig cellene fra fire kvadranter.
    4. Beregn totalt antall CD34+-celler ved å multiplisere celleantallet med 4 x 104 og registrer deretter levedyktigheten. Spinn ved 360 x g i 12 minutter ved 4 °C.
    5. Aspirer mediet forsiktig og resuspender cellepelleten i 100 μL steril PBS per n + 1 valper som skal injiseres, noe som resulterer i 250 000-450 000 CD34 + celler per mus. Plasser det koniske røret på is i en transportbeholder og reis til vivarium for injeksjon av avkom.
    6. Ta med en varmelampe, bleier, 1 ml sprøyte, 18 G kanyle, 30 G kanyle og CD34+ cellepreparat i sterile beholdere til vivarium BSC. Plasser en steril bleie ~ 2 fot under varmelampen. Hent buret med søppelet som skal injiseres og plasser i BSC.
    7. Monter sprøyten med en 18 G skråstilt kanyle. Tilpass vinkelen på det koniske røret med nålens skråning, bland forsiktig og trekk opp cellesuspensjonen. Legg valpene på bleien for å varme (se etter overoppheting). Fjern luft fra sprøyten og erstatt 18 G kanylen med 30 G kanylen, og trykk deretter forsiktig på sprøyten til cellesuspensjonen er akkurat på nålespissen.
      MERK: Alternativt kan en insulinsprøyte brukes.
    8. Ta en valp om gangen til kanten av bleien vekk fra varmelampen. Immobiliser valpen på siden under tommelen og pekefingeren, noe som gir et klart syn på ansiktet. Legg merke til venen over kinnet under der øret skal være. Stikk nålen grunt inn i venen (IV) nærmest øyet, og injiser sakte 50 μL celler.
    9. Sjekk om en boble dannes fra en subkutan injeksjon. Hvis ja, stikk nålen dypere og fortsett å injisere celler. En liten dråpe blod / hematom vil være synlig når vellykket.
      MERK: Se prosedyren av Gombash Lampe et al.24 angående valpeinjeksjon.
    10. Med valpen fortsatt immobilisert, utfør en intrahepatisk injeksjon (IH) med ytterligere 50 μL celler (100 μL totalt per valp IV + IH). Leveren kan visualiseres som et mørkt sted mellom det hvite melkebåndet og thoraxburet. Legg den injiserte valpen på en bleie lenger unna de uinjiserte valpene og varm opp.
      MERK: IV-injeksjon resulterer i bedre langsiktig kimerisme enn IH-injeksjon alene25, men IV-injeksjoner er ikke alltid vellykkede. Derfor splitter injeksjonen mellom IV og IH engraftment i en større prosentandel av mus.
    11. Gjenta både ansiktsvene og IH injeksjoner for alle valper. Rengjør blod, returner valper til reiret i buret og dekk til med sengetøy.

2. Testing av menneskelig kimerisme i blod

  1. Test chimerisme i blodet til HIS mus ved både 10 og 14 ukers alder. Samle 50 μL blod via retro-orbitalvenen eller ved hjelp av en alternativ IACUC-godkjent metode.
    1. For retro-orbitale blødninger, bedøv mus med en isofluran fordamper satt til 5 i 1-2 minutter og skru deretter fordamperinnstillingen ned til 4. Skru ned fordamperen etter behov for å la mus holde seg tilstrekkelig oksygenert mens de er under anestesi. Ikke hold musene under isofluran i mer enn 5 minutter.
    2. Plasser nesen til den bedøvede musen inn i isofluranfordamperens nesekeglefeste og legg en dråpe smertestillende (0,5% proparakain HCl oftalmisk løsning USP) på øyet.
    3. Etter 1 min, fjern proparakainet ved hjelp av et sterilt gasbind, proptose øyet, og sett inn et 75 mm heparinisert hematokritrør retro-orbitalt for å samle 50 μL blod. Støt blodet ut i et 1,5 ml mikrofugerør inneholdende 50 μL heparin og bland forsiktig.
    4. Klem øyet lukket med sterilt gasbind for å stoppe blødningen og påfør en dråpe proparakain. Fjern musen fra isofluran og gjenopprett den i et rent bur.
  2. PBMC-isolasjon fra museblod
    1. Bland blodet/heparinet forsiktig opp og ned og legg langsomt over 500 μL med 1,077 g/ml tetthetsgradient, pass på at grenseflaten ikke forstyrres. Sentrifuger rørene ved 1,220 x g i 20 min ved RT uten bremser.
    2. Visualiser den cellulære buffy pelsen som et uklart lag på toppen av 1,077 g / ml tetthetsgradienten, under plasmaet. Fjern så mange av cellene som mulig fra buffy-pelsen med en 200 μL pipette og tilsett til nye 1,5 ml rør som inneholder 750 μL høstmedium. Sentrifuge ved 360 x g i 11 min ved RT.
    3. Aspirer mediet ned til 50 μL og resuspender pelleten i 750 μL høstmedium. Sentrifuger ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C, og aspirer ned igjen til 50 μL. Cellene er klare til å bli resuspendert i overflateflekken.
  3. Overflatefarging og flowcytometrisk analyse
    1. Fyll ut fargepanelets regneark (tabell 1; "Spectral flow bleed panel" regneark) med musenumre og klargjør antistofffargingscocktailen ved å tilsette alle fluorescerende antistoffer til fargebufferen (tilleggsfil 1). Lag et plateoppsett for å legge prøvene til en 96-brønns U-bunnplate. Merk bunnen av brønner ved hjelp av en permanent markør. Titrer antistoffer ved hjelp av en standard prosedyre før farging for å bestemme riktig konsentrasjon26.
    2. Tilsett 62 μL av overflateflekkcocktailen til hver brønn på 96-brønns U-bunnplaten. Resuspender cellene i de 50 μL som er igjen i røret, og legg hver prøve til den tilsvarende brønnen. Inkluder en brønn for en positiv fargekontroll (humane PBMCer + musemiltocytter, 1 x 106 celler hver) for å flekke sammen med prøvene. Bland ved pipettering og inkuber blandingen i 15 minutter ved 4 °C.
    3. Sentrifuge ved 680 x g i 3 minutter ved 4 °C. Sveip platen ut i vasken for å fjerne supernatanten, og vask cellene ved å resuspendere i 150 μL fargebuffer ved å pipettere ~10x forsiktig. Spinn og resuspender hver brønn i 150 μL fargebuffer.
    4. Innhent dataene for 100 μL av hver prøve på et flowcytometer (se materialfortegnelse) og eksporter .fcs-filene. Importer .fcs-filene til flytdataredigeringsprogramvaren (se Materialfortegnelse). Påfør en polygonport på et FSC-A x SSC-A-plott som omgir cellene, unntatt rusk. Merk cellene i porten (se tabell 1; "Spectral Flow Bleed Gating" regneark).
    5. Endre aksene til (FSC-A x FSC-H) og gate cellene på den lineære diagonalen unntatt dublettene som stikker ut fra linjen. Velg disse cellene og endre aksene til (hCD45 x mCD45).
    6. Påfør en polygonport på hCD45+-populasjonen og bruk navnet "menneske". Påfør en polygonport på mCD45+-populasjonen og bruk navnet "mus". Opprett en tellestatistikk for populasjoner av mennesker og mus.
    7. Velg den menneskelige populasjonen og endre aksene til (CD19 x CD3). Påfør en polygonport på CD19+-cellene og gi den navnet "B-celler". Påfør en polygonport på CD3+-populasjonen og gi den navnet "T-celler". Påfør en polygonport på den dobbelt negative populasjonen og gi den navnet "NonTB".
    8. Velg T-cellepopulasjonen og endre aksene til (CD8 x CD4). Påfør en polygonport på CD4- og CD8-positive populasjoner og gi dem navnene "CD4+" og "CD8+".
    9. Velg populasjonen Ikke-TB og endre aksene til (CD56 x myeloide). Påfør en polygonport på den totale CD56-positive populasjonen, inkludert de doble positive hendelsene, og gi den navnet "NK-celler". Påfør en polygonport på den CD56-negative og myeloide positive populasjonen og gi den navnet "myeloid".
    10. Lag en tabell for prosent- og tellestatistikk for alle populasjoner og eksporter til et regnearkprogram (se Materialfortegnelse). Beregn %hCD45 kimerisme = %hCD45/(%hCD45 + mCD45).
    11. Ekskluder HES-mus som er <20% hCD45+ (av mCD45 + hCD45) for videre eksperimenter.
      MERK: I denne studien ble PBMC fremstilt ved bruk av en 1.077 g / ml tetthetsgradientseparasjon for en renere RBC-uttømming. Denne prosedyren ekskluderte granulocytter fra mennesker og mus fra PBMC-laget. Alternativt kan RBC-lyse brukes.

3. Injeksjon av svulster i mus

  1. Før tumorinjeksjon, bekreft T-celletall fra 14 ukers blødningsdata. Svulster injiseres for å være klare til høsting mellom 20-26 uker hvis T-cellene er >20%, og mellom 24-28 uker hvis T-cellene er <20% av den totale immuncellepopulasjonen. Denne injeksjonstiden sikrer at musene er 20-28 uker gamle og har tilstrekkelig antall T-celler ved slutten av studien.
  2. Injeksjon av cellelinjederiverte xenotransplantater (CDX)
    MERK: Prosedyren er beskrevet ved hjelp av MDA-MB-231 brystadenokarsinomceller (se materialfortegnelse) som et eksempel.
    1. Tine en alikot av frosne celler, vask 1x ved å resuspendere i 10 ml DMEM supplert med 10% FBS, 1% PenStrep og 1% ikke-essensielle aminosyrer, og sentrifuge ved 360 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Aspirer mediet og resuspender i 10 ml DMEM supplert med 10% FBS, 1% PenStrep og 1% ikke-essensielle aminosyrer i en T25-kolbe og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2.
      MERK: Cellelinjene er autentisert av PCR for å sikre riktig celletype. Cellesupernatanter testes for mykoplasma via en biokjemisk analyse før injeksjon.
    2. Passasje og utvide cellene under eksponentiell vekstfase ved ca. 80% sammenløp.
      1. Aspirer mediet, skyll cellene med 5-10 ml steril PBS (pH 7,2), og inkuber med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 1-5 minutter til cellene løsner fra kolben.
      2. Tilsett 5 ml av samme DMEM og bland ved å pipettere opp og ned. Før hele 6 ml cellesuspensjonen inn i en ny vevskulturbehandlet T75-kolbe (1:3 fortynning) og tilsett ytterligere 10 ml DMEM.
      3. Pass cellene hver 2-3 dag ved 80% sammenløp ved 1: 3 fortynningsbelegg i DMEM for å utvide cellene.
    3. Høst cellene med 0,25% trypsin-EDTA i eksponentiell vekstfase innen seks passasjer og vask med PBS. Bland PBS og kjellermembranekstrakt (se materialtabell) i forholdet 1:1 og tilsett cellene ved en endelig konsentrasjon på 5 x 107 celler/ml.
    4. Bedøv musene med isofluran som beskrevet i trinn 2.1.1. 100 μL (5 x 106 celler) tumorcellesuspensjon injiseres subkutant i hver flanke ved hjelp av en 23 G kanyle.
  3. Utfør injeksjon av pasientderiverte xenotransplantater (PDX) ved hjelp av trokarer. Injeksjonsprosedyren og andre utviklings- og vedlikeholdsanvisninger for PDX-modellen er tilgjengelig i litteratur27.

4. Måling av tumorvekst

  1. Kontroller tumorfremgang en gang i uken etter implantasjon ved å føle seg langs flanken for tumorvekst. Når svulstene er palpable, bedøve musene med isofluran (som beskrevet i trinn 2.1.1) og barber på hver flanke med en elektrisk trimmer, og vær forsiktig rundt svulsten for å forhindre sårdannelser etter hvert som svulsten vokser.
    MERK: Mus kan barberes før tumorinjeksjon for å forhindre skader på huden rundt svulstene; Imidlertid kan frekvensen av hårvekst hindre tumormålinger.
  2. Mål lengden og bredden på svulstene to ganger i uken ved hjelp av kaliper og registrer målingene i mm. Rapporter tumormålinger som tumorvolum (mm3) ved hjelp av formelen Equation 1. Pass på at svulstbyrden ikke overstiger 2000 mm 3 per enkelt svulst eller et samlet volum på 3000 mm3.
    MERK: Retningslinjer for bruk av mus i kreftforskning varierer fra sted til sted. Se retningslinjene for stell og bruk av dyr ved forskerens institusjon.

5. Narkotika behandlinger

  1. Fordel HES-musene i ekvivalente behandlingsgrupper basert på hCD45-kimerisme, hCD3-kimerisme og hCD8-kimerisme. Når svulstene når 100 mm3 i gjennomsnitt, begynner medikamentelle behandlinger.
    MERK: Antall mus per gruppe er basert på antall HIS-mus generert fra CB. Minimum fire mus per gruppe anbefales. Ikke-topartsmatching av flere grupper (f.eks. i R-vivo Manila-programvare) er nyttig for denne grupperingen28.
  2. Legemiddelrute og hyppighet
    1. Injiser anti-PD-1-hemmere (nivolumab, pembrolizumab) intraperitonialt (i.p.) med 30 mg/kg 1x per uke eller 20 mg/kg 2x per uke for enkeltbehandlinger, eller 10-15 mg/kg 2x per uke for kombinasjonsbehandlinger.
    2. Dose kombinasjonsterapiene, for eksempel målrettede terapier, kjemoterapier og bestråling, i samsvar med eksperimentell design. Målrettede terapier og kjemoterapier kan gis gjennom oral gavage, i.p. injeksjon eller mat.
      MERK: Dosene kan varieres og optimaliseres i henhold til publiserte data og tumormodellen. Dosestudier testes ofte på immundefekte mottakere før HIS-musestudier.
  3. Overvåk musene minst 3x per uke for helseendringer som vekttap, løs avføring, hakket holdning, redusert mobilitet og pelstap. Noen symptomer kan være tegn på legemiddeltoksisitet eller GVHD, og det kan være nødvendig å redusere eller stoppe doseringen. Avlive mus etter behov i henhold til retningslinjer for dyrepleie og bruk.

6. Høsting av musevev og svulster ved slutten av studien

  1. Avlive musene enkeltvis i henhold til institusjonelle og veterinære retningslinjer ved bruk av komprimert CO 2 -gass med en strømningshastighet på 2,75 l / min. Overvåk musene som holdes i CO2 i 1 minutt etter døden og utfør deretter cervikal dislokasjon som en sekundær form for eutanasi.
  2. Blod samling
    1. Samle blod via intrakardial punktering. Hold musen loddrett og stikk en 1 ml sprøyte med en 25 G kanyle direkte inn i hjertet fra en linje like til venstre for midtlinjen og under ribbeina. Samle blodet i en sprøyte, ideelt gjennom en lang trekning og overfør til et merket 1,5 ml rør.
      MERK: Ytterligere nålinnstikk kan utføres for å samle ekstra blod fra hjørnene av lungehulen med forsiktighet.
    2. La blodet ligge ved 4 °C i 1 time, sentrifuge deretter blodet i en mikrosentrifuge i 6 minutter ved 7 800 x g. Samle den klare væsken (sera) over blodgrensesnittet i et annet rent og merket 1,5 ml rør. Oppbevar serumet ved -20 °C for nedstrømsanalyse, slik som human og mus inflammatorisk cytokin eller immunglobulintitere.
  3. Vev disseksjon
    1. Etter injeksjon og vekst av tumorceller i musene og administrering av medikamentelle behandlinger, høst vevet. Plasser musene på et skumdisseksjonsbrett, med pinner for å holde dem på plass, og armer og ben forlenget i 45 ° vinkler. Gjør et snitt opp i midten av overkroppen, start nær bekkenet og strekker seg til haken, og prøv å unngå å kutte bukhinnen (selv om dette ikke er viktig). Trekk huden til kanten og hold på plass med pinner.
    2. Trekk ut lymfeknuter (LN) ved hjelp av fine tang i følgende rekkefølge: inguinal, aksillær, cervikal, mesenterisk, hiatal.
      MERK: I HIS mus er LNene ofte svært små, ligner anlage, eller "betent" med et tydelig utseende i motsetning til det fra en villtype mus. Derfor er vev som ligner LN tatt fra hvert sted. De perifere LNene opptrer ofte som væskefylte "baller", mens de mesenteriske LNene er tettere. De mesenteriske LNene er de mest åpenbare og konsistente og observeres som en eller to forskjellige tettere noder, i motsetning til en streng.
    3. Legg LN-ene på den ene siden av frostede glassglass i 8 ml høstmedium i en petriskål. Hold lysbildene i vinkelrette vinkler med de frostede kantene innover, trykk forsiktig på vevet til det cellulære innholdet slippes ut.
    4. Skyll lysbildene flere ganger ved å trekke dem fra hverandre og sammen for å frigjøre maksimal mengde celler. Samle cellene med en 5 i glasspipette og filtrer dem gjennom en 9 i bomullsplugget pipette til et merket 15 ml konisk rør.
    5. Trekk milten fra øvre venstre side av magen ved hjelp av enten to par tang eller tang og saks. Legg merke til størrelsen på milten som et estimat av volumet av resuspensjonsmedier. Samle og filtrer milten ved mekanisk fordøyelse ved hjelp av frostede glassglassbilder, som med LN-ene.
      MERK: Enhver teknikk for fremstilling av vev for enkeltcellesuspensjoner kan brukes.
    6. Utfør telling og resuspendering av cellene fra vevsprøver som beskrevet nedenfor.
      1. Sentrifuger lymfecellene ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Aspirer væsken og resuspender cellepelleten i 1 ml høstmedium med DNase.
      2. Fjern erytrocytter fra miltcellene ved å inkubere med 3 ml ACK-lysisbuffer ved RT i 3 minutter, etterfulgt av tilsetning av 10 ml høstmedium/DNase. Sentrifuger miltcellene igjen, aspirer supernatanten og resuspender cellene i 1-10 ml høstmedier/DNase, basert på miltstørrelsen (f.eks. 1 ml for svært små milt og opptil 10 ml for de største miltene).
      3. Legg til en 10 μL alikot av cellesuspensjon til 90 μL media og stole på et hemocytometer. Sentrifuger LNene og miltcellene, aspirer supernatantene og resuspender cellene i høstmedium i en konsentrasjon på 1 x 108 celler/ml, eller minimum 80 μL.
    7. Pakk ut svulstene.
      1. Fjern svulsten fra den åpne flanken ved å holde svulsten med tang mens du sakte klipper på tumormarginene med disseksjonssaks.
      2. Når svulsten er fjernet, veier den og fjerner 1/4 for RNA og immunhistokjemi (IHC) behandling. Del 1/4 svulsten i halvparten; plasser den ene halvdelen (1/8 av hele svulsten) i en kryovial, blitzfrys i væske N2, og oppbevar ved -80 °C for nedstrøms genomiske studier.
      3. Plasser den andre 1/8 av svulsten i et merket prøverør som inneholder 10% formalin. Neste dag, skyll og resuspender vevet i 70% etanol til fremtidig bruk. Plasser de resterende 3/4 av svulsten i en 6 cm tallerken og hakk i ~ 1 mm stykker ved hjelp av et skalpellblad.
      4. Transporter tumorbitene inn i et dissosiasjonsrør (se materialtabell), skyll fatet med 5 ml ufullstendig tumorinfiltrerende leukocytt (TIL) medium, og legg til dissosiasjonsrøret.
        MERK: For svulster som veier >0,4 g, skyll parabolen med 10 ml TIL ufullstendig media og legg til dissosiasjonsrør.
      5. Legg til kollagenasepreparat (se materialtabell) ved en endelig konsentrasjon på 50 mg / ml til vevet i dissosiasjonsrøret. Dissosiere vevet ved hjelp av mekanisk dissosiasjon ved 37 °C i 30 minutter til 1 time, avhengig av svulstens fasthet.
      6. Etter dissosiasjon, før suspensjonen over et 100 μm filter inn i et 50 ml konisk rør og skyll filteret med 10 ml TIL komplett medium. Serumet i dette mediet vil stoppe kollagenasereaksjonen og beskytte cellene mot ytterligere nedbrytning.
      7. Sentrifuger encellesuspensjonen ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Resuspender pelleten i akkurat nok høstemedium med DNase slik at cellesuspensjonen lett kan passere gjennom en P1000-pipettespiss og registrere volumet for nedstrømsanalyse.
        MERK: Et mindre volum øker samlingen av tumorimmunceller, men er mer utsatt for strømningscytometertresko.

7. Cellefarging og flowcytometriske analyser

  1. Flekkforberedelse og cellebelegg
    1. Forbered fargecocktailer: På høstdagen legger du til antall prøver i fargearket (tabell 2; "Konvensjonelt Flow A-panel", "Spectral Flow B-panel" og "Konvensjonelt Flow C-panel" regneark) for alle flekker og utskrift. Forbered overflatebeiscocktailer for flekker A og B i fargebuffer (SB) ved å tilsette hvert antistoff individuelt med en ny spiss, markere hvert reagens mens du er på farten, og oppbevar ved 4 °C til det trengs. Klargjør passende levedyktighetsfargestoffer i azidfri PBS og oppbevar ved 4 °C til behov (varm til RT før bruk). Forbered overflatebeis C-cocktail på dag 2 i SB sammen med intracellulære flekker B og C i deres respektive permeabiliseringsbuffere.
    2. Lag et plateoppsett for alle prøver i fargearket og aliquot 100 μL azidfri PBS til brønnene. Inkluder ufargede kontroller for hvert vev og flekk (for spektral cytometri).
    3. Legg cellene til 96-brønnplater som inneholder 50 μL PBS. For beis A, resuspender hver vevsgruppe i riktig volum, som angitt på fargearket, og oppbevar ved 4 °C til anskaffelse på flowcytometer samme dag. For flekker B og C, tilsett 25 μL lymfe og 60 μL ikke-lymfevevscellesuspensjoner til brønnene med PBS.
    4. Utfør in vitro stimulering av cytokiner for påvisning ved intracellulær farging ved bruk av flekk C.
      1. Sentrifuger flekken C 96-brønnsplaten fra trinn 7.1.3 ved 680 x g i 3 minutter ved 4 °C. Tilsett 200 μL TIL komplette medier (RPMI 1640, 10 mM HEPES [pH 7], 10 % FBS) til hver brønn. Oppbevar platen med cellesuspensjonen ved 4 °C over natten.
      2. Tidlig neste morgen fortynner du cellestimuleringscocktailen (se materialfortegnelse) 1:500 i komplett TIL-medium. Sentrifuger platen som inneholder cellesuspensjonen ved 680 x g for å pelletere cellene og flikk for å fjerne mediet. Resuspender cellene i 200 μL av den tilberedte cellestimuleringscocktailen og inkuber ved 37 °C i 1 time.
      3. Tilsett 25 μL proteintransporthemmeroppløsning inneholdende monensin ved en 1:1000 fortynning i komplett TIL-medium, bland cellene og inkuber ved 37 °C i ytterligere 4 timer for å tillate intracellulær akkumulering av cytokiner.
    5. Utfør cellefarging.
      1. For flekker A og B (dag 1), og for beis C (dag 2), sentrifuge ved 680 x g i 3 minutter ved 4 °C. Flikk platene og tilsett passende levedyktighetsfarger til brønnene. Bland godt ved å pipettere forsiktig opp og ned med en flerkanals pipette og ruge i 15 minutter ved RT.
      2. Sentrifuger platene (som i trinn 7.1.5.1), tilsett deretter passende overflateflekker på platene og bland forsiktig ved pipettering med en flerkanalspipett. Inkuber i 15 minutter ved 4 °C og sentrifuger igjen. Knips platene, vask cellene ved å pipettere forsiktig opp og ned med 150 μL SB og sentrifuge.
      3. Knips platene, gjenta vasken ved å pipettere forsiktig opp og ned med 150 mikroliter SB og sentrifugere ved 680 x g i 3 minutter ved 4 °C. For beis A, resuspender hver vevsgruppe i riktig volum, som angitt på fargearket, og oppbevar ved 4 °C. For beis B, fikser med FoxP3 transkripsjonsfaktorsettfiksativ (se materialfortegnelse) i 30 minutter ved RT. For beis C, fest i 1% (v/v) paraformaldehyd i SB i 30 min ved RT.
      4. Sentrifuger de faste platene ved 480 x g i 3 minutter ved 4 °C. Vask 1x i SB. For Stain B kan cellene stå over natten.
      5. Permeabiliser cellene: resuspender brønnene i 150 μL FoxP3 transkripsjonsfaktorsett permeabiliseringsbuffer for flekk B og i 0,5% (w / v) saponin i SB for flekk C. Inkuber i 15 min ved RT. Sentrifuge de faste platene ved 480 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
      6. Flikk platene og tilsett de respektive intracellulære fargecocktailene for beis B og beis C. Inkuber i 30 minutter ved RT.
      7. Sentrifuger de faste platene ved 480 x g i 3 minutter ved 4 °C og knips platene. Vask cellene med 150 μL av de tilsvarende permeabiliseringsbufferne (flekk B, FoxP3 transkripsjonsfaktorsett permeabiliseringsbuffer; flekk C, saponin).
      8. Knips platene og vask ved å pipettere opp og ned i 150 mikroliter SB. Sentrifuge ved 480 x g i 3 minutter ved 4 °C. Flikk platene og resuspender cellene i SB etter vevsgruppe i de aktuelle volumene som er notert på fargearket.
        MERK: Prøvene er nå klare for innsamling ved spektral flowcytometri.
      9. Sett opp flowcytometeret (se materialfortegnelse) med passende enkeltfargede kontroller for hver flekk og ufargede prøver for hver vevsgruppe for å ta hensyn til forskjeller i autofluorescens under unmixing. Hent passende volumer per vevsgruppe som definert i fargearket (tabell 2), og eksporter .fcs-filene.
  2. Dataanalyse av flowcytometri
    1. Bruk programvaren for flowcytometrianalyse (se Materialfortegnelse) til å opprette et nytt arbeidsområde. Opprett nye grupper for hvert organ (LN, milt og TIL). Importer .fcs-filene for hvert organ til gruppen.
    2. Opprett et bivariat punktplott, sett aksene til (FSC-A x SSC-A), og bruk en polygonport på cellulære hendelser, unngå hendelser på kantene (alle celleporter). Velg cellehendelsene, endre aksene til (FSC-A x FSC-H), og bruk en polygonport på hendelsene på den lineære diagonalen, unntatt hendelser som avviker fra diagonalen for å generere "singlets"-porten. Velg "singlets"-porten og endre aksene til (hCD45 x mCD45). Påfør polygonporter på hCD45 og mCD45 positive hendelser, og gi dem henholdsvis "menneskelig" og "mus".
    3. Velg den menneskelige befolkningen og endre Y-aksen til Live / Dead Aqua. Påfør en polygonport på den levende/døde negative, hCD45-positive populasjonen og gi den navnet "levende menneske". Velg musepopulasjonen og endre X-aksen til Live/Dead Aqua. Påfør en polygonport på den levende/døde negative, mCD45-positive populasjonen og gi den navnet "levende mus".
    4. På lignende måte velger du den overordnede porten og X- og Y-aksene som beskrevet i regnearkene "Conventional Flow A Gating", "Spectral Flow B Gating" og "Conventional Flow C Gating" (tabell 2) for å isolere de angitte populasjonene (f.eks. humane B-celler, aktiverte T-celler).
      MERK: Representativ gating for hver flekk (Bleed, A, B, C) er inkludert i tilleggsfil 2.
    5. Opprett telle- og frekvenseksporttabeller i programvaren for flowcytometrianalyse for alle populasjoner og eksporter til et regnearkprogram. Den overordnede populasjonen for frekvenser er angitt i tabell 2.
    6. Bruk dataene til å generere grafer basert på eksperimentelle behandlingsgrupper.
      MERK: Dataene kan også analyseres ved hjelp av R-pakker i analyseprogramvaren. En enkelt .fcs-fil fra alle prøver som skal analyseres, kan opprettes ved hjelp av concatenate-funksjonen. Disse dataene kan reduseres dimensjonalt med T-SNE-algoritmen mens du legger til søkeordparametere for vevstype og behandlingsgruppe. FlowSOM-algoritmen kan deretter brukes til å gruppere populasjoner, og ClusterExplorer-verktøyet kan brukes til å identifisere populasjonene. Nye cellepopulasjoner kan identifiseres på denne måten, sammenlignes visuelt og kvantifiseres mellom behandlingsgrupper eller i forskjellige vev.
    7. Korreler immunparametere for svulster innenfor samme behandlingsgruppe, med veksten for den svulsten for å definere immuntyper som korrelerer med tumorveksthemming. Kvantifisere tumorvekst med den spesifikke veksthastigheten (SGR) for den svulsten, en måling som tar hensyn til forskjellen i tumorvolum over en bestemt tid. Denne målingen normaliserer svulster høstet på forskjellige dager på grunn av musens helse og startdatoer for behandling.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter flanketumorprotokollen og eksperimentell tidslinje (figur 1) ble tumorvekst og immunrespons på en målrettet tyrosinkinasehemmer (TKI) terapi og nivolumab kombinasjonsbehandling studert i to distinkte humane kolorektal kreft (CRC) PDX. TKI-legemidlene har blitt studert i immundefekte verter for å evaluere tumorvekst bare29. Denne modellen muliggjorde studiet av endringer i immunresponsen til TKI alene, og enda viktigere, i kombinasjon med anti-PD-1. Denne studien var fokusert på kombinasjonsbehandlede kohorter i to forskjellige eksperimenter som representerer en vellykket evaluering ved bruk av HIS-BRGS-mus og et teknisk feilaktig eksperiment. For PDX CRC307P reduserte kombinasjonsbehandlingen veksten av svulsten, som bestemt av tumorvekstvolum over tid, tumorvekter ved høsting og SGR (figur 2A-C). På den annen side var veksten av en PDX utviklet fra en metastatisk tumor fra samme pasient, PDX CRC307M, testet i en annen kohort av HIS-BRGS-mus, mindre påvirket av samme kombinasjonsbehandling i HIS-BRGS-mus (figur 2D).

Til tross for allokering av HIS-BRGS-mus i ekvivalente eksperimentelle grupper basert på total human (hCD45+) og human T-celle (hCD3+) kimerisme i blodet før tumorimplantasjon (figur 3A-C), økte begge parametrene i det perifere immunsystemet (milt) og de tumorinfiltrerende leukocytter (TIL) i kombinasjonsbehandlede CRC307P-bærende mus, men ikke CRC307M-modellen (figur 3D-F ). Selv om begge HIS-BRGS-kohortene hadde sammenlignbar human- og T-cellekimerisme i blodet før tumorimplantasjon, hadde CRC307M-kohorten svært lite lymfeknutekkimerisme og klarte ikke å utvikle merkbare nivåer av T-celler i milten i den behandlede kohorten (figur 3D-F). CRC307M-eksperimentet representerer et teknisk feilaktig eksempel på grunn av generelt utilstrekkelig milt T-cellekimerisme og lymfeknutekimerisme. Vi foreslår utelukkelse av HES-mus som har <20% hCD3+ kimerisme i milten og/eller <1,5 x 106 hCD45+ celler i lymfeknuter ved slutten av studien. For CRC307M-modellen ble flertallet av musene ekskludert, hovedsakelig på grunn av svært små lymfeknuter, og etterlot bare to mus per kohort.

Videre undersøkelse av de humane T-cellene (figur 4A) viste flere aktiverte (HLA-DR+) T-celler i CR307P-svulstene, men ikke lymfen, fra kombinasjonsbehandlede mus (figur 4B). I CRC307M "negativt" eksperiment var det ingen signifikant økning av HLA-DR + T-celler i TILene til behandlede HIS-BRGS-mus når man analyserte alle musene, noe som tyder på at denne ikke-optimale HIS-BRGS-kohorten påvirket datasignifikansen på grunn av HIS-mus med svært få T-celler og ingen aktivering (figur 4B). Faktisk nådde økningen i HLA-DR + T-celler i TILene i CRC307M-modellen betydning når man ekskluderer HIS-BRGS-musene med lav T-cellekimerisme (figur 4B). I tillegg var det flere CD8+ T-celler med effektorminne og færre TIM-3+ (terminalt utmattede) T-celler i de kombinasjonsbehandlede CRC307P-svulstene, mens denne forskjellen ikke ble observert i CRC307M-modellen (figur 4C,D). I dette eksperimentet ble det ikke observert endringer i frekvensen av cytotoksiske T-celler (Granzyme B+ eller IFNγ+TNFα+) populasjoner blant kombinasjonsbehandlede mus, selv om høyere cytotoksiske T-celler ble observert i ubehandlede (figur 4E) eller behandlede (data ikke vist) tumorer i forhold til lymfeknuter. Det er viktig å merke seg at selv om det ikke var forskjeller i frekvens mellom T-cellepopulasjonene, ble det observert høyere antall cytotoksiske T-celler i svulstene hos behandlede HIS-CRC307P-BRGS-mus, med høyere frekvenser (figur 3B) og antall humane T-celler i svulstene. På den annen side viste denne kombinasjonsbehandlingen ingen effekt på frekvensene av Tregs i verken CRC307P lymfeorganer eller svulster, selv om CRC307M-dataene viste en trend med redusert Tregs som måtte valideres i et annet eksperiment (figur 4F).

I tillegg til utspørring av humant immunsystem ble også immunrelaterte forandringer på tumorceller evaluert ved hjelp av flowcytometri (figur 5A). Ved gating på EpCAM+-celler, som beskrevet i protokollen, ble det funnet økt ekspresjon av både MHC klasse I (HLA-ABC) og klasse II (HLA-DR) på CRC307P-tumorceller skåret ut fra kombinasjonsbehandlede HIS-BRGS-mus (figur 5B). I CRC307M-modellen induserte den samme medikamentelle behandlingen HLA-klasse II-uttrykk på tumorcellene, men i mindre grad enn i CRC307P-modellen (figur 5C). Dermed ser kombinasjonsbehandlingen ut til å indusere oppregulering av MHC klasse II, uavhengig av T-celleinfiltrasjon (figur 5B,C). Spesielt var MHC-ekspresjon på tumorcellene lavere enn på humane immunceller, et funn som stemmer overens med humane tumorrapporter (figur 5B). Tilsvarende resulterte kombinasjonsbehandlingen i økt PD-L1-uttrykk på EpCAM+ CRC307P-tumorcellene (figur 5D).

Til slutt ble korrelasjoner av immunresponser med tumorvekst undersøkt ved å plotte SGR av svulsten versus immunparametere. Selv om frekvensen av CD4 + T-celler i svulstene hos ubehandlede mus ikke viste noen sammenheng med tumorvekst, viste økte CD4 + T-celler en signifikant (figur 6A) korrelasjon med mindre tumorvekst, og mer spesifikt HLA-DR + aktiverte T-celler (figur 6B), i kombinasjonen behandlet HIS mus.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrering av generering av HIS-BRGS-mus og implantasjon av humane CDX- eller PDX-svulster for kreftimmunterapistudier. Tidslinjen er viktig for å sikre tilstedeværelsen av T-celler som tar måneder å innpode i CB-avledede HES-mus. Laget med Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Analyse av tumorvekst. Tumorvekstmålinger for CRC307P PDX i kontroll (svart) eller kombinasjonsbehandlet (rød) HIS-BRGS-mus kvantifisert med (A) volum over tid, (B) vekter ved slutten av studien, eller (C) spesifikk vekstrate (SGR). (D) SGRs for CRC307M PDX. Data inkluderer svulster implantert i begge flankene av seks kjøretøy HIS-BRGS-mus, syv kombinasjonsbehandlede BRGS-mus for CRC307P, og bare to kjøretøy- og kombinasjonsbehandlede mus for CRC307M på grunn av høye ekskluderingsrater. Statistiske analyser mellom to uavhengige grupper ble utført med uparet, parametrisk togruppe-Welchs t-test. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Human immun- og T-cellekimerisme i lymfeorganer og svulster hos CRC PDX-tumorbærende HIS-BRGS-mus. (A) Representativ flowcytometrianalyse av humane (hCD45) og mus (mCD45) hematopoietiske og humane T (CD3) celler i perifert blod (PBMC) før tumorimplantasjon, og i LN og tumorer (TIL) ved slutten av studien. (B,C) Ekvivalent human- og T-cellekimerisme i blod ved 14 uker hos HIS-BRGS-mus injisert med (B) CRC307P eller (C) CRC307M PDX og ubehandlet eller behandlet med kombinasjonsimmunterapi (Tx). (VG Nett) Økte humane T-celler i lymfeorganer og svulster (TIL) hos kombinasjonsbehandlede HIS-BRGS-CRC307P-mus, men ikke HIS-BRGS-CRC307M-mus. Data viser humane og T-cellefrekvenser på Y-aksen som en prosentandel av foreldrepopulasjonen i (D) lymfeknuter (LN), (E) milt (SP) og (F) svulster av individuelle mus ved slutten av studien. Statistiske analyser mellom to uavhengige grupper ble utført med uparet, parametrisk togruppe-Welchs t-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Analyse av T-celleaktivering ved flowcytometri i perifere lymfeorganer og tumorer i CRC PDX-bærende HIS-BRGS-mus. (A) Representativ flowcytometrianalyse av T-celler i LN, milt (SPs) og svulster (TIL) skåret ut fra HIS-BRGS-mus som måler følgende populasjoner: aktiverte T-celler (HLA-DR+), naive T-celler (CD45RA+ CCR7+), Tem (CD45RA-, CCR7-), Tregs (CD25+, FoxP3+) og cytotoksiske T-celler (Granzyme B+, TNFα+ og/eller IFNγ+). (VG Nett) Frekvenser av indikerte T-cellepopulasjoner i lymfeorganer eller TILer av HIS-CRC307P-BRGS og HIS-CRC307M-BRGS-mus: (B) HLA-DR+ aktiverte T-celler, (C) CCR7-CD45RA-Tem CD8+ T-celler, (D) hemmende reseptor TIM-3 CD8+ T-celler, (E) Granzyme B CD8+ T-celler og (F) CD25+FoxP3+ CD4+ Tregs. For HIS-CRC307M-BRGS-musene i (B) viser det første datasettet alle mus analysert ved høsting, mens det andre datasettet bare inkluderer de med tilstrekkelig LN og milt T-cellekimerisme. I alle grafer representerer de fylte symbolene for 307M mus med tilstrekkelig kimerisme, mens åpne symboler er ekskludert HIS mus. Statistiske analyser mellom to uavhengige grupper ble utført med uparet, parametrisk togruppe-Welchs t-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Flowcytometrianalyse av MHC klasse I, II og PD-L1 på humane tumorer i HIS-BRGS-mus. (A) Representative flow cytometry dot plots, som illustrerer gating strategi for måling av ekspresjonsnivåer av MHC klasse I (HLA-ABC), KLASSE II (HLA-DR), og PD-L1 på epitelial (EpCAM+) humane tumorer i HIS-BRGS mus. (VG Nett) Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av HLA-ABC (B), HLA-DR (B,C) og PD-L1 (D) på humane (hCD45+) og tumorceller (EpCAM+) fra dissosierte CRC307P (B,D) eller CRC307M (C) PDX-er skåret ut fra HIS-BRGS-mus. Statistiske analyser mellom to uavhengige grupper ble utført med uparet, parametrisk togruppe-Welchs t-test. *p <0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. Forkortelse: Tx = Behandling Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Analyse av immunkorrelater av respons. SGRs av CRC307P-tumorvekst i flankene av ubehandlet (Veh) eller kombinasjonsimmunterapibehandlet (Tx) HIS-BRGS-mus ble plottet mot frekvensen av (A) CD4 + eller (B) HLA-DR + T-celler som en indikator på immunparametere som korrelerer med redusert tumorvekst (dvs. mindre SGR). En enkel lineær regresjonsanalyse ble utført for å indikere signifikante korrelasjoner. R2-verdier indikerer grad av korrelasjon. *p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Regneark for overflatefargepanel. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Cellefargepaneler og regneark for flowcytometri gating. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: Oppskrifter på medier og løsninger brukt i studien. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Representativ flowcytometrigating for hver flekk. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I løpet av de siste 6 årene, ved hjelp av vår kompetanse innen både immunologi og humaniserte mus, har vårt forskerteam utviklet en sårt tiltrengt preklinisk modell for å teste immunterapier på en rekke humane svulster 3,7,30,31. Denne protokollen legger vekt på hensynet til modellens variabilitet, med spesiell oppmerksomhet til immunterapi-sentriske humane T-cellepopulasjoner. I denne protokollen er genereringen av HES-mus beskrevet, samt immunanalysen av både lymfeorganene og svulsten. Flowcytometriprotokoller utviklet for tradisjonelle kompensasjonsbaserte cytometre og spektrale cytometre er også inkludert. Evnen til å forhøre endringer i immunsystemet i store tumorprøver, så vel som i periferien, representerer en betydelig fordel for denne prekliniske modellen. En ekstra fordel med dette systemet er at flere mus, som har den samme unike humane svulsten, kan allokeres i separate kohorter og behandles med forskjellige kombinasjoner av immunterapi-legemidler, og i hovedsak utfører en "mini" legemiddelforsøk. Kombinert muliggjør disse to faktorene undersøkelse av virkningsmekanismer og resistens av foreslåtte (kombinasjons) immunterapier. Modellen har evnen til å teste medikamenttiming og dosering på et bredt spekter av humane svulster og en rekke immunmålrettede behandlinger, inkludert målrettede terapier, biologiske legemidler, kjemoterapier, stråling og til og med cellebaserte terapier.

På grunn av den iboende variasjonen i HIS-muskimerismen, er det nødvendig med et høyere antall mus per behandlingsgruppe enn en typisk syngen tumormodell. Ved hjelp av disse protokollene er kohorter på fem til syv HIS-BRGS-mus per behandlingsarm tilstrekkelig til å oppnå statistiske forskjeller i immunparametere. Denne variasjonen i kimerisme representerer en utfordring i denne modellen og må vurderes. Et eksperimentelt eksempel som demonstrerer både tumorvekst og immunrespons ved en kombinasjonsbehandling til en CRC PDX har blitt vist her, samt et eksempel der samme behandling til en annen CRC PDX ikke viste en lignende sterk respons. Denne forskjellen i eksperimentelt utfall kan skyldes forskjellig PDX (samme pasient, men metastatisk vs. primær) og/eller kimerismen. I det andre forsøket var det svært få T-celler i milten hos flertallet av musene i behandlingsgruppen, samt svært små LNer; flere laboratorier har vist at den største batch-til-batch-variabiliteten blant HIS-modeller er T-cellefrekvensene 20,32,33. Vi har også vist at menneskelig engraftment i LN korrelerer sterkt med T-cellekimerismen32. På tvers av mer enn 40 eksperimenter har vi registrert et krav om 20% T-celler i milten for tilstrekkelig kimerisme for å oppdage behandlingsrelaterte immunforandringer3. Ved ofring er det viktig å sikre signifikant T-cellerekonstitusjon, som vi definerer som bemerkelsesverdig LN-utvikling (>1,5 x 106 hCD45-celler) og >20 % T-celler (av hCD45+-celler) i milten. HES-mus som ikke oppfyller dette kravet, fjernes fra datasettet. Kimerisme i blodet før tumorimplantat bidrar til å forutsi denne parameteren; Det er imidlertid forskjeller i T-celleutvikling hos individuelle mus over tid som best vurderes ved slutten av studien. Heldigvis, i denne modellen, utvikler omtrent 95% av HIS-BRGS-muskohortene tilstrekkelig T-cellekimerisme for immunterapistudier. Det bør understrekes at dataanalysen ved slutten av studien alltid bør inkludere undersøkelse av kimerismen i de perifere lymfeorganene og fjerne HES-mus som ikke oppfyller human- og T-cellekimerismen. I eksperimenter med mindre enn fire HES-mus per kohort etter denne justeringen, bør resultatene valideres med en annen HIS-BRGS-kohort avledet fra en distinkt CB.

Selv om vår gruppe har fokusert på mottakeren av BRGS-musemodellen, er det mange modeller tilgjengelig over hele verden. For eksempel er mottakeren av NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ) den mest karakteriserte modellen og ligner på NOG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Sug/Jic) og til og med NRG (NOD-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl/SzJ) -modellen, som bruker Rag-mutasjoner for genetisk ablasjon av mus T- og B-celler i stedet for SCID-mutasjonen20. Disse modellene er alle på NOD-bakgrunnsstammen og har dermed SIRPaNOD-allelet, noe som er viktig for å unngå fagocytose av humane celler ved vertsmakrofager13. Rapporter antyder lignende kimerisme i disse "grunnleggende" humaniserte musemodellene som i BRGS-modellen, med for det meste menneskelige B-celler i de første månedene etterfulgt av engraftment med humane T-celler32,34,35. I disse modellene er NK- og myeloide celler underrepresentert i forhold til et menneske36,37. Det er flere iterasjoner av "neste generasjon" humaniserte musemottakere som kan forbedre avstamningsspesifikk utvikling gjennom innføring av menneskespesifikke cytokiner. For eksempel har NSG-SGM3 (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl Tg (CMV-IL3, CSF2, KITLG) 1Eav / MloySzJ) mus humane IL-3, GM-CSF og SCF cytokiner og forbedret human myelopoiesis 37, eller humane HLA-transgener for seleksjon på en human HLA (f.eks. NSG-HLA-A2 eller BRGS-HLA-A2 / DR238,39). Omfattende anmeldelser om dette emnet20,21 anbefales til leserne. HIS musemodeller skal valideres i hvert laboratorium med sin egen kilde til humane stamceller. Denne valideringen bør omfatte kvantifisering av menneskelig kimerisme, inkludert humane B-, T-, NK- og myeloide celler, i blodet over tid og i LN, milt, benmarg og thymus mellom 16-20 uker og igjen mellom 24-28 uker. Spesiell oppmerksomhet bør gis til multi-lineage engraftment, inkludert T-celle chimerisme. I tillegg bør vekstratene for svulster testes i HES-musene i forhold til ikke-humaniserte mus av samme stamme. Det er sannsynlig at betydelige forbedringer i HIS-musemodeller kan føre til avvisning av svulsten. Som et forsøk på ressursbesparelser gjøres disse vekstkurvene ofte samtidig med analysene av immunresponsdataene. Kommersielt tilgjengelige HES-mus bør inkludere omfattende kimerismedata fra blodet, samt referanser til kimerisme i andre organer fra andre kohorter.

De eksperimentelle protokollene for å analysere tumorvekst og immunresponser i HES-mus til humane CDX-er eller PDX-er krever standard laboratoriemetoder og immunologisk ekspertise. Genereringen av HES-mus, inkludert isolering av stamceller, injeksjon i immundefekte mus og testing av menneskelig kimerisme i blodet, er alle relativt enkle laboratorieprosedyrer. De logistiske problemene rundt denne prosedyren, inkludert avl av svært immundefekte musestammer, anskaffelse av en pålitelig kilde til humane HSC-er, etc., er den mest tungvinte komponenten i protokollen. Prosessuelt må mer oppmerksomhet gis til eksperimentell design, inkludert tidspunktet for tumorimplantasjon (vanligvis 19-21 uker når nok T-celler er til stede), dosering av legemidler og timing ved slutten av studien. Anskaffelse av tumormålingsdata er en annen rutinemessig prosedyre. Men siden immundataene ofte er mer informative enn tumorvekstdataene i dette systemet, kan flowcytometriske analyser av immunresponsene gi relevante data. Farging av celler for flowcytometri er en annen enkel prosedyre, som er å lære å kjøre et flowcytometer. Analysen og tolkningen av disse dataene krever imidlertid unik kompetanse. Selv om dette manuskriptet fungerer som en ryggrad for å utføre immunonkologistudier i HIS-mus, bør hvert protokolltrinn optimaliseres i et nytt laboratorium. Fra erfaring krever opprettholdelse av musens helse, anskaffelse av tilstrekkelige HSC-er fra CB-enheter og timing av tumorinjeksjonene for tilstrekkelige T-celler mest oppmerksomhet og feilsøking.

HIS-BRGS-musene utviser ekstrem immunsuppresjon som ligner den som er observert i mange humane svulster. Denne immunsuppresjonen er bemerkelsesverdig, da høye ekspresjonsnivåer av PD-1 og TIGIT, men mindre TIM-3, observeres på T-cellene i de perifere immunorganene til HIS-BRGS-musene 3,7. Disse T-cellene viser også markører for immunaktivering, inkludert høyt uttrykk av HLA-DR og lavt uttrykk av CCR7 og CD45RA, indikativ for T-effektorceller, som vist her i figur 4 og i referanser 3,7. Denne kvaliteten er et sentralt paradoks for systemet; immunsuppresjonen tillater vekst av allogene humane svulster i nærvær av en allogen HIS, med hastigheter lik eller enda raskere enn ikke-humaniserte BRGS eller nakne (Nu / J) mus 3,7,23. Imidlertid har immunstimuli vist seg å kunne overvinne denne immunosuppresjonen og avvise en svulst 7,8. Selv om signifikante endringer i tumorvekst mellom kjøretøy og behandlede mus ikke alltid observeres, har signifikante forskjeller i immunfenotyper blitt funnet oftere, så analyse av tumorvekstratene korrelert med immunfenotyper foreslås. I denne analysen ble det funnet immunparametere som signifikant korrelerer med redusert tumorvekst3. Disse dataene tyder på at bestemte "immunkorrelater" er behandlingsrelaterte og deltar i tumorkontroll. Dermed gir tumorvekstmålinger kombinert med immunfenotyper i HIS-musemodellen viktige prekliniske data med hensyn til tumorimmunresponser mot unike humane svulster. Utfordringen for enhver preklinisk modell er korrelasjon til kliniske resultater. HIS muse onkologi feltet har flere eksempler på klinisk korrelasjon: 1) vi og andre har vist at den humane immuninfiltrasjonen korrelerer med tumortypen 3,22,23,40; 2) vi har vist vellykket behandling med anti-PD-1 i en ACC Lynch syndrom PDX tatt fra en pasient som senere responderte på denne behandlingen31; og 3) vi har vist overlegen respons på en CRC MSS hi PDX, en kreft med høye responsrater i klinikken over den notorisk dårlig responderende CRC MSS PDX7. Sammen med in vitro og andre in vivo-modeller utgjør disse dataene en sammenheng for oversettelse til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke både Animal Research Facility (OLAR) for deres omsorg for våre mus, og Flow Cytometry Shared Resource støttet av Cancer Center Support Grant (P30CA046934) ved vårt institutt for deres enorme hjelp i alt vårt arbeid. Vi anerkjenner også både Gail Eckhardt og Anna Capasso for våre innledende samarbeid som studerer immunterapier mot humane PDXer i vår HIS-BRGS-modell. Denne studien ble støttet delvis av National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant ved bruk av PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Denne forskningen ble støttet delvis av NIAID fra National Institutes of Health under kontraktsnummer 75N93020C00058.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe w/needles McKesson 1031815
15 mL tubes Grenier Bio-One 188271
2-mercaptoethanol Sigma M6250
50 mL tubes Grenier Bio-One 227261
AutoMACS Pro Separator Miltenyi 130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin BD Bioscience BDB563792
BSA Fisher Scientific BP1600100
Cell Stim Cocktail Life Technologies 509305
Chill 15 Rack Miltenyi 130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes Fisher Scientific 13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract R&D Systems 363200502
Cytek Aurora Cytek
DNase Sigma 9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set Invitrogen 00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS Gibco 10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume Grenier Bio-One 616201
Excel Microsoft
FBS Benchmark 100-106 500mL
Ficoll Hypaque GE Healthcare 45001752
FlowJo Software BD Biosciences
Forceps - fine Roboz Surgical  RS5045
Forceps normal Dumont RS4919
Formaldehyde Fisher F75P1GAL
Frosted Glass Slides Corning 1255310
Gentlemacs C-Tubes Miltenyi    130-096-334
GentleMACS Dissociator Miltenyi 130-093-235
glass pipettes DWK Life Sciences 63A53
Glutamax Gibco 11140050
HBSS w/ Ca & Mg Sigma 55037C
HEPES Corning MT25060CI
IgG standard Sigma I2511
IgM standard Sigma 401108
IMDM Gibco 12440053
Liberase DL Roche 5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue Thermo L23105
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MEM Gibco 1140050
mouse anti-human IgG-AP Southern Biotech JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled Southern Biotech H2
mouse anti-human IgM-AP Southern Biotech UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled Southern Biotech SA-DA4
MultiRad 350 Precision X-Ray
PBS Corning 45000-446
Pen Strep Gibco 15140122
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713A
p-nitrophenyl substrate Thermo 34045
PRISM Graphpad
Rec Hu FLT3L R&D systems 308-FK-005/CF
Rec Hu IL6 R&D systems 206-IL-010/CF
Rec Hu SCF R&D systems 255SC010
RPMI 1640 Corning 45000-39
Saponin Sigma 8047-15-2
Scissors McKesson 862945
Serological pipettes 25 mL Fisher Scientific 1367811
Sterile filter Nalgene 567-0020
Sterile molecular water Sigma 7732-18-5
Yeti Cell Analyzer Bio-Rad 12004279
Zombie Green biolegend 423112

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
  2. Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
  3. Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
  4. Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
  5. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
  6. Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
  7. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
  8. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  9. Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
  10. Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
  11. Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
  12. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  13. Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
  14. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  15. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  16. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  17. Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
  18. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  19. Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
  20. Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
  21. Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
  22. Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
  23. Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
  24. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
  25. Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
  26. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
  27. Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
  28. Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
  29. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
  30. Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
  31. Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
  32. Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
  33. Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
  34. Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
  35. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
  36. Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
  37. Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
  38. Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
  39. Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
  40. Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).

Tags

Kreftforskning utgave 190

Erratum

Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 05/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

Testing av kreftimmunterapi i en humanisert musemodell som bærer menneskelige svulster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lanis, J. M., Lewis, M. S.,… More

Lanis, J. M., Lewis, M. S., Strassburger, H., Larsen, K., Bagby, S. M., Dominguez, A. T. A., Marín-Jiménez, J. A., Pelanda, R., Pitts, T. M., Lang, J. Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. J. Vis. Exp. (190), e64606, doi:10.3791/64606 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter