Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Testen van kankerimmunotherapeutica in een gehumaniseerd muismodel met menselijke tumoren

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64606
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 2, 1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Dit protocol schetst de generatie van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS) voor immuno-oncologische studies. Instructies en overwegingen bij het gebruik van dit model voor het testen van menselijke immunotherapeutica op menselijke tumoren die in dit model zijn geïmplanteerd, worden gepresenteerd met de nadruk op het karakteriseren van de reactie van het menselijk immuunsysteem op de tumor.

Abstract

Het omkeren van de immunosuppressieve aard van de micro-omgeving van de tumor is van cruciaal belang voor de succesvolle behandeling van kankers met immunotherapiegeneesmiddelen. Murine kankermodellen zijn uiterst beperkt in hun diversiteit en lijden aan een slechte vertaling naar de kliniek. Om te dienen als een meer fysiologisch preklinisch model voor immunotherapiestudies, is dit protocol ontwikkeld om de behandeling van menselijke tumoren te evalueren in een muis gereconstitueerd met een menselijk immuunsysteem. Dit unieke protocol toont de ontwikkeling van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS, "gehumaniseerd"), gevolgd door implantatie van een menselijke tumor, ofwel een cellijn-afgeleide xenograft (CDX) of een patiënt afgeleide xenograft (PDX). HIS-muizen worden gegenereerd door CD34+ menselijke hematopoëtische stamcellen geïsoleerd uit navelstrengbloed te injecteren in neonatale BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) zeer immunodeficiënte muizen die ook in staat zijn om een xenogene tumor te accepteren. Het belang van de kinetiek en kenmerken van de ontwikkeling van het menselijk immuunsysteem en tumorimplantatie wordt benadrukt. Ten slotte wordt een diepgaande evaluatie van de tumormicro-omgeving met behulp van flowcytometrie beschreven. In talrijke studies met dit protocol werd gevonden dat de tumormicro-omgeving van individuele tumoren wordt gerecapituleerd in HIS-PDX-muizen; "Hete" tumoren vertonen grote immuuninfiltratie, terwijl "koude" tumoren dat niet doen. Dit model dient als proeftuin voor combinatie-immunotherapieën voor een breed scala aan menselijke tumoren en vormt een belangrijk hulpmiddel in de zoektocht naar gepersonaliseerde geneeskunde.

Introduction

Muiskankermodellen zijn belangrijk voor het vaststellen van basismechanismen van tumorgroei en immuunvlucht. Kankerbehandelingsstudies in muismodellen hebben echter eindige vertaling naar de kliniek opgeleverd vanwege beperkte syngenetische modellen en soortspecifieke verschillen 1,2. De opkomst van immuuntherapieën als een dominante benadering om tumoren onder controle te houden, heeft de noodzaak van een in vivo model met een functioneel menselijk immuunsysteem herhaald. Vooruitgang in muizen met het menselijk immuunsysteem (HIS-muizen) in het afgelopen decennium heeft het mogelijk gemaakt om immuno-oncologie in vivo te bestuderen in een breed scala aan kankertypen en immunotherapeutische middelen 3,4,5,6. Menselijke tumormodellen, waaronder cellijn-afgeleide en patiënt-afgeleide xenografts (CDX en PDX, respectievelijk), groeien goed in HIS-muizen en zijn in de meeste gevallen bijna identiek aan hun groei in de immunodeficiënte gastheer zonder menselijke hematopoietische engraftment 7,8. Op basis van deze belangrijke bevinding hebben onderzoekers het HIS-muismodel gebruikt om menselijke immunotherapieën te bestuderen, waaronder combinatietherapieën die zijn ontworpen om de tumormicro-omgeving (TME) te veranderen om immunosuppressie te verminderen en zo immuungestuurde tumordoding te verbeteren. Deze preklinische modellen helpen de problemen van heterogeniteit van menselijke kankers aan te pakken en kunnen ook het succes van de behandeling voorspellen en immuungerelateerde geneesmiddeltoxiciteiten monitoren 9,10.

De productie van een muismodel met een menselijk immuunsysteem door de introductie van menselijke hematopoëtische stamcellen vereist een ontvangende immunodeficiënte muis die de xenograft niet zal afstoten. De huidige HIS-muismodellen zijn afgeleid van immunodeficiënte muizenstammen die meer dan 30 jaar geleden werden gerapporteerd. De eerste immunodeficiënte muizenstam die werd beschreven was SCID-muizen zonder T- en B-cellen11, gevolgd door een hybride NOD-SCID met een SIRPα-polymorfisme dat verantwoordelijk is voor muismacrofaagtolerantie voor menselijke cellen, als gevolg van verhoogde binding voor het NOD SIRPα-allel aan het menselijke CD47-molecuul12,13. In de vroege jaren 2000 was de deletie van de gemeenschappelijke gammaketen van de IL-2-receptor (IL-2Rγc) op zowel BALB / c- als NOD-immunodeficiënte stammen een game changer voor verbeterde menselijke transplantatie, vanwege genetische deleties die de ontwikkeling van NK-cellen van de gastheer verbieden14,15,16,17. Alternatieve modellen, zoals BRG- en NRG-muizen, bereiken T- en B-celdeficiëntie door deletie van het Rag1- of Rag2-gen, vereist voor T- en B-celreceptorgenherschikkingen en dus de rijping en overleving van lymfocyten18,19. De BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) muis die hierin wordt gebruikt, combineert de IL-2Rγ-ketendeficiëntie en hetNOD SIRPα-allel op de Rag2-/- achtergrond, wat resulteert in een zeer immunodeficiënte muis zonder T-, B- of NK-cellen, maar met voldoende kracht en gezondheid om langdurige transplantatie van meer dan 30 weken mogelijk te maken13.

HIS-muizen kunnen op meerdere manieren worden gegenereerd, waarbij menselijke PBMC-injectie de meest directe methode is15,18,20. Deze muizen hebben echter een uitgesproken uitbreiding van geactiveerde menselijke T-cellen die resulteert in graft versus host disease (GVHD) op de leeftijd van 12 weken, waardoor langetermijnstudies worden voorkomen. Als alternatief kunnen menselijke hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed (CB), beenmerg en foetale lever ook worden gebruikt voor transplantatie en productie van het menselijk immuunsysteem de novo. In dit systeem produceren de hematopoëtische stamcellen een multi-lineage menselijk immuunsysteem met de generatie van T, B en aangeboren immuuncellen die belangrijk tolerant zijn voor de muisgastheer, vergeleken met de PBMC-muizen die voornamelijk T-cellen ontwikkelen. Daarom is GVHD afwezig of sterk vertraagd en kunnen studies worden uitgebreid tot muizen tot 10 maanden oud. CB biedt een eenvoudige, toegankelijke en niet-invasieve bron van CD34+ menselijke hematopoëtische stamcellen die de engraftment van meerdere HIS-muizen met genetisch identieke immuunsystemen vergemakkelijkt 17,18,20,21. In de afgelopen jaren zijn HIS-muismodellen uitgebreid gebruikt om immunotherapie en de TME 3,4,5,6 te bestuderen. Ondanks de ontwikkeling van menselijke afgeleide immuunsystemen bij deze muizen, groeien menselijke xenografttumoren met vergelijkbare snelheden in vergelijking met de controle-immunodeficiënte muizen en maken ze het complexe samenspel tussen de kankercellen en immuuncellen mogelijk, wat belangrijk is voor het behoud van de micro-omgeving van de geënte PDX 3,7,8 . Dit protocol is gebruikt om meer dan 50 studies uit te voeren die behandelingen testen in HIS-BRGS-muizen met PDX's en CDX's. Een belangrijke conclusie is dat menselijke tumoren in de HIS-muizen hun unieke TME behouden zoals gedefinieerd door moleculaire evaluatie van de tumor ten opzichte van het initiële patiëntmonster en immuuninfiltraatkenmerken 3,22,23. Onze groep richt zich op een diepgaande evaluatie van de HIS in zowel immuunorganen als de tumor met behulp van multi-parameter flowcytometrie. Hierin beschrijven we een protocol voor de humanisatie van BRGS-muizen, evaluatie van chimerisme, implantatie van menselijke tumoren, tumorgroeimetingen, toediening van kankerbehandeling en analyse van de HIS-cellen door flowcytometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al het dierenwerk werd uitgevoerd onder dierprotocollen die zijn goedgekeurd door de University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-protocollen # 00593 en # 00021). Al het dierenwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met het Office of Laboratory Animal Resources (OLAR), een geaccrediteerde faciliteit van de American Association for Laboratory Animal Care, aan de University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus. Alle menselijke navelstrengbloedmonsters werden verkregen als donaties van niet-geïdentificeerde donoren en zijn dus niet onderworpen aan goedkeuring door de ethische commissie voor menselijk onderzoek.

OPMERKING: Composities van alle media en oplossingen die in het protocol worden genoemd, zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. Figuur 1 illustreert het algemene protocol voor het genereren en analyseren van immuunresponsen op tumoren in HIS-BRGS-muizen.

1. Generatie van HIS muizen

  1. Muizenhouderij van BALB/c -Rag2 null Il2RγCnull Sirpα NOD (BRGS) muizen
    OPMERKING: Deze stam is extreem immunodeficiënt, zonder T-, B- of NK-cellen. Daarom moeten rigoureuze maatregelen worden genomen om opportunistische infecties te voorkomen. Handhaaf de kolonie op een dieet met trimethoprim en sulfadiazine op een afwisselend schema van 2 weken met een normaal dieet. Zorg voor een zo hoog mogelijk niveau van voorzorgshuisvesting (bijv. Een barrièredouche-in faciliteit met beperkte toegang).
    1. Onderhoud kolonies van BALB/c -Rag2 null Il2RγC null Sirpα NOD (BRGS) en BALB/c Rag2 null Il2RγC null SirpaBalb/c (BRG) homozygote muizen als fokkers.
    2. Fok BRGS N/N×BRG B/B om BRGSB/N pups te genereren, te gebruiken als ontvangers van menselijke stamcellen. In deze kolonie zijn BRGSB/N gezonder dan BRGS N/N, en enten op gelijkwaardige niveaus (meer dan BRG).
  2. CD34+ menselijke stamcelisolatie uit navelstreng CB
    OPMERKING: Er worden geen antibiotica gebruikt voor deze procedure. Daarom is een goede steriele techniek noodzakelijk.
    1. Plaats een conisch buizenrek van 50 ml, evenals 3x 15 ml en ~ 10x 50 ml conische buizen in een gesteriliseerde bioveiligheidskast (BSC). Spuit een bloedafnamezak in met 70% ethanol en laat deze drogen in de BSC.
    2. Bereken het aantal conische buizen van 50 ml dat nodig is voor CB-dichtheidsgradiëntisolatie = CB-volume/15, afgerond naar boven en op een even buisnummer. Bereken het bloedvolume per buis = CB-volume/aantal buisjes. Giet voorzichtig bloed uit de CB-zak in elke conische buis; dit is maximaal 15 ml per buis. Gebruik een automatische pipettor en een serologische pipet van 25 ml om het bloed 1:1 te mengen met steriele PBS door op en neer te pipetteren.
    3. Gebruik een automatische pipettor op lage snelheid en een serologische pipet van 10 ml om het bloed langzaam te bedekken met een oplossing met kamertemperatuur (RT) van 1,077 g/ml dichtheidsgradiënt (zie materiaaltabel) zonder de interface te verstoren. Zorg ervoor dat de pipetpunt de onderkant van de buis niet raakt. Herhaal dit voor alle buizen. Centrifugeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 850 x g, zonder remmen, bij RT om het behoud van de dichtheidsgradiënt te garanderen.
    4. Visualiseer de cellulaire buffy coat bovenop de 1.077 g / ml dichtheidsgradiënt als een troebele witte laag. Verwijder en gooi de plasmalaag weg tot ongeveer 10 ml boven de buffy coat met behulp van een serologische pipet van 25 ml en een automatische pipettor.
    5. Verzamel de buffy coat met een steriele transfer of serologische pipet. Gebruik de pipet als een spatel om de cellen van de zijkant van de conische buis te schrapen terwijl u de bol loslaat (of langzaam pipetteert) om de cellen op te trekken. Combineer de buffy coats van twee 50 ml conische buizen tot één nieuwe 50 ml conische buis.
    6. Was de cellen door 45 ml steriel HBSS met 2% FBS in elke conische buis te gieten. Centrifugeer gedurende 11 min bij 360 x g bij RT.
    7. Zuig de wasmiddelen aan tot aan de pellet in alle buisjes. Gebruik een serologische pipet van 10 ml en een automatische pipettor om de eerste pellet te resuspenseren in 10 ml HBSS met 2% FBS. Resuspendeer elke pellet in dezelfde 10 ml HBSS en spoel elke buis af met een extra 10 ml HBSS om alle cellen in een enkele buis te verzamelen.
    8. Giet 45 ml steriel HBSS met 2% FBS in de conische buis. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 360 x g, bij 4 °C.
    9. Zuig de wasbuffer op tot aan de celpellet en resuspensie de pellet in 20 ml magnetische celscheiderbuffer (zie materiaaltabel). Verwijder een klein aliquot om de cellen te tellen met een hemacytometer bij een verdunning van 1:20 in methyleenblauw. Voeg het aantal blauwe en witte cellen toe. Centrifugeer bij 360 x g, gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van magnetische kralentechnologie (zie materiaaltabel). Het protocol kan worden aangepast voor gebruik met elke celscheidingstechnologie, met voldoende zuiverheid en opbrengst van de CD34+ stamcellen.
    10. Zuig het supernatant op en resuspensie de CD34+ celpellet geïsoleerd uit navelstrengbloed in 300 μL magnetische celscheidingsbuffer per 1 x 108 cellen. Voeg eerst 100 μL FcR-blokkerend reagens toe en vervolgens 100 μL CD34+ magnetische kralen per 1 x 108 cellen. Incubeer bij 4 °C gedurende 30 minuten (geen ijs).
    11. Voeg 5 ml magnetische celscheiderbuffer per 1 x 108 cellen toe en draai gedurende 10 minuten bij 4 °C op 360 x g . Herhaal de wasstap en resuspensie van de pellet in 500 μL magnetische celscheiderbuffer per 1 x 108 cellen in een conische buis van 15 ml met het label "ongefractioneerd".
    12. Label nog twee conische buizen van 15 ml "CD34-" en "CD34+". Plaats de drie conische buizen van 15 ml (ongefractioneerd, CD34- en CD34+) respectievelijk op sleuven A1, B1 en C1 op een koelrek (zie materiaaltabel). Scheid de cellen met behulp van het positieve selectieprogramma met twee kolommen op een automatische magnetische celscheider (zie materiaaltabel) in een BSC, volgens de instrumentinstructies van de fabrikant.
  3. Uitbreiden en bevriezen van CD34+ menselijke stamcellen
    1. Aliquot 10 μL van de teruggewonnen CD34+ celsuspensie (2 ml) op een hemocytometerschuif en tel de cellen onder 10x vergroting. Bereken het totale aantal CD34+ cellen door het aantal cellen te vermenigvuldigen met 2 x 104. Deel het totale CD34+ celnummer door 250.000 om het aantal in te vriezen injectieflacons te berekenen (50.000 cellen per muispup voorafgaand aan in vitro expansie).
    2. Bereid CB medium Iscove's 10% FCS (plus 1 ml extravoor filterverlies), aangevuld met 40 ng / ml stamcelfactor, 20 ng / ml Flt3L en 10 ng / ml IL-6, en passeer een filter van 0,22 μm. Resuspendeer de CD34+ cellen bij 100.000 per ml CB-medium en incubeer bij 37 °C. Voeg op dag 3 een equivalent volume CB-medium zonder cytokines toe aan de kolf met de cellen en het CB-medium met cytokines.
      OPMERKING: Toevoeging van deze cytokines aan het CB-medium bevordert de overleving en uitbreiding van de CD34+ cellen en voorkomt differentiatie.
    3. Oogst de uitgebreide CD34+ cellen op dag 5. Pipetteer de celsuspensie op en neer en verzamel in een conische buis van 50 ml. Voeg voldoende CB-medium toe om de bodem van de kolf te bedekken. Schraap met behulp van een celschraper de gehele bodem van de kolf. Verzamel alle media in dezelfde buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 11 minuten op 360 x g .
    4. Resuspendie van de cellen in 2 ml CB-medium. Bewaar de laatste druppel van de pipet in een plaat met 96 putten om te tellen. Verdun de cellen 1:1 in trypan blauw en voeg 10 μL toe aan de hemacytometer, tel en gemiddelde cellen uit vier kwadranten. Bereken het totale aantal CD34+ cellen door het celgetal te vermenigvuldigen met 4 x 104 en noteer de levensvatbaarheid.
    5. Maak n+1 ml vriesmedium, waarbij n het aantal vriesflacons is, berekend in stap 1.3.1. Bereid vriesmedium voor door 10% (v/v) DMSO toe te voegen aan FBS en op ijs te houden. Label de cryovialen met CB#, CD34+ d5 en datum.
    6. Draai de CD34+ cellen op 360 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Zuig het medium aan tot op de pellet en resuspensie de celpellet in vriesmedium. Aliquot 1 ml celsuspensie aan elke injectieflacon en verdeel de restanten gelijkmatig over de injectieflacons. Voeg de injectieflacons toe aan een isopropanolcelvriezer gekoeld tot 4 °C, plaats ze bij -80 °C en breng ze over naar vloeibare stikstof om ze >90 dagen te bewaren.
  4. Bestraling van muizenpups
    1. Verzamel de BRGSB/N pups, 1-3 dagen na de geboorte, in een geautoclaveerde plastic doos met vulling. Voeg een kleine hoeveelheid strooisel toe met de pups. Label de doos met het kooinummer en het aantal pups.
    2. Stel de bestralingstoestel (zie materiaaltabel) in voor een dosis van 300 rad. Zet de doos met pups in de bestralingsmachine en stel ze bloot aan 300 rad. Breng de pups terug naar hun kooi, leg ze op een stapel en bedek ze met beddengoed.
  5. Pup injecties en CD34+ celpreparatie
    1. Begin cd34+ celvoorbereiding ~ 3 uur na bestraling. Verwarm 10 ml CB-media in een conische buis van 50 ml. Voer alle stappen uit in een steriele BSC.
    2. Haal één injectieflacon met in vitro geëxpandeerde en bevroren CD34+ cellen op voor elke vier tot zes pups om te injecteren. Ontdooi snel bij 55 °C, totdat slechts een kleine hoeveelheid ijs zichtbaar is, en voeg de cellen toe aan het verwarmde CB-medium (de injectieflacon moet nog steeds koel aanvoelen.) Gebruik 1 ml medium om elke injectieflacon af te spoelen en draai de cellen gedurende 12 minuten bij 4 °C op 360 x g .
      OPMERKING: Snel ontdooien bij 55 °C bleek een betere levensvatbaarheid van de cellen op te leveren (90%-95%) dan ontdooien bij 37 °C.
    3. Zuig het medium voorzichtig op. Resuspendie de (kleine) pellet in 2 ml CB-media, meng voorzichtig en voeg ~ 30 μL van de celsuspensie toe aan een enkele put in een telplaat. Verdun 1:1 in trypan blauw, voeg vervolgens 10 μL toe aan een hemocytometer en tel en gemiddeld de cellen uit vier kwadranten.
    4. Bereken het totale aantal CD34+ cellen door het celgetal te vermenigvuldigen met 4 x 104 en noteer vervolgens de levensvatbaarheid. Draai op 360 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C.
    5. Zuig het medium voorzichtig op en resuspendien de celkorrel in 100 μL steriele PBS per n+1 pups om te injecteren, wat resulteert in 250.000-450.000 CD34+ cellen per muis. Plaats de conische buis op ijs in een transportcontainer en reis naar het vivarium voor pupinjectie.
    6. Breng een warmtelamp, luiers, 1 ml spuit, 18 G naald, 30 G naald en het CD34+ celpreparaat in steriele containers naar het vivarium BSC. Plaats een steriele luier ~ 2 ft onder de warmtelamp. Haal de kooi met het te injecteren strooisel op en plaats in de BSC.
    7. Monteer de spuit met een afgeschuinde naald van 18 G. Stem de hoek van de conische buis af op de schuine kant van de naald, meng en trek de celsuspensie voorzichtig op. Leg de pups op de luier om op te warmen (let op oververhitting). Verwijder lucht uit de spuit en vervang de naald van 18 G door de naald van 30 G en duw vervolgens voorzichtig op de spuit totdat de celsuspensie net aan de punt van de naald zit.
      OPMERKING: Als alternatief kan een insulinespuit worden gebruikt.
    8. Neem één pup tegelijk mee naar de rand van de luier, weg van de warmtelamp. Immobiliseer de pup op zijn zij onder de duim en wijsvinger, waardoor een duidelijk zicht op het gezicht ontstaat. Let op de ader over de wang onder waar het oor zal zijn. Steek de naald ondiep in de ader (IV) die zich het dichtst bij het oog bevindt en injecteer langzaam 50 μL cellen.
    9. Controleer of er een bel wordt gevormd door een subcutane injectie. Als dat het geval is, steekt u de naald dieper in en gaat u verder met het injecteren van cellen. Een kleine druppel bloed/hematoom zal zichtbaar zijn wanneer dit lukt.
      OPMERKING: Raadpleeg de procedure van Gombash Lampe et al.24 met betrekking tot het injecteren van pups.
    10. Terwijl de pup nog steeds geïmmobiliseerd is, voert u een intrahepatische injectie (IH) uit met nog eens 50 μL cellen (100 μL totaal per pup IV + IH). De lever kan worden gevisualiseerd als een donkere vlek tussen de witte melkband en de thoracale kooi. Plaats de geïnjecteerde pup op een luier verder weg van de niet-geïnjecteerde pups en warmte.
      OPMERKING: IV-injectie resulteert in een beter chimerisme op lange termijn dan IH-injectie alleen25, maar IV-injecties zijn niet altijd succesvol. Daarom zorgt het splitsen van de injectie tussen IV en IH voor engraftment in een groter percentage muizen.
    11. Herhaal zowel gezichtsader- als IH-injecties voor alle pups. Reinig al het bloed, breng pups terug naar het nest in hun kooi en bedek met beddengoed.

2. Testen van menselijk chimerisme in bloed

  1. Test chimerisme in het bloed van HIS-muizen op de leeftijd van zowel 10 als 14 weken. Verzamel 50 μL bloed via de retro-orbitale ader of met behulp van een alternatieve IACUC-goedgekeurde methode.
    1. Voor retro-orbitale bloedingen, verdoven muizen met een isofluraan vaporizer ingesteld op 5 gedurende 1-2 minuten en zet vervolgens de verdamper ingesteld op 4. Zet de verdamper zo nodig lager om muizen voldoende zuurstofrijk te laten blijven terwijl ze onder narcose zijn. Houd de muizen niet langer dan 5 minuten onder isofluraan.
    2. Plaats de neus van de verdoofde muis in de isofluraan verdamper neuskegelbevestiging en plaats een druppel van het analgeticum (0,5% proparacaïne HCl oftalmische oplossing USP) op het oog.
    3. Verwijder na 1 minuut de proparacaïne met behulp van een steriel gaasje, proptose het oog en breng een 75 mm gehepariniseerde hematocrietbuis retro-orbitaal in om 50 μL bloed te verzamelen. Werp het bloed uit in een microfugebuis van 1,5 ml met 50 μL heparine en meng voorzichtig.
    4. Knijp het oog dicht met steriel gaas om het bloeden te stoppen en breng een druppel proparacaïne aan. Verwijder de muis uit isofluraan en herstel in een schone kooi.
  2. PBMC-isolatie uit muizenbloed
    1. Meng het bloed / heparine door zachtjes op en neer te pipetteren en langzaam over de top van 500 μL van 1,077 g / ml dichtheidsgradiënt te leggen, waarbij u voorzichtig bent om de interface niet te verstoren. Centrifugeer de buizen op 1.220 x g gedurende 20 minuten bij RT zonder remmen.
    2. Visualiseer de cellulaire buffy coat als een troebele laag bovenop de 1.077 g / ml dichtheidsgradiënt, onder het plasma. Verwijder zoveel mogelijk van de cellen uit de buffy coat met een pipet van 200 μL en voeg toe aan nieuwe buizen van 1,5 ml met 750 μL oogstmedium. Centrifugeer op 360 x g gedurende 11 min bij RT.
    3. Zuig het medium aan tot 50 μL en resuspensie van de pellet in 750 μL oogstmedium. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 360 x g bij 4 °C en zuig opnieuw af tot 50 μl. De cellen zijn klaar om te worden geresuspendeerd in de oppervlaktevlek.
  3. Oppervlaktekleuring en flowcytometrische analyse
    1. Vul het werkblad van het kleurpaneel in (tabel 1; "spectral flow bleed panel" werkblad) met muisnummers en bereid de antilichaamkleuringscocktail voor door alle fluorescerende antilichamen toe te voegen aan de kleuringsbuffer (aanvullend bestand 1). Maak een plaatindeling om de monsters toe te voegen aan een U-bodemplaat met 96 putten. Markeer de bodems van putten met behulp van een permanente markering. Titreerantistoffen met behulp van een standaardprocedure voorafgaand aan kleuring om de juiste concentratie te bepalen26.
    2. Voeg 62 μL van de oppervlaktevlekcocktail toe aan elk putje van de 96-well U-bodemplaat. Resuspendien de cellen in de resterende 50 μL in de buis en voeg elk monster toe aan de overeenkomstige put. Voeg een put toe voor een positieve kleuringscontrole (menselijke PBMC's + muizensplenocyten, 1 x 106 cellen elk) om naast de monsters te kleuren. Meng door pipetteren en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    3. Centrifugeer bij 680 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Veeg de plaat uit in de gootsteen om het supernatant te verwijderen en was de cellen door opnieuw te suspensiëren in 150 μL kleuringsbuffer door voorzichtig ~ 10x te pipetteren. Draai en resuspensie van elke put in 150 μL kleuringsbuffer.
    4. Verkrijg de gegevens voor 100 μL van elk monster op een flowcytometer (zie materiaaltabel) en exporteer de FCS-bestanden. Importeer de FCS-bestanden naar de software voor het bewerken van stroomgegevens (zie Materiaaltabel). Pas een polygoonpoort toe op een FSC-A x SSC-A-plot rond de cellen, met uitzondering van vuil. Selecteer de cellen binnen de poort (zie tabel 1; werkblad "spectral flow bleed gating").
    5. Verander de assen in (FSC-A x FSC-H) en gat de cellen op de lineaire diagonaal met uitzondering van de doubletten die uit de lijn steken. Selecteer deze cellen en wijzig de assen in (hCD45 x mCD45).
    6. Pas een polygoonpoort toe op de hCD45+ populatie en pas de naam "mens" toe. Pas een polygoonpoort toe op de mCD45+ populatie en pas de naam "muis" toe. Maak een telstatistiek voor zowel de menselijke als de muizenpopulatie.
    7. Selecteer de menselijke populatie en verander de assen in (CD19 x CD3). Pas een polygoonpoort toe op de CD19+ cellen en noem deze "B-cellen". Pas een polygoonpoort toe op de CD3+ populatie en noem deze "T-cellen". Pas een polygoonpoort toe op de dubbele negatieve populatie en noem deze "NonTB".
    8. Selecteer de T-celpopulatie en wijzig de assen in (CD8 x CD4). Pas een polygoonpoort toe op de CD4- en CD8-positieve populaties en noem ze respectievelijk "CD4+" en "CD8+".
    9. Selecteer de NonTB-populatie en wijzig de assen in (CD56 x myeloïde). Pas een polygoonpoort toe op de totale CD56-positieve populatie inclusief de dubbele positieve gebeurtenissen en noem deze "NK-cellen". Pas een polygoonpoort toe op de CD56-negatieve en myeloïde positieve populatie en noem deze "myeloïde".
    10. Maak een tabel voor de percentage- en telstatistieken van alle populaties en exporteer deze naar spreadsheetsoftware (zie Materiaaltabel). Bereken %hCD45 chimerisme = %hCD45/(%hCD45 + mCD45).
    11. Sluit HIS-muizen uit die <20% hCD45+ (van mCD45 + hCD45) zijn voor verdere experimenten.
      OPMERKING: In deze studie werden PBMC's bereid met behulp van een gradiëntscheiding met een dichtheid van 1,077 g / ml voor een schonere RBC-depletie. Deze procedure sloot menselijke en muisgranulocyten uit van de PBMC-laag. Als alternatief kan RBC-lysis worden gebruikt.

3. Injectie van tumoren in muizen

  1. Bevestig voorafgaand aan de tumorinjectie het aantal T-cellen uit de 14 weken durende bloedingsgegevens. Tumoren worden geïnjecteerd om klaar te zijn voor de oogst tussen 20-26 weken als de T-cellen >20% zijn, en tussen 24-28 weken als de T-cellen <20% van de totale immuuncelpopulatie zijn. Deze injectietiming zorgt ervoor dat de muizen 20-28 weken oud zijn en aan het einde van het onderzoek voldoende T-cellen hebben.
  2. Injectie van van cellijn afgeleide xenografts (CDX)
    OPMERKING: De procedure wordt beschreven met MDA-MB-231 adenocarcinoomcellen van de borst (zie materiaaltabel) als voorbeeld.
    1. Ontdooi een hoeveelheid bevroren cellen, was 1x door resuspensie in 10 ml DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% PenStrep en 1% niet-essentiële aminozuren, en centrifugeer op 360 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Zuig het medium aan en resuspensie in 10 ml DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% PenStrep en 1% niet-essentiële aminozuren in een T25-kolf en incubeer bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: De cellijnen worden geverifieerd door PCR om het juiste celtype te garanderen. Celsupernatanten worden vóór injectie getest op mycoplasma via een biochemische test.
    2. Passage en uitbreiding van de cellen tijdens exponentiële groeifase bij ongeveer 80% confluentie.
      1. Zuig het medium op, spoel de cellen met 5-10 ml steriele PBS (pH 7,2) en incubeer met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 1-5 minuten totdat de cellen loskomen van de kolf.
      2. Voeg 5 ml van dezelfde DMEM toe en meng door op en neer te pipetteren. Breng de volledige 6 ml celsuspensie in een nieuwe weefselkweekkolf met T75 (1:3 verdunning) en voeg nog eens 10 ml DMEM toe.
      3. Passeer de cellen om de 2-3 dagen bij 80% confluentie bij 1:3 verdunningsplating in DMEM om de cellen uit te breiden.
    3. Oogst de cellen met 0,25% trypsine-EDTA tijdens de exponentiële groeifase binnen zes passages en was met PBS. Meng PBS en keldermembraanextract (zie materiaaltabel) in een verhouding van 1:1 en voeg toe aan de cellen in een eindconcentratie van 5 x 107 cellen/ml.
    4. Verdoof de muizen met isofluraan zoals beschreven in stap 2.1.1. Injecteer subcutaan 100 μL (5 x 106 cellen) tumorcelsuspensie in elke flank met behulp van een naald van 23 G.
  3. Voer injectie uit van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) met behulp van trocars. De injectieprocedure en andere ontwikkelings- en onderhoudsinstructies voor het PDX-model zijn beschikbaar in literatuur27.

4. Tumorgroei meting

  1. Controleer de voortgang van de tumor eenmaal per week na implantatie door langs de flank te voelen voor tumorgroei. Zodra de tumoren voelbaar zijn, verdooft u de muizen met isofluraan (zoals beschreven in stap 2.1.1) en scheert u op elke flank met een elektrische trimmer, waarbij u rond de tumor zorgt om ulceraties te voorkomen terwijl de tumor groeit.
    OPMERKING: Muizen kunnen worden geschoren vóór tumorinjectie om verwondingen aan de huid rond de tumoren te voorkomen; de snelheid van haargroei kan echter tumormetingen belemmeren.
  2. Meet de lengte en breedte van de tumoren twee keer per week met behulp van remklauwen en noteer de metingen in mm. Rapporteer tumormetingen als tumorvolume (mm3) met behulp van de formule Equation 1. Zorg ervoor dat de tumorlast niet groter is dan 2.000 mm 3 per enkele tumor of een gecombineerd volume van 3.000 mm3.
    OPMERKING: Richtlijnen voor het gebruik van muizen in kankeronderzoek verschillen per locatie. Raadpleeg het beleid voor dierverzorging en -gebruik bij de instelling van de onderzoeker.

5. Medicamenteuze behandelingen

  1. Wijs de HIS-muizen toe in gelijkwaardige behandelingsgroepen op basis van hCD45-chimerisme, hCD3-chimerisme en hCD8-chimerisme. Zodra de tumoren gemiddeld 100 mm3 bereiken, begint u met medicamenteuze behandelingen.
    OPMERKING: Het aantal muizen per groep is gebaseerd op het aantal HIS-muizen dat wordt gegenereerd uit de CB. Een minimum van vier muizen per groep wordt aanbevolen. Niet-bipartiete multigroepsmatching (bijv. in R-vivo Manila-software) is nuttig voor deze groepering28.
  2. Route en frequentie van geneesmiddelen
    1. Injecteer anti-PD-1-remmers (nivolumab, pembrolizumab) intraperitonisch (i.p.) bij 30 mg/kg 1x per week of 20 mg/kg 2x per week voor enkelvoudige behandelingen, of 10-15 mg/kg 2x per week voor combinatiebehandelingen.
    2. Doseer de combinatietherapieën, zoals gerichte therapieën, chemotherapieën en bestraling, in overeenstemming met het experimentele ontwerp. Gerichte therapieën en chemotherapieën kunnen worden gegeven via orale maagsonde, i.p. injectie of voedsel.
      OPMERKING: Doses kunnen worden gevarieerd en geoptimaliseerd op basis van gepubliceerde gegevens en het tumormodel. Dosisstudies worden vaak getest bij immunodeficiënte ontvangers voorafgaand aan HIS-muisstudies.
  3. Controleer de muizen minstens 3x per week op gezondheidsveranderingen zoals gewichtsverlies, losse uitwerpselen, gebogen houding, verminderde mobiliteit en vachtverlies. Sommige symptomen kunnen tekenen zijn van geneesmiddeltoxiciteit of GVHD, en de dosering van geneesmiddelen moet mogelijk worden verminderd of gestopt. Euthanaseer muizen indien nodig volgens het beleid voor dierverzorging en gebruik.

6. Oogsten van muizenweefsels en tumoren aan het einde van het onderzoek

  1. Euthanaseer de muizen afzonderlijk volgens institutionele en veterinaire richtlijnen met behulp van gecomprimeerd CO 2-gas met een stroomsnelheid van 2,75 l / min. Controleer de muizen die gedurende 1 minuut na de dood in CO2 worden gehouden en voer vervolgens cervicale dislocatie uit als een secundaire vorm van euthanasie.
  2. Bloedafname
    1. Bloed verzamelen via intracardiale punctie. Houd de muis rechtop en steek een spuit van 1 ml met een naald van 25 G rechtstreeks in het hart vanaf een lijn net links van de middellijn en onder de ribben. Verzamel het bloed in een spuit, idealiter door één lange trek en breng het over in een gelabelde buis van 1,5 ml.
      OPMERKING: Extra naaldinbrengingen kunnen worden uitgevoerd om extra bloed uit de hoeken van de longholte met zorg te verzamelen.
    2. Laat het bloed gedurende 1 uur bij 4 °C staan en centrifugeer het bloed vervolgens gedurende 6 minuten in een microcentrifuge bij 7.800 x g. Verzamel de heldere vloeistof (sera) boven de bloedinterface in een tweede schone en gelabelde buis van 1,5 ml. Bewaar het serum bij -20 °C voor downstream-analyse, zoals ontstekingscytokine- of immunoglobulinetiters bij mens en muis.
  3. Weefseldissectie
    1. Na de injectie en groei van tumorcellen in de muizen en het toedienen van medicamenteuze behandelingen, oogst de weefsels. Plaats de muizen op een schuimsnijplaat, met pinnen om ze op hun plaats te houden, en de armen en benen strekken zich uit in een hoek van 45°. Maak een incisie in het midden van de romp, beginnend bij het bekken en zich uitstrekkend tot de kin, in een poging om te voorkomen dat het peritoneum wordt doorgesneden (hoewel dit niet essentieel is). Trek de huid naar de rand en houd deze op zijn plaats met pinnen.
    2. Extraheer de lymfeklieren (LN's) met behulp van een fijne tang in de volgende volgorde: inguinaal, oksel, cervicaal, mesenterisch, hiataal.
      OPMERKING: Bij ZIJN muizen zijn de LN's vaak erg klein, lijken ze op anlage of "ontstoken" met een duidelijk uiterlijk dat verschilt van dat van een wild-type muis. Daarom wordt weefsel dat lijkt op LN's van elke site genomen. De perifere LN's verschijnen vaak als met vloeistof gevulde "ballen", terwijl de mesenteriale LN's dichter zijn. De mesenteriale LN's zijn het meest voor de hand liggend en consistent en worden waargenomen als een of twee verschillende dichtere knooppunten, in tegenstelling tot een string.
    3. Plaats de LN's aan één kant van matglazen glaasjes in 8 ml oogstmedium in een petrischaaltje. Houd de dia's loodrecht met de matranden naar binnen en druk zachtjes op de weefsels totdat de cellulaire inhoud wordt vrijgegeven.
    4. Spoel de glaasjes meerdere keren af door ze uit elkaar te trekken en samen om het maximale aantal cellen vrij te maken. Verzamel de cellen met een 5 in glazen pipet en filter ze door een 9 in katoenen pipet in een gelabelde 15 ml conische buis.
    5. Haal de milt uit de linkerbovenhoek van de buik met behulp van twee paar tangen of een tang en schaar. Let op de grootte van de milt als een schatting van het volume van resuspensiemedia. Verzamel en filter de milt door mechanische vergisting met behulp van matglazen dia's, zoals bij de LN's.
      OPMERKING: Elke techniek voor de bereiding van weefsels voor suspensies met één cel kan worden gebruikt.
    6. Voer het tellen en resuspensie van de cellen uit weefselmonsters uit zoals hieronder beschreven.
      1. Centrifugeer de lymfecellen bij 360 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Zuig de vloeistof aan en resuspensie de celkorrel in 1 ml oogstmedium met DNase.
      2. Verwijder erytrocyten uit de miltcellen door gedurende 3 minuten te broeden met 3 ml ACK-lysisbuffer bij RT, gevolgd door de toevoeging van 10 ml oogstmedium / DNase. Centrifugeer de miltcellen opnieuw, zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 1-10 ml oogstmedia / DNase, op basis van de miltgrootte (bijvoorbeeld 1 ml voor zeer kleine milten en tot 10 ml voor de grootste milt).
      3. Voeg een aliquot van 10 μL celsuspensie toe aan 90 μL media en reken op een hemocytometer. Centrifugeer de LN's en miltcellen, zuig de supernatanten op en resuspensie de cellen in het oogstmedium in een concentratie van 1 x 108 cellen/ml, of minimaal 80 μl.
    7. Extraheer de tumoren.
      1. Verwijder de tumor van de open flank door de tumor met een tang vast te houden terwijl u langzaam met een dissectieschaar aan de tumorranden knipt.
      2. Zodra de tumor is verwijderd, weegt u deze en verwijdert u 1/4 voor RNA- en immunohistochemie (IHC) -verwerking. Verdeel de 1/4 tumor in tweeën; plaats de ene helft (1/8 van de hele tumor) in een cryovial, flash freeze in vloeistof N2 en bewaar bij -80 °C voor downstream genomisch onderzoek.
      3. Plaats de andere 1/8 van de tumor in een gelabeld monsterbuis met 10% formaline. Spoel de volgende dag het weefsel af en resuspensie in 70% ethanol tot toekomstig gebruik. Plaats de resterende 3/4 van de tumor in een schaal van 6 cm en hak in stukjes van ~ 1 mm met behulp van een scalpelmesje.
      4. Transporteer de tumorstukken in een dissociatiebuis (zie tabel met materialen), spoel de schaal met 5 ml onvolledig tumorinfiltrerend leukocyt (TIL) -medium en voeg toe aan de dissociatiebuis.
        OPMERKING: Voor tumoren met een gewicht van >0,4 g, spoel de schaal met 10 ml TIL onvolledige media en voeg toe aan dissociatiebuis.
      5. Voeg collagenasepreparaat (zie materiaaltabel) in een eindconcentratie van 50 mg/ml toe aan het weefsel in de dissociatiebuis. Dissocieer het weefsel met behulp van mechanische dissociatie bij 37 °C gedurende 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de stevigheid van de tumor.
      6. Laat na dissociatie de suspensie over een filter van 100 μm in een conische buis van 50 ml gaan en spoel het filter af met 10 ml TIL-volledige media. Het serum in deze media stopt de collagenasereactie en beschermt de cellen tegen verdere afbraak.
      7. Centrifugeer de eencellige suspensie gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 360 x g . Resuspendie van de pellet in net genoeg oogstmedium met DNase, zodat de celsuspensie gemakkelijk door een P1000-pipetpunt kan gaan en het volume kan registreren voor downstream-analyse.
        OPMERKING: Een kleiner volume verhoogt de verzameling tumorimmuuncellen, maar is gevoeliger voor flowcytometerklompen.

7. Celkleuring en flowcytometrische analyses

  1. Vlekvoorbereiding en celplating
    1. Bereid kleuringscocktails voor: Voeg op de dag van de oogst het aantal monsters toe aan het vlekkenwerkblad (tabel 2; "Conventional Flow A panel", "Spectral Flow B panel" en "Conventional Flow C panel" werkbladen) voor alle vlekken en afdrukken. Bereid oppervlaktevlekcocktails voor vlekken A en B in kleurbuffer (SB) door elk antilichaam afzonderlijk toe te voegen met een nieuwe punt, elk reagens onderweg af te markeren en bij 4 °C te bewaren totdat het nodig is. Bereid de juiste levensvatbaarheidskleurstoffen in azidevrije PBS en bewaar bij 4 °C totdat ze nodig zijn (warm tot RT voor gebruik). Bereid oppervlaktevlek C-cocktail op dag 2 in SB samen met intracellulaire vlekken B en C in hun respectieve permeabilisatiebuffers.
    2. Maak een plaatindeling voor alle monsters in het kleuringswerkblad en aliquoteer 100 μL azidevrije PBS naar de putten. Neem niet-gekleurde controles op voor elk weefsel en elke kleuring (voor spectrale cytometrie).
    3. Voeg de cellen toe aan 96-putplaten met 50 μL PBS. Voor kleuring A resuspendeert u elke weefselgroep in het juiste volume, zoals vermeld op het kleuringswerkblad, en bewaart u bij 4 °C totdat deze op dezelfde dag op de flowcytometer is verkregen. Voeg voor vlekken B en C 25 μL lymfe en 60 μL niet-lymfeweefselcelsuspensies toe aan de putjes met PBS.
    4. Voer in vitro stimulatie van cytokines uit voor detectie door intracellulaire kleuring met behulp van kleuring C.
      1. Centrifugeer de beits C 96-putplaat van stap 7.1.3 bij 680 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Voeg 200 μL til complete media (RPMI 1640, 10 mM HEPES [pH 7], 10% FBS) toe aan elke put. Bewaar de plaat met de celsuspensie een nacht bij 4 °C.
      2. Verdun de volgende ochtend vroeg de celstimulatiecocktail (zie materiaaltabel) 1:500 in volledige TIL-media. Centrifugeer de plaat met de celsuspensie op 680 x g om de cellen te pelleteren en veeg om de media te verwijderen. Resuspendeer de cellen in 200 μL van de bereide celstimulatiecocktail en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
      3. Voeg 25 μL eiwittransportremmeroplossing met monensine toe in een verdunning van 1:1.000 in volledige TIL-media, meng de cellen en incubeer bij 37 °C gedurende nog eens 4 uur om intracellulaire accumulatie van cytokines mogelijk te maken.
    5. Celkleuring uitvoeren.
      1. Voor vlekken A en B (dag 1) en voor vlek C (dag 2) centrifugeer bij 680 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Veeg de platen en voeg de juiste levensvatbaarheidskleurstoffen toe aan de putten. Meng goed door voorzichtig op en neer te pipetteren met een meerkanaalspipet en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
      2. Centrifugeer de platen (zoals in stap 7.1.5.1), voeg vervolgens de juiste oppervlaktevlekken toe aan de platen en meng voorzichtig door te pipetteren met een meerkanaals pipet. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C en centrifugeer opnieuw. Veeg over de platen, was de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren met 150 μL SB en centrifugeer.
      3. Veeg over de platen, herhaal de was door voorzichtig op en neer te pipetteren met 150 μL SB en centrifugeer op 680 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Voor kleuring A resuspendeert u elke weefselgroep in het juiste volume, zoals vermeld op het kleuringswerkblad, en bewaart u deze bij 4 °C. Voor vlek B, fixeren met FoxP3 transcriptiefactor kit fixatief (zie Tabel van materialen) gedurende 30 minuten bij RT. Voor vlek C, fixeren in 1% (v / v) paraformaldehyde in SB gedurende 30 minuten bij RT.
      4. Centrifugeer de vaste platen op 480 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Was 1x in SB. Voor Vlek B kunnen de cellen een nacht worden achtergelaten.
      5. Permeabiliseer de cellen: resuspendien de putjes in 150 μL van FoxP3 transcriptiefactor kit permeabilisatiebuffer voor kleuring B en in 0,5% (w/v) saponine in SB voor kleuring C. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT. Centrifugeer de vaste platen op 480 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
      6. Veeg over de borden en voeg de respectievelijke intracellulaire kleuringscocktails toe voor vlek B en vlek C. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
      7. Centrifugeer de vaste platen op 480 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C en veeg de platen. Was de cellen met 150 μL van de overeenkomstige permeabilisatiebuffers (kleuring B, FoxP3 transcriptiefactorkit permeabilisatiebuffer; kleuring C, saponine).
      8. Veeg de platen en was door op en neer te pipetteren in 150 μL SB. Centrifugeer op 480 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Veeg over de platen en resuspensie van de cellen in SB per weefselgroep in de juiste volumes die op het kleuringswerkblad zijn vermeld.
        OPMERKING: De monsters zijn nu klaar voor acquisitie door spectrale flowcytometrie.
      9. Stel de flowcytometer (zie materiaaltabel) in met geschikte enkele gekleurde controles voor elke vlek en niet-gekleurde monsters voor elke weefselgroep om rekening te houden met verschillen in autofluorescentie tijdens het mengen. Verkrijg de juiste volumes per weefselgroep zoals gedefinieerd in het kleuringswerkblad (tabel 2) en exporteer de FCS-bestanden.
  2. Flowcytometrie data-analyse
    1. Maak met behulp van de flowcytometrie-analysesoftware (zie Materiaaltabel) een nieuwe werkruimte. Maak nieuwe groepen voor elk orgaan (LN, milt en TIL). Importeer de FCS-bestanden voor elk orgaan in de groep.
    2. Maak een bivariate dot plot, stel de assen in op (FSC-A x SSC-A) en pas een polygoonpoort toe op cellulaire gebeurtenissen, waarbij gebeurtenissen aan de randen (alle cellen gate) worden vermeden. Selecteer de cellulaire gebeurtenissen, wijzig de assen in (FSC-A x FSC-H) en pas een polygoonpoort toe op de gebeurtenissen op de lineaire diagonaal, met uitzondering van gebeurtenissen die afwijken van de diagonaal om de "singlets" -poort te genereren. Selecteer de "singlets" gate en verander de assen in (hCD45 x mCD45). Pas polygoonpoorten toe op de positieve gebeurtenissen hCD45 en mCD45 en noem ze respectievelijk "mens" en "muis".
    3. Selecteer de menselijke populatie en verander de Y-as in Live/Dead Aqua. Pas een polygoonpoort toe op de Live/Dead negatieve, hCD45 positieve populatie en noem het "levend mens". Selecteer de muizenpopulatie en wijzig de X-as in Live/Dead Aqua. Pas een polygoonpoort toe op de Live/Dead negatieve, mCD45 positieve populatie en noem deze "live mouse".
    4. Selecteer op dezelfde manier de bovenliggende poort en de X- en Y-assen zoals beschreven in de werkbladen "Conventional Flow A Gating", "Spectral Flow B Gating" en "Conventional Flow C Gating" (tabel 2) om de aangegeven populaties te isoleren (bijv. Menselijke B-cellen, geactiveerde T-cellen).
      OPMERKING: Representatieve gating voor elke vlek (Bleed, A, B, C) is opgenomen in Aanvullend Bestand 2.
    5. Maak tel- en frequentie-exporttabellen in de flowcytometrie-analysesoftware voor alle populaties en exporteer naar een spreadsheetsoftware. De ouderpopulatie voor frequenties is aangegeven in tabel 2.
    6. Gebruik de gegevens om grafieken te genereren op basis van experimentele behandelingsgroepen.
      OPMERKING: De gegevens kunnen ook worden geanalyseerd met behulp van R-pakketten in de analysesoftware. Een enkel .fcs-bestand van alle te analyseren monsters kan worden gemaakt met behulp van de aaneengeschakelde functie. Deze gegevens kunnen dimensionaal worden verminderd met het T-SNE-algoritme terwijl trefwoordparameters voor weefseltype en behandelingsgroep worden toegevoegd. Het FlowSOM-algoritme kan vervolgens worden gebruikt om populaties te clusteren en de ClusterExplorer-tool kan worden gebruikt om de populaties te identificeren. Nieuwe celpopulaties kunnen op deze manier worden geïdentificeerd, visueel worden vergeleken en gekwantificeerd tussen behandelingsgroepen of in verschillende weefsels.
    7. Correleer immuunparameters voor tumoren binnen dezelfde behandelingsgroep, met de groei voor die tumor om immunotypen te definiëren die correleren met tumorgroeiremming. Kwantificeer tumorgroei door de specifieke groeisnelheid (SGR) voor die tumor, een meting die rekening houdt met het verschil in tumorvolumes gedurende een bepaalde tijd. Deze meting normaliseert tumoren die op verschillende dagen worden geoogst vanwege de gezondheid van muizen en de startdata van de behandeling.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Volgens het flanktumorprotocol en de experimentele tijdlijn (figuur 1) werden de tumorgroei en immuunrespons op een gerichte tyrosinekinaseremmer (TKI) therapie en nivolumab-combinatiebehandeling bestudeerd in twee verschillende humane colorectale kanker (CRC) PDX's. De TKI-geneesmiddelen zijn onderzocht in immunodeficiënte gastheren om tumorgroei slechts29 te evalueren. Dit model maakte het mogelijk om veranderingen in de immuunrespons van het TKI alleen te bestuderen, en nog belangrijker, in combinatie met anti-PD-1. Deze studie was gericht op de combinatie behandelde cohorten in twee verschillende experimenten die een succesvolle evaluatie vertegenwoordigen met behulp van HIS-BRGS-muizen en een technisch gebrekkig experiment. Voor PDX CRC307P vertraagde de combinatiebehandeling de groei van de tumor, zoals bepaald door tumorgroeivolumes in de loop van de tijd, tumorgewichten bij de oogst en de SGR (figuur 2A-C). Aan de andere kant werd de groei van een PDX ontwikkeld uit een gemetastaseerde tumor van dezelfde patiënt, PDX CRC307M, getest in een ander cohort van HIS-BRGS-muizen, minder beïnvloed door dezelfde combinatiebehandeling bij HIS-BRGS-muizen (figuur 2D).

Ondanks de toewijzing van HIS-BRGS-muizen in equivalente experimentele groepen op basis van algemeen humaan (hCD45+) en humaan T-cel (hCD3+) chimerisme in het bloed voorafgaand aan tumorimplantatie (figuur 3A-C), namen beide parameters toe in het perifere immuunsysteem (milt) en de tumor-infiltrerende leukocyten (TIL) in combinatie behandelde CRC307P-dragende muizen, maar niet het CRC307M-model (figuur 3D-F ). Met name, hoewel beide HIS-BRGS-cohorten vergelijkbaar humaan en T-cel chimerisme in het bloed hadden voorafgaand aan tumorimplantatie, had het CRC307M-cohort zeer weinig lymfeklierchimerisme en slaagde er niet in om merkbare niveaus van T-cellen in de milt in het behandelde cohort te ontwikkelen (figuur 3D-F). Het CRC307M-experiment vertegenwoordigt een technisch gebrekkig voorbeeld als gevolg van over het algemeen onvoldoende milt T-cel chimerisme en lymfeklier chimerisme. We stellen de uitsluiting voor van HIS-muizen met <20% hCD3+ chimerisme in de milt en/of <1,5 x 106 hCD45+ cellen in de lymfeklieren aan het einde van het onderzoek. Voor het CRC307M-model werd de meerderheid van de muizen uitgesloten, meestal vanwege zeer kleine lymfeklieren, waardoor er slechts twee muizen per cohort overbleven.

Verder onderzoek van de menselijke T-cellen (figuur 4A) onthulde meer geactiveerde (HLA-DR +) T-cellen in de CR307P-tumoren, maar niet de lymfe, van met combinatie behandelde muizen (figuur 4B). In het CRC307M "negatieve" experiment was er geen significante toename van HLA-DR + T-cellen in de TILs van behandelde HIS-BRGS-muizen bij het analyseren van alle muizen, wat suggereert dat dit niet-optimale HIS-BRGS-cohort de gegevensbetekenis beïnvloedde vanwege HIS-muizen met zeer weinig T-cellen en geen activering (figuur 4B). Inderdaad, de toename van HLA-DR + T-cellen in de TILs in het CRC307M-model bereikte significantie bij het uitsluiten van de HIS-BRGS-muizen met een laag T-celchimerisme (figuur 4B). Bovendien waren er meer effectorgeheugen CD8+ T-cellen en minder TIM-3+ (terminaal uitgeputte) T-cellen in de met combinatie behandelde CRC307P-tumoren, terwijl dit verschil niet werd opgemerkt in het CRC307M-model (figuur 4C,D). In dit experiment werden geen veranderingen in de frequenties van cytotoxische T-cellen (Granzyme B + of IFN + TNF + TNFα +) populaties waargenomen bij de met combinatie behandelde muizen, hoewel hogere cytotoxische T-cellen werden waargenomen in onbehandelde (figuur 4E) of behandelde (gegevens niet getoond) tumoren ten opzichte van lymfeklieren. Belangrijk is dat, hoewel er geen verschillen in frequenties waren tussen de T-celpopulaties, hogere aantallen cytotoxische T-cellen werden waargenomen in de tumoren van behandelde HIS-CRC307P-BRGS-muizen, met hogere frequenties (figuur 3B) en aantallen menselijke T-cellen in de tumoren. Aan de andere kant toonde deze combinatiebehandeling geen effect op de frequenties van Tregs in CRC307P-lymfeorganen of tumoren, hoewel de CRC307M-gegevens een trend van verminderde Tregs vertoonden die in een ander experiment zou moeten worden gevalideerd (figuur 4F).

Naast het ondervragen van het menselijk immuunsysteem, werden immuungerelateerde veranderingen op tumorcellen ook geëvalueerd met behulp van flowcytometrie (figuur 5A). Door gating op EpCAM+ cellen, zoals beschreven in het protocol, werd een verhoogde expressie van zowel MHC Klasse I (HLA-ABC) als Klasse II (HLA-DR) gevonden op de CRC307P tumorcellen die werden weggesneden uit met combinatie behandelde HIS-BRGS muizen (Figuur 5B). In het CRC307M-model veroorzaakte dezelfde medicamenteuze behandeling HLA Klasse II-expressie op de tumorcellen, hoewel in mindere mate dan in het CRC307P-model (figuur 5C). De combinatiebehandeling lijkt dus upregulatie van MHC-klasse II te induceren, onafhankelijk van T-celinfiltratie (figuur 5B,C). Met name de MHC-expressie op de tumorcellen was lager dan die op menselijke immuuncellen, een bevinding die consistent is met menselijke tumorrapporten (figuur 5B). Evenzo resulteerde de combinatiebehandeling in verhoogde PD-L1-expressie op de EpCAM+ CRC307P-tumorcellen (figuur 5D).

Ten slotte werden correlaties van immuunresponsen met tumorgroei onderzocht door de SGR van de tumor versus immuunparameters uit te zetten. Hoewel de frequentie van CD4+ T-cellen in de tumoren van onbehandelde muizen geen correlatie vertoonde met tumorgroei, vertoonden verhoogde CD4+ T-cellen een significante (figuur 6A) correlatie met kleinere tumorgroei, en meer specifiek de HLA-DR+ geactiveerde T-cellen (figuur 6B), in de combinatie behandelde HIS-muizen.

Figure 1
Figuur 1: Schematische illustratie van de generatie van HIS-BRGS-muizen en implantatie van menselijke CDX- of PDX-tumoren voor kankerimmunotherapiestudies. De tijdlijn is belangrijk om de aanwezigheid van T-cellen te garanderen die maanden nodig hebben om te enten in de CB-afgeleide HIS-muizen. Gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Analyse van tumorgroei. Tumorgroeimetingen voor CRC307P PDX in controle (zwart) of combinatie behandelde (rode) HIS-BRGS-muizen gekwantificeerd door (A) volume in de loop van de tijd, (B) gewichten aan het einde van het onderzoek, of (C) specifieke groeisnelheid (SGR). (D) SGR's voor CRC307M PDX. Gegevens omvatten tumoren geïmplanteerd in beide flanken van zes voertuig HIS-BRGS-muizen, zeven combinatie-behandelde BRGS-muizen voor CRC307P, en slechts twee voertuig- en combinatie-behandelde muizen voor CRC307M vanwege hoge uitsluitingspercentages. Statistische analyses tussen twee onafhankelijke groepen werden uitgevoerd met behulp van ongepaarde, parametrische twee-groep Welch's t-test. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Humaan immuun- en T-celchimerisme in lymfeorganen en tumoren van CRC PDX-tumordragende HIS-BRGS-muizen. (A) Representatieve flowcytometrie-analyse van humane (hCD45) en muis (mCD45) hematopoietische en menselijke T (CD3) cellen in perifeer bloed (PBMC) voorafgaand aan tumorimplantatie, en in LN's en tumoren (TIL) aan het einde van het onderzoek. (B,C) Equivalent humaan en T-cel chimerisme in het bloed na 14 weken in HIS-BRGS muizen vervolgens geïnjecteerd met (B) CRC307P of (C) CRC307M PDXs en onbehandeld of behandeld met combinatie-immunotherapie (Tx). (D-F) Verhoogde menselijke T-cellen in lymfeorganen en tumoren (TIL) van met combinatie behandelde HIS-BRGS-CRC307P-muizen, maar niet van HIS-BRGS-CRC307M-muizen. Gegevens tonen menselijke en T-celfrequenties op de Y-as als een percentage van de ouderpopulatie in (D) lymfeklieren (LN's), (E) milten (SP) en (F) tumoren van individuele muizen aan het einde van het onderzoek. Statistische analyses tussen twee onafhankelijke groepen werden uitgevoerd met behulp van ongepaarde, parametrische twee-groep Welch's t-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Analyse van T-celactivatie door flowcytometrie in perifere lymfeorganen en tumoren van CRC PDX dragende HIS-BRGS-muizen. (A) Representatieve flowcytometrie-analyse van T-cellen in LN's, milten (SP's) en tumoren (TILs) weggesneden uit HIS-BRGS-muizen die de volgende populaties meten: geactiveerde T-cellen (HLA-DR+), naïeve T-cellen (CD45RA+ CCR7+), Tem (CD45RA-, CCR7-), Tregs (CD25+, FoxP3+) en cytotoxische T-cellen (Granzyme B+, TNFα+ en/of IFNγ+). (B-D) Frequenties van geïndiceerde T-celpopulaties in lymfeorganen of TILs van HIS-CRC307P-BRGS en HIS-CRC307M-BRGS muizen: (B) HLA-DR+ geactiveerde T-cellen, (C) CCR7-CD45RA-Tem CD8+ T-cellen, (D) remmende receptor TIM-3 CD8+ T-cellen, (E) Granzyme B CD8+ T-cellen en (F) CD25+FoxP3+ CD4+ Tregs. Voor de HIS-CRC307M-BRGS-muizen in (B) toont de eerste dataset alle muizen die bij de oogst zijn geanalyseerd, terwijl de tweede dataset alleen die met voldoende LN en milt T-cel chimerisme bevat. In alle grafieken vertegenwoordigen de gevulde symbolen voor 307M muizen met voldoende chimerisme, terwijl open symbolen zijn uitgesloten ZIJN muizen. Statistische analyses tussen twee onafhankelijke groepen werden uitgevoerd met behulp van ongepaarde, parametrische twee-groep Welch's t-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Flowcytometrie-analyse van MHC klasse I, II en PD-L1 op menselijke tumoren in HIS-BRGS muizen. (A) Representatieve flowcytometrie dot plots, ter illustratie van gating strategie voor het meten van expressieniveaus van MHC Klasse I (HLA-ABC), Klasse II (HLA-DR) en PD-L1 op epitheliale (EpCAM+) menselijke tumoren in HIS-BRGS muizen. (B-D) Gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van HLA-ABC (B), HLA-DR (B,C) en PD-L1 (D) op menselijke (hCD45+) en tumorcellen (EpCAM+) van gedissocieerde CRC307P (B,D) of CRC307M (C) PDX's die zijn weggesneden uit HIS-BRGS-muizen. Statistische analyses tussen twee onafhankelijke groepen werden uitgevoerd met behulp van ongepaarde, parametrische twee-groep Welch's t-test. *p <0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. Afkorting: Tx = Behandeling Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Analyse van immunocorrelaten van respons. De SGR's van CRC307P-tumorgroei in de flanken van onbehandelde (Veh) of met gecombineerde immunotherapie behandelde (Tx) HIS-BRGS-muizen werden uitgezet versus de frequentie van (A) CD4 + of (B) HLA-DR + T-cellen als een indicator van immuunparameters die correleren met verminderde tumorgroei (d.w.z. kleinere SGR). Een eenvoudige lineaire regressieanalyse werd uitgevoerd om significante correlaties aan te geven. R2-waarden geven de mate van correlatie aan. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Werkblad voor oppervlaktekleuringspaneel. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Celkleuringspanelen en flowcytometrie gating werkblad. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Recepten voor media en oplossingen die in het onderzoek worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Representatieve flowcytometrie gating voor elke vlek. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de afgelopen 6 jaar heeft ons onderzoeksteam, gebruikmakend van onze expertise in zowel immunologie als gehumaniseerde muizen, een broodnodig preklinisch model ontwikkeld om immunotherapieën te testen op een verscheidenheid aan menselijke tumoren 3,7,30,31. Dit protocol benadrukt de overweging van de variabiliteit van het model, met speciale aandacht voor de immunotherapie-centrische menselijke T-celpopulaties. In dit protocol wordt de generatie van HIS-muizen beschreven, evenals de immuunanalyse van zowel hun lymfeorganen als de tumor. Flowcytometrieprotocollen die zijn ontwikkeld voor traditionele op compensatie gebaseerde cytometers en spectrale cytometers zijn ook opgenomen. Het vermogen om veranderingen in het immuunsysteem in grote tumormonsters en in de periferie te ondervragen, vertegenwoordigt een aanzienlijk voordeel van dit preklinische model. Een bijkomend voordeel van dit systeem is dat meerdere muizen, die dezelfde unieke menselijke tumor herbergen, kunnen worden toegewezen aan afzonderlijke cohorten en kunnen worden behandeld met verschillende combinaties van immunotherapiegeneesmiddelen, waarbij in wezen een "mini" -medicijnonderzoek wordt uitgevoerd. Gecombineerd maken deze twee factoren onderzoek mogelijk naar de werkingsmechanismen en resistentie van voorgestelde (combinatie)immunotherapieën. Het model heeft de mogelijkheid om de timing en dosering van geneesmiddelen te testen op een breed scala aan menselijke tumoren en een groot aantal immuungerichte behandelingen, waaronder gerichte therapieën, biologische geneesmiddelen, chemotherapieën, bestraling en zelfs celgebaseerde therapieën.

Vanwege de inherente variabiliteit in het chimerisme van de HIS-muizen is een hoger aantal muizen per behandelingsgroep vereist dan een typisch syngenetisch tumormodel. Met behulp van deze protocollen zijn cohorten van vijf tot zeven HIS-BRGS-muizen per behandelingsarm voldoende om statistische verschillen in immuunparameters te verkrijgen. Deze variabiliteit in chimerisme vormt een uitdaging in dit model en moet worden overwogen. Een experimenteel voorbeeld dat zowel tumorgroei als immuunrespons aantoont bij een combinatiebehandeling met een CRC PDX is hier getoond, evenals een voorbeeld waarin dezelfde behandeling met een andere CRC PDX geen vergelijkbare sterke respons vertoonde. Dit verschil in experimentele uitkomst kan te wijten zijn aan de verschillende PDX (dezelfde patiënt maar gemetastaseerd versus primair) en / of het chimerisme. In het tweede experiment waren er zeer weinig T-cellen in de milt van de meerderheid van de muizen in de behandelingsgroep, evenals zeer kleine LN's; verschillende laboratoria hebben aangetoond dat de grootste batch-to-batch variabiliteit onder HIS-modellen de T-celfrequenties 20,32,33 zijn. We hebben ook aangetoond dat menselijke engraftment in de LN's sterk correleert met het T-cel chimerisme32. In meer dan 40 experimenten hebben we een vereiste van 20% T-cellen in de milt opgemerkt voor voldoende chimerisme om behandelingsgerelateerde immuunveranderingen te detecteren3. Bij opoffering is het belangrijk om te zorgen voor significante T-celreconstitutie, die we definiëren als opmerkelijke LN-ontwikkeling (>1,5 x 106 hCD45-cellen) en >20% T-cellen (van hCD45 + -cellen) in de milt. HIS-muizen die niet aan deze eis voldoen, worden uit de dataset verwijderd. Chimerisme in het bloed voorafgaand aan tumorimplantaat helpt deze parameter te voorspellen; er zijn echter verschillen in de ontwikkeling van T-cellen bij individuele muizen in de loop van de tijd die het beste aan het einde van het onderzoek kunnen worden overwogen. Gelukkig ontwikkelt in dit model ongeveer 95% van de HIS-BRGS-muizencohorten voldoende T-cel chimerisme voor immunotherapiestudies. Er moet worden benadrukt dat de gegevensanalyse aan het einde van het onderzoek altijd ondervraging van het chimerisme in de perifere lymfeorganen moet omvatten en HIS-muizen moet verwijderen die niet voldoen aan het menselijke en T-cel chimerisme. In experimenten met minder dan vier HIS-muizen per cohort na deze aanpassing, moeten de resultaten worden gevalideerd met een ander HIS-BRGS-cohort afgeleid van een afzonderlijke CB.

Hoewel onze groep zich heeft gericht op de ontvanger van het BRGS-muismodel, zijn er wereldwijd talloze modellen beschikbaar. De NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ)ontvanger is bijvoorbeeld het meest gekarakteriseerde model en is vergelijkbaar met het NOG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/Jic) en zelfs het NRG (NOD-Rag1 tm1Mom Il2rg tm1Wjl/SzJ) model, dat Rag-mutaties gebruikt voor genetische ablatie van muis T- en B-cellen in plaats van de SCID-mutatie 20. Deze modellen bevinden zich allemaal op de NOD-achtergrondstam en hebben dus het SIRPaNOD-allel, dat belangrijk is bij het voorkomen van fagocytose van menselijke cellen door gastheermacrofagen13. Rapporten suggereren vergelijkbaar chimerisme in deze "basale" gehumaniseerde muismodellen als in het BRGS-model, met voornamelijk menselijke B-cellen in de eerste paar maanden gevolgd door engraftment met menselijke T-cellen32,34,35. In deze modellen zijn de NK- en myeloïde cellen ondervertegenwoordigd ten opzichte van een menselijke36,37. Er zijn verschillende iteraties van "next gen" gehumaniseerde muisontvangers die de afstammingsspecifieke ontwikkeling kunnen verbeteren door de introductie van mensspecifieke cytokines. Bijvoorbeeld, NSG-SGM3 (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ) muizen hebben menselijke IL-3, GM-CSF en SCF cytokines en verbeterde humane myelopoiese37, of menselijke HLA-transgenen voor selectie op een menselijke HLA (bijv. NSG-HLA-A2 of BRGS-HLA-A2/DR238,39). Uitgebreide recensies over dit onderwerp20,21 worden aanbevolen aan lezers. HIS-muismodellen moeten in elk laboratorium worden gevalideerd met hun eigen bron van menselijke stamcellen. Deze validatie moet het kwantificeren van het menselijk chimerisme, inclusief menselijke B-, T-, NK- en myeloïde cellen, in het bloed in de loop van de tijd en in de LN's, milt, beenmerg en thymus tussen 16-20 weken en opnieuw tussen 24-28 weken omvatten. Speciale aandacht moet worden besteed aan multi-lineage engraftment, inclusief T-cel chimerisme. Bovendien moeten de groeisnelheden van tumoren worden getest in de HIS-muizen ten opzichte van niet-gehumaniseerde muizen van dezelfde stam. Het is aannemelijk dat significante verbeteringen in HIS-muismodellen kunnen leiden tot afstoting van de tumor. Als een poging om hulpbronnen te besparen, worden deze groeicurven vaak gelijktijdig met de analyses van immuunresponsgegevens uitgevoerd. In de handel verkrijgbare HIS-muizen moeten uitgebreide chimerismegegevens uit het bloed bevatten, evenals verwijzingen naar chimerisme in andere organen uit andere cohorten.

De experimentele protocollen voor het analyseren van tumorgroei en immuunresponsen in HIS-muizen op menselijke CDX's of PDX's vereisen standaard laboratoriummethodologieën en immunologische expertise. De generatie van HIS-muizen, inclusief de isolatie van de stamcellen, injectie in immunodeficiënte muizen en het testen van menselijk chimerisme in het bloed, zijn allemaal relatief eenvoudige laboratoriumprocedures. De logistieke problemen rond deze procedure, waaronder het kweken van zeer immunodeficiënte muizenstammen, het verkrijgen van een betrouwbare bron van menselijke HSC's, enz., Zijn het meest omslachtige onderdeel van het protocol. Procedureel moet meer aandacht worden besteed aan experimenteel ontwerp, inclusief de timing van tumorimplantatie (meestal 19-21 weken wanneer er voldoende T-cellen aanwezig zijn), medicijndosering en timing aan het einde van het onderzoek. Het verkrijgen van tumormeetgegevens is een andere routineprocedure. Omdat de immuungegevens echter vaak informatiever zijn dan de tumorgroeigegevens in dit systeem, kunnen flowcytometrische analyses van de immuunresponsen relevante gegevens opleveren. Het kleuren van cellen voor flowcytometrie is een andere eenvoudige procedure, net als het leren uitvoeren van een flowcytometer. De analyse en interpretatie van deze gegevens vereist echter unieke expertise. Hoewel dit manuscript dient als een ruggengraat om immuno-oncologische studies uit te voeren bij HIS-muizen, moet elke protocolstap worden geoptimaliseerd binnen een nieuw laboratorium. Uit ervaring vereisen het handhaven van de gezondheid van de muizen, het verkrijgen van adequate HSC's van CB-eenheden en het timen van de tumorinjecties voor voldoende T-cellen de meeste aandacht en probleemoplossing.

De HIS-BRGS-muizen vertonen extreme immuunsuppressie vergelijkbaar met die waargenomen in veel menselijke tumoren. Deze immuunsuppressie is opmerkelijk, omdat hoge expressieniveaus van PD-1 en TIGIT, maar minder TIM-3, worden waargenomen op de T-cellen in de perifere immuunorganen van de HIS-BRGS-muizen 3,7. Deze T-cellen vertonen ook markers van immuunactivatie, waaronder hoge expressie van HLA-DR en lage expressie van CCR7 en CD45RA, indicatief voor T-effectorcellen, zoals hier weergegeven in figuur 4 en in referenties 3,7. Deze kwaliteit is een centrale paradox in het systeem; de immunosuppressie maakt de groei van allogene menselijke tumoren mogelijk in de aanwezigheid van een allogene HIS, met snelheden die vergelijkbaar zijn met of zelfs sneller zijn dan niet-gehumaniseerde BRGS- of naakte (Nu / J) muizen 3,7,23. Van immuunstimuli is echter aangetoond dat ze deze immunosuppressie kunnen overwinnen en een tumor 7,8 kunnen afstoten. Hoewel significante veranderingen in tumorgroei tussen voertuig en behandelde muizen niet altijd worden waargenomen, zijn er vaker significante verschillen in immuunfenotypen gevonden, dus het analyseren van de tumorgroeisnelheden gecorreleerd aan immuunfenotypen wordt gesuggereerd. In deze analyse werden immuunparameters gevonden die significant correleren met verminderde tumorgroei3. Deze gegevens suggereren dat bepaalde "immunocorrelaten" behandelingsgerelateerd zijn en deelnemen aan tumorcontrole. Tumorgroeimetingen in combinatie met immuunfenotypen in het HIS-muismodel leveren dus belangrijke preklinische gegevens op met betrekking tot tumorimmuunresponsen op unieke menselijke tumoren. De uitdaging voor elk preklinisch model is correlatie met klinische resultaten. Het HIS-muizenoncologieveld heeft verschillende voorbeelden van klinische correlatie: 1) wij en anderen hebben aangetoond dat de menselijke immuuninfiltratie correleert met het tumortype 3,22,23,40; 2) we hebben een succesvolle behandeling met anti-PD-1 aangetoond bij een PDX met ACC Lynch-syndroom, afgenomen van een patiënt die vervolgens op deze therapie reageerde31; en 3) we hebben superieure reacties laten zien op een CRC MSS hi PDX, een kanker met hoge responspercentages in de kliniek ten opzichte van de notoir slecht reagerende CRC MSS PDX7. Samen met in vitro en andere in vivo modellen vormen deze gegevens een nexus voor vertaling naar de kliniek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen.

Acknowledgments

We willen zowel de Animal Research Facility (OLAR) bedanken voor hun zorg voor onze muizen, als de Flow Cytometry Shared Resource ondersteund door de Cancer Center Support Grant (P30CA046934) op ons instituut voor hun immense hulp bij al ons werk. We erkennen ook zowel Gail Eckhardt als Anna Capasso voor onze inaugurele samenwerkingen met immunotherapieën voor menselijke PDX's in ons HIS-BRGS-model. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant met behulp van de PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Dit onderzoek werd mede mogelijk gemaakt door de NIAID van de National Institutes of Health onder contractnummer 75N93020C00058.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe w/needles McKesson 1031815
15 mL tubes Grenier Bio-One 188271
2-mercaptoethanol Sigma M6250
50 mL tubes Grenier Bio-One 227261
AutoMACS Pro Separator Miltenyi 130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin BD Bioscience BDB563792
BSA Fisher Scientific BP1600100
Cell Stim Cocktail Life Technologies 509305
Chill 15 Rack Miltenyi 130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes Fisher Scientific 13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract R&D Systems 363200502
Cytek Aurora Cytek
DNase Sigma 9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set Invitrogen 00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS Gibco 10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume Grenier Bio-One 616201
Excel Microsoft
FBS Benchmark 100-106 500mL
Ficoll Hypaque GE Healthcare 45001752
FlowJo Software BD Biosciences
Forceps - fine Roboz Surgical  RS5045
Forceps normal Dumont RS4919
Formaldehyde Fisher F75P1GAL
Frosted Glass Slides Corning 1255310
Gentlemacs C-Tubes Miltenyi    130-096-334
GentleMACS Dissociator Miltenyi 130-093-235
glass pipettes DWK Life Sciences 63A53
Glutamax Gibco 11140050
HBSS w/ Ca & Mg Sigma 55037C
HEPES Corning MT25060CI
IgG standard Sigma I2511
IgM standard Sigma 401108
IMDM Gibco 12440053
Liberase DL Roche 5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue Thermo L23105
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MEM Gibco 1140050
mouse anti-human IgG-AP Southern Biotech JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled Southern Biotech H2
mouse anti-human IgM-AP Southern Biotech UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled Southern Biotech SA-DA4
MultiRad 350 Precision X-Ray
PBS Corning 45000-446
Pen Strep Gibco 15140122
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713A
p-nitrophenyl substrate Thermo 34045
PRISM Graphpad
Rec Hu FLT3L R&D systems 308-FK-005/CF
Rec Hu IL6 R&D systems 206-IL-010/CF
Rec Hu SCF R&D systems 255SC010
RPMI 1640 Corning 45000-39
Saponin Sigma 8047-15-2
Scissors McKesson 862945
Serological pipettes 25 mL Fisher Scientific 1367811
Sterile filter Nalgene 567-0020
Sterile molecular water Sigma 7732-18-5
Yeti Cell Analyzer Bio-Rad 12004279
Zombie Green biolegend 423112

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
  2. Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
  3. Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
  4. Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
  5. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
  6. Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
  7. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
  8. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  9. Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
  10. Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
  11. Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
  12. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  13. Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
  14. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  15. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  16. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  17. Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
  18. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  19. Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
  20. Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
  21. Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
  22. Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
  23. Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
  24. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
  25. Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
  26. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
  27. Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
  28. Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
  29. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
  30. Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
  31. Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
  32. Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
  33. Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
  34. Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
  35. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
  36. Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
  37. Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
  38. Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
  39. Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
  40. Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).

Tags

Cancer Research Nummer 190

Erratum

Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 05/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

Testen van kankerimmunotherapeutica in een gehumaniseerd muismodel met menselijke tumoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lanis, J. M., Lewis, M. S.,… More

Lanis, J. M., Lewis, M. S., Strassburger, H., Larsen, K., Bagby, S. M., Dominguez, A. T. A., Marín-Jiménez, J. A., Pelanda, R., Pitts, T. M., Lang, J. Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. J. Vis. Exp. (190), e64606, doi:10.3791/64606 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter