Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Тестирование иммунотерапии рака на гуманизированной мышиной модели с опухолями человека

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64606
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 2, 1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

В этом протоколе описывается генерация мышей иммунной системы человека (HIS) для иммуноонкологических исследований. Инструкции и соображения по использованию этой модели для тестирования иммунотерапевтических средств человека на опухолях человека, имплантированных в эту модель, представлены с акцентом на характеристику реакции иммунной системы человека на опухоль.

Abstract

Изменение иммуносупрессивной природы микроокружения опухоли имеет решающее значение для успешного лечения рака иммунотерапевтическими препаратами. Модели рака мышей крайне ограничены в своем разнообразии и страдают от плохого перевода в клинику. Чтобы служить более физиологической доклинической моделью для исследований иммунотерапии, этот протокол был разработан для оценки лечения опухолей человека у мышей, восстановленных с иммунной системой человека. Этот уникальный протокол демонстрирует развитие иммунной системы человека (HIS, «гуманизированный») мышей с последующей имплантацией опухоли человека, либо ксенотрансплантата, полученного из клеточной линии (CDX), либо ксенотрансплантата, полученного из пациента (PDX). Мыши HIS генерируются путем инъекции CD34+ гемопоэтических стволовых клеток человека, выделенных из пуповинной крови, в новорожденных мышей с высоким иммунодефицитом BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα), которые также способны принимать ксеногенную опухоль. Подчеркивается важность кинетики и особенностей развития иммунной системы человека и имплантации опухоли. Наконец, описана углубленная оценка микроокружения опухоли с помощью проточной цитометрии. В многочисленных исследованиях с использованием этого протокола было обнаружено, что опухолевое микроокружение отдельных опухолей повторяется у мышей HIS-PDX; «Горячие» опухоли проявляют большую иммунную инфильтрацию, в то время как «холодные» опухоли этого не делают. Эта модель служит испытательным полигоном для комбинированной иммунотерапии широкого спектра опухолей человека и представляет собой важный инструмент в поисках персонализированной медицины.

Introduction

Модели рака мышей важны для установления основных механизмов роста опухоли и иммунного ускользания. Однако исследования по лечению рака на мышиных моделях дали конечную трансляцию в клинику из-за ограниченных сингенных моделей и видоспецифических различий 1,2. Появление иммунной терапии в качестве доминирующего подхода к борьбе с опухолями подтвердило необходимость модели in vivo с функциональной иммунной системой человека. Достижения в области мышей иммунной системы человека (мышей HIS) за последнее десятилетие позволили изучать иммуноонкологию in vivo при самых разных типах рака и иммунотерапевтических агентах 3,4,5,6. Модели опухолей человека, включая ксенотрансплантаты, полученные из клеточной линии, и ксенотрансплантаты, полученные от пациента (CDX и PDX соответственно), хорошо растут у мышей с HIS и в большинстве случаев почти идентичны их росту у иммунодефицитного хозяина, лишенного гемопоэтического приживления человека 7,8. Основываясь на этом ключевом выводе, исследователи использовали мышиную модель HIS для изучения иммунотерапии человека, включая комбинированную терапию, предназначенную для изменения микроокружения опухоли (TME) для снижения иммуносупрессии и, таким образом, усиления иммунно-направленного уничтожения опухоли. Эти доклинические модели помогают решить проблемы гетерогенности рака человека, а также могут прогнозировать успех лечения, а также контролировать токсичность лекарств, связанных с иммунитетом 9,10.

Для получения мышиной модели с иммунной системой человека путем введения гемопоэтических стволовых клеток человека требуется мышь-реципиент с иммунодефицитом, которая не будет отторгать ксенотрансплантат. Современные модели мышей HIS получены из иммунодефицитных штаммов мышей, о которых сообщалось более 30 лет назад. Первым описанным иммунодефицитным штаммом мышей были мыши с ТКИД, у которых отсутствовали Т- и В-клетки11, за которыми следовал гибрид NOD-SCID с полиморфизмом SIRPα, ответственным за толерантность макрофагов мыши к клеткам человека, из-за повышенного связывания аллеля NOD SIRPα с молекулой CD47человека 12,13. В начале 2000-х годов делеция общей гамма-цепи рецептора IL-2 (IL-2Rγc) на штаммах с иммунодефицитом BALB/c и NOD изменила правила игры для усиленного приживления человека из-за генетических делеций, запрещающих развитие NK-клеток хозяина14,15,16,17. Альтернативные модели, такие как мыши BRG и NRG, достигают дефицита Т- и В-клеток путем делеции гена Rag1 или Rag2, необходимого для перестройки генов рецепторов Т- и В-клеток и, следовательно, созревания и выживания лимфоцитов18,19. Мышь BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2R γCnullSirpαNOD), используемая в настоящем описании, сочетает в себе дефицит цепи IL-2Rγ и аллель NOD SIRPα на фоне Rag2-/-, в результате чего мышь с высоким иммунодефицитом отсутствует без Т, В или NK-клеток, но с достаточной энергией и здоровьем, чтобы обеспечить долгосрочное приживление более 30 недель13.

Мыши HIS могут быть получены несколькими способами, при этом инъекция PBMC человека является наиболее прямым методом15,18,20. Тем не менее, у этих мышей наблюдается выраженная экспансия активированных Т-клеток человека, что приводит к реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) к 12-недельному возрасту, что препятствует долгосрочным исследованиям. В качестве альтернативы, гемопоэтические стволовые клетки человека из пуповинной крови (КБ), костного мозга и печени плода также могут быть использованы для приживления и производства иммунной системы человека de novo. В этой системе гемопоэтические стволовые клетки продуцируют многолинейную иммунную систему человека с генерацией Т, В и врожденных иммунных клеток, которые, что важно, толерантны к мыши-хозяину, по сравнению с мышами PBMC, которые развивают в основном Т-клетки. Поэтому РТПХ отсутствует или сильно задерживается, и исследования могут быть распространены на мышей до 10-месячного возраста. CB обеспечивает простой, доступный и неинвазивный источник CD34+ гемопоэтических стволовых клеток человека, который облегчает приживление нескольких мышей HIS с генетически идентичной иммунной системой 17,18,20,21. За последние несколько лет модели мышей HIS широко использовались для изучения иммунотерапии и TME 3,4,5,6. Несмотря на развитие иммунной системы человека у этих мышей, опухоли ксенотрансплантата человека растут с той же скоростью по сравнению с контрольными иммунодефицитными мышами и допускают сложное взаимодействие между раковыми клетками и иммунными клетками, что важно для поддержания микроокружения привитого PDX 3,7,8 . Этот протокол был использован для проведения более 50 исследований, в которых тестировались методы лечения мышей HIS-BRGS с PDX и CDX. Важным выводом является то, что опухоли человека у мышей HIS сохраняют свой уникальный TME, определяемый молекулярной оценкой опухоли по отношению к исходному образцу пациента и характеристиками иммунного инфильтрата 3,22,23. Наша группа фокусируется на углубленной оценке ГИС как в иммунных органах, так и в опухоли с использованием многопараметрической проточной цитометрии. Здесь мы описываем протокол гуманизации мышей BRGS, оценку химеризма, имплантацию опухолей человека, измерения роста опухоли, назначение лечения рака и анализ клеток HIS с помощью проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все работы с животными выполнялись в соответствии с протоколами на животных, одобренными Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Колорадо в Денвере (протоколы IACUC #00593 и #00021). Все работы с животными выполнялись в соответствии с Управлением ресурсов лабораторных животных (OLAR), аккредитованным Американской ассоциацией по уходу за лабораторными животными, в медицинском кампусе Университета Колорадо в Денвере. Все образцы пуповинной крови человека были получены в качестве донорства от неидентифицированных доноров и, таким образом, не подлежат утверждению комитетом по этике исследований на людях.

ПРИМЕЧАНИЕ: Композиции всех сред и растворов, упомянутых в протоколе, включены в дополнительный файл 1. На рисунке 1 показан общий протокол генерации и анализа иммунных ответов на опухоли у мышей HIS-BRGS.

1. Генерация мышей HIS

  1. Разведение мышей BALB/c -Rag2 null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот штамм крайне иммунодефицитен, в нем нет Т, В или NK-клеток. Поэтому необходимо использовать строгие меры для предотвращения оппортунистических инфекций. Поддерживайте колонию на диете, содержащей триметоприм и сульфадиазин, по чередуя 2-недельный график с обычной диетой. Поддерживайте в помещении с максимально возможным уровнем предосторожности (например, в барьерном душевом помещении с ограниченным доступом).
    1. Поддерживайте колонии гомозиготных мышей BALB/c -Rag2 null Il2RγC null Sirpα NOD (BRGS) и BALB/c Rag2 null Il2RγC null SirpaBalb/c (BRG) в качестве селекционеров.
    2. Разводить BRGS N/N×BRG B/B для получения щенков BRGSB/N, которые будут использоваться в качестве реципиентов стволовых клеток человека. В этой колонии BRGSB/N более здоровы, чем BRGS N/N, и приживаются на эквивалентных уровнях (больше, чем BRG).
  2. Выделение стволовых клеток человека CD34+ из пупочного CB
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры не используются антибиотики. Поэтому необходима хорошая стерильная техника.
    1. Поместите коническую пробирку объемом 50 мл, а также 3 конические пробирки по 15 мл и ~10 пробирок по 50 мл в стерилизованный шкаф биобезопасности (BSC). Опрыскайте мешок для сбора крови 70% этанолом и дайте ему высохнуть в BSC.
    2. Рассчитайте количество конических пробирок объемом 50 мл, необходимых для изоляции градиента плотности CB = объем CB/15, округленное в большую сторону и до четного числа пробирок. Рассчитайте объем крови на пробирку = объем CB / количество пробирок. Осторожно налейте кровь из мешка CB в каждую коническую трубку; это максимум 15 мл на пробирку. Используйте автоматический пипеттор и серологическую пипетку объемом 25 мл, чтобы смешать кровь 1:1 со стерильным PBS путем пипетки вверх и вниз.
    3. Используйте автоматический пипеттор на низкой скорости и серологическую пипетку объемом 10 мл, чтобы медленно подложить кровь раствором градиента плотности комнатной температуры (RT) 1,077 г / мл (см. Таблицу материалов), не нарушая границу раздела. Следите за тем, чтобы наконечник пипетки не касался дна тюбика. Повторите для всех пробирок. Затем центрифугу в течение 30 мин при 850 x g, без торможения, при RT, чтобы обеспечить поддержание градиента плотности.
    4. Визуализируйте клеточную охристую шерсть поверх градиента плотности 1,077 г/мл в виде мутно-белого слоя. Удалите и отбросьте слой плазмы примерно на 10 мл выше охристой оболочки с помощью серологической пипетки объемом 25 мл и автоматического пипеттора.
    5. Соберите охристую шерсть стерильной переносной или серологической пипеткой. Используйте пипетку как шпатель, чтобы соскрести клетки со стороны конической трубки, отпуская колбу (или медленно пипетируя), чтобы вытянуть клетки. Объедините охристые покрытия из двух конических пробирок объемом 50 мл в одну новую коническую пробирку объемом 50 мл.
    6. Промойте клетки, налив 45 мл стерильного HBSS, содержащего 2% FBS, в каждую коническую пробирку. Центрифуга в течение 11 мин при 360 x g при RT.
    7. Аспирируйте промывочный материал до гранул во всех тюбиках. Используйте серологическую пипетку объемом 10 мл и автоматический дозатор для ресуспендирования первой гранулы в 10 мл HBSS, содержащей 2% FBS. Ресуспендируйте каждую гранулу в тех же 10 мл HBSS и промойте каждую пробирку дополнительными 10 мл HBSS, чтобы собрать все клетки в одну пробирку.
    8. Налейте 45 мл стерильного HBSS, содержащего 2% FBS, в коническую пробирку. Центрифуга в течение 10 мин при 360 x g, при 4 °C.
    9. Аспирируйте промывочный буфер вниз к грануле ячейки и ресуспендируйте гранулу в 20 мл буфера магнитного сепаратора ячеек (см. Таблицу материалов). Удалите небольшую аликвоту, чтобы подсчитать клетки с помощью гемацитометра в разведении 1:20 в метиленовом синем. Добавьте количество синих и белых ячеек. Центрифуга при 360 x g, в течение 10 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется технология магнитных шариков (см. Таблицу материалов). Протокол может быть модифицирован для использования с любой технологией разделения клеток, с достаточной чистотой и выходом стволовых клеток CD34+.
    10. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу CD34+ клеток, выделенную из пуповинной крови, в 300 мкл буфера магнитного сепаратора клеток на 1 x 108 клеток. Сначала добавьте 100 мкл реагента, блокирующего FcR, а затем 100 мкл магнитных шариков CD34+ на 1 x 108 ячеек. Инкубировать при 4 °C в течение 30 мин (без льда).
    11. Добавьте 5 мл буфера сепаратора магнитных ячеек на 1 x 108 ячеек и вращайте при 360 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Повторите этап промывки и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера-сепаратора магнитных ячеек на 1 x 108 ячеек в конической пробирке объемом 15 мл с маркировкой «нефракционированная».
    12. Пометьте еще две конические трубки по 15 мл «CD34-» и «CD34+». Поместите три конические пробирки объемом 15 мл (нефракционированные, CD34- и CD34+) в пазы A1, B1 и C1 соответственно на охлаждающей стойке (см. Таблицу материалов). Разделите ячейки с помощью двухколоночной программы положительного отбора на автоматическом магнитном сепараторе ячеек (см. Таблицу материалов) в BSC в соответствии с инструкциями производителя прибора.
  3. Расширение и замораживание CD34+ стволовых клеток человека
    1. Аликвотируйте 10 мкл восстановленной клеточной суспензии CD34+ (2 мл) на предметном стекле гемоцитометра и подсчитайте клетки под 10-кратным увеличением. Рассчитайте общее количество клеток CD34+, умножив количество ячеек на 2 x 104. Разделите общее количество клеток CD34+ на 250 000, чтобы рассчитать количество флаконов для замораживания (50 000 клеток на детеныша мыши до расширения in vitro ).
    2. Приготовьте CB medium 10% FCS Iscove (плюс 1 мл дополнительно для потери фильтрации), дополненный 40 нг / мл фактора стволовых клеток, 20 нг / мл Flt3L и 10 нг / мл IL-6, и пропустите через фильтр 0,22 мкм. Ресуспендируют клетки CD34+ при 100 000 на мл среды CB и инкубируют при 37 ° C. На 3-й день добавляют эквивалентный объем среды ХБ без цитокинов в колбу, содержащую клетки, и среду ХБ с цитокинами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление этих цитокинов в среду CB способствует выживанию и экспансии клеток CD34+, предотвращая дифференцировку.
    3. Соберите расширенные клетки CD34+ на 5-й день. Пипеткой суспензию клеток вверх и вниз и соберите в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте достаточное количество CB medium, чтобы покрыть дно колбы. С помощью клеточного скребка соскребите все дно колбы. Соберите все среды в одну и ту же пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 360 x g в течение 11 минут.
    4. Ресуспендируют клетки в 2 мл среды CB. Сохраните последнюю каплю из пипетки в 96-луночную пластину для подсчета. Разбавьте клетки 1:1 трипановым синим и добавьте 10 мкл в гемацитометр, затем подсчитайте и усредните клетки из четырех квадрантов. Рассчитайте общее количество клеток CD34+, умножив количество клеток на 4 x 104, и запишите жизнеспособность.
    5. Сделайте n+1 мл замораживающей среды, где n - количество замораживающих флаконов, рассчитанное на шаге 1.3.1. Приготовьте морозильную среду, добавив 10% (об. / об.) ДМСО в FBS и держите на льду. Пометьте криовиалы CB#, CD34+ d5 и датой.
    6. Отжимайте клетки CD34+ при 360 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Аспирируйте среду вниз к грануле и ресуспендируйте гранулу ячейки в морозильной среде. Аликвотируйте 1 мл клеточной суспензии на каждый флакон и равномерно разделите остаток между флаконами. Добавьте флаконы в морозильную камеру изопропанола, охлажденные до 4 ° C, поместите при -80 ° C и переведите на жидкий азот для хранения в течение >90 дней.
  4. Облучение детенышей мыши
    1. Соберите щенков BRGSB/N через 1-3 дня после рождения в автоклавную пластиковую коробку с набивкой. Добавьте небольшое количество подстилки вместе со щенками. Пометьте коробку номером клетки и количеством щенков.
    2. Настройте облучатель (см. Таблицу материалов) на дозу 300 рад. Поместите коробку с щенками в облучатель и подвергните их воздействию 300 рад. Отнесите щенков обратно в клетку, сложите их в кучу и накройте подстилкой.
  5. Инъекции щенков и подготовка клеток CD34+
    1. Начало подготовки клеток CD34+ через ~3 ч после облучения. Нагрейте 10 мл среды CB в конической пробирке объемом 50 мл. Выполняйте все действия в стерильном BSC.
    2. Извлеките один флакон in vitro расширенных и замороженных клеток CD34+ на каждые четыре-шесть щенков для инъекции. Быстро разморозьте при 55 ° C, пока не станет видно небольшое количество льда, и добавьте клетки в нагретую среду CB (флакон все еще должен быть прохладным на ощупь). Используйте 1 мл среды для ополаскивания каждого флакона и вращайте клетки при 360 x g в течение 12 мин при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было обнаружено, что быстрое оттаивание при 55 ° C дает лучшую жизнеспособность клеток (90% -95%), чем оттаивание при 37 ° C.
    3. Тщательно аспирируйте среду. Ресуспендируйте (небольшую) гранулу в 2 мл среды CB, осторожно перемешайте и добавьте ~ 30 мкл клеточной суспензии в одну лунку в счетной пластине. Разбавьте 1:1 трипановым синим, затем добавьте 10 мкл в гемоцитометр и подсчитайте и усредните клетки из четырех квадрантов.
    4. Рассчитайте общее количество клеток CD34+, умножив количество клеток на 4 x 104 , а затем запишите жизнеспособность. Отжим при 360 x g в течение 12 мин при 4 °C.
    5. Осторожно аспирируйте среду и ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл стерильного PBS на n + 1 детенышей для инъекции, в результате чего получается 250 000-450 000 клеток CD34 + на мышь. Поместите коническую трубку на лед в транспортный контейнер и отправляйтесь в виварий для инъекции щенка.
    6. Принесите в виварий BSC тепловую лампу, подгузники, шприц объемом 1 мл, иглу 18 г, иглу 30 г и клеточный препарат CD34+ в стерильных контейнерах. Поместите стерильный подгузник на ~ 2 фута под нагревательную лампу. Достаньте клетку с подстилкой, которую нужно впрыснуть, и поместите ее в BSC.
    7. Соберите шприц со скошенной иглой 18 G. Совместив угол наклона конической трубки со скосом иглы, аккуратно перемешайте и вытяните клеточную суспензию. Положите щенков на подгузник, чтобы они согрелись (следите за перегревом). Удалите воздух из шприца и замените иглу 18 G на иглу 30 G, а затем осторожно нажимайте на шприц, пока суспензия клеток не окажется прямо на кончике иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать инсулиновый шприц.
    8. Отводите по одному щенку к краю подгузника подальше от нагревательной лампы. Обездвижите щенка на боку под большим и указательным пальцами, чтобы было хорошо видно лицо. Обратите внимание на вену поперек щеки под тем местом, где будет ухо. Введите иглу неглубоко в ближайшую к глазу вену (IV) и медленно введите 50 мкл клеток.
    9. Проверьте, не образуется ли пузырь от подкожной инъекции. Если это так, вставьте иглу глубже и приступайте к введению клеток. Небольшая капля крови/гематомы будет видна при успехе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к процедуре Gombash Lampe et al.24 в отношении инъекции щенков.
    10. Когда щенок все еще обездвижен, выполните внутрипеченочную инъекцию (ИГ) еще 50 мкл клеток (всего 100 мкл на щенка IV+ИГ). Печень можно визуализировать как темное пятно между белой молочной лентой и грудной клеткой. Положите инъецированного щенка на подгузник подальше от непривитых щенков и нагрейте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутривенная инъекция приводит к лучшему долгосрочному химеризму, чем только инъекция ИГ25, но внутривенные инъекции не всегда успешны. Таким образом, разделение инъекции между внутривенными и ИГ обеспечивает приживление у большего процента мышей.
    11. Повторите инъекции в лицевую вену и ИГ для всех щенков. Счистите кровь, верните детенышей в гнездо в клетке и накройте подстилкой.

2. Тестирование химеризма человека в крови

  1. Тест химеризма в крови мышей HIS в возрасте 10 и 14 недель. Соберите 50 мкл крови через ретроорбитальную вену или с помощью альтернативного метода, одобренного IACUC.
    1. При ретроорбитальных кровотечениях обезболивайте мышей испарителем изофлурана, установленным на 5, в течение 1-2 минут, а затем уменьшите настройку испарителя до 4. При необходимости выключите испаритель, чтобы мыши оставались достаточно насыщенными кислородом во время анестезии. Не держите мышей под изофлураном более 5 мин.
    2. Поместите нос анестезированной мыши в носовой конус испарителя изофлурана и поместите каплю анальгетика (0,5% офтальмологического раствора пропаракаина HCl USP) на глаз.
    3. Через 1 минуту удалите пропаракаин с помощью стерильной марли, проптовысьте глаз и вставьте 75-миллиметровую гепаринизированную гематокритную трубку ретроорбитально, чтобы собрать 50 мкл крови. Вытолкните кровь в микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 50 мкл гепарина, и осторожно перемешайте.
    4. Зажмите закрытый глаз стерильной марлей, чтобы остановить кровотечение, и нанесите каплю пропаракаина. Извлеките мышь из изофлурана и восстановите в чистой клетке.
  2. Выделение PBMC из крови мыши
    1. Смешайте кровь / гепарин, осторожно пипеткой вверх и вниз и медленно наложив сверху 500 мкл градиента плотности 1,077 г / мл, стараясь не нарушить границу раздела. Центрифугируйте пробирки при 1,220 x g в течение 20 мин при RT без тормозов.
    2. Визуализируйте клеточную охристую шерсть в виде облачного слоя поверх градиента плотности 1,077 г/мл под плазмой. Удалите как можно больше клеток из охристой оболочки с помощью пипетки объемом 200 мкл и добавьте в новые пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 750 мкл питательной среды. Центрифуга при 360 x g в течение 11 мин при RT.
    3. Аспирируйте среду до 50 мкл и ресуспендируйте гранулы в 750 мкл питательной среды. Центрифугу при 360 x g в течение 10 мин при 4 °C и снова аспирируйте до 50 мкл. Клетки готовы к ресуспендированию в поверхностном окрашивании.
  3. Поверхностное окрашивание и проточный цитометрический анализ
    1. Заполните рабочий лист окрашивания панели (таблица 1; рабочий лист «Панель кровопускания спектрального потока») с номерами мыши и приготовьте коктейль для окрашивания антител, добавив все флуоресцентные антитела в буфер для окрашивания (дополнительный файл 1). Сделайте макет пластины, чтобы добавить образцы в 96-луночную U-образную нижнюю пластину. Разметьте днища скважин с помощью перманентного маркера. Титруют антитела с использованием стандартной процедуры перед окрашиванием для определения соответствующей концентрации26.
    2. Добавьте 62 мкл коктейля для поверхностных пятен в каждую лунку 96-луночной U-образной нижней пластины. Ресуспендируют клетки в 50 мкл, оставшихся в пробирке, и добавляют каждый образец в соответствующую лунку. Включите лунку для положительного контроля окрашивания (человеческие PBMC + спленоциты мыши, 1 x 106 клеток каждая) для окрашивания рядом с образцами. Смешайте пипеткой и инкубируйте смесь в течение 15 минут при температуре 4 °C.
    3. Центрифуга при 680 x g в течение 3 мин при 4 °C. Вылейте пластину в раковину, чтобы удалить надосадочную жидкость, и промойте клетки, ресуспендируя в 150 мкл окрашивающего буфера путем осторожного пипетирования ~ 10x. Отжим и ресуспендирование каждой лунки в 150 мкл окрашивающего буфера.
    4. Соберите данные для 100 мкл каждого образца на проточном цитометре (см. Таблицу материалов) и экспортируйте файлы .fcs. Импортируйте файлы .fcs в программное обеспечение для редактирования данных потока (см. Таблицу материалов). Примените полигональные ворота к графику FSC-A x SSC-A, окружающему ячейки, исключая любой мусор. Выделите ячейки внутри ворот (см. Таблицу 1; «Стробирование стравливания спектрального потока»).
    5. Измените оси на (FSC-A x FSC-H) и затворите ячейки, содержащиеся на линейной диагонали, исключая дублеты, выступающие из линии. Выделите эти ячейки и измените оси на (hCD45 x mCD45).
    6. Примените полигональные ворота к популяции hCD45+ и примените имя «человек». Примените полигональный вентиль к популяции mCD45+ и примените имя «мышь». Создайте статистику подсчета как для людей, так и для мышей.
    7. Выберите человеческую популяцию и измените оси на (CD19 x CD3). Примените полигональные ворота к ячейкам CD19+ и назовите их «B-ячейками». Примените полигональные ворота к популяции CD3+ и назовите его «Т-клетки». Примените полигональные ворота к двойной отрицательной популяции и назовите ее «NonTB».
    8. Выберите популяцию Т-клеток и измените оси на (CD8 x CD4). Примените полигональные ворота к положительным популяциям CD4 и CD8 и назовите их «CD4+» и «CD8+» соответственно.
    9. Выберите популяцию, не связанную с туберкулезом, и измените оси на (CD56 x миелоид). Примените полигональные ворота к общей популяции CD56, включая двойные положительные события, и назовите их «NK-клетками». Примените полигональные ворота к CD56-отрицательной и миелоидно-положительной популяции и назовите ее «миелоидной».
    10. Создайте таблицу для процентной и подсчитываемой статистики всех популяций и экспортируйте ее в программное обеспечение для работы с электронными таблицами (см. Таблицу материалов). Рассчитайте химеризм %hCD45 = %hCD45/(%hCD45 + mCD45).
    11. Исключите мышей HIS, которые содержат <20% hCD45+ (mCD45 + hCD45) для дальнейших экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании PBMC были приготовлены с использованием разделения градиента плотности 1,077 г / мл для более чистого истощения эритроцитов. Эта процедура исключила гранулоциты человека и мыши из слоя PBMC. В качестве альтернативы можно использовать лизис эритроцитов.

3. Инъекция опухолей мышам

  1. Перед инъекцией опухоли подтвердите количество Т-клеток по данным 14-недельного кровотечения. Опухоли вводят, чтобы быть готовыми к сбору между 20-26 неделями, если Т-клетки составляют >20%, и между 24-28 неделями, если Т-клетки составляют <20% от общей популяции иммунных клеток. Такое время инъекции гарантирует, что мыши находятся в возрасте 20-28 недель и имеют достаточное количество Т-клеток в конце исследования.
  2. Инъекция ксенотрансплантатов, полученных из клеточной линии (CDX)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура описана с использованием клеток аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231 (см. Таблицу материалов) в качестве примера.
    1. Разморозьте аликвоту замороженных клеток, промойте 1 раз, ресуспендируя в 10 мл DMEM с добавлением 10% FBS, 1% PenStrep и 1% заменимых аминокислот, и центрифугу при 360 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Аспирировать среду и ресуспендировать в 10 мл DMEM с добавлением 10% FBS, 1% PenStrep и 1% заменимых аминокислот в колбе T25 и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные линии аутентифицируются с помощью ПЦР для обеспечения правильного типа клеток. Клеточные надосадочные жидкости проверяются на микоплазму с помощью биохимического анализа перед инъекцией.
    2. Проход и расширение клеток во время фазы экспоненциального роста при слиянии около 80%.
      1. Аспирировать среду, промыть клетки 5-10 мл стерильного PBS (рН 7,2) и инкубировать с 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 1-5 мин до отрыва клеток от колбы.
      2. Добавьте 5 мл того же ДМЭМ и перемешайте, пипеткой вверх и вниз. Поместите все 6 мл клеточной суспензии в новую колбу T75, обработанную тканевой культурой (разведение 1:3), и добавьте еще 10 мл DMEM.
      3. Прохождение клеток каждые 2-3 дня при 80% слиянии при разбавлении 1:3 в DMEM для расширения клеток.
    3. Соберите клетки с 0,25% трипсина-ЭДТА во время фазы экспоненциального роста в течение шести пассажей и промойте PBS. Смешайте PBS и экстракт базальной мембраны (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:1 и добавьте в клетки в конечной концентрации 5 x 107 клеток/мл.
    4. Обезболивайте мышей изофлураном, как описано на шаге 2.1.1. Подкожно вводят 100 мкл (5 x 106 клеток) суспензии опухолевых клеток в каждую сторону с помощью иглы 23 G.
  3. Выполните инъекцию ксенотрансплантатов пациента (PDX) с использованием троакаров. Процедура впрыска и другие инструкции по разработке и обслуживанию модели PDX доступны в литературе27.

4. Измерение роста опухоли

  1. Проверяйте прогресс опухоли один раз в неделю после имплантации, ощупывая вдоль бока рост опухоли. Как только опухоли прощупываются, обезболите мышей изофлураном (как описано на шаге 2.1.1) и побрейте каждую сторону электрическим триммером, заботясь об опухоли, чтобы предотвратить изъязвления по мере роста опухоли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей можно брить перед инъекцией опухоли, чтобы предотвратить травмы кожи вокруг опухолей; Тем не менее, скорость роста волос может препятствовать измерениям опухоли.
  2. Измеряйте длину и ширину опухолей два раза в неделю с помощью штангенциркуля и записывайте измерения в мм. Сообщайте об измерениях опухоли в виде объема опухоли (мм3), используя формулуEquation 1. Следите за тем, чтобы опухолевая нагрузка не превышала 2000 мм3 на одну опухоль или общий объем 3000мм3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендации по использованию мышей в исследованиях рака варьируются в зависимости от местоположения. Пожалуйста, ознакомьтесь с политикой ухода за животными и их использования в учреждении исследователя.

5. Медикаментозное лечение

  1. Распределите мышей HIS в эквивалентные группы лечения на основе химеризма hCD45, химеризма hCD3 и химеризма hCD8. Как только опухоли достигнут в среднем 100мм3 , начинают медикаментозное лечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество мышей в группе основано на количестве мышей HIS, сгенерированных из CB. Рекомендуется минимум четыре мыши в группе. Недвудольное многогрупповое сопоставление (например, в программном обеспечении R-vivo Manila) полезно для этой группировки28.
  2. Путь и частота приема лекарств
    1. Вводите ингибиторы анти-PD-1 (ниволумаб, пембролизумаб) внутриперитонально (внутривенно) по 30 мг / кг 1 раз в неделю или 20 мг / кг 2 раза в неделю для однократного лечения или 10-15 мг / кг 2 раза в неделю для комбинированного лечения.
    2. Дозируйте комбинированную терапию, такую как таргетная терапия, химиотерапия и облучение, в соответствии с планом эксперимента. Таргетная терапия и химиотерапия могут проводиться через пероральный зонд, внутривенные инъекции или пищу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дозы могут варьироваться и оптимизироваться в соответствии с опубликованными данными и моделью опухоли. Исследования доз часто тестируются на реципиентах с иммунодефицитом до исследований HIS на мышах.
  3. Следите за мышами не реже 3 раз в неделю на предмет изменений в состоянии здоровья, таких как потеря веса, рыхлые фекалии, сгорбленная осанка, снижение подвижности и потеря шерсти. Некоторые симптомы могут быть признаками токсичности лекарств или РТПХ, и дозировку препарата может потребоваться уменьшить или прекратить. Усыпляйте мышей по мере необходимости в соответствии с политикой ухода за животными и их использования.

6. Забор тканей и опухолей мыши в конце исследования

  1. Усыпляют мышей по отдельности в соответствии с институциональными и ветеринарными рекомендациями, используя сжатый газ CO 2 с расходом 2,75 л / мин. Наблюдайте за мышами, содержащимися в CO2, в течение 1 минуты после смерти, а затем выполняйте вывих шейки матки в качестве вторичной формы эвтаназии.
  2. Забор крови
    1. Соберите кровь с помощью внутрисердечной пункции. Держите мышь в вертикальном положении и вставьте шприц объемом 1 мл с иглой 25 G прямо в сердце с линии, расположенной слева от средней линии и ниже ребер. Соберите кровь в шприц, в идеале через один длинный забор и переложите в маркированную пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные вставки игл могут быть выполнены для тщательного сбора дополнительной крови из углов полости легкого.
    2. Оставьте кровь при температуре 4 °C на 1 ч, затем центрифугируйте кровь в микроцентрифуге в течение 6 мин при 7 800 x g. Соберите прозрачную жидкость (сыворотку) над границей раздела крови во вторую чистую и маркированную пробирку объемом 1,5 мл. Храните сыворотку при температуре -20 °C для последующего анализа, например, для анализа воспалительных цитокинов человека и мыши или титров иммуноглобулинов.
  3. Рассечение тканей
    1. После инъекции и роста опухолевых клеток у мышей и введения медикаментозного лечения собирают ткани. Поместите мышей на доску для рассечения пенопласта со штифтами, чтобы удерживать их на месте, а руки и ноги вытянуть под углом 45 °. Сделайте разрез посередине туловища, начиная с таза и доходя до подбородка, стараясь не резать брюшину (хотя это не обязательно). Подтяните кожу к краю и удерживайте на месте булавками.
    2. Извлеките лимфатические узлы (ЛН) с помощью тонких щипцов в следующем порядке: паховые, подмышечные, шейные, брыжеечные, пищеводного отверстия диафрагмы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У мышей HIS LN часто очень маленькие, напоминающие анлаж, или «воспаленные» с отчетливым внешним видом, в отличие от мышей дикого типа. Поэтому из каждого участка берется ткань, напоминающая LN. Периферические LN часто выглядят как заполненные жидкостью «шарики», в то время как брыжеечные LN более плотные. Брыжеечные LN являются наиболее очевидными и последовательными и наблюдаются как один или два отдельных более плотных узла, в отличие от струны.
    3. Поместите LN на одну сторону предметных стекол из матового стекла в 8 мл питательной среды в чашке Петри. Держа предметные стекла под перпендикулярными углами матовыми краями внутрь, аккуратно прижимайте ткани до тех пор, пока клеточное содержимое не освободится.
    4. Промойте предметные стекла несколько раз, раздвинув их и вместе, чтобы освободить максимальное количество ячеек. Соберите клетки с помощью стеклянной пипетки диаметром 5 дюймов и отфильтруйте их через пипетку с ватной пробкой диаметром 9 дюймов в коническую пробирку объемом 15 мл с маркировкой.
    5. Извлеките селезенку из верхней левой части живота с помощью двух пар щипцов или щипцов и ножниц. Обратите внимание на размер селезенки как оценку объема ресуспендированной среды. Собирайте и фильтруйте селезенку путем механического разложения с использованием предметных стекол с матовым стеклом, как в случае с LN.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любую методику подготовки тканей к одноклеточным суспензиям.
    6. Выполните подсчет и ресуспендирование клеток из образцов тканей, как описано ниже.
      1. Центрифугируйте лимфатические клетки в дозе 360 x g в течение 10 мин при 4 °C. Аспирируйте жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл уборочной среды с ДНКазой.
      2. Удаляют эритроциты из клеток селезенки путем инкубации с 3 мл буфера для лизиса ACK при RT в течение 3 мин с последующим добавлением 10 мл питательной среды/ДНКазы. Снова центрифугируйте клетки селезенки, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1-10 мл питательной среды/ДНКазы в зависимости от размера селезенки (например, 1 мл для очень маленьких селезенок и до 10 мл для самых больших селезенок).
      3. Добавьте аликвоту 10 мкл клеточной суспензии к 90 мкл среды и рассчитывайте на гемоцитометре. Центрифугируют LN и клетки селезенки, аспирируют надосадочные жидкости и ресуспендируют клетки в собираемой среде в концентрации 1 x 10-8 клеток/мл или минимум 80 мкл.
    7. Извлеките опухоли.
      1. Удалите опухоль с открытого бока, удерживая опухоль щипцами, медленно разрезая края опухоли диссекционными ножницами.
      2. После удаления опухоли взвесьте ее и удалите 1/4 для обработки РНК и иммуногистохимии (IHC). Разделите 1/4 опухоли пополам; поместить одну половину (1/8 всей опухоли) в криовальную камеру, мгновенно заморозить в жидкости N2 и хранить при -80 °C для последующих геномных исследований.
      3. Поместите другую 1/8 опухоли в меченую пробирку для образца, содержащую 10% формалина. На следующий день промойте и ресуспендируйте салфетку в 70% этаноле до будущего использования. Поместите оставшиеся 3/4 опухоли в 6-сантиметровую посуду и измельчите на кусочки ~1 мм с помощью лезвия скальпеля.
      4. Транспортируйте кусочки опухоли в диссоциационную трубку (см. Таблицу материалов), промойте посуду 5 мл неполной среды, инфильтрирующей опухоль лейкоцитов (TIL), и добавьте в диссоциационную трубку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При опухолях массой >0,4 г промыть посуду 10 мл неполной среды TIL и добавить в диссоциационную трубку.
      5. Добавьте препарат коллагеназы (см. Таблицу материалов) в конечной концентрации 50 мг/мл в ткань в диссоциационной трубке. Диссоциируют ткань с помощью механической диссоциации при 37 ° C в течение от 30 мин до 1 ч, в зависимости от твердости опухоли.
      6. После диссоциации пропустите суспензию через фильтр размером 100 мкм в коническую трубку объемом 50 мл и промойте фильтр 10 мл полной среды TIL. Сыворотка в этой среде остановит реакцию коллагеназы и защитит клетки от дальнейшей деградации.
      7. Центрифугу одноэлементной суспензии при 360 x g в течение 10 мин при 4 °C. Ресуспендируйте гранулы в достаточно питательной среде с помощью ДНКазы, чтобы клеточная суспензия могла легко пройти через наконечник пипетки P1000 и записать объем для последующего анализа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Меньший объем увеличивает сбор опухолевых иммунных клеток, но более восприимчив к засорению проточного цитометра.

7. Окрашивание клеток и проточные цитометрические анализы

  1. Подготовка пятен и покрытие ячеек
    1. Приготовьте коктейли для окрашивания: в день сбора урожая добавьте количество образцов в рабочий лист окрашивания (таблица 2; Рабочие листы «Панель обычного потока A», «Панель спектрального потока B» и «Панель обычного потока C») для всех пятен и печати. Приготовьте коктейли для окрашивания пятен A и B в окрашивающем буфере (SB), добавив каждое антитело по отдельности с новым наконечником, пометив каждый реагент на ходу, и храните при температуре 4 ° C до тех пор, пока не понадобится. Приготовьте соответствующие жизнеспособные красители в PBS, не содержащем азидов, и храните при температуре 4 °C до тех пор, пока они не понадобятся (перед использованием нагрейте до RT). Приготовьте коктейль поверхностного окрашивания C на 2-й день в SB вместе с внутриклеточными пятнами B и C в соответствующих буферах пермеабилизации.
    2. Создайте макет планшета для всех образцов в листе окрашивания и отдайте в лунки 100 мкл ПБС, не содержащего азидов. Включите неокрашенный контроль для каждой ткани и окрашивания (для спектральной цитометрии).
    3. Добавьте клетки в 96-луночные планшеты, содержащие 50 мкл PBS. Для окрашивания А ресуспендировать каждую группу тканей в соответствующем объеме, как указано на листе окрашивания, и хранить при температуре 4 ° C до получения на проточном цитометре в тот же день. Для окрашиваний B и C добавьте 25 мкл лимфы и 60 мкл клеточных суспензий, не относящихся к лимфатической ткани, в лунки с PBS.
    4. Проводят in vitro стимуляцию цитокинов для выявления путем внутриклеточного окрашивания с использованием красителя С.
      1. Центрифугируйте 96-луночную пластину с пятном C с шага 7.1.3 при 680 x g в течение 3 мин при 4 °C. Добавьте 200 мкл полной среды TIL (RPMI 1640, 10 мМ HEPES [pH 7], 10% FBS) в каждую лунку. Храните пластину с клеточной суспензией при температуре 4 °C в течение ночи.
      2. Рано утром следующего дня разбавьте коктейль для стимуляции клеток (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:500 на полном носителе TIL. Центрифугируйте пластину, содержащую суспензию ячеек при 680 x g , чтобы гранулировать ячейки, и щелкните, чтобы удалить среду. Ресуспендируют клетки в 200 мкл приготовленного коктейля для стимуляции клеток и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
      3. Добавьте 25 мкл раствора ингибитора транспорта белка, содержащего монензин, в разведении 1:1000 в полной среде TIL, перемешайте клетки и инкубируйте при 37 ° C в течение дополнительных 4 часов, чтобы обеспечить внутриклеточное накопление цитокинов.
    5. Выполните окрашивание клеток.
      1. Для пятен А и В (1-й день) и для пятен С (2-й день) центрифугу при 680 х г в течение 3 мин при 4 °С. Переверните пластины и добавьте в лунки соответствующие красители. Хорошо перемешайте, аккуратно пипеткой вверх и вниз с помощью многоканальной пипетки, и выдерживайте в течение 15 минут при ЛТ.
      2. Центрифугируйте пластины (как на шаге 7.1.5.1), затем добавьте соответствующие поверхностные пятна на пластины и аккуратно перемешайте путем пипетки многоканальной пипеткой. Инкубировать в течение 15 минут при 4 ° C и снова центрифугировать. Переверните пластины, промойте клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз 150 мкл SB и центрифугу.
      3. Переверните пластины, повторите стирку, осторожно пипеткой вверх и вниз с 150 мкл SB, и центрифугу при 680 x g в течение 3 мин при 4 ° C. Для окрашивания А ресуспендируйте каждую группу тканей в соответствующем объеме, как указано на листе окрашивания, и храните при температуре 4 °C. Для пятна B зафиксируйте с помощью фиксатора набора факторов транскрипции FoxP3 (см. Таблицу материалов) в течение 30 минут при RT. Для окрашивания С зафиксируйте в 1% (об./об.) параформальдегид в SB в течение 30 мин при RT.
      4. Центрифугируйте неподвижные пластины при 480 x g в течение 3 мин при 4 °C. Стирка 1x в SB. Для пятна B клетки можно оставить на ночь.
      5. Пермеабилизация клеток: ресуспендирование лунок в 150 мкл буфера для пермеабилизации набора факторов транскрипции FoxP3 для окрашивания B и в 0,5% (мас./об.) сапонина в SB для окрашивания C. Инкубировать в течение 15 мин при ЛТ. Центрифугировать неподвижные пластины при 480 x g в течение 3 мин при 4 °C.
      6. Переверните пластины и добавьте соответствующие коктейли для внутриклеточного окрашивания для окрашивания В и С. Инкубируйте в течение 30 минут при ЛТ.
      7. Центрифугируйте неподвижные пластины при 480 x g в течение 3 мин при 4 ° C и перелистывайте пластины. Промойте клетки 150 мкл соответствующих буферов пермеабилизации (окрашивание B, буфер пермеабилизации набора факторов транскрипции FoxP3; окрашивание C, сапонин).
      8. Переверните пластины и промойте пипеткой вверх и вниз в 150 мкл SB. Центрифуга при 480 x g в течение 3 мин при 4 °C. Переверните пластины и ресуспендируйте клетки в SB по группам тканей в соответствующих объемах, указанных на листе окрашивания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время образцы готовы к получению с помощью спектральной проточной цитометрии.
      9. Установите проточный цитометр (см. Таблицу материалов) с соответствующими элементами управления одиночным окрашиванием для каждого окрашивания и неокрашенными образцами для каждой группы тканей, чтобы учесть различия в автофлуоресценции во время разменивания. Получите соответствующие объемы для каждой группы тканей, как определено на листе окрашивания (таблица 2), и экспортируйте файлы .fcs.
  2. Анализ данных проточной цитометрии
    1. С помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии (см. Таблицу материалов) создайте новое рабочее пространство. Создайте новые группы для каждого органа (LN, селезенки и TIL). Импортируйте FCS-файлы для каждого органа в группу.
    2. Создайте двумерную точечную диаграмму, установите для осей значение (FSC-A x SSC-A) и примените полигональный вентиль к клеточным событиям, избегая событий на ребрах (все ячейки затворяют). Выберите события ячеек, измените оси на (FSC-A x FSC-H) и примените полигональный вентиль к событиям на линейной диагонали, исключив события, которые отклоняются от диагонали для создания «синглетного» вентиля. Выберите затвор «синглеты» и измените оси на (hCD45 x mCD45). Примените полигональные вентили к положительным событиям hCD45 и mCD45 и назовите их «человек» и «мышь» соответственно.
    3. Выберите человеческую популяцию и измените ось Y на Живую/Мертвую Воду. Примените полигональные ворота к живой / мертвой отрицательной популяции hCD45 и назовите ее «живым человеком». Выберите популяцию мыши и измените ось X на Live/Dead Aqua. Примените полигональные ворота к живой / мертвой отрицательной популяции mCD45 и назовите ее «живой мышью».
    4. Аналогичным образом выберите родительский затвор и оси X и Y, как описано в рабочих листах «Обычное стробирование потока A», «Стробирование спектрального потока B» и «Обычное стробирование потока C» (таблица 2), чтобы изолировать указанные популяции (например, В-клетки человека, активированные Т-клетки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные ворота для каждого пятна (кровотечение, A, B, C) включены в дополнительный файл 2.
    5. Создавайте таблицы подсчета и экспорта частоты в программном обеспечении для анализа проточной цитометрии для всех групп населения и экспортируйте их в программное обеспечение для работы с электронными таблицами. Родительская популяция для частот указана в таблице 2.
    6. Используйте данные для создания графиков на основе экспериментальных групп лечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные также могут быть проанализированы с помощью пакетов R в программном обеспечении для анализа. С помощью функции объединения можно создать один файл .fcs из всех анализируемых образцов. Эти данные могут быть уменьшены по размерам с помощью алгоритма T-SNE при добавлении параметров ключевых слов для типа ткани и группы лечения. Затем алгоритм FlowSOM можно использовать для кластеризации популяций, а инструмент ClusterExplorer можно использовать для идентификации популяций. Новые клеточные популяции могут быть идентифицированы таким образом, визуально сравнены и количественно определены между группами лечения или в различных тканях.
    7. Сопоставьте иммунные параметры опухолей в одной и той же группе лечения с ростом этой опухоли, чтобы определить иммунотипы, которые коррелируют с ингибированием роста опухоли. Количественно определите рост опухоли по удельной скорости роста (SGR) для этой опухоли, измерению, которое учитывает разницу в объемах опухоли за определенное время. Это измерение нормализует опухоли, собранные в разные дни из-за здоровья мышей и дат начала лечения.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В соответствии с протоколом опухоли на боку и экспериментальной временной шкалой (рис. 1) рост опухоли и иммунный ответ на терапию таргетным ингибитором тирозинкиназы (ИТК) и комбинированное лечение ниволумабом были изучены в двух различных PDX колоректального рака человека (КРР). Препараты ИТК были изучены на иммунодефицитных хозяевах для оценки роста опухоли только29. Эта модель позволила изучить изменения в иммунном ответе только ИТК и, что более важно, в сочетании с анти-PD-1. Это исследование было сосредоточено на когортах, обработанных комбинацией, в двух отдельных экспериментах, которые представляют собой успешную оценку с использованием мышей HIS-BRGS и технически ошибочный эксперимент. Для PDX CRC307P комбинированное лечение замедляло рост опухоли, что определялось объемами роста опухоли с течением времени, весом опухоли при сборе урожая и SGR (рис. 2A-C). С другой стороны, рост PDX, развившийся из метастатической опухоли от того же пациента, PDX CRC307M, протестированный в другой когорте мышей HIS-BRGS, был менее затронут тем же комбинированным лечением у мышей HIS-BRGS (рис. 2D).

Несмотря на распределение мышей HIS-BRGS в эквивалентные экспериментальные группы на основе общего химеризма человека (hCD45+) и Т-клеток человека (hCD3+) в крови до имплантации опухоли (рис. 3A-C), оба параметра увеличились в периферической иммунной системе (селезенке) и инфильтрирующих опухоль лейкоцитах (TIL) у мышей, получавших комбинированный прием CRC307P, но не у модели CRC307M (рис. 3D-F ). Примечательно, что, хотя обе когорты HIS-BRGS имели сопоставимый химеризм человека и Т-клеток в крови до имплантации опухоли, когорта CRC307M имела очень низкий химеризм лимфатических узлов и не смогла развить заметные уровни Т-клеток в селезенке в обработанной когорте (рис. 3D-F). Эксперимент CRC307M представляет собой технически несовершенный пример из-за общего недостаточного химеризма Т-клеток селезенки и химеризма лимфатических узлов. Мы предлагаем исключить мышей HIS, у которых <20% hCD3+ химеризм в селезенке и/или <1,5 x 106 hCD45+ клеток в лимфатических узлах в конце исследования. Для модели CRC307M большинство мышей были исключены, в основном из-за очень маленьких лимфатических узлов, в результате чего осталось только две мыши в когорте.

Дальнейшее исследование Т-клеток человека (рис. 4A) выявило больше активированных (HLA-DR+) Т-клеток в опухолях CR307P, но не в лимфе у мышей, обработанных комбинацией (рис. 4B). В «отрицательном» эксперименте CRC307M не было значительного увеличения HLA-DR + Т-клеток в TIL обработанных мышей HIS-BRGS при анализе всех мышей, что позволяет предположить, что эта неоптимальная когорта HIS-BRGS повлияла на значимость данных из-за мышей HIS с очень небольшим количеством Т-клеток и без активации (рис. 4B). Действительно, увеличение HLA-DR + Т-клеток в TIL в модели CRC307M действительно достигло значимости при исключении мышей HIS-BRGS с низким химеризмом Т-клеток (рис. 4B). Кроме того, было больше эффекторных CD8+ Т-клеток памяти и меньше TIM-3+ (терминально истощенных) Т-клеток в опухолях CRC307P, обработанных комбинацией, тогда как эта разница не была отмечена в модели CRC307M (рис. 4C, D). В этом эксперименте не наблюдалось никаких изменений в частотах цитотоксических Т-клеток (Granzyme B+ или IFNγ+TNFα+) среди мышей, получавших комбинированную обработку, хотя более высокие цитотоксические Т-клетки наблюдались в необработанных (рис. 4E) или обработанных (данные не показаны) опухолях по сравнению с лимфатическими узлами. Важно отметить, что, хотя не было различий в частотах между популяциями Т-клеток, более высокое количество цитотоксических Т-клеток наблюдалось в опухолях обработанных мышей HIS-CRC307P-BRGS с более высокими частотами (рис. 3B) и количеством Т-клеток человека в опухолях. С другой стороны, это комбинированное лечение не показало влияния на частоту Tregs ни в лимфатических органах CRC307P, ни в опухолях, хотя данные CRC307M показали тенденцию к снижению Tregs, которая должна быть подтверждена в другом эксперименте (рис. 4F).

В дополнение к опросу иммунной системы человека, иммунные изменения на опухолевых клетках также оценивались с помощью проточной цитометрии (рис. 5А). При стробировании клеток EpCAM+, как описано в протоколе, повышенная экспрессия MHC класса I (HLA-ABC) и класса II (HLA-DR) была обнаружена на опухолевых клетках CRC307P, вырезанных у мышей HIS-BRGS, обработанных комбинацией (рис. 5B). В модели CRC307M это же лекарственное лечение индуцировало экспрессию HLA класса II на опухолевых клетках, хотя и в меньшей степени, чем в модели CRC307P (рис. 5C). Таким образом, комбинированное лечение, по-видимому, индуцирует активацию MHC класса II, независимо от инфильтрации Т-клеток (рис. 5B, C). Примечательно, что экспрессия MHC на опухолевых клетках была ниже, чем на иммунных клетках человека, что согласуется с сообщениями об опухолях человека (рис. 5B). Аналогичным образом, комбинированное лечение привело к увеличению экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках EpCAM+ CRC307P (рис. 5D).

Наконец, корреляции иммунных реакций с ростом опухоли были исследованы путем построения графика SGR опухоли в сравнении с иммунными параметрами. Хотя частота CD4+ Т-клеток в опухолях необработанных мышей не показала корреляции с ростом опухоли, увеличение CD4+ Т-клеток показало значительную (рис. 6A) корреляцию с меньшим ростом опухоли и, более конкретно, активированными HLA-DR+ Т-клетками (рис. 6B), в комбинации, обработанной мышами HIS.

Figure 1
Рисунок 1: Схема, иллюстрирующая генерацию мышей HIS-BRGS и имплантацию опухолей CDX или PDX человека для исследований иммунотерапии рака. Сроки важны для обеспечения присутствия Т-клеток, которым требуются месяцы для приживления у мышей HIS, полученных из CB. Создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ опухолевого роста. Измерения роста опухоли для CRC307P PDX у контрольных (черных) или комбинированных (красных) мышей HIS-BRGS, количественно определяемых по (A) объему с течением времени, (B) весу в конце исследования или (C) удельному темпу роста (SGR). (D) SGR для CRC307M PDX. Данные включают опухоли, имплантированные в оба бока шести мышей-носителей HIS-BRGS, семи мышей BRGS, обработанных комбинацией для CRC307P, и только двух мышей, обработанных носителем и комбинацией, для CRC307M из-за высоких показателей исключения. Статистический анализ между двумя независимыми группами проводился с использованием непарного, параметрического двухгруппового t-критерия Уэлча. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Иммунный и Т-клеточный химеризм человека в лимфатических органах и опухолях мышей HIS-BRGS с опухолями CRC PDX. (A) Репрезентативный анализ проточной цитометрии гемопоэтических клеток человека (hCD45) и мыши (mCD45) и клеток Т (CD3) человека в периферической крови (PBMC) до имплантации опухоли, а также в LN и опухолях (TIL) в конце исследования. (В,В) Эквивалентный химеризм человека и Т-клеток в крови через 14 недель у мышей HIS-BRGS, которым впоследствии вводили (B) CRC307P или (C) CRC307M PDX и не лечили или лечили комбинированной иммунотерапией (Tx). (Д-Ж) Увеличение количества Т-клеток человека в лимфатических органах и опухолях (TIL) у мышей HIS-BRGS-CRC307P, получавших комбинированную терапию, но не у мышей HIS-BRGS-CRC307M. Данные показывают частоту человеческих и Т-клеток по оси Y в процентах от родительской популяции в (D) лимфатических узлах (LN), (E) селезенке (SP) и (F) опухолях отдельных мышей в конце исследования. Статистический анализ между двумя независимыми группами проводился с использованием непарного, параметрического двухгруппового t-критерия Уэлча. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ активации Т-клеток методом проточной цитометрии в периферических лимфатических органах и опухолях мышей HIS-BRGS С CRC PFX. (A) Репрезентативный анализ проточной цитометрии Т-клеток в LN, селезенке (SP) и опухолях (TIL), удаленных у мышей HIS-BRGS, измеряя следующие популяции: активированные Т-клетки (HLA-DR+), наивные Т-клетки (CD45RA+), CCR7+), Tem (CD45RA-, CCR7-), Tregs (CD25+, FoxP3+) и цитотоксические Т-клетки (Granzyme B+, TNFα+ и/или IFNγ+). (Б-Д) Частоты указанных популяций Т-клеток в лимфатических органах или TIL мышей HIS-CRC307P-BRGS и HIS-CRC307M-BRGS: (B) активированные HLA-DR+ Т-клетки, (C) CCR7-CD45RA-Tem CD8+ Т-клетки, (D) ингибирующие рецепторы TIM-3 CD8+ Т-клетки, (E) Granzyme B CD8+ Т-клетки и (F) CD25 + FoxP3 + CD4+ Tregs. Для мышей HIS-CRC307M-BRGS в (B) первый набор данных показывает всех мышей, проанализированных при сборе урожая, тогда как второй набор данных включает только те, у которых есть достаточный химеризм LN и селезеночных Т-клеток. На всех графиках заполненные символы для 307M представляют мышей с достаточным химеризмом, тогда как открытые символы исключают мышей HIS. Статистический анализ между двумя независимыми группами проводился с использованием непарного, параметрического двухгруппового t-критерия Уэлча. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Проточный цитометрический анализ MHC классов I, II и PD-L1 на опухолях человека у мышей HIS-BRGS. (A) Репрезентативные точечные графики проточной цитометрии, иллюстрирующие стратегию стробирования для измерения уровней экспрессии MHC класса I (HLA-ABC), КЛАССА II (HLA-DR) и PD-L1 на эпителиальных (EpCAM+) опухолях человека у мышей HIS-BRGS. (Б-Д) Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) HLA-ABC (B), HLA-DR (B, C) и PD-L1 (D) на клетках человека (hCD45+) и опухолевых (EpCAM+) клетках из диссоциированных PDX CRC307P (B, D) или CRC307M (C), вырезанных у мышей HIS-BRGS. Статистический анализ между двумя независимыми группами проводился с использованием непарного, параметрического двухгруппового t-критерия Уэлча. *p <0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. Аббревиатура: Tx = Лечение Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Анализ иммунокоррелятов ответа. SGR роста опухоли CRC307P на флангах необработанных (Veh) или обработанных комбинированной иммунотерапией (Tx) мышей HIS-BRGS были построены по сравнению с частотой (A) CD4+ или (B) HLA-DR+ Т-клеток в качестве индикатора иммунных параметров, которые коррелируют со снижением роста опухоли (т.е. меньшим SGR). Для выявления значимых корреляций был проведен простой линейный регрессионный анализ. Значения R2 указывают на степень корреляции. *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Рабочий лист панели окрашивания поверхности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Панели окрашивания клеток и рабочий лист стробирования проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Рецепты сред и растворов, использованных в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Репрезентативное стробирование проточной цитометрии для каждого пятна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

За последние 6 лет, используя наш опыт как в области иммунологии, так и в области гуманизированных мышей, наша исследовательская группа разработала столь необходимую доклиническую модель для тестирования иммунотерапии на различных опухолях человека 3,7,30,31. В этом протоколе особое внимание уделяется рассмотрению вариабельности модели, уделяя особое внимание иммунотерапевтическим популяциям Т-клеток человека. В этом протоколе описана генерация мышей HIS, а также иммунный анализ как их лимфатических органов, так и опухоли. Также были включены протоколы проточной цитометрии, разработанные для традиционных компенсационных цитометров и спектральных цитометров. Возможность исследовать изменения иммунной системы в больших образцах опухолей, а также на периферии представляет собой значительное преимущество этой доклинической модели. Дополнительным преимуществом этой системы является то, что несколько мышей, несущих одну и ту же уникальную человеческую опухоль, могут быть выделены в отдельные когорты и обработаны различными комбинациями иммунотерапевтических препаратов, по сути, выполняя «мини» испытание препарата. В совокупности эти два фактора позволяют исследовать механизмы действия и резистентность предлагаемых (комбинированных) иммунотерапий. Модель имеет возможность тестировать время и дозировку лекарств на широком спектре опухолей человека и множество иммунотаргетных методов лечения, включая таргетную терапию, биологические препараты, химиотерапию, лучевую терапию и даже клеточную терапию.

Из-за присущей изменчивости химеризма мышей HIS требуется большее количество мышей в группе лечения, чем типичная модель сингенной опухоли. Используя эти протоколы, когорты из пяти-семи мышей HIS-BRGS в каждой группе лечения достаточны для получения статистических различий в иммунных параметрах. Эта изменчивость химеризма представляет собой проблему в этой модели и должна быть рассмотрена. Здесь был показан экспериментальный пример, демонстрирующий как рост опухоли, так и иммунный ответ при комбинированном лечении CRC PDX, а также пример, в котором то же лечение другим CRC PDX не показало аналогичного сильного ответа. Это различие в экспериментальном исходе может быть связано с разным PDX (один и тот же пациент, но метастатический по сравнению с первичным) и/или химеризмом. Во втором эксперименте в селезенке большинства мышей в группе лечения было очень мало Т-клеток, а также очень маленькие LN; несколько лабораторий показали, что наибольшая вариабельность от партии к партии среди HIS-моделей - это частоты Т-клеток 20,32,33. Мы также показали, что приживление человека в LNs сильно коррелирует с химеризмом Т-клеток32. В более чем 40 экспериментах мы отметили потребность в 20% Т-клеток в селезенке для адекватного химеризма для выявления иммунных изменений, связанных с лечением3. После жертвоприношения важно обеспечить значительное восстановление Т-клеток, которое мы определяем как заметное развитие LN (>1,5 x 106 hCD45 клеток) и >20% Т-клеток (hCD45+ клеток) в селезенке. Мыши HIS, которые не соответствуют этому требованию, удаляются из набора данных. Химеризм в крови до имплантации опухоли помогает предсказать этот параметр; однако существуют различия в развитии Т-клеток у отдельных мышей с течением времени, которые лучше всего рассмотреть в конце исследования. К счастью, в этой модели примерно у 95% когорт мышей HIS-BRGS развивается достаточный химеризм Т-клеток для исследований иммунотерапии. Следует подчеркнуть, что анализ данных в конце исследования всегда должен включать опрос химеризма в периферических лимфатических органах и удаление мышей HIS, которые не соответствуют химеризму человека и Т-клеток. В экспериментах с менее чем четырьмя мышами HIS в когорте после этой корректировки результаты должны быть подтверждены с другой когортой HIS-BRGS, полученной из отдельного CB.

Несмотря на то, что наша группа сосредоточилась на получателе модели мыши BRGS, во всем мире доступно множество моделей. Например, реципиент NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ) является наиболее широко охарактеризованной моделью и похож на NOG (NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg tm1Sug/Jic) и даже на модель NRG (NOD-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ), которая использует мутации Rag для генетической абляции Т- и В-клеток мыши вместо мутацииSCID 20. Все эти модели основаны на фоновом штамме NOD и, таким образом, имеют аллельSIRPa NOD, который важен для предотвращения фагоцитоза клеток человека макрофагами-хозяевами13. Отчеты предполагают аналогичный химеризм в этих «базовых» гуманизированных моделях мышей, как и в модели BRGS, с преимущественно человеческими В-клетками в первые несколько месяцев, за которыми следует приживление с человеческими Т-клетками32,34,35. В этих моделях NK и миелоидные клетки недостаточно представлены по сравнению с человеческими36,37. Существует несколько итераций гуманизированных реципиентов мышей «следующего поколения», которые могут улучшить развитие специфической линии за счет введения цитокинов, специфичных для человека. Например, мыши NSG-SGM3 (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ) имеют цитокины IL-3, GM-CSF и SCF человека и улучшенный миелопоэз человека 37 или трансгены HLA человека для отбора на HLA человека (например, NSG-HLA-A2 или BRGS-HLA-A2/DR238,39). Обширные обзоры на эту тему20,21 рекомендуются читателям. Модели мышей HIS должны быть проверены в каждой лаборатории с их собственным источником стволовых клеток человека. Эта валидация должна включать количественную оценку химеризма человека, включая человеческие B, T, NK и миелоидные клетки, в крови с течением времени и в LN, селезенке, костном мозге и тимусе между 16-20 неделями и снова между 24-28 неделями. Особое внимание следует уделить многолинейному приживлению, в том числе химеризму Т-клеток. Кроме того, скорость роста опухолей должна быть проверена на мышах HIS по сравнению с негуманизированными мышами того же штамма. Вполне вероятно, что значительные улучшения в мышиных моделях HIS могут привести к отторжению опухоли. В качестве попытки экономии ресурсов эти кривые роста часто выполняются одновременно с анализом данных иммунного ответа. Коммерчески доступные мыши HIS должны включать обширные данные о химеризме из крови, а также ссылки на химеризм в других органах из других когорт.

Экспериментальные протоколы для анализа роста опухоли и иммунных реакций у мышей HIS на человеческие CDX или PDX требуют стандартных лабораторных методологий и иммунологического опыта. Генерация мышей HIS, включая выделение стволовых клеток, инъекции иммунодефицитным мышам и тестирование химеризма человека в крови, являются относительно простыми лабораторными процедурами. Логистические проблемы, связанные с этой процедурой, включая разведение штаммов мышей с высоким иммунодефицитом, приобретение надежного источника человеческих ГСК и т. д., являются наиболее громоздким компонентом протокола. С процедурной точки зрения больше внимания должно уделяться дизайну эксперимента, включая сроки имплантации опухоли (обычно 19-21 неделя при наличии достаточного количества Т-клеток), дозировку препарата и время окончания исследования. Получение данных измерения опухоли является еще одной рутинной процедурой. Однако, поскольку иммунные данные часто более информативны, чем данные о росте опухоли в этой системе, проточный цитометрический анализ иммунных реакций может предоставить соответствующие данные. Окрашивание клеток для проточной цитометрии — еще одна простая процедура, как и обучение работе с проточным цитометром. Однако анализ и интерпретация этих данных требует уникального опыта. Хотя эта рукопись служит основой для проведения иммуноонкологических исследований на мышах HIS, каждый шаг протокола должен быть оптимизирован в новой лаборатории. Исходя из опыта, поддержание здоровья мышей, приобретение адекватных ГСК из единиц CB и выбор времени для инъекций опухоли для достаточного количества Т-клеток требуют наибольшего внимания и устранения неполадок.

Мыши HIS-BRGS демонстрируют крайнюю иммунную супрессию, аналогичную той, которая наблюдается во многих опухолях человека. Эта иммунная супрессия примечательна, так как высокие уровни экспрессии PD-1 и TIGIT, но меньше TIM-3, наблюдаются на Т-клетках в периферических иммунных органах мышей HIS-BRGS 3,7. Эти Т-клетки также демонстрируют маркеры иммунной активации, включая высокую экспрессию HLA-DR и низкую экспрессию CCR7 и CD45RA, что указывает на Т-эффекторные клетки, как показано здесь на рисунке 4 и в ссылках 3,7. Это качество является центральным парадоксом системы; иммуносупрессия позволяет расти аллогенным опухолям человека в присутствии аллогенного ГИС со скоростью, аналогичной или даже более быстрой, чем у негуманизированных BRGS или голых (Nu / J) мышей 3,7,23. Однако было показано, что иммунные стимулы способны преодолеть эту иммуносупрессию и отторгнуть опухоль 7,8. Хотя значительные изменения в росте опухоли между носителями и обработанными мышами не всегда наблюдаются, значительные различия в иммунных фенотипах были обнаружены чаще, поэтому предлагается анализ скорости роста опухоли, коррелирующей с иммунными фенотипами. В этом анализе были обнаружены иммунные параметры, которые достоверно коррелируют со снижением ростаопухоли3. Эти данные свидетельствуют о том, что определенные «иммунокорреляты» связаны с лечением и участвуют в борьбе с опухолью. Таким образом, измерения роста опухоли в сочетании с иммунными фенотипами в мышиной модели HIS предоставляют важные доклинические данные в отношении иммунных реакций опухоли на уникальные опухоли человека. Проблемой для любой доклинической модели является корреляция с клиническими результатами. В области онкологии мышей HIS есть несколько примеров клинической корреляции: 1) мы и другие показали, что иммунная инфильтрация человека коррелирует с опухолью типа 3,22,23,40; 2) мы показали успешное лечение анти-PD-1 при синдроме Линча ACC PDX, взятом у пациента, который впоследствии ответил на эту терапию31; и 3) мы показали превосходную реакцию на CRC MSS hi PDX, рак с высокими показателями ответа в клинике по сравнению с заведомо плохо реагирующим CRC MSS PDX7. Вместе с in vitro и другими моделями in vivo эти данные обеспечивают связь для трансляции в клинику.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить как Центр исследований животных (OLAR) за заботу о наших мышах, так и общий ресурс проточной цитометрии, поддерживаемый грантом поддержки онкологического центра (P30CA046934) в нашем институте, за их огромную помощь во всей нашей работе. Мы также выражаем признательность Гейл Экхардт и Анне Капассо за наше первое сотрудничество по изучению иммунотерапии PDX человека в нашей модели HIS-BRGS. Это исследование было частично поддержано грантом поддержки онкологического центра Национального института здравоохранения P30CA06934 с использованием общего ресурса PHISM (доклинические модели иммунной системы человека), RRID: SCR_021990 и общего ресурса по проточной цитометрии, RRID: SCR_022035. Это исследование было частично поддержано NIAID Национальных институтов здравоохранения по контракту No 75N93020C00058.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe w/needles McKesson 1031815
15 mL tubes Grenier Bio-One 188271
2-mercaptoethanol Sigma M6250
50 mL tubes Grenier Bio-One 227261
AutoMACS Pro Separator Miltenyi 130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin BD Bioscience BDB563792
BSA Fisher Scientific BP1600100
Cell Stim Cocktail Life Technologies 509305
Chill 15 Rack Miltenyi 130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes Fisher Scientific 13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract R&D Systems 363200502
Cytek Aurora Cytek
DNase Sigma 9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set Invitrogen 00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS Gibco 10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume Grenier Bio-One 616201
Excel Microsoft
FBS Benchmark 100-106 500mL
Ficoll Hypaque GE Healthcare 45001752
FlowJo Software BD Biosciences
Forceps - fine Roboz Surgical  RS5045
Forceps normal Dumont RS4919
Formaldehyde Fisher F75P1GAL
Frosted Glass Slides Corning 1255310
Gentlemacs C-Tubes Miltenyi    130-096-334
GentleMACS Dissociator Miltenyi 130-093-235
glass pipettes DWK Life Sciences 63A53
Glutamax Gibco 11140050
HBSS w/ Ca & Mg Sigma 55037C
HEPES Corning MT25060CI
IgG standard Sigma I2511
IgM standard Sigma 401108
IMDM Gibco 12440053
Liberase DL Roche 5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue Thermo L23105
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MEM Gibco 1140050
mouse anti-human IgG-AP Southern Biotech JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled Southern Biotech H2
mouse anti-human IgM-AP Southern Biotech UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled Southern Biotech SA-DA4
MultiRad 350 Precision X-Ray
PBS Corning 45000-446
Pen Strep Gibco 15140122
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713A
p-nitrophenyl substrate Thermo 34045
PRISM Graphpad
Rec Hu FLT3L R&D systems 308-FK-005/CF
Rec Hu IL6 R&D systems 206-IL-010/CF
Rec Hu SCF R&D systems 255SC010
RPMI 1640 Corning 45000-39
Saponin Sigma 8047-15-2
Scissors McKesson 862945
Serological pipettes 25 mL Fisher Scientific 1367811
Sterile filter Nalgene 567-0020
Sterile molecular water Sigma 7732-18-5
Yeti Cell Analyzer Bio-Rad 12004279
Zombie Green biolegend 423112

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
  2. Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
  3. Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
  4. Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
  5. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
  6. Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
  7. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
  8. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  9. Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
  10. Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
  11. Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
  12. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  13. Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
  14. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  15. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  16. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  17. Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
  18. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  19. Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
  20. Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
  21. Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
  22. Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
  23. Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
  24. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
  25. Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
  26. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
  27. Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
  28. Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
  29. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
  30. Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
  31. Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
  32. Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
  33. Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
  34. Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
  35. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
  36. Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
  37. Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
  38. Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
  39. Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
  40. Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).

Tags

Исследование рака выпуск 190

Erratum

Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 05/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

Тестирование иммунотерапии рака на гуманизированной мышиной модели с опухолями человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lanis, J. M., Lewis, M. S.,… More

Lanis, J. M., Lewis, M. S., Strassburger, H., Larsen, K., Bagby, S. M., Dominguez, A. T. A., Marín-Jiménez, J. A., Pelanda, R., Pitts, T. M., Lang, J. Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. J. Vis. Exp. (190), e64606, doi:10.3791/64606 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter