Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Testa cancerimmunotherapeutics i en humaniserad musmodell som bär mänskliga tumörer

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64606
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 2, 1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll beskriver genereringen av möss med humant immunsystem (HIS) för immunonkologistudier. Instruktioner och överväganden vid användning av denna modell för testning av humana immunotherapeutics på humana tumörer implanterade i denna modell presenteras med tonvikt på att karakterisera det mänskliga immunsystemets svar på tumören.

Abstract

Att vända den immunsuppressiva naturen hos tumörmikromiljön är avgörande för framgångsrik behandling av cancer med immunterapiläkemedel. Murina cancermodeller är extremt begränsade i sin mångfald och lider av dålig översättning till kliniken. För att fungera som en mer fysiologisk preklinisk modell för immunterapistudier har detta protokoll utvecklats för att utvärdera behandlingen av humana tumörer i en mus rekonstituerad med ett humant immunsystem. Detta unika protokoll visar utvecklingen av humant immunsystem (HIS, "humaniserad") möss, följt av implantation av en mänsklig tumör, antingen en cellinjehärledd xenograft (CDX) eller en patienthärledd xenograft (PDX). HIS-möss genereras genom att injicera CD34 + humana hematopoetiska stamceller isolerade från navelsträngsblod i neonatal BRGS (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) mycket immunbristfälliga möss som också kan acceptera en xenogen tumör. Betydelsen av kinetiken och egenskaperna hos det mänskliga immunsystemets utveckling och tumörimplantation betonas. Slutligen beskrivs en fördjupad utvärdering av tumörmikromiljön med hjälp av flödescytometri. I många studier med användning av detta protokoll fann man att tumörmikromiljön hos enskilda tumörer rekapituleras i HIS-PDX-möss; "Heta" tumörer uppvisar stor immuninfiltration medan "kalla" tumörer inte gör det. Denna modell fungerar som en testplats för kombinationsimmunterapier för ett brett spektrum av mänskliga tumörer och representerar ett viktigt verktyg i strävan efter personlig medicin.

Introduction

Muscancermodeller är viktiga för att etablera grundläggande mekanismer för tumörtillväxt och immunflykt. Cancerbehandlingsstudier i musmodeller har dock gett begränsad översättning till kliniken på grund av begränsade syngena modeller och artspecifika skillnader 1,2. Framväxten av immunterapier som ett dominerande tillvägagångssätt för att kontrollera tumörer har upprepat behovet av en in vivo-modell med ett funktionellt mänskligt immunsystem. Framsteg inom humana immunsystemmöss (HIS-möss) under det senaste decenniet har gjort det möjligt att studera immunonkologi in vivo i en mängd olika cancertyper och immunterapeutiska medel 3,4,5,6. Humana tumörmodeller, inklusive cellinjehärledda och patienthärledda xenotransplantat (CDX respektive PDX), växer bra hos HIS-möss och är i de flesta fall nästan identiska med deras tillväxt i den immunbristfälliga värden som saknar human hematopoetisk engraftment 7,8. Baserat på detta viktiga fynd har forskare använt HIS-musmodellen för att studera humana immunterapier, inklusive kombinationsterapier utformade för att förändra tumörmikromiljön (TME) för att minska immunsuppression och därmed förbättra immunriktad tumördöd. Dessa prekliniska modeller hjälper till att ta itu med problemen med heterogenitet hos mänskliga cancerformer och kan också förutsäga behandlingsframgång samt övervaka immunrelaterade läkemedelstoxiciteter 9,10.

Produktionen av en musmodell med ett mänskligt immunsystem genom införande av humana hematopoetiska stamceller kräver en mottagande immunbristfällig mus som inte kommer att avvisa xenogramfen. Nuvarande HIS-musmodeller härrör från immunbristfälliga musstammar som rapporterades för över 30 år sedan. Den första immunbristfälliga musstammen som beskrevs var SCID-möss som saknade T- och B-celler11, följt av en hybrid NOD-SCID med en SIRPα-polymorfism som är ansvarig för musmakrofagtolerans mot mänskliga celler, på grund av ökad bindning för NOD SIRPα-allelen till den humana CD47-molekylen12,13. I början av 2000-talet var deletionen av den gemensamma gammakedjan av IL-2-receptorn (IL-2Rγc) på både BALB / c och NOD immunbristfälliga stammar en spelväxlare för förbättrad mänsklig engraftment, på grund av genetiska deletioner som förbjuder värd NK-cellutveckling14,15,16,17. Alternativa modeller, såsom BRG- och NRG-möss, uppnår T- och B-cellbrist genom deletion av Rag1- eller Rag2-genen, som krävs för omarrangemang av T- och B-cellreceptorgener och därmed mognad och överlevnad av lymfocyter18,19. BRGS-musen (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) som används här kombinerar IL-2Rγ-kedjebristen ochNOD SIRPα-allelen på Rag2-/-bakgrunden, vilket resulterar i en mus med mycket immunbrist utan T-, B- eller NK-celler, men ändå med tillräcklig kraft och hälsa för att möjliggöra långvarig engraftment på mer än 30 veckor13.

HIS-möss kan genereras på flera sätt, med human PBMC-injektion som den mest direkta metoden15,18,20. Dessa möss har dock en uttalad expansion av aktiverade humana T-celler som resulterar i transplantat mot värdsjukdom (GVHD) vid 12 veckors ålder, vilket förhindrar långtidsstudier. Alternativt kan humana hematopoetiska stamceller från navelsträngsblod (CB), benmärg och fosterlever också användas för engraftment och produktion av det mänskliga immunsystemet de novo. I detta system producerar de hematopoetiska stamcellerna ett humant immunsystem med flera linjer med generering av T, B och medfödda immunceller som är viktiga toleranta mot musvärden jämfört med PBMC-mössen som utvecklar mestadels T-celler. Därför är GVHD frånvarande eller kraftigt försenad, och studier kan utvidgas till möss upp till 10 månaders ålder. CB tillhandahåller en enkel, tillgänglig och icke-invasiv källa till CD34 + humana hematopoetiska stamceller som underlättar engraftment av flera HIS-möss med genetiskt identiska immunsystem 17,18,20,21. Under de senaste åren har HIS-musmodeller använts i stor utsträckning för att studera immunterapi och TME 3,4,5,6. Trots utvecklingen av humant härledda immunsystem hos dessa möss växer humana xenografttumörer i liknande takt jämfört med kontrollimmunbristfälliga möss och möjliggör det komplexa samspelet mellan cancercellerna och immuncellerna, vilket är viktigt för att upprätthålla mikromiljön hos den transplanterade PDX 3,7,8 . Detta protokoll har använts för att utföra över 50 studier som testar behandlingar i HIS-BRGS-möss med PDX och CDX. En viktig slutsats är att humana tumörer i HIS-mössen bibehåller sin unika TME som definieras genom molekylär utvärdering av tumören i förhållande till det initiala patientprovet och immuninfiltratkarakteristika 3,22,23. Vår grupp fokuserar på djupgående utvärdering av HIS i både immunorgan och tumör med hjälp av multiparameterflödescytometri. Här beskriver vi ett protokoll för humanisering av BRGS-möss, utvärdering av chimärism, implantation av humana tumörer, tumörtillväxtmätningar, administrering av cancerbehandling och analys av HIS-cellerna genom flödescytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Allt djurarbete utfördes enligt djurprotokoll godkända av University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocols #00593 och #00021). Allt djurarbete utfördes i enlighet med Office of Laboratory Animal Resources (OLAR), en ackrediterad anläggning av American Association for Laboratory Animal Care, vid University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus. Alla humana navelsträngsblodprover erhölls som donationer från avidentifierade givare och är därför inte föremål för godkännande av den mänskliga forskningsetiska kommittén.

OBS: Kompositioner av alla medier och lösningar som nämns i protokollet ingår i kompletterande fil 1. Figur 1 illustrerar det övergripande protokollet för generering och analys av immunsvar mot tumörer hos HIS-BRGS-möss.

1. Generation av HIS-möss

  1. Mushållning av BALB/c -Rag2 null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) möss
    OBS: Denna stam är extremt immunbristfällig, utan T-, B- eller NK-celler. Därför måste stränga åtgärder vidtas för att förhindra opportunistiska infektioner. Behåll kolonin på en diet som innehåller trimetoprim och sulfadiazin på ett alternerande 2 veckors schema med en normal diet. Håll dig i högsta möjliga försiktighetsnivå bostadsrum (t.ex. en barriärdusch-in-anläggning med begränsad tillgång).
    1. Behåll kolonier av BALB/c -Rag2 null Il2RγC null Sirpα NOD (BRGS) och BALB/c Rag2 null Il2RγC null SirpaBalb/c (BRG) homozygota möss som uppfödare.
    2. Föda upp BRGS N/N×BRG B/B för att generera BRGSB/N-ungar, som ska användas som mottagare av mänskliga stamceller. I denna koloni är BRGSB / N friskare än BRGS N/ N och transplantat på motsvarande nivåer (mer än BRG).
  2. CD34+ isolering av mänskliga stamceller från navelns CB
    OBS: Inga antibiotika används för denna procedur. Därför är god steril teknik absolut nödvändig.
    1. Placera ett 50 ml koniskt rörställ, samt 3x 15 ml och ~ 10x 50 ml koniska rör i ett steriliserat biosäkerhetsskåp (BSC). Spraya en bloduppsamlingspåse med 70% etanol och låt den torka i BSC.
    2. Beräkna antalet 50 ml koniska rör som krävs för CB-densitetsgradientisolering = CB-volym/15, avrundat uppåt och till ett jämnt rörtal. Beräkna blodvolym per rör = CB-volym / antal rör. Häll försiktigt blod från CB-påsen i varje koniskt rör; detta är högst 15 ml per rör. Använd en automatisk pipettor och en 25 ml serologisk pipett för att blanda blodet 1:1 med sterilt PBS genom att pipettera upp och ner.
    3. Använd en automatisk pipettor på låg hastighet och en 10 ml serologisk pipett för att långsamt lägga in blodet med rumstemperatur (RT) 1,077 g / ml densitetsgradientlösning (se materialförteckning) utan att störa gränssnittet. Se till att pipettspetsen inte vidrör rörets botten. Upprepa för alla rör. Centrifugera sedan i 30 minuter vid 850 x g, utan bromsning, vid RT för att säkerställa bibehållande av densitetsgradienten.
    4. Visualisera den cellulära buffybeläggningen ovanpå densitetsgradienten 1,077 g / ml som ett grumligt vitt lager. Ta bort och kassera plasmaskiktet ner till ca 10 ml ovanför buffyskiktet med en 25 ml serologisk pipett och en automatisk pipettor.
    5. Samla upp buffypälsen med en steril överföring eller serologisk pipett. Använd pipetten som en spatel för att skrapa cellerna från sidan av det koniska röret medan du släpper glödlampan (eller pipetterar långsamt) för att dra upp cellerna. Kombinera buffyskikten från två 50 ml koniska rör till ett nytt 50 ml koniskt rör.
    6. Tvätta cellerna genom att hälla 45 ml steril HBSS innehållande 2% FBS i varje koniskt rör. Centrifugera i 11 min vid 360 x g vid rumstemperatur.
    7. Aspirera tvättmediet ner till pelleten i alla rör. Använd en 10 ml serologisk pipett och en automatisk pipettor för att resuspendera den första pelleten i 10 ml HBSS innehållande 2% FBS. Resuspendera varje pellet i samma 10 ml HBSS och skölj varje rör med ytterligare 10 ml HBSS för att samla alla celler i ett enda rör.
    8. Häll 45 ml steril HBSS innehållande 2% FBS i det koniska röret. Centrifugera i 10 min vid 360 x g vid 4 °C.
    9. Aspirera tvättbufferten ner till cellpelleten och suspendera pelleten igen i 20 ml magnetisk cellseparatorbuffert (se materialtabell). Ta bort en liten alikvot för att räkna cellerna med en hemacytometer vid en spädning på 1:20 i metylenblått. Lägg till antalet blå och vita celler. Centrifugera vid 360 x g i 10 min vid 4 °C.
      OBS: Detta protokoll använder magnetisk pärlteknik (se materialförteckning). Protokollet kan modifieras för användning med vilken cellseparationsteknik som helst, med tillräcklig renhet och utbyte av CD34 + stamceller.
    10. Aspirera supernatanten och resuspendera CD34 + cellpelleten isolerad från navelsträngsblod i 300 μL magnetisk cellseparatorbuffert per 1 x 108 celler. Tillsätt först 100 μL FcR-blockerande reagens och sedan 100 μL CD34+ magnetiska pärlor per 1 x 108 celler. Inkubera vid 4 °C i 30 minuter (ingen is).
    11. Tillsätt 5 ml magnetisk cellseparatorbuffert per 1 x 108 celler och snurra vid 360 x g i 10 minuter vid 4 °C. Upprepa tvättsteget och suspendera pelleten igen i 500 μL magnetisk cellseparatorbuffert per 1 x 108 celler i ett 15 ml koniskt rör märkt "ofraktionerat".
    12. Märk ytterligare två 15 ml koniska rör "CD34-" och "CD34+". Placera de tre 15 ml koniska rören (ofraktionerade, CD34- och CD34+) i slitsarna A1, B1 respektive C1 på ett kylställ (se Materialtabell). Separera cellerna med hjälp av det positiva urvalsprogrammet med två kolumner på en automatisk magnetisk cellseparator (se materialförteckning) i en BSC, enligt tillverkarens instrumentinstruktioner.
  3. Expanderande och frysning av CD34 + mänskliga stamceller
    1. Alikvot 10 μL av den återvunna CD34+ cellsuspensionen (2 ml) på en hemocytometerglas, glid och räkna cellerna under 10x förstoring. Beräkna det totala antalet CD34 + -celler genom att multiplicera cellantalet med 2 x 104. Dela det totala CD34 + cellnumret med 250 000 för att beräkna antalet injektionsflaskor som ska frysa (50 000 celler per musvalp före in vitro-expansion ).
    2. Förbered CB-mediet Iscoves 10% FCS (plus 1 ml extraför filtreringsförlust), kompletterat med 40 ng / ml stamcellsfaktor, 20 ng / ml Flt3L och 10 ng / ml IL-6 och passera genom ett 0,22 μm filter. Resuspendera CD34+-cellerna vid 100 000 per ml CB-medium och inkubera vid 37 °C. På dag 3 tillsätts en motsvarande volym CB-medium utan cytokiner till kolven som innehåller cellerna och CB-mediet med cytokiner.
      OBS: Tillägg av dessa cytokiner till CB-mediet främjar överlevnad och expansion av CD34 + -cellerna samtidigt som differentiering förhindras.
    3. Skörda de expanderade CD34 + -cellerna på dag 5. Pipettera cellsuspensionen upp och ner och samla i ett 50 ml koniskt rör. Tillsätt tillräckligt med CB-medium för att täcka kolvens botten. Skrapa hela kolvens botten med en cellskrapa. Samla alla medier i samma 50 ml rör och centrifugera vid 360 x g i 11 minuter.
    4. Resuspendera cellerna i 2 ml CB-medium. Spara den sista droppen från pipetten i en 96-brunnsplatta för räkning. Späd cellerna 1: 1 i trypanblått och tillsätt 10 μL till hemacytometern, räkna sedan och genomsnittliga celler från fyra kvadranter. Beräkna det totala antalet CD34 + -celler genom att multiplicera cellantalet med 4 x 104 och registrera livskraften.
    5. Gör n+1 ml frysmedel, där n är antalet injektionsflaskor beräknat i steg 1.3.1. Förbered frysmedel genom att tillsätta 10% (v / v) DMSO till FBS och håll på is. Märk kryovialerna med CB #, CD34 + d5 och datum.
    6. Snurra ner CD34 + -cellerna vid 360 x g i 10 minuter vid 4 ° C. Aspirera mediet ner till pelleten och resuspendera cellpelleten i frysmedium. Alikvot 1 ml cellsuspension till varje injektionsflaska och dela eventuella rester jämnt mellan injektionsflaskorna. Tillsätt injektionsflaskorna i en isopropanolcellfrys kyld till 4 °C, placera vid -80 °C och överför till flytande kväve för lagring i >90 dagar.
  4. Bestrålning av musvalpar
    1. Samla BRGSB / N-valparna , 1-3 dagar efter födseln, i en autoklaverad plastlåda med stoppning. Tillsätt en liten mängd sängkläder med valparna. Märk lådan med burnummer och antal valpar.
    2. Ställ in bestrålningsapparaten (se materialförteckning) för en dos av 300 rad. Ställ lådan med valpar i bestrålningsanordningen och utsätt dem för 300 rad. Ta valparna tillbaka till buren, lägg dem i en hög och täck med sängkläder.
  5. Injektioner av valpar och CD34 + cellberedning
    1. Börja CD34 + cellberedning ~ 3 timmar efter bestrålning. Värm 10 ml CB-media i ett 50 ml koniskt rör. Utför alla steg i en steril BSC.
    2. Hämta en injektionsflaska med in vitro expanderade och frysta CD34 + -celler för var fjärde till sex valpar att injicera. Tina snabbt vid 55 °C tills bara en liten mängd is syns och tillsätt cellerna till det uppvärmda CB-mediet (injektionsflaskan ska fortfarande vara sval vid beröring.) Använd 1 ml medium för att skölja varje injektionsflaska och snurra cellerna vid 360 x g i 12 minuter vid 4 °C.
      OBS: Snabb upptining vid 55 ° C visade sig ge bättre cellviabilitet (90% -95%) än upptining vid 37 ° C.
    3. Aspirera mediet försiktigt. Återsuspendera den (lilla) pelleten i 2 ml CB-media, blanda försiktigt och tillsätt ~ 30 μL av cellsuspensionen till en enda brunn i en räkneplatta. Späd 1: 1 i trypanblått, tillsätt sedan 10 μL till en hemocytometer och räkna och beräkna medelvärdet av cellerna från fyra kvadranter.
    4. Beräkna det totala antalet CD34 + -celler genom att multiplicera cellantalet med 4 x 104 och registrera sedan livskraften. Snurra vid 360 x g i 12 min vid 4 °C.
    5. Aspirera mediet försiktigt och resuspendera cellpelleten i 100 μL steril PBS per n+1 unge för injektion, vilket resulterar i 250 000-450 000 CD34+ celler per mus. Placera det koniska röret på is i en transportbehållare och resa till vivarium för injektion av ungar.
    6. Ta med en värmelampa, blöjor, 1 ml spruta, 18 G nål, 30 G nål och CD34 + cellberedning i sterila behållare till vivarium BSC. Placera en steril blöja ~ 2 fot under värmelampan. Hämta buren med kullen som ska injiceras och placera i BSC.
    7. Sätt ihop sprutan med en 18 G avfasad nål. Matcha vinkeln på det koniska röret med nålens avfasning, blanda försiktigt och dra upp cellsuspensionen. Placera valparna på blöjan för att värma (se upp för överhettning). Ta bort luft från sprutan och ersätt 18 G-nålen med 30 G-nålen och tryck sedan försiktigt in sprutan tills cellsuspensionen är precis vid nålspetsen.
      OBS: Alternativt kan en insulinspruta användas.
    8. Ta en valp i taget till blöjans kant bort från värmelampan. Immobilisera valpen på sidan under tummen och pekfingret, vilket möjliggör en tydlig bild av ansiktet. Lägg märke till venen över kinden under där örat kommer att vara. För in nålen ytligt i venen (IV) närmast ögat och injicera långsamt 50 μL celler.
    9. Kontrollera om en bubbla bildas från en subkutan injektion. Om så är fallet, sätt in nålen djupare och fortsätt att injicera celler. En liten droppe blod / hematom kommer att synas när det lyckas.
      OBS: Se proceduren av Gombash Lampe et al.24 angående injektion av ungar.
    10. Med ungen fortfarande immobiliserad, utför en intrahepatisk injektion (IH) med ytterligare 50 μL celler (100 μL totalt per unge IV + IH). Levern kan visualiseras som en mörk fläck mellan det vita mjölkbandet och bröstkorgen. Placera den injicerade valpen på en blöja längre bort från de oinjicerade valparna och värm.
      OBS: IV injektion resulterar i bättre långvarig chimärism än IH injektion ensam25, men IV injektioner är inte alltid framgångsrika. Därför säkerställer uppdelning av injektionen mellan IV och IH engraftment i en större andel möss.
    11. Upprepa både ansiktsven- och IH-injektioner för alla valpar. Rengör allt blod, returnera valpar till boet i buret och täck med sängkläder.

2. Testa mänsklig chimärism i blod

  1. Testa chimärism i blodet hos HIS-möss vid både 10 och 14 veckors ålder. Samla upp 50 μl blod via retroorbitalvenen eller med en alternativ IACUC-godkänd metod.
    1. För retroorbitala blödningar, bedöva möss med en isofluranförångare inställd på 5 i 1-2 minuter och vrid sedan ner vaporizerinställningen till 4. Vrid ner vaporizern efter behov för att låta möss förbli tillräckligt syresatta under anestesi. Håll inte mössen under isofluran i mer än 5 min.
    2. Placera näsan på den bedövade musen i isofluranförångarens näskonfäste och placera en droppe av smärtstillande medel (0,5% proparakain HCl oftalmisk lösning USP) på ögat.
    3. Efter 1 minut, ta bort proparakain med en steril gasväv, proptos ögat och sätt in ett 75 mm hepariniserat hematokritrör retroorbitalt för att samla 50 μL blod. Mata ut blodet i ett 1,5 ml mikrofugerör innehållande 50 μl heparin och blanda försiktigt.
    4. Knippa ögat stängt med steril gasbindning för att stoppa blödningen och applicera en droppe proparakain. Ta bort musen från isofluran och återhämta sig i en ren bur.
  2. PBMC-isolering från musblod
    1. Blanda blodet/heparinet genom att försiktigt pipettera upp och ner och långsamt överlappa ovanpå 500 μL med en densitetsgradient på 1,077 g/ml, var försiktig så att gränssnittet inte störs. Centrifugera rören vid 1,220 x g i 20 minuter vid RT utan bromsar.
    2. Visualisera den cellulära buffybeläggningen som ett grumligt lager ovanpå densitetsgradienten 1,077 g / ml, under plasma. Ta bort så många celler som möjligt från buffyskiktet med en 200 μL pipett och tillsätt till nya 1,5 ml rör som innehåller 750 μL skördemedium. Centrifugera vid 360 x g i 11 min vid rumstemperatur.
    3. Sug mediet ner till 50 μl och suspendera pelleten igen i 750 μL skördemedium. Centrifugera vid 360 x g i 10 minuter vid 4 °C och aspirera nedåt igen till 50 μl. Cellerna är redo att återsuspenderas i ytfläcken.
  3. Ytfärgning och flödescytometrisk analys
    1. Fyll i färgningspanelens kalkylblad (tabell 1; "Spectral Flow Bleed Panel" kalkylblad) med musnummer och förbered antikroppsfärgningscocktailen genom att tillsätta alla fluorescerande antikroppar till färgningsbufferten (kompletterande fil 1). Gör en plattlayout för att lägga till proverna på en 96-brunns U-bottenplatta. Markera brunnarnas botten med en permanent markör. Titrera antikroppar med hjälp av ett standardförfarande före färgning för att bestämma lämplig koncentration26.
    2. Tillsätt 62 μL ytfläckcocktail till varje brunn på 96-brunnens U-bottenplatta. Återsuspendera cellerna i de 50 μl som finns kvar i röret och tillsätt varje prov till motsvarande brunn. Inkludera en brunn för en positiv färgningskontroll (humana PBMC + mussplenocyter, 1 x 106 celler vardera) för att färga bredvid proverna. Blanda genom pipettering och inkubera blandningen i 15 minuter vid 4 °C.
    3. Centrifugera vid 680 x g i 3 min vid 4 °C. Snärta ut plattan i diskbänken för att ta bort supernatanten och tvätta cellerna genom att återsuspendera i 150 μL färgningsbuffert genom att försiktigt pipettera ~ 10x. Snurra och suspendera varje brunn i 150 μL färgningsbuffert.
    4. Hämta data för 100 μL av varje prov på en flödescytometer (se Materialförteckning) och exportera .fcs-filerna. Importera FCS-filerna till redigeringsprogrammet för flödesdata (se Materialförteckning). Applicera en polygongrind på ett FSC-A x SSC-A-diagram som omger cellerna, exklusive eventuellt skräp. Markera cellerna i grinden (se tabell 1; Arbetsbladet "Spektralflödesblödningsgrind").
    5. Ändra axlarna till (FSC-A x FSC-H) och grinda cellerna på den linjära diagonalen exklusive dubbletterna som sticker ut från linjen. Markera dessa celler och ändra axlarna till (hCD45 x mCD45).
    6. Applicera en polygongrind på hCD45+-populationen och använd namnet "människa". Applicera en polygongrind på mCD45+-populationen och använd namnet "mus". Skapa en antalsstatistik för både human- och muspopulationer.
    7. Välj den mänskliga populationen och ändra axlarna till (CD19 x CD3). Applicera en polygongrind på CD19 + -cellerna och namnge den "B-celler". Applicera en polygongrind på CD3 + -populationen och namnge den "T-celler". Applicera en polygongrind på den dubbla negativa populationen och namnge den "NonTB".
    8. Markera T-cellpopulationen och ändra axlarna till (CD8 x CD4). Applicera en polygongrind på CD4- och CD8-positiva populationer och namnge dem "CD4 +" respektive "CD8 +".
    9. Välj NonTB-populationen och ändra axlarna till (CD56 x myeloid). Applicera en polygongrind på den totala CD56-positiva populationen inklusive de dubbla positiva händelserna och namnge den "NK-celler". Applicera en polygongrind på den CD56-negativa och myeloida positiva populationen och namnge den "myeloid".
    10. Skapa en tabell för procent- och räkningsstatistik för alla populationer och exportera till ett kalkylprogram (se Materialförteckning). Beräkna %hCD45 chimärism = % hCD45 / (% hCD45 + mCD45).
    11. Uteslut HIS-möss som är <20% hCD45+ (av mCD45 + hCD45) för ytterligare experiment.
      OBS: I denna studie framställdes PBMC med användning av en 1,077 g / ml densitetsgradientseparation för en renare RBC-utarmning. Denna procedur uteslöt humana granulocyter och musgranulocyter från PBMC-skiktet. Alternativt kan RBC-lys användas.

3. Injektion av tumörer i möss

  1. Före tumörinjektion, bekräfta T-cellnummer från 14 veckors blödningsdata. Tumörer injiceras för att vara redo för skörd mellan 20-26 veckor om T-cellerna är >20% och mellan 24-28 veckor om T-cellerna är <20% av den totala immuncellspopulationen. Denna injektionstidpunkt säkerställer att mössen är 20-28 veckor gamla och har tillräckligt antal T-celler i slutet av studien.
  2. Injektion av cellinjehärledda xenotransplantat (CDX)
    OBS: Proceduren beskrivs med MDA-MB-231 bröstadenokarcinomceller (se materialförteckning) som exempel.
    1. Tina en alikvot frysta celler, tvätta 1x genom att resuspendera i 10 ml DMEM kompletterat med 10% FBS, 1% PenStrep, och 1% icke-essentiella aminosyror, och centrifugera vid 360 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera mediet och resuspendera i 10 ml DMEM kompletterat med 10 % FBS, 1 % PenStrep och 1 % icke-essentiella aminosyror i en T25-kolv och inkubera vid 37 °C med 5 %CO2.
      OBS: Cellinjerna autentiseras med PCR för att säkerställa korrekt celltyp. Cellsupernatanter testas för mykoplasma via en biokemisk analys före injektion.
    2. Passera och expandera cellerna under exponentiell tillväxtfas vid ca 80% sammanflöde.
      1. Aspirera mediet, skölj cellerna med 5-10 ml steril PBS (pH 7,2) och inkubera med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 1-5 minuter tills cellerna lossnar från kolven.
      2. Tillsätt 5 ml av samma DMEM och blanda genom pipettering upp och ner. För in hela 6 ml cellsuspension i en ny vävnadskulturbehandlad T75-kolv (spädning 1:3) och tillsätt ytterligare 10 ml DMEM.
      3. Passera cellerna var 2-3: e dag vid 80% sammanflöde vid 1: 3 utspädningsplätering i DMEM för att expandera cellerna.
    3. Skörda cellerna med 0,25% trypsin-EDTA under den exponentiella tillväxtfasen inom sex passager och tvätta med PBS. Blanda PBS och basalmembranextrakt (se materialförteckning) i förhållandet 1:1 och tillsätt till cellerna vid en slutlig koncentration av 5 x 107 celler/ml.
    4. Bedöva mössen med isofluran enligt beskrivningen i steg 2.1.1. Injicera subkutant 100 μL (5 x 106 celler) tumörcellssuspension i varje flank med en 23 G nål.
  3. Utför injektion av patient-derived xenografts (PDX) med hjälp av trokar. Injektionsproceduren och andra utvecklings- och underhållsinstruktioner för PDX-modellen finns i litteratur27.

4. Mätning av tumörtillväxt

  1. Kontrollera tumörframsteg en gång i veckan efter implantation genom att känna längs flanken för tumörtillväxt. När tumörerna är palpabla, bedöva mössen med isofluran (som beskrivs i steg 2.1.1) och raka på varje flank med en elektrisk trimmer, var försiktig runt tumören för att förhindra sår när tumören växer.
    OBS: Möss kan rakas före tumörinjektion för att förhindra skador på huden runt tumörerna; Emellertid kan hastigheten för hårväxt hindra tumörmätningar.
  2. Mät tumörernas längd och bredd två gånger per vecka med hjälp av bromsok och registrera mätningarna i mm. Rapportera tumörmätningar som tumörvolym (mm3) med hjälp av formeln Equation 1. Var försiktig så att tumörbördan inte överstiger 2 000 mm 3 per enskild tumör eller en sammanlagd volym på 3 000 mm3.
    OBS: Riktlinjer för användning av möss i cancerforskning varierar beroende på plats. Se policyer för djurvård och användning vid forskarens institution.

5. Läkemedelsbehandlingar

  1. Tilldela HIS-mössen i ekvivalenta behandlingsgrupper baserat på hCD45-chimärism, hCD3-chimärism och hCD8-chimärism. När tumörerna når 100 mm3 i genomsnitt, börja läkemedelsbehandlingar.
    OBS: Antalet möss per grupp baseras på antalet HIS-möss som genereras från CB. Minst fyra möss per grupp rekommenderas. Icke-tvådelad multigruppmatchning (t.ex. i R-vivo Manila-programvara) är användbar för denna gruppering28.
  2. Drogens väg och frekvens
    1. Injicera anti-PD-1-hämmare (nivolumab, pembrolizumab) intraperitoniellt (i.p.) med 30 mg/kg 1x per vecka eller 20 mg/kg 2x per vecka för enstaka behandlingar, eller 10-15 mg/kg 2x per vecka för kombinationsbehandlingar.
    2. Dosera kombinationsterapierna, såsom riktade terapier, kemoterapier och bestrålning, i enlighet med experimentell design. Riktade terapier och kemoterapier kan ges genom oral sondmatning, i.p. injektion eller mat.
      OBS: Doserna kan varieras och optimeras enligt publicerade data och tumörmodellen. Dosstudier testas ofta på mottagare med immunbrist före HIS-studier på möss.
  3. Övervaka mössen minst 3x per vecka för hälsoförändringar som viktminskning, lös avföring, böjd hållning, minskad rörlighet och pälsförlust. Vissa symtom kan vara tecken på läkemedelstoxicitet eller GVHD, och läkemedelsdoseringen kan behöva minskas eller stoppas. Avliva möss efter behov enligt djurvårds- och användningspolicyer.

6. Skörd av musvävnader och tumörer i slutet av studien

  1. Avliva mössen var för sig enligt institutionella och veterinära riktlinjer med komprimerad CO 2-gas med en flödeshastighet på 2,75 l/min. Övervaka mössen som hålls i CO2 i 1 min förbi döden och utför sedan cervikal dislokation som en sekundär form av eutanasi.
  2. Insamling av blod
    1. Samla blod via intrakardiell punktering. Håll musen i upprätt läge och sätt in en 1 ml spruta med en 25 G nål direkt i hjärtat från en linje precis till vänster om mittlinjen och under revbenen. Samla blodet i en spruta, helst genom ett långt drag och överför till ett märkt 1,5 ml rör.
      OBS: Ytterligare nålinsatser kan utföras för att samla ytterligare blod från hörnen av lunghålan med försiktighet.
    2. Låt blodet stå vid 4 °C i 1 timme och centrifugera sedan blodet i en mikrocentrifug i 6 minuter vid 7 800 x g. Samla den klara vätskan (sera) ovanför blodgränssnittet i en andra ren och märkt 1,5 ml rör. Förvara serumet vid -20 °C för analys nedströms, såsom humana och musinflammatoriska cytokin- eller immunglobulintitrar.
  3. Dissektion av vävnad
    1. Efter injektion och tillväxt av tumörceller i mössen och administrering av läkemedelsbehandlingar, skörda vävnaderna. Placera mössen på en skumdissektionsbräda, med stift för att hålla dem på plats, och armar och ben utsträckta i 45 ° vinklar. Gör ett snitt upp i mitten av torso, börja nära bäckenet och sträcker sig till hakan, försök att undvika att skära bukhinnan (även om detta inte är nödvändigt). Dra huden till kanten och håll på plats med stift.
    2. Extrahera lymfkörtlarna (LN) med fina pincett i följande ordning: inguinal, axillär, livmoderhals, mesenterisk, hiatal.
      OBS: Hos HIS möss är LN ofta mycket små, liknar anlage, eller "inflammerade" med ett distinkt utseende som inte liknar det från en vildtypmus. Därför tas vävnad som liknar LN från varje plats. De perifera LN: erna uppträder ofta som vätskefyllda "bollar", medan de mesenteriska LN: erna är tätare. De mesenteriska LN: erna är de mest uppenbara och konsekventa och observeras som en eller två distinkta tätare noder, i motsats till en sträng.
    3. Placera LN på ena sidan av frostat glasskivor i 8 ml skördmedium i en petriskål. Håll objektglasen i vinkelräta vinklar med de frostat kanterna inåt, tryck försiktigt på vävnaderna tills cellinnehållet släpps.
    4. Skölj objektglasen flera gånger genom att dra isär dem och tillsammans för att frigöra maximal mängd celler. Samla cellerna med en 5 tum glaspipett och filtrera dem genom en 9 i bomullspluggad pipett till ett märkt 15 ml koniskt rör.
    5. Dra ut mjälten från övre vänstra sidan av buken med antingen två par pincett eller pincett och sax. Notera mjältens storlek som en uppskattning av volymen av resuspensionsmedia. Samla och filtrera mjälten genom mekanisk matsmältning med frostat glasskivor, som med LN.
      OBS: Vilken teknik som helst för beredning av vävnader för encellssuspensioner kan användas.
    6. Utför räkning och resuspension av cellerna från vävnadsprover enligt beskrivningen nedan.
      1. Centrifugera lymfcellerna vid 360 x g i 10 minuter vid 4 °C. Aspirera vätskan och resuspendera cellpelleten i 1 ml skördemedium med DNase.
      2. Avlägsna erytrocyter från mjältcellerna genom inkubering med 3 ml ACK-lysbuffert vid rumstemperatur i 3 minuter, följt av tillsats av 10 ml skördemedium/DNas. Centrifugera mjältcellerna igen, aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 1-10 ml skördemedium / DNas, baserat på mjältens storlek (t.ex. 1 ml för mycket små mjälte och upp till 10 ml för de största mjältarna).
      3. Tillsätt en alikvot på 10 μl cellsuspension till 90 μl medium och räkna med en hemocytometer. Centrifugera LN och mjältceller, aspirera supernatanterna och suspendera cellerna i skördemedium vid en koncentration av 1 x 108 celler/ml, eller minst 80 μl.
    7. Extrahera tumörerna.
      1. Ta bort tumören från den öppna flanken genom att hålla tumören med pincett medan du långsamt klipper på tumörmarginalerna med dissektionssax.
      2. När tumören har tagits bort, väga den och ta bort 1/4 för RNA och immunohistokemi (IHC) bearbetning. Dela 1/4 tumören i hälften; placera hälften (1/8 av hela tumören) i en kryovial, blixtfrysning i vätskaN2 och förvara vid -80 ° C för genomiska studier nedströms.
      3. Placera den andra 1/8 av tumören i ett märkt provrör innehållande 10% formalin. Nästa dag, skölj och resuspendera vävnaden i 70% etanol tills framtida användning. Placera de återstående 3/4 av tumören i en 6 cm skål och hacka i ~ 1 mm bitar med ett skalpellblad.
      4. Transportera tumörbitarna i ett dissociationsrör (se materialförteckning), skölj skålen med 5 ml ofullständigt tumörinfiltrerande leukocytmedium (TIL) och lägg till dissociationsröret.
        OBS: För tumörer som väger >0,4 g, skölj skålen med 10 ml TIL ofullständigt medium och lägg till dissociationsröret.
      5. Tillsätt kollagenaspreparat (se Materialförteckning) i en slutlig koncentration på 50 mg/ml till vävnaden i dissociationsröret. Dissociera vävnaden med mekanisk dissociation vid 37 °C i 30 minuter till 1 timme, beroende på tumörens fasthet.
      6. Efter dissociation, passera suspensionen över ett 100 μm filter i ett 50 ml koniskt rör och skölj filtret med 10 ml TIL komplett medium. Serumet i detta medium kommer att stoppa kollagenasreaktionen och skydda cellerna från ytterligare nedbrytning.
      7. Centrifugera encellssuspensionen vid 360 x g i 10 minuter vid 4 °C. Återsuspendera pelleten i precis tillräckligt skördemedium med DNas så att cellsuspensionen lätt kan passera genom en P1000-pipettspets och registrera volymen för nedströmsanalys.
        OBS: En mindre volym ökar insamlingen av tumörimmunceller men är mer mottaglig för flödescytometerträskor.

7. Cellfärgning och flödescytometriska analyser

  1. Fläckberedning och cellplätering
    1. Förbered färgningscocktails: På skördedagen, lägg till antalet prover i färgningsbladet (tabell 2; "Konventionell Flow A-panel", "Spectral Flow B-panel" och "Conventional Flow C panel" kalkylblad) för alla fläckar och utskrifter. Förbered ytfläckcocktails för fläckar A och B i färgningsbuffert (SB) genom att tillsätta varje antikropp individuellt med en ny spets, markera varje reagens när du är på språng och förvara vid 4 °C tills det behövs. Bered lämpliga viabilitetsfärgämnen i azidfri PBS och förvara vid 4 °C tills det behövs (varmt till rumstemperatur före användning). Förbered ytfläck C-cocktail på dag 2 i SB tillsammans med intracellulära fläckar B och C i deras respektive permeabiliseringsbuffertar.
    2. Skapa en plattlayout för alla prover i färgningskalkylbladet och fördela 100 μL azidfri PBS till brunnarna. Inkludera ofärgade kontroller för varje vävnad och fläck (för spektralcytometri).
    3. Lägg cellerna till 96-brunnsplattor innehållande 50 μL PBS. För fläck A, suspendera varje vävnadsgrupp i lämplig volym, enligt noteringen på färgningsbladet, och förvara vid 4 °C tills den förvärvats på flödescytometer samma dag. För fläckar B och C, tillsätt 25 μl lymfa och 60 μl icke-lymfvävnadscellsuspensioner till brunnarna med PBS.
    4. Utför in vitro-stimulering av cytokiner för detektion genom intracellulär färgning med användning av fläck C.
      1. Centrifugera färgningsplattan C 96 från steg 7.1.3 vid 680 x g i 3 minuter vid 4 °C. Tillsätt 200 μL TIL kompletta medier (RPMI 1640, 10 mM HEPES [pH 7], 10% FBS) till varje brunn. Förvara plattan med cellsuspensionen vid 4 °C över natten.
      2. Tidigt följande morgon, späd cellstimuleringscocktailen (se Materialförteckning) 1:500 i komplett TIL-media. Centrifugera plattan som innehåller cellsuspensionen vid 680 x g för att pellet cellerna och flicka för att ta bort mediet. Återsuspendera cellerna i 200 μl av den beredda cellstimuleringscocktailen och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
      3. Tillsätt 25 μl proteintransporthämmande lösning innehållande monensin i spädning 1:1 000 i fullständigt TIL-medium, blanda cellerna och inkubera vid 37 °C i ytterligare 4 timmar för att möjliggöra intracellulär ackumulering av cytokiner.
    5. Utför cellfärgning.
      1. För fläckar A och B (dag 1) och för fläckar C (dag 2), centrifugera vid 680 x g i 3 minuter vid 4 °C. Knäpp plattorna och tillsätt lämpliga livskraftsfärger till brunnarna. Blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ner med en flerkanalig pipett och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
      2. Centrifugera plattorna (som i steg 7.1.5.1), tillsätt sedan lämpliga ytfläckar på plattorna och blanda försiktigt genom pipettering med en flerkanalig pipett. Inkubera i 15 minuter vid 4 °C och centrifugera igen. Knäpp plattorna, tvätta cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner med 150 μL SB och centrifugera.
      3. Knäpp plattorna, upprepa tvätten genom att försiktigt pipettera upp och ner med 150 μL SB och centrifugera vid 680 x g i 3 min vid 4 °C. För fläck A, suspendera varje vävnadsgrupp i lämplig volym, enligt noteringen på färgningsbladet, och förvara vid 4 °C. För fläck B, fixera med FoxP3 transkriptionsfaktorkit fixativ (se materialförteckning) i 30 minuter vid RT. För fläck C, fixa i 1% (v / v) paraformaldehyd i SB i 30 minuter vid RT.
      4. Centrifugera de fasta plattorna vid 480 x g i 3 min vid 4 °C. Tvätta 1x i SB. För fläck B kan cellerna lämnas över natten.
      5. Permeabilisera cellerna: suspendera brunnarna igen i 150 μL FoxP3 transkriptionsfaktorkit permeabiliseringsbuffert för fläck B och i 0,5% (w/v) saponin i SB för fläck C. Inkubera i 15 minuter vid RT. Centrifugera de fasta plattorna vid 480 x g i 3 min vid 4 °C.
      6. Knäpp plattorna och tillsätt respektive intracellulära färgningscocktails för fläck B och fläck C. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
      7. Centrifugera de fasta plattorna vid 480 x g i 3 minuter vid 4 °C och knäpp plattorna. Tvätta cellerna med 150 μL av motsvarande permeabiliseringsbuffertar (fläck B, FoxP3 transkriptionsfaktor kit permeabiliseringsbuffert; fläck C, saponin).
      8. Knäpp plattorna och tvätta genom pipettering upp och ner i 150 μL SB. Centrifugera vid 480 x g i 3 min vid 4 °C. Snärta plattorna och suspendera cellerna i SB efter vävnadsgrupp i lämpliga volymer som anges på färgningsbladet.
        OBS: Proverna är nu klara för insamling med spektralflödescytometri.
      9. Ställ in flödescytometern (se materialtabell) med lämpliga enkelfärgade kontroller för varje fläck och ofärgade prover för varje vävnadsgrupp för att ta hänsyn till skillnader i autofluorescens under oblandning. Hämta lämpliga volymer per vävnadsgrupp enligt definitionen i färgningskalkylbladet (tabell 2) och exportera .fcs-filerna.
  2. Dataanalys av flödescytometri
    1. Använd analysprogrammet för flödescytometri (se Materialförteckning) och skapa en ny arbetsyta. Skapa nya grupper för varje organ (LN, mjälte och TIL). Importera FCS-filerna för varje organ till gruppen.
    2. Skapa ett bivariat punktdiagram, ställ in axlarna på (FSC-A x SSC-A) och tillämpa en polygongrind på cellulära händelser, undvik händelser på kanterna (alla celler grind). Välj cellulära händelser, ändra axlarna till (FSC-A x FSC-H) och tillämpa en polygongrind på händelserna på den linjära diagonalen, exklusive händelser som avviker från diagonalen för att generera "singlets" -grinden. Välj grinden "singlets" och ändra axlarna till (hCD45 x mCD45). Applicera polygongrindar på hCD45- och mCD45-positiva händelser och namnge dem "mänskliga" respektive "mus".
    3. Välj den mänskliga populationen och ändra Y-axeln till Live/Dead Aqua. Applicera en polygongrind på den levande / döda negativa, hCD45-positiva befolkningen och namnge den "levande människa". Välj muspopulationen och ändra X-axeln till Live/Dead Aqua. Applicera en polygongrind på den levande / döda negativa, mCD45-positiva befolkningen och namnge den "levande mus".
    4. På liknande sätt väljer du den överordnade grinden och X- och Y-axlarna enligt beskrivningen i kalkylbladen "Conventional Flow A Gating", "Spectral Flow B Gating" och "Conventional Flow C Gating" (tabell 2) för att isolera de angivna populationerna (t.ex. humana B-celler, aktiverade T-celler).
      OBS: Representativ grind för varje fläck (utfall, A, B, C) ingår i tilläggsfil 2.
    5. Skapa räknings- och frekvensexporttabeller i flödescytometrianalysprogrammet för alla populationer och exportera till ett kalkylprogram. Moderpopulationen för frekvenser anges i tabell 2.
    6. Använd data för att generera grafer baserade på experimentella behandlingsgrupper.
      OBS: Data kan också analyseras med R-paket i analysprogramvaran. En enda .fcs-fil från alla prover som ska analyseras kan skapas med hjälp av concatenate-funktionen. Dessa data kan reduceras dimensionellt med T-SNE-algoritmen samtidigt som nyckelordsparametrar för vävnadstyp och behandlingsgrupp läggs till. FlowSOM-algoritmen kan sedan användas för att klustra populationer och ClusterExplorer-verktyget kan användas för att identifiera populationerna. Nya cellpopulationer kan identifieras på detta sätt, jämföras visuellt och kvantifieras mellan behandlingsgrupper eller inom olika vävnader.
    7. Korrelera immunparametrar för tumörer inom samma behandlingsgrupp, med tillväxten för den tumören för att definiera immuntyper som korrelerar med tumörtillväxthämning. Kvantifiera tumörtillväxt med den specifika tillväxthastigheten (SGR) för den tumören, en mätning som tar hänsyn till skillnaden i tumörvolymer under en viss tid. Denna mätning normaliserar tumörer som skördas på olika dagar på grund av mushälsa och behandlingsstartdatum.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter flanktumörprotokollet och experimentell tidslinje (figur 1) studerades tumörtillväxt och immunsvar mot en riktad tyrosinkinashämmare (TKI) och kombinationsbehandling med nivolumab i två distinkta humana kolorektal cancer (CRC) PDX. TKI-läkemedlen har studerats i immunbristfälliga värdar för att utvärdera tumörtillväxt endast29. Denna modell möjliggjorde studier av förändringar i immunsvaret av TKI ensam, och ännu viktigare, i kombination med anti-PD-1. Denna studie fokuserade på kombinationsbehandlade kohorter i två distinkta experiment som representerar en framgångsrik utvärdering med HIS-BRGS-möss och ett tekniskt bristfälligt experiment. För PDX CRC307P bromsade kombinationsbehandlingen tumörens tillväxt, vilket bestämdes av tumörtillväxtvolymer över tid, tumörvikter vid skörd och SGR (figur 2A-C). Å andra sidan påverkades tillväxten av en PDX utvecklad från en metastaserande tumör från samma patient, PDX CRC307M, testad i en annan kohort av HIS-BRGS-möss, mindre av samma kombinationsbehandling hos HIS-BRGS-möss (figur 2D).

Trots fördelningen av HIS-BRGS-möss i ekvivalenta experimentella grupper baserat på övergripande human (hCD45 +) och human T-cell (hCD3 +) chimärism i blodet före tumörimplantation (figur 3A-C), ökade båda parametrarna i det perifera immunsystemet (mjälten) och de tumörinfiltrerande leukocyterna (TIL) i kombinationsbehandlade CRC307P-bärande möss, men inte CRC307M-modellen (figur 3D-F ). Även om båda HIS-BRGS-kohorterna hade jämförbar human- och T-cellchimerism i blodet före tumörimplantation, hade CRC307M-kohorten mycket liten lymfkörtelchimär och misslyckades med att utveckla märkbara nivåer av T-celler i mjälten i den behandlade kohorten (figur 3D-F). CRC307M-experimentet representerar ett tekniskt bristfälligt exempel på grund av övergripande otillräcklig mjält-T-cellchimerism och lymfkörtelchimärism. Vi föreslår uteslutning av HIS-möss som har <20% hCD3 + chimärism i mjälten och / eller <1.5 x 106 hCD45 + -celler i lymfkörtlarna i slutet av studien. För CRC307M-modellen uteslöts majoriteten av mössen, främst på grund av mycket små lymfkörtlar, vilket lämnade endast två möss per kohort.

Ytterligare undersökning av de humana T-cellerna (figur 4A) avslöjade fler aktiverade (HLA-DR +) T-celler i CR307P-tumörerna, men inte lymfan, från kombinationsbehandlade möss (figur 4B). I CRC307M "negativa" experimentet fanns det ingen signifikant ökning av HLA-DR + T-celler i TILs hos behandlade HIS-BRGS-möss vid analys av alla möss, vilket tyder på att denna icke-optimala HIS-BRGS-kohort påverkade datasignifikansen på grund av HIS-möss med mycket få T-celler och ingen aktivering (Figur 4B). Faktum är att ökningen av HLA-DR + T-celler i TIL: erna i CRC307M-modellen nådde betydelse när man utesluter HIS-BRGS-möss med låg T-cellchimär (figur 4B). Dessutom fanns det fler effektorminnes-CD8 + T-celler och färre TIM-3 + (terminalt utmattade) T-celler i de kombinationsbehandlade CRC307P-tumörerna, medan denna skillnad inte noterades i CRC307M-modellen (figur 4C, D). I detta experiment observerades inga förändringar i frekvenserna av cytotoxiska T-celler (Granzyme B+ eller IFNγ+TNFα+) populationer bland de kombinationsbehandlade mössen, även om högre cytotoxiska T-celler observerades i obehandlade (figur 4E) eller behandlade (data visas inte) tumörer i förhållande till lymfkörtlar. Viktigt, även om det inte fanns några skillnader i frekvenser bland T-cellpopulationerna, observerades högre antal cytotoxiska T-celler i tumörerna hos behandlade HIS-CRC307P-BRGS-möss, med högre frekvenser (figur 3B) och antal humana T-celler i tumörerna. Å andra sidan visade denna kombinationsbehandling ingen effekt på frekvenserna av Tregs i varken CRC307P-lymforgan eller tumörer, även om CRC307M-data visade en trend med reducerade Tregs som skulle behöva valideras i ett annat experiment (Figur 4F).

Förutom att undersöka det mänskliga immunsystemet utvärderades immunrelaterade förändringar på tumörceller också med hjälp av flödescytometri (figur 5A). Genom grindning på EpCAM+-celler, som beskrivs i protokollet, hittades ökat uttryck av både MHC klass I (HLA-ABC) och klass II (HLA-DR) på CRC307P-tumörcellerna som skärs ut från kombinationsbehandlade HIS-BRGS-möss (figur 5B). I CRC307M-modellen inducerade samma läkemedelsbehandling HLA klass II-uttryck på tumörcellerna, men i mindre grad än i CRC307P-modellen (figur 5C). Således verkar kombinationsbehandlingen inducera uppreglering av MHC klass II, oberoende av T-cellinfiltration (figur 5B, C). I synnerhet var MHC-uttrycket på tumörcellerna lägre än det på humana immunceller, ett resultat som överensstämmer med humana tumörrapporter (figur 5B). På liknande sätt resulterade kombinationsbehandlingen i ökat PD-L1-uttryck på EpCAM+ CRC307P-tumörcellerna (figur 5D).

Slutligen undersöktes korrelationer mellan immunsvar och tumörtillväxt genom att plotta tumörens SGR kontra immunparametrar. Även om frekvensen av CD4 + T-celler i tumörerna hos obehandlade möss inte visade någon korrelation med tumörtillväxt, visade ökade CD4 + T-celler en signifikant (figur 6A) korrelation med mindre tumörtillväxt, och mer specifikt HLA-DR + aktiverade T-celler (figur 6B), i kombinationen behandlade HIS-möss.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt illustrerande generering av HIS-BRGS-möss och implantation av humana CDX- eller PDX-tumörer för cancerimmunterapistudier. Tidslinjen är viktig för att säkerställa närvaron av T-celler som tar månader att transplantera i de CB-härledda HIS-mössen. Skapad med Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Analys av tumörtillväxt. Tumörtillväxtmätningar för CRC307P PDX i kontroll (svart) eller kombinationsbehandlade (röda) HIS-BRGS-möss kvantifierade med (A) volym över tid, (B) vikter i slutet av studien eller (C) specifik tillväxthastighet (SGR). d) SGR för CRC307M PDX. Data inkluderar tumörer implanterade i båda flankerna av sex HIS-BRGS-möss för vehikel, sju kombinationsbehandlade BRGS-möss för CRC307P och endast två vehikel- och kombinationsbehandlade möss för CRC307M på grund av höga uteslutningsfrekvenser. Statistiska analyser mellan två oberoende grupper utfördes med hjälp av oparat, parametriskt tvågrupps Welchs t-test. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Humant immun- och T-cellschimärism i lymforgan och tumörer hos CRC PDX-tumörbärande HIS-BRGS-möss. (A) Representativ flödescytometrianalys av humana (hCD45) och mus (mCD45) hematopoetiska och humana T (CD3) celler i perifert blod (PBMC) före tumörimplantation och i LN och tumörer (TIL) i slutet av studien. (B,C) Ekvivalent human och T-cellschimärism i blod vid 14 veckor hos HIS-BRGS-möss som därefter injiceras med (B) CRC307P eller (C) CRC307M PDX och obehandlad eller behandlad med kombinationsimmunterapi (Tx). (D-F) Ökade humana T-celler i lymforgan och tumörer (TIL) av kombinationsbehandlade HIS-BRGS-CRC307P-möss men inte HIS-BRGS-CRC307M-möss. Data visar humana och T-cellfrekvenser på Y-axeln som en procentandel av moderpopulationen i (D) lymfkörtlar (LN), (E) mjälte (SP) och (F) tumörer hos enskilda möss i slutet av studien. Statistiska analyser mellan två oberoende grupper utfördes med hjälp av oparat, parametriskt tvågrupps Welchs t-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Analys av T-cellaktivering genom flödescytometri i perifera lymforgan och tumörer hos CRC PDX-bärande HIS-BRGS-möss. (A) Representativ flödescytometrianalys av T-celler i LNs, mjälte (SPs) och tumörer (TILs) utskurna från HIS-BRGS-möss som mäter följande populationer: aktiverade T-celler (HLA-DR+), naiva T-celler (CD45RA+ CCR7+), Tem (CD45RA-, CCR7-), Tregs (CD25+, FoxP3+) och cytotoxiska T-celler (Granzyme B+, TNFα+ och/eller IFNγ+). (B-D) Frekvenser av indikerade T-cellpopulationer i lymforgan eller TILs av HIS-CRC307P-BRGS och HIS-CRC307M-BRGS-möss: (B) HLA-DR+-aktiverade T-celler, (C) CCR7-CD45RA-Tem CD8+ T-celler, (D) hämmande receptor TIM-3 CD8+ T-celler, (E) Granzyme B CD8+ T-celler och (F) CD25+FoxP3+ CD4+ Tregs. För HIS-CRC307M-BRGS-mössen i (B) visar den första datauppsättningen alla möss som analyserats vid skörd, medan den andra datauppsättningen endast innehåller de med tillräcklig LN- och mjält-T-cellchimärism. I alla grafer representerar de fyllda symbolerna för 307M möss med tillräcklig chimärism, medan öppna symboler är uteslutna HIS-möss. Statistiska analyser mellan två oberoende grupper utfördes med hjälp av oparat, parametriskt tvågrupps Welchs t-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Flödescytometrianalys av MHC klass I, II och PD-L1 på humana tumörer hos HIS-BRGS-möss. (A) Representativa punktdiagram för flödescytometri, som illustrerar grindstrategi för mätning av uttrycksnivåer av MHC klass I (HLA-ABC), KLASS II (HLA-DR) och PD-L1 på epiteliala (EpCAM+) humana tumörer hos HIS-BRGS-möss. (B-D) Genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) för HLA-ABC (B), HLA-DR (B, C) och PD-L1 (D) på humana (hCD45+) och tumörceller (EpCAM+) från dissocierade CRC307P (B, D) eller CRC307M (C) PDX utskurna från HIS-BRGS-möss. Statistiska analyser mellan två oberoende grupper utfördes med hjälp av oparat, parametriskt tvågrupps Welchs t-test. *p <0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. Förkortning: Tx = Treatment Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Analys av immunkorrelat av svar. SGR för CRC307P-tumörtillväxt i flankerna av obehandlade (Veh) eller kombinationsimmunterapibehandlade (Tx) HIS-BRGS-möss plottades jämfört med frekvensen av (A) CD4+ eller (B) HLA-DR+ T-celler som en indikator på immunparametrar som korrelerar med minskad tumörtillväxt (dvs. mindre SGR). En enkel linjär regressionsanalys utfördes för att indikera signifikanta korrelationer. R2-värden indikerar korrelationsgrad. *p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Arbetsblad för panelen Färgning av ytor. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Cellfärgningspaneler och flödescytometri gating kalkylblad. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande fil 1: Recept för media och lösningar som används i studien. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Representativ flödescytometrigrind för varje fläck. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under de senaste 6 åren, med hjälp av vår expertis inom både immunologi och humaniserade möss, har vårt forskargrupp utvecklat en välbehövlig preklinisk modell för att testa immunterapier på en mängd olika mänskliga tumörer 3,7,30,31. Detta protokoll betonar övervägande av modellens variabilitet, med särskild uppmärksamhet på de immunterapicentrerade humana T-cellpopulationerna. I detta protokoll beskrivs genereringen av HIS-möss, liksom immunanalysen av både deras lymforgan och tumören. Flödescytometriprotokoll utvecklade för traditionella kompensationsbaserade cytometrar och spektralcytometrar har också inkluderats. Möjligheten att förhöra förändringar i immunsystemet i stora tumörprover, liksom i periferin, utgör en betydande fördel för denna prekliniska modell. En ytterligare fördel med detta system är att flera möss, som har samma unika mänskliga tumör, kan fördelas i separata kohorter och behandlas med olika kombinationer av immunterapiläkemedel, vilket i huvudsak utför en "mini" läkemedelsprövning. Tillsammans möjliggör dessa två faktorer undersökning av verkningsmekanismer och resistens hos föreslagna (kombinations) immunterapier. Modellen har förmågan att testa läkemedelstiming och dosering på en mängd olika mänskliga tumörer och en mängd immunriktade behandlingar, inklusive riktade terapier, biologiska läkemedel, kemoterapier, strålning och till och med cellbaserade terapier.

På grund av den inneboende variationen i HIS-mössens chimärism krävs ett högre antal möss per behandlingsgrupp än en typisk syngen tumörmodell. Med hjälp av dessa protokoll är kohorter av fem till sju HIS-BRGS-möss per behandlingsarm tillräckliga för att erhålla statistiska skillnader i immunparametrar. Denna variation i chimärism utgör en utmaning i denna modell och måste beaktas. Ett experimentellt exempel som visar både tumörtillväxt och immunsvar vid en kombinationsbehandling till en CRC PDX har visats här, liksom ett exempel där samma behandling till en annan CRC PDX inte visade ett liknande starkt svar. Denna skillnad i experimentellt resultat kan bero på olika PDX (samma patient men metastaserande kontra primär) och / eller chimärismen. I det andra experimentet fanns det mycket få T-celler i mjälten hos majoriteten av mössen i behandlingsgruppen, liksom mycket små LN; flera laboratorier har visat att den största batch-till-batch-variabiliteten bland HIS-modeller är T-cellfrekvenserna 20,32,33. Vi har också visat att mänsklig engraftment i LN korrelerar starkt med T-cellens chimärism32. I mer än 40 experiment har vi noterat ett krav på 20% T-celler i mjälten för adekvat chimärism för att upptäcka behandlingsrelaterade immunförändringar3. Vid uppoffring är det viktigt att säkerställa betydande T-cellrekonstitution, som vi definierar som anmärkningsvärd LN-utveckling (>1,5 x 106 hCD45-celler) och >20% T-celler (av hCD45 + -celler) i mjälten. HIS-möss som inte uppfyller detta krav tas bort från datauppsättningen. Chimerism i blodet före tumörimplantat hjälper till att förutsäga denna parameter; Det finns dock skillnader i T-cellutveckling hos enskilda möss över tid som bäst beaktas i slutet av studien. Lyckligtvis utvecklar cirka 95% av HIS-BRGS-mösskohorterna i denna modell tillräcklig T-cellchimärism för immunterapistudier. Det bör betonas att dataanalysen i slutet av studien alltid bör innehålla förhör av chimärismen i perifera lymforganen och ta bort HIS-möss som inte uppfyller human- och T-cellchimären. I experiment med färre än fyra HIS-möss per kohort efter denna justering bör resultaten valideras med en annan HIS-BRGS-kohort härledd från en distinkt CB.

Även om vår grupp har fokuserat på BRGS-musmodellmottagaren, finns det många modeller tillgängliga över hela världen. Till exempel är NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl / SzJ) mottagaren den mest karakteriserade modellen och liknar NOG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Sug / Jic) och till och med NRG (NOD-Rag1 tm1Mom Il2rg tm1Wjl / SzJ) -modellen, som använder Rag-mutationer för genetisk ablation av mus T- och B-celler istället för SCID-mutationen20. Dessa modeller är alla på NOD-bakgrundsstammen och har därmed SIRPa NOD-allelen, vilket är viktigt för att undvika fagocytos av mänskliga celler av värdmakrofager13. Rapporter tyder på liknande chimärism i dessa "grundläggande" humaniserade musmodeller som i BRGS-modellen, med mestadels mänskliga B-celler under de första månaderna följt av engraftment med humana T-celler32,34,35. I dessa modeller är NK- och myeloida celler underrepresenterade i förhållande till en människa36,37. Det finns flera iterationer av "nästa gen" humaniserade musmottagare som kan förbättra härstamningsspecifik utveckling genom introduktion av humanspecifika cytokiner. Till exempel har NSG-SGM3 (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl Tg (CMV-IL3, CSF2, KITLG) 1Eav / MloySzJ) möss humana IL-3, GM-CSF och SCF cytokiner och förbättrad human myelopoes37, eller humana HLA-transgener för selektion på en human HLA (t.ex. NSG-HLA-A2 eller BRGS-HLA-A2 / DR238,39). Omfattande recensioner om detta ämne20,21 rekommenderas till läsare. HIS-musmodeller bör valideras i varje laboratorium med sin egen källa av mänskliga stamceller. Denna validering bör omfatta kvantifiering av human chimärism, inklusive humana B-, T-, NK- och myeloida celler, i blodet över tid och i LN, mjälte, benmärg och bräss mellan 16-20 veckor och igen mellan 24-28 veckor. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt flerlinjegravering, inklusive T-cellchimerism. Dessutom bör tumörernas tillväxthastigheter testas i HIS-mössen i förhållande till icke-humaniserade möss av samma stam. Det är troligt att signifikanta förbättringar i HIS-musmodeller kan leda till avstötning av tumören. Som ett resursbesparingsförsök görs dessa tillväxtkurvor ofta samtidigt med immunsvarsdataanalyserna. Kommersiellt tillgängliga HIS-möss bör innehålla omfattande chimärdata från blodet samt referenser till chimärism i andra organ från andra kohorter.

De experimentella protokollen för analys av tumörtillväxt och immunsvar hos HIS-möss till humana CDX eller PDX kräver standardlaboratoriemetoder och immunologisk expertis. Genereringen av HIS-möss, inklusive isolering av stamcellerna, injektion i immunbristfälliga möss och testning av mänsklig chimärism i blodet, är alla relativt enkla laboratorieprocedurer. De logistiska frågorna kring detta förfarande, inklusive uppfödning av mycket immunbristfälliga musstammar, förvärv av en pålitlig källa till mänskliga HSC, etc., är den mest besvärliga komponenten i protokollet. Procedurmässigt måste mer uppmärksamhet ägnas åt experimentell design, inklusive tidpunkten för tumörimplantation (vanligtvis 19-21 veckor när tillräckligt med T-celler är närvarande), läkemedelsdosering och tidpunkt för studiens slut. Att förvärva tumörmätningsdata är ett annat rutinförfarande. Men eftersom immundata ofta är mer informativa än tumörtillväxtdata i detta system kan flödescytometriska analyser av immunsvaren ge relevanta data. Färgning av celler för flödescytometri är en annan enkel procedur, liksom att lära sig att köra en flödescytometer. Analysen och tolkningen av dessa data kräver dock unik expertis. Medan detta manuskript fungerar som en ryggrad för att utföra immunonkologiska studier i HIS-möss, bör varje protokollsteg optimeras i ett nytt labb. Av erfarenhet kräver upprätthållande av mössens hälsa, förvärv av adekvata HSC från CB-enheter och timing av tumörinjektionerna för tillräckliga T-celler mest uppmärksamhet och felsökning.

HIS-BRGS-mössen uppvisar extrem immunsuppression som liknar den som observerats i många mänskliga tumörer. Denna immunsuppression är anmärkningsvärd, eftersom höga uttrycksnivåer av PD-1 och TIGIT, men mindre TIM-3, observeras på T-cellerna i de perifera immunorganen hos HIS-BRGS-mössen 3,7. Dessa T-celler visar också markörer för immunaktivering, inklusive högt uttryck av HLA-DR och lågt uttryck av CCR7 och CD45RA, vilket indikerar T-effektorceller, som visas här i figur 4 och i referenser 3,7. Denna kvalitet är en central paradox för systemet; immunsuppressionen möjliggör tillväxt av allogena humana tumörer i närvaro av en allogen HIS, i hastigheter som liknar eller till och med snabbare än icke-humaniserade BRGS- eller nakna (Nu/J) möss 3,7,23. Immunstimuli har dock visat sig kunna övervinna denna immunsuppression och avvisa en tumör 7,8. Även om signifikanta förändringar i tumörtillväxt mellan vehikel och behandlade möss inte alltid observeras, har signifikanta skillnader i immunfenotyper hittats oftare, så analys av tumörtillväxthastigheterna korrelerade med immunfenotyper föreslås. I denna analys hittades immunparametrar som signifikant korrelerar med minskad tumörtillväxt3. Dessa data tyder på att särskilda "immunkorrelat" är behandlingsrelaterade och deltar i tumörkontroll. Således ger tumörtillväxtmätningar i kombination med immunfenotyper i HIS-musmodellen viktiga prekliniska data med avseende på tumörimmunsvar mot unika humana tumörer. Utmaningen för alla prekliniska modeller är korrelation med kliniska resultat. HIS-musens onkologifält har flera exempel på klinisk korrelation: 1) vi och andra har visat att den mänskliga immuninfiltrationen korrelerar med tumörtypen 3,22,23,40; 2) vi har visat framgångsrik behandling med anti-PD-1 i ett ACC Lynch syndrom PDX taget från en patient som senare svarade på denna behandling31; och 3) vi har visat överlägsna svar på en CRC MSS hi PDX, en cancer med hög svarsfrekvens i kliniken jämfört med den notoriskt dåligt svarande CRC MSS PDX7. Tillsammans med in vitro- och andra in vivo-modeller ger dessa data en koppling för översättning till kliniken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi vill tacka både Animal Research Facility (OLAR) för deras vård av våra möss och Flow Cytometry Shared Resource som stöds av Cancer Center Support Grant (P30CA046934) vid vårt institut för deras enorma hjälp i allt vårt arbete. Vi tackar också både Gail Eckhardt och Anna Capasso för våra inledande samarbeten som studerar immunterapier mot humana PDX i vår HIS-BRGS-modell. Denna studie stöddes delvis av National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant med användning av PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Denna forskning stöddes delvis av NIAID från National Institutes of Health under kontraktsnummer 75N93020C00058.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe w/needles McKesson 1031815
15 mL tubes Grenier Bio-One 188271
2-mercaptoethanol Sigma M6250
50 mL tubes Grenier Bio-One 227261
AutoMACS Pro Separator Miltenyi 130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin BD Bioscience BDB563792
BSA Fisher Scientific BP1600100
Cell Stim Cocktail Life Technologies 509305
Chill 15 Rack Miltenyi 130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes Fisher Scientific 13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract R&D Systems 363200502
Cytek Aurora Cytek
DNase Sigma 9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set Invitrogen 00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS Gibco 10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume Grenier Bio-One 616201
Excel Microsoft
FBS Benchmark 100-106 500mL
Ficoll Hypaque GE Healthcare 45001752
FlowJo Software BD Biosciences
Forceps - fine Roboz Surgical  RS5045
Forceps normal Dumont RS4919
Formaldehyde Fisher F75P1GAL
Frosted Glass Slides Corning 1255310
Gentlemacs C-Tubes Miltenyi    130-096-334
GentleMACS Dissociator Miltenyi 130-093-235
glass pipettes DWK Life Sciences 63A53
Glutamax Gibco 11140050
HBSS w/ Ca & Mg Sigma 55037C
HEPES Corning MT25060CI
IgG standard Sigma I2511
IgM standard Sigma 401108
IMDM Gibco 12440053
Liberase DL Roche 5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue Thermo L23105
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MEM Gibco 1140050
mouse anti-human IgG-AP Southern Biotech JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled Southern Biotech H2
mouse anti-human IgM-AP Southern Biotech UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled Southern Biotech SA-DA4
MultiRad 350 Precision X-Ray
PBS Corning 45000-446
Pen Strep Gibco 15140122
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713A
p-nitrophenyl substrate Thermo 34045
PRISM Graphpad
Rec Hu FLT3L R&D systems 308-FK-005/CF
Rec Hu IL6 R&D systems 206-IL-010/CF
Rec Hu SCF R&D systems 255SC010
RPMI 1640 Corning 45000-39
Saponin Sigma 8047-15-2
Scissors McKesson 862945
Serological pipettes 25 mL Fisher Scientific 1367811
Sterile filter Nalgene 567-0020
Sterile molecular water Sigma 7732-18-5
Yeti Cell Analyzer Bio-Rad 12004279
Zombie Green biolegend 423112

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
  2. Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
  3. Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
  4. Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
  5. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
  6. Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
  7. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
  8. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  9. Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
  10. Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
  11. Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
  12. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  13. Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
  14. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  15. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  16. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  17. Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
  18. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  19. Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
  20. Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
  21. Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
  22. Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
  23. Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
  24. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
  25. Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
  26. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
  27. Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
  28. Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
  29. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
  30. Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
  31. Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
  32. Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
  33. Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
  34. Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
  35. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
  36. Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
  37. Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
  38. Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
  39. Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
  40. Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).

Tags

Cancerforskning nr 190

Erratum

Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 05/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

Testa cancerimmunotherapeutics i en humaniserad musmodell som bär mänskliga tumörer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lanis, J. M., Lewis, M. S.,… More

Lanis, J. M., Lewis, M. S., Strassburger, H., Larsen, K., Bagby, S. M., Dominguez, A. T. A., Marín-Jiménez, J. A., Pelanda, R., Pitts, T. M., Lang, J. Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. J. Vis. Exp. (190), e64606, doi:10.3791/64606 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter