Summary
Het huidige protocol beschrijft hoogfrequente echografie voor het visualiseren van de gehele schildklier van de muis en het monitoren van de groei van anaplastisch schildkliercarcinoom.
Abstract
Anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) wordt geassocieerd met een slechte prognose en korte mediane overlevingstijd, maar geen enkele effectieve behandeling verbetert de resultaten aanzienlijk. Genetisch gemanipuleerde muizenmodellen die de progressie van ATC nabootsen, kunnen onderzoekers helpen om behandelingen voor deze ziekte te bestuderen. Het kruisen van drie verschillende genotypen van muizen, een TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgeen ATC-model werd ontwikkeld. Het ATC-muizenmodel werd geïnduceerd door een intraperitoneale injectie van tamoxifen met overexpressie van BrafV600E en deletie van Trp53, en de tumoren werden binnen ongeveer 1 maand gegenereerd. Echografie met hoge resolutie werd toegepast om de tumorinitiatie en -progressie te onderzoeken en de dynamische groeicurve werd verkregen door de tumorgroottes te meten. In vergelijking met magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en computertomografie scanning, heeft echografie voordelen bij het observeren van het ATC-muizenmodel, zoals niet-invasief, draagbaar, in realtime en zonder blootstelling aan straling. Echografie met hoge resolutie is geschikt voor dynamische en meervoudige metingen. Echechografisch onderzoek van de schildklier bij muizen vereist echter relevante anatomische kennis en ervaring. Dit artikel biedt een gedetailleerde procedure voor het gebruik van echografie met hoge resolutie om tumoren in het transgene ATC-model te scannen. Ondertussen worden ultrasone parameteraanpassing, echografie, anesthesie en herstel van de dieren en andere elementen die aandacht nodig hebben tijdens het proces vermeld.
Introduction
Hoewel anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) verantwoordelijk is voor minder dan 2% van de schildklierkankers, veroorzaakt het jaarlijks meer dan 50% van de schildklierkankergerelateerde sterfgevallen. De mediane overlevingstijd na diagnose met ATC is slechts ongeveer 6 maanden en er zijn geen behandelingen beschikbaar die de overleving aanzienlijk verbeteren 1,2.
De zeldzaamheid van ATC heeft het onderzoek belemmerd dat bestudeert hoe de ziekte begint en agressief vordert. Onlangs zijn genetisch gemanipuleerde muismodellen beschikbaar gekomen die de ziekte nabootsen, die inzicht geven in de ziekte en de reacties op mogelijke behandelingen 3,4,5. Dergelijke studies vereisen nauwkeurige tumorbeeldvorming voor metingen en monitoring, die meestal wordt uitgevoerd met behulp van magnetische resonantiebeeldvorming, computertomografie of echografie met hoge resolutie 6,7. Echografie is op grote schaal gebruikt in muizenorganen. Het heeft voordelen ten opzichte van magnetische resonantie beeldvorming en computertomografie omdat het in realtime kan worden uitgevoerd en het onderwerp niet blootstelt aan straling, en de benodigde apparatuur is klein genoeg om draagbaar te zijn 8,9. Studies over het continu monitoren van ATC-groei met behulp van echografie zijn echter zeldzaam; Daarom onderzoekt dit werk het nut van echografie in deze context.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het gebruik van echografie met hoge resolutie om tumoren nauwkeurig te scannen, te monitoren en te meten in een muismodel van ATC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De huidige studie werd uitgevoerd met goedkeuring van de Animal Care and Use Committee van de Sichuan University. TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgene muizen10 werden gebruikt in deze studie (zie tabel met materialen). De protocolstappen kunnen indien nodig worden aangepast voor verschillende diersoorten. Twaalf muizen, waaronder zes vrouwtjes en zes mannetjes, met een gemiddelde leeftijd van 93 dagen, werden hier gebruikt.
1. Experimentele voorbereiding
- Schakel het echografiesysteem in (zie Materiaaltabel) en maak een nieuwe map voor het vastleggen van de afbeeldingen en het verzamelen van de gegevens. Selecteer de 40 MHz lijnsonde en klik op het oppervlakkige weefselpatroon om de oppervlakkige weefseltransducer te activeren. Gebruik de "B-modus" voor schildklierbeeldvorming (figuur 1A).
OPMERKING: B-modus is de basis ultrasone beeldvormingsmodus. Het uiterlijk van echografiebeelden is afhankelijk van de fysieke interacties van geluid met de weefsels in het lichaam. B-mode beelden worden geproduceerd als grijze beelden11,12. - Houd de muizen in specifieke kooien met vrije toegang tot voedsel en water. Plaats de kooi op een aanvullend verwarmingsapparaat (zie materiaaltabel) om thermoregulatie te garanderen.
- Zorg voor voldoende isofluraan in de vaporizer en O2 in de tank. Als de voorraden ontoereikend zijn, ruil dan de tanks in voor nieuwe.
- Reinig het dierbeeldvormingsplatform met steriele zoutoplossing en schakel de verwarmingsknop in. Controleer of de temperatuur 38-40 °C is voordat u het dier op het platform plaatst (figuur 1C).
2. Voorbereiding van dieren voor beeldvorming
- Schakel de isofluraan vaporizer in. Breng de muis over van de kooi naar de verdovingsdoos.
- Verdoof het dier met een mengsel van 1%-2% isofluraan uit de verdamper en zuurstof die met 0,8 l/min stroomt.
- Breng ontharingscrème aan van de borst naar de nek, wacht 30 seconden en veeg vervolgens de crème en vacht volledig weg. Spoel het gebied en de omliggende vacht grondig af met warme steriele zoutoplossing.
- Plaats het verdoofde dier op het verwarmde platform. Bedek de snuit met een neuskegel die is aangesloten op de anesthesie-uitlaat (figuur 2A, B).
OPMERKING: De muis moet binnen 1-2 minuten volledig worden verdoofd. Als het dier nog steeds actief is, voer dan langdurige isofluraaninductie uit totdat het dier niet langer een pedaalterugtrekkingsreflex vertoont. Zorg ervoor dat het dier stabiel ademt. - Controleer tijdens het maken van de beeldvorming de hartslag van de muis via het verwarmde platform.
OPMERKING: Het echografiebeeldvormingssysteem is uitgerust met een hartslagmeter. - Gebruik plakband om de ledematen van de muis aan het verwarmde platform te bevestigen, met het dier in rugligging. Zorg ervoor dat de neuskegel stabiel is geplaatst met een constante verdovingsgasstroom (1,5 l/min).
- Bescherm de ogen door oogzalf aan te brengen.
3. Beeldvorming van tumoren
- Pas het beeldvormingssysteem aan om de resolutie te optimaliseren. Stel de volgende parameters in: tweedimensionale versterking, 25-30 dB; beelddiepte, 10 mm; aantal aandachtszones, 3; en midden, 3-6 mm.
OPMERKING: Voor deze studie werd een 40 MHz-sonde gebruikt. De B-modus is gespecificeerd voor data-acquisitie. - Breng royaal ultrasone gel (zie tabel met materialen) aan op het gebied van de blote huid.
- Houd de sonde vast en plaats deze in contact met de ultrasone gel op de borst en scan vervolgens van de borst naar de nek om de schildklier te lokaliseren (figuur 2C).
OPMERKING: Oefen voorzichtig druk uit tijdens het scannen; Overmatige druk op de nek van het dier kan hijgen of apneu veroorzaken. Dit protocol is ontwikkeld op basis van handheld scanning, maar gemechaniseerd scannen kan ook worden uitgevoerd met behulp van een machine om de sonde te begeleiden, zoals een dierbeeldvormingsplatform dat langs de x- en y-as beweegt. - Scan omhoog en omlaag om de grenzen van de tumor te identificeren en de grootte en vorm ervan te beoordelen.
OPMERKING: Een gezonde schildklier verschijnt meestal als een hypoechogene, homogene structuur voor de luchtpijp. Anaplastische tumoren zorgen ervoor dat de schildklier veel groter lijkt, wat gemakkelijk kan worden geïdentificeerd door nekscans (figuur 3). - Identificeer de ATC-tumoren van de luchtpijp en riemspieren, afhankelijk van de anatomische locatie en echografie-echo.
OPMERKING: De riemspieren bevinden zich voor de schildklier en luchtpijp, evenals achter de schildklier. De echo van de riemspieren lijkt hoger dan die van de ATC, terwijl verzwakking bestaat achter de luchtpijp13.- Bevestig op basis van de indruk van de totale tumor het beeldgedeelte met de grootste tumordiameter van links naar rechts. Druk op de vriesknop en meet de anteroposterieure en van links naar rechts tumordiameters met behulp van de ultrasone remklauw.
OPMERKING: De anteroposterieure diameter moet loodrecht op de linker-naar-rechts tumordiameter worden gemeten (figuur 4). De tumorgrootte van de ATC werd berekend door de anteroposterieure diameter te vermenigvuldigen met de links-naar-rechts tumordiameter14. Omdat de grootte van de tumoren aan de linker- en rechterkant inconsistent was, werd elke kant van de tumoren afzonderlijk berekend. De totale grootte van de tumoren werd verkregen door de bilaterale tumoren toe te voegen. De maten werden geregistreerd om de groeicurve van de ATC te observeren.
- Bevestig op basis van de indruk van de totale tumor het beeldgedeelte met de grootste tumordiameter van links naar rechts. Druk op de vriesknop en meet de anteroposterieure en van links naar rechts tumordiameters met behulp van de ultrasone remklauw.
- Sla de opname op als een cine-loop, wat de beoordeling van de geselecteerde afbeeldingen vergemakkelijkt.
4. Terugwinning van dieren
- Veeg na het scannen de ultrasone gel af en verwijder de fixatietape van de ledematen van het dier.
- Plaats de muis op het aanvullende verwarmingsapparaat (stap 1.2). Leg het dier op zijn zij (figuur 2D).
- Nadat de muis is hersteld (~ 5 min), breng u deze terug naar de kooi.
- Reinig het echografiesysteem, de sonde en het platform met een zachte doek en isopropylalcohol of glutaaraldehydedoekjes.
- Schakel het beeldvormingssysteem uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gemiddelde rechter ATC-grootte aan het begin van het onderzoek was 4,867 mm 2 en de gemiddelde linker ATC-grootte was 5,189 mm2. Bij de vierde meting was de gemiddelde rechter ATC-grootte gegroeid tot 11,844 mm 2, terwijl de tumorgrootte van de linkerkwab was gegroeid tot 9,280 mm2. De totale ATC-grootte steeg van 10,057 mm 2 naar 15,843 mm2. In de latere fase van het onderzoek groeide de ATC snel. In termen van de muis met het label "P92" (tabel 1), was de tumorgrootte bij de vierde meting bijna vier keer groter geworden dan de grootte bij de eerste meting. De representatieve metingen van vier muizen en de groeicurves zijn weergegeven in figuur 5.
Hoogfrequente echografie is de beeldvormingsmodaliteit die het vaakst wordt gebruikt om de schildklieren bij mensen te onderzoeken, en de techniek lijkt ook goed geschikt voor muizen. Het kan de hele schildklier van de muis en details van de groei van schildklierlaesies visualiseren. Dit protocol van het toepassen van de methode van hoogfrequente echografie kan worden gebruikt om tumoren nauwkeurig te scannen, te monitoren en te meten in een genetisch gemanipuleerd muismodel van ATC.
Figuur 1: In dit onderzoek gebruikte apparatuur . (A) Het hoogfrequente echografiesysteem. (B) Laboratoriumbenodigdheden: (1) Elektrische verwarmingsdeken. (2) Papieren handdoeken. (3) Ultrasone gel. (4) Isofluraan verdamper. (5) Ontharingscrème. (6) Wattenstaafjes. (7) Schaar. (8) Plakband. (9) Medische handschoenen. (10) Kamer voor anesthesie-inductie. (11) Anesthesiesysteem. (C) Een gemechaniseerd scansysteem voor echografie. De volledig verdoofde muis werd op het verwarmde platform geplaatst (weergegeven in groen) en de scansonde werd bevestigd aan een nauwkeurig beweegbare arm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Muisvoorbereiding en echografie . (A) Anesthesie-inductie. (B) Bevestiging van het dier op het verwarmde platform en onderhoud van de anesthesie. (C) Echografie met een methode uit de vrije hand. D) Herstel van het dier op de elektrische verwarmingsdeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Echografiebeelden van een orthotopisch ATC-tumormuismodel. De groene lijn bakent de luchtpijp af, de rode lijn bakent de ATC-tumor af en de gele lijn bakent de bandspier af. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Berekening van de tumorgrootte. De tumorgrootte werd berekend door de anteroposterieure diameter (oranje lijn) te vermenigvuldigen met de links-naar-rechts tumordiameter (witte lijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Longitudinale analyse van orthotopische ATC-groei in het muismodel . (A) Rechter schildklierkwab. (B) Linker schildklierkwab. (C) Volledige schildklier. Elke curve komt overeen met één dier dat vier keer is gemeten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Datum | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| Etiket | Plaats | Tumor grootte (mm2) | |||
| P71 | Rechts | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| Links | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| totaal | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | Rechts | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| Links | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| totaal | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | Rechts | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| Links | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| totaal | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | Rechts | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| Links | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| totaal | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
Tabel 1: Gegevens over het meten van de tumorgrootte. "P71", "P85", "P89" en "P92" vertegenwoordigen de labels van de muizen. Rechts: de tumorgrootte van de rechterkant. Links: de tumorgrootte van de linkerkant. Totaal: de totale tumorgrootte door de bilaterale tumoren toe te voegen. De eerste regel bevat de tumorgrootte (mm2: vierkante millimeter) en de datum van de metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol maakt gebruik van echografie met hoge resolutie om orthotopische ATC-tumoren te analyseren in een genetisch gemanipuleerd muismodel. Het transgene model, met een genotype van TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, is ontwikkeld in ons laboratorium. De dieren overexpresseren BrafV600E en missen Trp53; Het intraperitoneaal injecteren van de dieren met tamoxifen leidt tot tumorgroei na ongeveer 1 maand10. De tumoren groeien snel en bereiken binnen 50 dagen een meetbare grootte. Dit protocol werd gebruikt om de tumorgroei gedurende 4 maanden te volgen.
Echografie is betrouwbaar gebleken bij muizen voor het afbeelden van weefsels die vergelijkbare lichaamslocaties bezetten als menselijke weefsels, waaronder de lever, schildklier en foetus9. Net als bij mensen bevindt de schildklier van de muis zich aan elke kant van het kraakbeen en de luchtpijp van de schildklier13. Het gepresenteerde protocol maakt de analyse van ATC-tumoren in de schildklier mogelijk, waardoor de studie van tumorinitiatie, progressie en respons op behandelingen mogelijk wordt. De schildkliertumoren in het muismodel werden vrij groot en bezetten de ruimte rond de luchtpijp en riemspieren. Ze vertoonden solide-cystische kenmerken in echografie, vergelijkbaar met folliculaire structuren. De niet-invasiviteit, korte duur en het gemak van echografie kunnen het voor veel onderzoeksgroepen aantrekkelijker maken dan magnetische resonantiebeeldvorming of computertomografie8. Aangezien langdurige sedatie of anesthesieperioden onnodig zijn, kunnen de voordelen van echografie longitudinale studies vergemakkelijken.
Het aanbrengen van voldoende ultrasone gel tijdens het scannen is cruciaal om luchtzakken te elimineren die de beeldvorming kunnen beïnvloeden en om overmatige compressie te voorkomen die tot apneu kan leiden. Dit protocol wordt routinematig uitgevoerd in ons laboratorium door ervaren echografiespecialisten die uit de vrije hand scannen. Scannen uit de vrije hand heeft de voorkeur boven een gemechaniseerd platform omdat het flexibiliteit biedt bij het aanpassen van de positie van de ultrasone sonde aan de toestand van het dier. Bij gebruik van een gemechaniseerd platform moeten de x- en y-coördinaten worden aangepast om overmatige compressie op het dier te voorkomen. De resultaten toonden aan dat de tumoren in de vroege periode langzaam groeiden, maar vanaf dag 60 ontwikkelden de tumoren zich dramatisch sneller en was de maximale tumorgrootte 38,188 mm2. De belangrijkste doodsoorzaak was verstikking in het late stadium. In klinische onderzoeken, vanwege de zeldzaamheid van ATC-tumoren, is het moeilijk om voldoende monsters te verzamelen om het proces en het mechanisme van ontwikkeling te observeren. De methode van ATC-laesies kon beter worden waargenomen in het muizenmodel. In de toekomst kunnen deze monsters meer informatie opleveren voor klinische behandelingen.
Een beperking van echografie is dat de echogeniciteit van ATC-tumoren kan lijken op die van de omliggende weefsels, waardoor tumormarges worden verduisterd, vooral in één stilstaand beeld. Deze marges kunnen echter worden geïdentificeerd met behulp van dynamisch contrast, dus dynamische afbeeldingen werden in deze studie opgeslagen voor latere analyse. Om de meest nauwkeurige en betrouwbare resultaten te garanderen, moet de sonde op verschillende manieren worden gepositioneerd om de hele schildklier en tumor vanuit verschillende hoeken te visualiseren. In deze studie voerde slechts één echoscopist alle metingen uit, dus betrouwbaarheidsmetingen tussen verschillende examinatoren werden niet geëvalueerd.
Dit protocol kan het gebruik van hoge-resolutie echografie vergemakkelijken voor het lokaliseren en meten van ATC-tumoren bij dieren, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor gedetailleerde studies van het begin, de progressie en de behandeling van kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit onderzoek ontving geen specifieke subsidie van publieke, commerciële of non-profit financieringsagentschappen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527 (2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731 (2017).
- Renault, G., et al.
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M.
- Aldrich, J. E.
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
