Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר אולטרה-סאונד בתדירות גבוהה להדמיית בלוטת התריס כולה של העכבר ולמעקב אחר צמיחת קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס.
Abstract
קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) קשורה לפרוגנוזה גרועה ולזמן הישרדות חציוני קצר, אך אין טיפול יעיל שמשפר את התוצאות באופן משמעותי. מודלים מהונדסים גנטית המחקים את התקדמות ATC עשויים לסייע לחוקרים לחקור טיפולים למחלה זו. חציית שלושה גנוטיפים שונים של עכברים, TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 מודל ATC מהונדס פותח. מודל ATC murine נגרם על ידי הזרקה intraperitoneal של טמוקסיפן עם ביטוי יתר של BrafV600E ומחיקה של Trp53, והגידולים נוצרו בתוך כחודש. אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה הופעל כדי לחקור את התחלת הגידול והתקדמותו, ועקומת הצמיחה הדינמית התקבלה על ידי מדידת גודל הגידול. בהשוואה לדימות תהודה מגנטית (MRI) וסריקת טומוגרפיה ממוחשבת, לאולטרסאונד יתרונות בצפייה במודל ATC murine, כגון היותו לא פולשני, נייד, בזמן אמת וללא חשיפה לקרינה. אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה מתאים למדידות דינמיות ומרובות. עם זאת, בדיקה אולטרה-סונוגרפית של בלוטת התריס בעכברים דורשת ידע וניסיון אנטומיים רלוונטיים. מאמר זה מספק הליך מפורט לשימוש באולטרסאונד ברזולוציה גבוהה לסריקת גידולים במודל ATC מהונדס. בינתיים, התאמת פרמטרים קוליים, מיומנויות סריקת אולטרסאונד, הרדמה והתאוששות של בעלי החיים, ואלמנטים אחרים הזקוקים לתשומת לב במהלך התהליך מפורטים.
Introduction
למרות שקרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) מהווה פחות מ -2% ממקרי סרטן בלוטת התריס, היא גורמת ליותר מ -50% ממקרי המוות הקשורים לסרטן בלוטת התריס מדי שנה. זמן ההישרדות החציוני לאחר האבחנה עם ATC הוא רק כ 6 חודשים, ואין טיפולים זמינים המשפרים באופן משמעותי את הישרדות 1,2.
הנדירות של ATC הקשתה על המחקר הבוחן כיצד המחלה מתחילה ומתקדמת באגרסיביות. לאחרונה התפרסמו מודלים של עכברים מהונדסים גנטית המחקים את המחלה, המספקים תובנות לגבי המחלה ותגובותיה לטיפולים אפשריים 3,4,5. מחקרים כאלה דורשים הדמיה מדויקת של הגידול לצורך מדידות וניטור, המבוצעת בדרך כלל באמצעות הדמיית תהודה מגנטית, טומוגרפיה ממוחשבת או אולטרה-סאונד ברזולוציה גבוהה 6,7. אולטרה-סאונד נמצא בשימוש נרחב באיברי עכבר. יש לו יתרונות על פני הדמיית תהודה מגנטית וטומוגרפיה ממוחשבת שכן ניתן לבצע אותו בזמן אמת ואינו חושף את הנושא לקרינה, והציוד הדרוש קטן מספיק כדי להיות נייד 8,9. עם זאת, מחקרים על ניטור רציף של צמיחת ATC באמצעות אולטרסאונד הם נדירים; לכן, עבודה זו בוחנת את התועלת של אולטרסאונד בהקשר זה.
כאן מוצג פרוטוקול לשימוש באולטרה-סאונד ברזולוציה גבוהה לסריקה, ניטור ומדידה מדויקים של גידולים במודל עכבר של ATC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר הנוכחי בוצע באישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת סצ'ואן. TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 עכברים טרנסגניים10 שימשו במחקר זה (ראו טבלת חומרים). ניתן לשנות את שלבי הפרוטוקול עבור מיני בעלי חיים שונים במידת הצורך. שנים עשר עכברים, כולל שש נקבות ושישה זכרים, עם גיל ממוצע של 93 ימים, שימשו כאן.
1. הכנה ניסיונית
- הפעל את מערכת האולטרה-סאונד (ראה טבלת חומרים) וצור תיקייה חדשה ללכידת התמונות ואיסוף הנתונים. בחר את בדיקת הקו 40 MHz ולחץ על תבנית רקמה שטחית כדי להפעיל את מתמר הרקמה השטחית. השתמשו במצב "B" להדמיית בלוטת התריס (איור 1A).
הערה: מצב B הוא מצב הדמיית האולטרסאונד הבסיסי. המראה של תמונות אולטרסאונד מסתמך על אינטראקציות פיזיות של קול עם רקמות הגוף. תמונות במצב B מופקות כתמונות אפורות11,12. - החזיקו את העכברים בכלובים ספציפיים עם גישה חופשית למזון ומים. הניחו את הכלוב על מכשיר חימום משלים (ראו טבלת חומרים) כדי להבטיח ויסות תרמי.
- ודא איזופלורן מספיק בוופורייזר ו- O2 במיכל. אם האספקה אינה מספקת, החליפו את המכלים בחדשים.
- נקו את פלטפורמת ההדמיה של בעלי חיים במי מלח סטריליים והפעילו את כפתור החימום. ודאו שהטמפרטורה היא 38-40 מעלות צלזיוס לפני שאתם מניחים את החיה על הפלטפורמה (איור 1C).
2. הכנת בעלי חיים להדמיה
- הפעל את וופורייזר איזופלורן. מעבירים את העכבר מהכלוב לקופסת ההרדמה.
- מרדימים את בעל החיים באמצעות תערובת של 1%-2% איזופלורן מהוופורייזר וחמצן הזורם במהירות של 0.8 ליטר/דקה.
- יש למרוח קרם דפילציה מהחזה לצוואר, להמתין 30 שניות ולאחר מכן לנגב את הקרם והפרווה לחלוטין. שטפו היטב את האזור ואת הפרווה שמסביב במי מלח סטריליים חמים.
- הניחו את בעל החיים המרדים על המשטח המחומם. כסו את החוטם בחרוט אף שמחובר למוצא ההרדמה (איור 2A, B).
הערה: העכבר חייב להיות מורדם לחלוטין תוך 1-2 דקות. אם בעל החיים עדיין פעיל, בצע אינדוקציה איזופלורנית ממושכת עד שבעל החיים כבר לא מראה רפלקס נסיגה מדוושה. ודא כי בעל החיים נושם ביציבות. - במהלך ההדמיה, עקוב אחר קצב הלב של העכבר דרך הפלטפורמה המחוממת.
הערה: מערכת הדמיה אולטרה-סאונד מצוידת במד דופק. - השתמש בסרט הדבקה כדי לקבע את גפי העכבר לפלטפורמה המחוממת, כאשר בעל החיים במצב שכיבה. ודא כי חרוט האף ממוקם ביציבות עם זרימת גז הרדמה קבועה (1.5 ליטר לדקה).
- הגן על העיניים על ידי החלת משחה אופתלמית.
3. הדמיית הגידול
- התאם את מערכת ההדמיה כדי למטב את הרזולוציה. הגדר את הפרמטרים הבאים: רווח דו מימדי, 25-30 dB; עומק תמונה, 10 מ"מ; מספר אזורי מוקד, 3; ובמרכז, 3-6 מ"מ.
הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בגשושית 40 מגה-הרץ. מצב B צוין לרכישת נתונים. - יש למרוח ג'ל אולטרסאונד בנדיבות (ראו טבלת חומרים) על אזור העור החשוף.
- החזיקו את הבדיקה והניחו אותה במגע עם ג'ל האולטרסאונד שעל החזה, ואז סרקו מהחזה לכיוון הצוואר כדי לאתר את בלוטת התריס (איור 2C).
הערה: יש להפעיל לחץ בעדינות בזמן הסריקה; לחץ מוגזם על צוואר בעל החיים עלול לגרום להתנשפות או דום נשימה. פרוטוקול זה פותח על בסיס סריקה ידנית, אך סריקה ממוכנת יכולה להתבצע גם באמצעות מכונה שתנחה את הגשושית, כגון פלטפורמת הדמיה של בעלי חיים הנעה לאורך צירי ה-X וה-Y. - סרוק למעלה ולמטה כדי לזהות את גבולות הגידול ולהעריך את גודלו וצורתו.
הערה: בלוטת תריס בריאה מופיעה בדרך כלל כמבנה היפואקוגני והומוגני, לפני קנה הנשימה. גידולים אנאפלסטיים גורמים לבלוטת התריס להיראות הרבה יותר גדולה, דבר שניתן לזהות בקלות באמצעות סריקת צוואר (איור 3). - זהה את גידולי ATC מקנה הנשימה ושרירי הרצועה בהתאם למיקום האנטומי והד האולטרסאונד.
הערה: שרירי הרצועה ממוקמים לפני בלוטת התריס וקנה הנשימה, כמו גם מאחורי בלוטת התריס. הד האולטרסאונד של שרירי הרצועה נראה גבוה מזה של ATC, בעוד הנחתה קיימת מאחורי קנה הנשימה13.- בהתבסס על הרושם של הגידול הכולל, לאשר את קטע התמונה עם קוטר הגידול הגדול ביותר משמאל לימין. לחץ על כפתור ההקפאה , ומדוד את קוטר הגידול האנטרופוסטרי והשמאלי לימין באמצעות קליפר האולטרסאונד.
הערה: יש למדוד את הקוטר הקדמי בניצב לקוטר הגידול משמאל לימין (איור 4). גודל הגידול של ATC חושב על ידי הכפלת הקוטר הקדמי בקוטר הגידול משמאל לימין14. מכיוון שגודל הגידולים בצד שמאל ובצד ימין לא היה עקבי, כל צד של הגידולים חושב בנפרד. הגודל הכולל של הגידולים התקבל על ידי הוספת הגידולים הדו-צדדיים. הגדלים נרשמו כדי לבחון את עקומת הצמיחה של ATC.
- בהתבסס על הרושם של הגידול הכולל, לאשר את קטע התמונה עם קוטר הגידול הגדול ביותר משמאל לימין. לחץ על כפתור ההקפאה , ומדוד את קוטר הגידול האנטרופוסטרי והשמאלי לימין באמצעות קליפר האולטרסאונד.
- שמור את ההקלטה כלולאת cine, המאפשרת סקירה של התמונות שנבחרו.
4. התאוששות בעלי חיים
- לאחר הסריקה, נגבו את ג'ל האולטרסאונד והסירו את סרט הריסון מגפי החיה.
- הנח את העכבר על התקן החימום המשלים (שלב 1.2). הניחו את החיה על צדה (איור 2D).
- לאחר שהעכבר מתאושש (~ 5 דקות), העבר אותו בחזרה לכלוב.
- נקו את מערכת האולטרה-סאונד, הבדיקה והפלטפורמה באמצעות מטלית רכה ואיזופרופיל אלכוהול או מגבוני גלוטראלדהיד.
- כבה את מערכת ההדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גודל ה-ATC הימני הממוצע בתחילת המחקר היה 4.867 מ"מ 2, וגודל ה-ATC השמאלי הממוצע היה 5.189 מ"מ2. במדידה הרביעית, גודל ה-ATC הימני הממוצע גדל ל-11.844 מ"מ 2, בעוד שגודל הגידול של האונה השמאלית גדל ל-9.280 מ"מ2. גודל ה-ATC הכולל גדל מ-10.057 מ"מ 2 ל-15.843 מ"מ2. בשלב מאוחר יותר של המחקר, ATC גדל במהירות. במונחים של העכבר שכותרתו "P92" (טבלה 1), גודל הגידול במדידה הרביעית גדל כמעט פי ארבעה מהגודל במדידה הראשונית. המדידות המייצגות של ארבעה עכברים ועקומות הגדילה מוצגות באיור 5.
אולטרה-סאונד בתדר גבוה הוא שיטת ההדמיה המשמשת לרוב לבדיקת בלוטות התריס בבני אדם, והטכניקה נראית מתאימה גם לעכברים. זה יכול לדמיין את כל בלוטת התריס של העכבר ופרטים של צמיחת נגע בלוטת התריס. פרוטוקול זה של יישום השיטה של אולטרה-סאונד בתדר גבוה יכול לשמש לסריקה, ניטור ומדידה מדויקים של גידולים במודל עכבר מהונדס גנטית של ATC.
איור 1: ציוד ששימש במחקר הנוכחי . (A) מערכת אולטרה-סאונד בתדר גבוה. (ב) ציוד מעבדה: (1) שמיכת חימום חשמלית. (2) מגבות נייר. (3) ג'ל אולטרסאונד. (4) וופורייזר איזופלורן. (5) קרם אפילציה. (6) צמר גפן. (7) מספריים. (8) סרט הדבקה. (9) כפפות רפואיות. (10) תא להשראת הרדמה. (11) מערכת הרדמה. (ג) מערכת סריקה ממוכנת להדמיית אולטרסאונד. העכבר המורדם לחלוטין הונח על הפלטפורמה המחוממת (מוצג בירוק), וגשושית הסריקה חוברה לזרוע ניידת מדויקת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת עכבר וסריקת אולטרסאונד . (A) השראת הרדמה. (ב) תיקון בעל החיים על המצע המחומם ותחזוקת חומר הרדמה. (C) סריקת אולטרסאונד בשיטה חופשית. (ד) החזרת בעל החיים על שמיכת החימום החשמלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות אולטרסאונד של מודל עכבר גידול ATC אורתוטופי. הקו הירוק תוחם את קנה הנשימה, הקו האדום תוחם את גידול ה-ATC והקו הצהוב תוחם את שריר הרצועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חישוב גודל הגידול. גודל הגידול חושב על ידי הכפלת הקוטר הקדמי (הקו הכתום) בקוטר הגידול משמאל לימין (הקו הלבן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח אורך של גידול ATC אורתוטופי במודל עכבר . (A) אונת בלוטת התריס הימנית. (B) אונת בלוטת התריס השמאלית. (C) בלוטת התריס כולה. כל עקומה מקבילה לחיה אחת שנמדדה ארבע פעמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| תמר | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| תווית | מקום | גודל הגידול (מ"מ2) | |||
| עמ' 71 | ימין | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| שמאל | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| סך | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| עמ' 85 | ימין | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| שמאל | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| סך | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| עמ' 89 | ימין | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| שמאל | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| סך | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| עמ' 92 | ימין | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| שמאל | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| סך | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
טבלה 1: נתונים על מדידת גודל הגידול. "P71", "P85", "P89" ו- "P92" מייצגים את תוויות העכברים. מימין: גודל הגידול בצד ימין. משמאל: גודל הגידול בצד שמאל. סה"כ: גודל הגידול הכולל על ידי הוספת הגידולים הדו-צדדיים. הקו הראשון כולל את גודל הגידול (מ"מ2: מילימטרים רבועים) ואת תאריך המדידות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה משתמש באולטרה-סאונד ברזולוציה גבוהה כדי לנתח גידולי ATC אורתוטופיים במודל עכבר מהונדס גנטית. המודל המהונדס, עם גנוטיפ של TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, פותח במעבדה שלנו. בעלי החיים מבטאים יתר על המידה BrafV600E וחסרים Trp53; הזרקת בעלי חיים intraperitoneally עם טמוקסיפן מוביל לצמיחת הגידול לאחר כ 1 חודש10. הגידולים גדלים במהירות ומגיעים לגודל מדיד תוך 50 יום. פרוטוקול זה שימש למעקב אחר צמיחת הגידול במשך 4 חודשים.
אולטרה-סאונד הוכח כאמין בעכברים עבור רקמות הדמיה המאכלסות מיקומי גוף דומים לרקמות אנושיות, כולל הכבד, בלוטת התריס והעובר9. כמו אצל בני אדם, בלוטת התריס של העכבר ממוקמת בכל צד של סחוס בלוטת התריס וקנה הנשימה13. הפרוטוקול המוצג מאפשר ניתוח של גידולי ATC בבלוטת התריס, ומאפשר לחקור את התחלת הגידול, התקדמותו ותגובתו לטיפולים. גידולי בלוטת התריס במודל העכבר גדלו למדי ותפסו את החלל סביב קנה הנשימה ושרירי הרצועה. הם הראו תכונות מוצקות-ציסטיות באולטרסאונד, בדומה למבנים פוליקולריים. הלא פולשניות, משך הזמן הקצר והנוחות של אולטרה-סאונד עשויים להפוך אותו לאטרקטיבי יותר לקבוצות מחקר רבות מאשר הדמיית תהודה מגנטית או טומוגרפיה ממוחשבת8. מכיוון שתקופות טשטוש או הרדמה ממושכות אינן נחוצות, היתרונות של אולטרה-סאונד יכולים להקל על מחקרי אורך.
מריחת ג'ל אולטרסאונד בכמות מספקת במהלך הסריקה חיונית לסילוק כיסי אוויר שעלולים להשפיע על ההדמיה וכדי למנוע דחיסה מוגזמת שעלולה להוביל לדום נשימה. פרוטוקול זה מבוצע באופן שגרתי במעבדתנו על ידי מומחי אולטרה-סאונד מנוסים המבצעים סריקה ביד חופשית. סריקה ביד חופשית עדיפה על פלטפורמה ממוכנת מכיוון שהיא מאפשרת גמישות בהתאמת מיקום בדיקת האולטרסאונד בהתאם למצב החיה. בעת שימוש בפלטפורמה ממוכנת, יש להתאים את קואורדינטות x ו- y כדי למנוע דחיסה מוגזמת על החיה. התוצאות הראו כי הגידולים גדלו לאט בתקופה המוקדמת, אך מהיום ה-60 הגידולים התפתחו מהר יותר באופן דרמטי, וגודל הגידול המקסימלי היה 38.188 מ"מ2. סיבת המוות המובילה הייתה חנק בשלב מאוחר. בניסויים קליניים, בשל הנדירות של גידולי ATC, איסוף מספיק דגימות כדי לבחון את התהליך ואת מנגנון הפיתוח קשה. השיטה של נגעי ATC ניתן לראות טוב יותר במודל murine. בעתיד, דגימות אלה עשויות לספק מידע נוסף עבור טיפולים קליניים.
מגבלה אחת של הדמיית אולטרסאונד היא שהאקוגניות של גידולי ATC יכולה להיות דומה לזו של הרקמות הסובבות, ובכך לטשטש את שולי הגידול, במיוחד בתמונת סטילס אחת. עם זאת, ניתן לזהות שוליים אלה באמצעות ניגודיות דינמית, ולכן תמונות דינמיות נשמרו במחקר זה לניתוח הבא. כדי להבטיח את התוצאות המדויקות והאמינות ביותר, יש למקם את הבדיקה בדרכים שונות כדי לדמיין את בלוטת התריס והגידול כולו מזוויות שונות. במחקר זה, רק אולטרסונוגרף אחד ביצע את כל המדידות, ולכן מדידות אמינות בין בוחנים שונים לא הוערכו.
פרוטוקול זה עשוי להקל על השימוש באולטרה-סאונד ברזולוציה גבוהה לאיתור ומדידה של גידולי ATC בבעלי חיים, ובכך לסלול את הדרך למחקרים מפורטים על הופעת סרטן, התקדמותו וטיפולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה לא קיבל מענק ספציפי מסוכנויות מימון ציבוריות, מסחריות או שלא למטרות רווח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527 (2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731 (2017).
- Renault, G., et al.
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M.
- Aldrich, J. E.
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
