Summary
현재 프로토콜은 전체 마우스 갑상선을 시각화하고 역형성 갑상선 암종의 성장을 모니터링하기 위한 고주파 초음파를 설명합니다.
Abstract
역형성 갑상선암(ATC)은 예후가 좋지 않고 생존 기간 중앙값이 짧지만 효과적인 치료법이 결과를 크게 개선하지 않습니다. ATC의 진행을 모방하는 유전자 조작 쥐 모델은 연구자들이 이 질병에 대한 치료법을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스의 세 가지 다른 유전자형을 횡단하는 TPO-cre/ERT2; 브라프CA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 형질전환 ATC 모델이 개발되었습니다. ATC 뮤린 모델은 BrafV600E 의 과발현 및 Trp53의 결실과 함께 타목시펜의 복강내 주사에 의해 유도되었고, 종양은 약 1개월 이내에 생성되었다. 고해상도 초음파를 적용하여 종양 개시 및 진행을 조사하고 종양 크기를 측정하여 동적 성장 곡선을 얻었습니다. 자기 공명 영상 (MRI) 및 컴퓨터 단층 촬영 스캐닝과 비교할 때, 초음파는 비 침습적이고, 휴대가 가능하며, 실시간이며, 방사선 노출없이 ATC 쥐 모델을 관찰하는 데 이점이 있습니다. 고분해능 초음파는 동적 및 다중 측정에 적합합니다. 그러나 생쥐의 갑상선에 대한 초음파 검사에는 관련 해부학 적 지식과 경험이 필요합니다. 이 기사는 형질전환 ATC 모델에서 종양을 스캔하기 위해 고해상도 초음파를 활용하는 자세한 절차를 제공합니다. 한편, 초음파 매개 변수 조정, 초음파 스캐닝 기술, 동물의 마취 및 회복, 그리고 그 과정에서 주의가 필요한 기타 요소가 나열됩니다.
Introduction
역형성 갑상선암(ATC)은 갑상선암의 2% 미만을 차지하지만 매년 갑상선암 관련 사망의 50% 이상을 유발합니다. ATC 진단 후 평균 생존 기간은 약 6개월에 불과하며, 생존율을 유의하게 향상시키는 치료법은 없다 1,2.
ATC의 희귀성은 질병이 어떻게 시작되고 공격적으로 진행되는지를 연구하는 연구를 방해했습니다. 질병을 모방한 유전자 조작 마우스 모델이 최근에 이용 가능해졌으며, 이는 질병과 가능한 치료법에 대한 반응에 대한 통찰력을 제공합니다 3,4,5. 이러한 연구는 측정 및 모니터링을 위한 정확한 종양 영상화를 필요로 하며, 이는 전형적으로 자기 공명 영상, 컴퓨터 단층 촬영 또는 고해상도 초음파를 사용하여 수행된다 6,7. 초음파 검사는 마우스 기관에서 널리 사용되었습니다. 실시간으로 수행 할 수 있고 피사체를 방사선에 노출시키지 않기 때문에 자기 공명 영상 및 컴퓨터 단층 촬영에 비해 장점이 있으며 필요한 장비는 휴대가 가능할 정도로 작습니다 8,9. 그러나 초음파를 사용하여 ATC 성장을 지속적으로 모니터링하는 연구는 드뭅니다. 따라서 이 작업은 이러한 맥락에서 초음파의 유용성을 탐구합니다.
여기서는 ATC의 마우스 모델에서 종양을 정확하게 스캔, 모니터링 및 측정하기 위해 고해상도 초음파를 사용하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.
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Protocol
본 연구는 쓰촨대학교 동물관리이용위원회의 승인을 받아 수행되었다. TPO-cre/ERT2; 브라프CA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 형질전환 마우스10 마리가 본 연구에 사용되었다( 재료 표 참조). 프로토콜 단계는 필요한 경우 다른 동물 종에 대해 수정할 수 있습니다. 평균 연령이 93 일 인 암컷 6 마리와 수컷 6 마리를 포함한 12 마리의 마우스가 여기에 사용되었습니다.
1. 실험 준비
- 초음파 시스템을 켜고( 재료 표 참조) 이미지를 캡처하고 데이터를 수집하기 위한 새 폴더를 만듭니다. 40MHz 라인 프로브를 선택하고 표면 조직 패턴을 클릭하여 표면 조직 변환기를 활성화합니다. 갑상선 영상에 "B-모드"를 사용합니다(그림 1A).
알림: B 모드는 기본 초음파 영상 모드입니다. 초음파 이미지의 모양은 소리와 신체 조직의 물리적 상호 작용에 의존합니다. B-모드 이미지들은 회색 이미지들(11, 12)로서 생성된다. - 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있는 특정 케이지에 마우스를 보관하십시오. 온도 조절을 보장하기 위해 케이지를 보조 가열 장치( 재료 표 참조)에 놓습니다.
- 기화기에 충분한 이소플루란이 있고 탱크에 O2 가 있는지 확인하십시오. 보급품이 충분하지 않으면 탱크를 새 탱크로 교체하십시오.
- 멸균 식염수로 동물 이미징 플랫폼을 청소하고 가열 버튼을 켭니다. 동물을 플랫폼에 놓기 전에 온도가 38-40 °C인지 확인하십시오(그림 1C).
2. 이미징을 위한 동물 준비
- 이소플루란 기화기를 켭니다. 마우스를 케이지에서 마취 상자로 옮깁니다.
- 기화기에서 나온 1%-2%의 이소플루란과 0.8L/min으로 흐르는 산소의 혼합물을 사용하여 동물을 마취합니다.
- 가슴에서 목까지 제모 크림을 바르고 30초 정도 기다린 후 크림과 털을 완전히 닦아냅니다. 따뜻한 멸균 식염수로 해당 부위와 주변 모피를 철저히 헹굽니다.
- 가열 된 플랫폼에 마취 된 동물을 놓습니다. 마취 배출구에 연결된 노즈 콘으로 주둥이를 덮습니다(그림 2A, B).
알림: 마우스는 1-2분 이내에 완전히 진정되어야 합니다. 동물이 여전히 활동적이라면 동물이 더 이상 페달 금단 반사를 나타내지 않을 때까지 장기간의 이소플루란 유도를 수행합니다. 동물이 안정적으로 호흡하고 있는지 확인하십시오. - 이미징하는 동안 가열 된 플랫폼을 통해 마우스의 심박수를 모니터링하십시오.
알림: 초음파 영상 시스템에는 심박수 모니터가 장착되어 있습니다. - 접착 테이프를 사용하여 마우스의 팔다리를 가열 된 플랫폼에 고정하고 동물을 앙와위 자세로 고정하십시오. 노즈콘이 일정한 마취 가스 흐름(1.5L/min)으로 안정적으로 배치되었는지 확인하십시오.
- 안과 용 연고를 바르면 눈을 보호하십시오.
3. 종양 영상
- 이미징 시스템을 조정하여 해상도를 최적화합니다. 다음 매개 변수를 설정하십시오 : 2 차원 이득, 25-30dB; 이미지 깊이, 10mm; 초점 영역의 수, 3; 중앙, 3-6 mm.
참고: 본 연구에서는 40MHz 프로브를 사용했습니다. 데이터 수집을 위해 B 모드가 지정되었습니다. - 맨살 부위에 초음파 젤 ( 재료 표 참조)을 자유롭게 바르십시오.
- 프로브를 잡고 가슴의 초음파 젤에 닿게 한 다음 가슴에서 목을 향해 스캔하여 갑상선을 찾습니다(그림 2C).
알림: 스캔하는 동안 부드럽게 압력을 가하십시오. 동물의 목에 과도한 압력이 가해지면 헐떡 거림이나 무호흡이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 휴대용 스캐닝을 기반으로 개발되었지만 x축 및 y축을 따라 이동하는 동물 이미징 플랫폼과 같이 프로브를 안내하는 기계를 사용하여 기계화된 스캐닝을 수행할 수도 있습니다. - 위아래로 스캔하여 종양의 경계를 식별하고 크기와 모양을 평가합니다.
참고: 건강한 갑상선은 일반적으로 기관 앞에서 저에코 생성, 균질한 구조로 나타납니다. 역형성 종양은 갑상선을 훨씬 더 크게 보이게 하며, 이는 목 스캔으로 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 3). - 해부학적 위치와 초음파 에코에 따라 기관과 스트랩 근육에서 ATC 종양을 식별합니다.
참고: 스트랩 근육은 갑상선과 기관 앞과 갑상선 뒤에 있습니다. 스트랩 근육의 초음파 에코는 ATC의 초음파 에코보다 높게 나타나며, 감쇠는 기관 뒤에 존재한다(13).- 전체 종양의 인상에 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 종양 직경이 가장 큰 이미지 섹션을 확인합니다. 동결 버튼을 누르고 초음파 캘리퍼를 사용하여 전후 및 왼쪽에서 오른쪽 종양 직경을 측정합니다.
참고: 전후 직경은 왼쪽에서 오른쪽 종양 직경에 수직으로 측정해야 합니다(그림 4). ATC의 종양 크기는 전후 직경에 왼쪽에서 오른쪽 종양 직경14를 곱하여 계산되었습니다. 왼쪽과 오른쪽의 종양의 크기가 일치하지 않았기 때문에 종양의 각 측면을 별도로 계산했습니다. 종양의 전체 크기는 양측 종양을 추가하여 얻었다. ATC의 성장 곡선을 관찰하기 위해 크기를 기록하였다.
- 전체 종양의 인상에 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 종양 직경이 가장 큰 이미지 섹션을 확인합니다. 동결 버튼을 누르고 초음파 캘리퍼를 사용하여 전후 및 왼쪽에서 오른쪽 종양 직경을 측정합니다.
- 녹화물을 시네 루프로 저장하여 선택한 이미지를 쉽게 검토할 수 있습니다.
4. 동물 회복
- 스캔 후 초음파 젤을 닦고 동물의 팔다리에서 구속 테이프를 제거하십시오.
- 보조 가열 장치에 마우스를 놓습니다(1.2단계). 동물을 옆으로 눕힌다(그림 2D).
- 마우스가 회복된 후(~5분) 다시 케이지로 옮깁니다.
- 부드러운 천과 이소프로필 알코올 또는 글루타르알데히드 물티슈를 사용하여 초음파 시스템, 프로브 및 플랫폼을 청소합니다.
- 이미징 시스템을 끕니다.
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Representative Results
연구 시작 시 평균 우측 ATC 크기는 4.867mm2였고, 평균 좌측 ATC 크기는 5.189mm2였다. 네 번째 측정에서, 평균 우측 ATC 크기는 11.844 mm2로 증가한 반면, 좌엽의 종양 크기는 9.280mm2로 증가하였다. 총 ATC 크기가 10.057 mm 2에서 15.843 mm2로 변경 연구의 후반 단계에서 ATC는 빠르게 성장했습니다. "P92"로 표지된 마우스(표 1)의 경우, 네 번째 측정에서의 종양 크기는 초기 측정에서의 크기보다 거의 4배 더 크게 증가하였다. 4마리의 마우스의 대표적인 측정치와 성장 곡선을 도 5에 나타내었다.
고주파 초음파는 인간의 갑상선을 검사하는 데 가장 자주 사용되는 영상 방식이며 이 기술은 생쥐에게도 적합한 것으로 보입니다. 전체 마우스 갑상선과 갑상선 병변 성장의 세부 사항을 시각화할 수 있습니다. 고주파 초음파 검사 방법을 적용한 이 프로토콜은 ATC의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양을 정확하게 스캔, 모니터링 및 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1: 본 연구에 사용된 장비 . (A) 고주파 초음파 시스템. (B) 실험실 용품 : (1) 전기 난방 담요. (2) 종이 타월. (3) 초음파 젤. (4) 이소플루란 기화기. (5) 탈모 크림. (6) 면봉. (7) 가위. (8) 접착 테이프. (9) 의료용 장갑. (10) 마취 유도용 챔버. (11) 마취 시스템. (C) 초음파 이미징을 위한 기계화된 스캐닝 시스템. 완전히 진정된 마우스를 가열된 플랫폼(녹색으로 표시)에 놓고 스캐닝 프로브를 정밀 가동 암에 부착했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 마우스 준비 및 초음파 스캔. (A) 마취 유도. (B) 가열된 플랫폼에 동물을 고정하고 마취를 유지합니다. (C) 자유형 방법으로 초음파 스캐닝. (D) 전기 가열 담요에서 동물의 회수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 동소 ATC 종양 마우스 모델의 초음파 이미지. 녹색 선은 기관을 구분하고, 빨간색 선은 ATC 종양을 구분하고, 노란색 선은 스트랩 근육을 구분합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 종양 크기 계산. 종양 크기는 전후 직경(주황색 선)에 왼쪽에서 오른쪽 종양 직경(흰색 선)을 곱하여 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마우스 모델에서 동소 ATC 성장의 종단 분석 . (A) 오른쪽 갑상선 엽. (B) 왼쪽 갑상선 엽. (C) 갑상선 전체. 각 곡선은 4회 측정된 한 마리의 동물에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 날짜 | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| 레이블 | 위치 | 종양 크기(mm2) | |||
| P71 | 오른쪽 | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| 왼쪽 | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| 합계 | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | 오른쪽 | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| 왼쪽 | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| 합계 | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | 오른쪽 | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| 왼쪽 | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| 합계 | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | 오른쪽 | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| 왼쪽 | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| 합계 | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
표 1: 종양 크기 측정에 대한 데이터. "P71", "P85", "P89", 및 "P92"는 마우스의 라벨을 나타낸다. 오른쪽 : 오른쪽의 종양 크기. 왼쪽 : 왼쪽의 종양 크기. 전체: 양측 종양을 더한 전체 종양 크기. 첫 번째 라인에는 종양 크기(mm2: 제곱 밀리미터) 및 측정 날짜가 포함됩니다.
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Discussion
이 프로토콜은 고해상도 초음파 검사를 사용하여 유전자 조작 마우스 모델에서 동소 ATC 종양을 분석합니다. TPO-cre/ERT2의 유전자형을 가진 형질전환 모델; 브라프CA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10은 당사 실험실에서 개발되었습니다. 동물들은 BrafV600E 를 과발현하고 Trp53이 부족합니다. 동물에게 타목시펜을 복강 주사하면 약 1개월 후에 종양 성장이 일어난다10. 종양은 빠르게 성장하여 50일 이내에 측정 가능한 크기에 도달합니다. 이 프로토콜은 4개월 동안 종양 성장을 모니터링하는 데 사용되었습니다.
초음파는 간, 갑상선 및 태아를 포함하여 인간 조직과 유사한 신체 위치를 차지하는 조직을 이미징하기 위해 마우스에서 신뢰할 수 있음이 입증되었습니다9. 인간과 마찬가지로 마우스 갑상선은 갑상선 연골과 기관의 양쪽에 위치합니다13. 제시된 프로토콜은 갑상선의 ATC 종양을 분석하여 종양 시작, 진행 및 치료에 대한 반응을 연구할 수 있도록 합니다. 마우스 모델의 갑상선 종양은 상당히 커졌고 기관과 스트랩 근육 주변의 공간을 차지했습니다. 그들은 초음파에서 고체 낭성 특징을 보였으며, 모낭 구조와 유사했다. 초음파의 비침습성, 짧은 지속 시간 및 편리함은 많은 연구 그룹에게 자기공명영상이나 컴퓨터단층촬영보다 더 매력적일 수 있다8. 긴 진정 또는 마취 기간이 필요하지 않기 때문에 초음파의 장점은 종단 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
스캔하는 동안 충분한 초음파 젤을 바르는 것은 이미징에 영향을 줄 수 있는 공기 주머니를 제거하고 무호흡으로 이어질 수 있는 과도한 압박을 방지하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 자유형 스캔을 수행하는 숙련된 초음파 촬영 전문가가 실험실에서 일상적으로 수행합니다. 자유형 스캐닝은 동물의 상태에 따라 초음파 프로브의 위치를 유연하게 조정할 수 있기 때문에 기계화 된 플랫폼보다 선호됩니다. 기계화 된 플랫폼을 사용할 때 동물에 대한 과도한 압박을 방지하기 위해 x 및 y 좌표를 조정해야합니다. 그 결과, 종양은 초기에 천천히 성장하였으나, 60일째부터는 종양이 극적으로 더 빠르게 발달하였고, 최대 종양 크기는 38.188mm2였다. 주요 사망 원인은 말기의 질식이었습니다. 임상 시험에서 ATC 종양의 희귀성으로 인해 발달 과정과 메커니즘을 관찰하기에 충분한 샘플을 수집하는 것은 어렵습니다. ATC 병변의 방법은 쥐 모델에서 더 잘 관찰 될 수 있습니다. 앞으로 이러한 샘플은 임상 치료에 대한 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다.
초음파 영상의 한 가지 한계는 ATC 종양의 에코 발생성이 주변 조직의 에코 발생성과 유사하여 특히 하나의 정지 이미지에서 종양 가장자리를 가릴 수 있다는 것입니다. 그러나 이러한 여백은 동적 대비를 사용하여 식별할 수 있으므로 후속 분석을 위해 이 연구에서 동적 이미지를 저장했습니다. 가장 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 전체 갑상선과 종양을 다양한 각도에서 시각화할 수 있도록 프로브를 다양한 방식으로 배치해야 합니다. 이 연구에서는 한 명의 초음파 기사만이 모든 측정을 수행했기 때문에 서로 다른 검사자 간의 신뢰성 측정은 평가되지 않았습니다.
이 프로토콜은 동물에서 ATC 종양을 찾고 측정하기 위한 고해상도 초음파 검사의 사용을 용이하게 하여 암 발병, 진행 및 치료에 대한 자세한 연구를 위한 길을 열 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 공공, 상업 또는 비영리 자금 지원 기관으로부터 특정 보조금을 받지 못했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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