Summary
Bu protokol, fare tiroid bezinin tamamını görselleştirmek ve anaplastik tiroid karsinomunun büyümesini izlemek için yüksek frekanslı ultrasonografiyi tanımlamaktadır.
Abstract
Anaplastik tiroid karsinomu (ATK) kötü prognoz ve kısa medyan sağkalım süresi ile ilişkilidir, ancak etkili bir tedavi sonuçları önemli ölçüde iyileştirmez. ATC'nin ilerlemesini taklit eden genetik olarak tasarlanmış murin modelleri, araştırmacıların bu hastalık için tedavileri incelemelerine yardımcı olabilir. Üç farklı fare genotipini geçmek, bir TPO-cre / ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgenik ATC modeli geliştirildi. ATC murin modeli, BrafV600E'nin aşırı ekspresyonu ve Trp53'ün silinmesi ile intraperitoneal tamoksifen enjeksiyonu ile indüklendi ve tümörler yaklaşık 1 ay içinde üretildi. Tümörün başlama ve progresyonunu araştırmak için yüksek çözünürlüklü ultrasonografi uygulandı ve tümör boyutları ölçülerek dinamik büyüme eğrisi elde edildi. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve bilgisayarlı tomografi taraması ile karşılaştırıldığında, ultrasonun ATC murin modelini gözlemlemede noninvaziv, taşınabilir, gerçek zamanlı ve radyasyona maruz kalmadan avantajlar vardır. Yüksek çözünürlüklü ultrason dinamik ve çoklu ölçümler için uygundur. Bununla birlikte, farelerde tiroidin ultrasonografik incelemesi, ilgili anatomik bilgi ve deneyimi gerektirir. Bu makalede, transgenik ATC modelinde tümörleri taramak için yüksek çözünürlüklü ultrason kullanımı için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu arada, ultrasonik parametre ayarı, ultrason tarama becerileri, anestezi ve hayvanların iyileşmesi ve işlem sırasında dikkat edilmesi gereken diğer unsurlar listelenmiştir.
Introduction
Anaplastik tiroid karsinomu (ATC) tiroid kanserlerinin %2'sinden azını oluştursa da, yılda tiroid kanserine bağlı ölümlerin %50'sinden fazlasına neden olmaktadır. ATC tanısından sonra medyan sağkalım süresi sadece yaklaşık 6 aydır ve sağkalımı önemli ölçüde artıran hiçbir tedavi mevcut değildir 1,2.
ATC'nin nadirliği, hastalığın nasıl başladığını ve agresif bir şekilde ilerlediğini inceleyen araştırmaları engellemiştir. Hastalığı taklit eden genetiği değiştirilmiş fare modelleri yakın zamanda kullanıma sunulmuştur, bu da hastalık ve olası tedavilere verdiği yanıtlar hakkında fikir vermektedir 3,4,5. Bu tür çalışmalar, tipik olarak manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı tomografi veya yüksek çözünürlüklü ultrasonografi 6,7 kullanılarak gerçekleştirilen ölçümler ve izleme için doğru tümör görüntülemesi gerektirir. Ultrasonografi fare organlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Gerçek zamanlı olarak yapılabilmesi ve konuyu radyasyona maruz bırakmaması nedeniyle manyetik rezonans görüntüleme ve bilgisayarlı tomografiye göre avantajları vardır ve gerekli ekipmanlar taşınabilir olacak kadar küçüktür 8,9. Bununla birlikte, ultrason kullanarak ATC büyümesini sürekli izlemeye yönelik çalışmalar nadirdir; Bu nedenle, bu çalışma bu bağlamda ultrasonun faydasını araştırmaktadır.
Burada, ATC'nin bir fare modelinde tümörleri doğru bir şekilde taramak, izlemek ve ölçmek için yüksek çözünürlüklü ultrasonografi kullanmak için bir protokol sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Sichuan Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir. TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Bu çalışmada Trp53Δex2-10/Δex2-10 transgenik fareler10 kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu). Protokol adımları gerekirse farklı hayvan türleri için değiştirilebilir. Burada altı dişi ve altı erkek olmak üzere, yaş ortalaması 93 gün olan on iki fare kullanılmıştır.
1. Deneysel hazırlık
- Ultrasonografi sistemini açın (bakınız Malzeme Tablosu) ve görüntüleri yakalamak ve verileri toplamak için yeni bir klasör oluşturun. 40 MHz çizgi probunu seçin ve yüzeysel doku dönüştürücüsünü etkinleştirmek için yüzeysel doku desenine tıklayın. Tiroid görüntüleme için "B modunu" kullanın (Şekil 1A).
NOT: B modu temel ultrason görüntüleme modudur. Ultrason görüntülerinin ortaya çıkması, sesin vücuttaki dokularla fiziksel etkileşimlerine dayanır. B modu görüntüler gri görüntülerolarak üretilir 11,12. - Fareleri, yiyecek ve suya serbest erişimi olan belirli kafeslerde tutun. Termoregülasyonu sağlamak için kafesi ek bir ısıtma cihazına yerleştirin (bkz.
- Buharlaştırıcıda yeterli izofluran ve tanktaO2 olduğundan emin olun. Sarf malzemeleri yetersizse, tankları yenileriyle değiştirin.
- Hayvan görüntüleme platformunu steril salin ile temizleyin ve ısıtma düğmesini açın. Hayvanı platforma yerleştirmeden önce sıcaklığın 38-40 °C olduğunu doğrulayın (Şekil 1C).
2. Görüntüleme için hayvan hazırlığı
- İzofluran buharlaştırıcıyı açın. Fareyi kafesten anestezi kutusuna aktarın.
- Buharlaştırıcıdan% 1 -% 2 izofluran karışımı ve 0.8 L / dak'da akan oksijen kullanarak hayvanı uyuşturun.
- Tüy dökücü kremi göğüsten boyuna sürün, 30 saniye bekleyin ve ardından kremi ve kürkü tamamen silin. Alanı ve çevresindeki kürkü ılık steril salinle iyice durulayın.
- Anestezi uygulanan hayvanı ısıtılmış platforma yerleştirin. Burnu anestezi çıkışına bağlı bir burun konisi ile örtün (Şekil 2A, B).
NOT: Fare 1-2 dakika içinde tamamen sakinleştirilmelidir. Hayvan hala aktifse, hayvan artık bir pedal geri çekilme refleksi göstermeyene kadar uzun süreli izofluran indüksiyonu yapın. Hayvanın istikrarlı bir şekilde nefes aldığından emin olun. - Görüntüleme sırasında, farenin kalp atış hızını ısıtılmış platformdan izleyin.
NOT: Ultrasonografi görüntüleme sistemi kalp atış hızı monitörü ile donatılmıştır. - Farenin uzuvlarını, hayvan sırtüstü pozisyonda olacak şekilde ısıtılmış platforma sabitlemek için yapışkan bant kullanın. Burun konisinin sabit bir anestezik gaz akışı (1,5 L/dak) ile stabil bir şekilde konumlandırıldığından emin olun.
- Oftalmik merhem uygulayarak gözleri koruyun.
3. Tümör görüntüleme
- Çözünürlüğü optimize etmek için görüntüleme sistemini ayarlayın. Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: iki boyutlu kazanç, 25-30 dB; görüntü derinliği, 10 mm; odak bölgelerinin sayısı, 3; ve merkez, 3-6 mm.
NOT: Bu çalışmada 40 MHz prob kullanılmıştır. Veri toplama için B modu belirtildi. - Çıplak cilt bölgesine ultrason jelini (bakınız Malzeme Tablosu) serbestçe uygulayın.
- Probu tutun ve göğüsteki ultrason jeli ile temas ettirin ve ardından tiroidi bulmak için göğüsten boyuna doğru tarayın (Şekil 2C).
NOT: Tarama sırasında basıncı nazikçe uygulayın; Hayvanın boynundaki aşırı baskı, nefes darlığına veya apneye neden olabilir. Bu protokol elde taramaya dayalı olarak geliştirilmiştir, ancak mekanize tarama, x ve y eksenleri boyunca hareket eden bir hayvan görüntüleme platformu gibi probu yönlendirmek için bir makine kullanılarak da gerçekleştirilebilir. - Tümörün sınırlarını belirlemek ve boyutunu ve şeklini değerlendirmek için yukarı ve aşağı tarayın.
NOT: Sağlıklı bir tiroid genellikle trakeanın önünde hipoekojenik, homojen bir yapı olarak ortaya çıkar. Anaplastik tümörler tiroidin çok daha büyük görünmesine neden olur ve bu da boyun taraması ile kolayca tanımlanabilir (Şekil 3). - ATC tümörlerini trakeadan tanımlayın ve anatomik lokalizasyona ve ultrason ekosuna bağlı olarak kasları bağlayın.
NOT: Kayış kasları tiroid ve trakeanın önünde ve tiroidin arkasında bulunur. Kayış kaslarının ultrason ekosu ATC'ninkinden daha yüksek görünürken, trakea13'ün arkasında zayıflama vardır.- Toplam tümörün izlenimine dayanarak, en büyük soldan sağa tümör çapına sahip görüntü bölümünü onaylayın. Dondurma düğmesine basın ve ultrason kaliperi kullanarak anteroposterior ve soldan sağa tümör çaplarını ölçün.
NOT: Anteroposterior çap, soldan sağa tümör çapına dik olarak ölçülmelidir (Şekil 4). ATK'nın tümör boyutu, anteroposterior çapın soldan sağa tümör çapı14 ile çarpılmasıyla hesaplandı. Sol ve sağ taraftaki tümörlerin boyutları tutarsız olduğundan, tümörlerin her iki tarafı ayrı ayrı hesaplandı. Bilateral tümörlerin eklenmesiyle tümörlerin toplam büyüklüğü elde edildi. ATC'nin büyüme eğrisini gözlemlemek için boyutlar kaydedildi.
- Toplam tümörün izlenimine dayanarak, en büyük soldan sağa tümör çapına sahip görüntü bölümünü onaylayın. Dondurma düğmesine basın ve ultrason kaliperi kullanarak anteroposterior ve soldan sağa tümör çaplarını ölçün.
- Kaydı, seçilen görüntülerin incelenmesini kolaylaştıran bir sinema döngüsü olarak kaydedin.
4. Hayvan kurtarma
- Taradıktan sonra, ultrason jelini silin ve kısıtlayıcı bandı hayvanın uzuvlarından çıkarın.
- Fareyi ek ısıtma aygıtının üzerine yerleştirin (adım 1.2). Hayvanı yan yatırdınız (Şekil 2D).
- Fare iyileştikten sonra (~ 5 dakika), kafese geri aktarın.
- Ultrasonografi sistemini, probu ve platformu yumuşak bir bez ve izopropil alkol veya glutaraldehit mendiller kullanarak temizleyin.
- Görüntüleme sistemini kapatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çalışmanın başında ortalama sağ ATC boyutu 4.867 mm2, ortalama sol ATC boyutu 5.189mm2 idi. Dördüncü ölçümde, ortalama sağ ATC boyutu 11.844 mm2'ye yükselirken, sol lobun tümör boyutu 9.280mm2'ye yükselmiştir. Toplam ATC boyutu 10,057 mm2'den 15,843mm2'ye yükseltildi. Çalışmanın sonraki aşamasında, ATC hızla büyüdü. "P92" etiketli fare açısından (Tablo 1), dördüncü ölçümdeki tümör boyutu, ilk ölçümdeki boyuttan neredeyse dört kat daha büyük hale geldi. Dört farenin temsili ölçümleri ve büyüme eğrileri Şekil 5'te gösterilmiştir.
Yüksek frekanslı ultrasonografi, insanlarda tiroid bezlerini incelemek için en sık kullanılan görüntüleme yöntemidir ve teknik fareler için de çok uygun görünmektedir. Tüm fare tiroid bezini ve tiroid lezyonu büyümesinin ayrıntılarını görselleştirebilir. Yüksek frekanslı ultrasonografi yöntemini uygulayan bu protokol, genetik olarak tasarlanmış bir ATC fare modelinde tümörleri doğru bir şekilde taramak, izlemek ve ölçmek için kullanılabilir.
Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan ekipman . (A) Yüksek frekanslı ultrasonografi sistemi. (B) Laboratuvar malzemeleri: (1) Elektrikli ısıtma battaniyesi. (2) Kağıt havlular. (3) Ultrason jeli. (4) İzofluran buharlaştırıcı. (5) Tüy dökücü krem. (6) Pamuklu çubuklar. (7) Makas. (8) Yapışkan bant. (9) Tıbbi eldivenler. (10) Anestezi indüksiyonu odası. (11) Anestezi sistemi. (C) Ultrason görüntüleme için mekanize bir tarama sistemi. Tamamen yatıştırılmış fare, ısıtılmış platforma (yeşil renkle gösterilmiştir) yerleştirildi ve tarama probu hassas bir hareketli kola tutturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare hazırlığı ve ultrason taraması . (A) Anestezi indüksiyonu. (B) Hayvanın ısıtılmış platforma sabitlenmesi ve anestezi bakımı. (C) Serbest el yöntemiyle ultrason taraması. (D) Elektrikli ısıtma battaniyesi üzerindeki hayvanın geri kazanılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ortotopik ATC tümör fare modelinin ultrason görüntüleri. Yeşil çizgi trakeayı sınırlar, kırmızı çizgi ATC tümörünü sınırlar ve sarı çizgi kayış kasını sınırlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tümör boyutunun hesaplanması. Tümör boyutu, anteroposterior çapın (turuncu çizgi) soldan sağa tümör çapı (beyaz çizgi) ile çarpılmasıyla hesaplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Fare modelinde ortotopik ATC büyümesinin uzunlamasına analizi . (A) Sağ tiroid lobu. (B) Sol tiroid lobu. (C) Tüm tiroid. Her eğri, dört kez ölçülen bir hayvana karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Tarih | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| Etiket | Yer | Tümör Boyutu (mm2) | |||
| P71 | Sağ | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| Sol | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| toplam | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | Sağ | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| Sol | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| toplam | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | Sağ | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| Sol | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| toplam | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | Sağ | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| Sol | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| toplam | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
Tablo 1: Tümör boyutu ölçümü ile ilgili veriler. "P71", "P85", "P89" ve "P92" farelerin etiketlerini temsil eder. Sağ: Sağ tarafın tümör boyutu. Sol: Sol tarafın tümör boyutu. Toplam: İki taraflı tümörlerin eklenmesiyle toplam tümör boyutu. İlk satır, tümör boyutunu (mm2: milimetre kare) ve ölçümlerin tarihini içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, genetiği değiştirilmiş bir fare modelinde ortotopik ATC tümörlerini analiz etmek için yüksek çözünürlüklü ultrasonografi kullanır. TPO-cre/ERT2 genotipine sahip transgenik model; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, laboratuvarımızda geliştirilmiştir. Hayvanlar BrafV600E'yi aşırı ifade eder ve Trp53'ten yoksundur; Hayvanlara intraperitoneal olarak tamoksifen enjekte edilmesi yaklaşık 1 ay sonra tümör büyümesine yol açar10. Tümörler hızla büyür ve 50 gün içinde ölçülebilir bir boyuta ulaşır. Bu protokol 4 ay boyunca tümör büyümesini izlemek için kullanıldı.
Ultrasonografinin farelerde karaciğer, tiroid vefetüs 9 dahil olmak üzere insan dokularıyla benzer vücut konumlarını işgal eden dokuları görüntülemek için güvenilir olduğu kanıtlanmıştır. İnsanlarda olduğu gibi, fare tiroidi tiroid kıkırdağının her iki tarafında bulunur ve trakea13. Sunulan protokol, tiroiddeki ATC tümörlerinin analizine izin vererek, tümör başlangıcı, ilerlemesi ve tedavilere yanıtın incelenmesini sağlar. Fare modelindeki tiroid tümörleri oldukça büyüdü ve trakea ve kayış kaslarının etrafındaki alanı kapladı. Ultrasonda foliküler yapılara benzer şekilde solid-kistik özellikler gösterdiler. Ultrasonografinin non-invaziv olması, kısa süreli olması ve rahatlığı birçok araştırma grubu için manyetik rezonans görüntüleme veya bilgisayarlı tomografi8'den daha cazip hale getirebilir. Uzun sedasyon veya anestezi süreleri gereksiz olduğundan, ultrasonografinin avantajları uzunlamasına çalışmaları kolaylaştırabilir.
Tarama sırasında yeterli ultrason jeli uygulanması, görüntülemeyi etkileyebilecek hava ceplerini ortadan kaldırmak ve apneye yol açabilecek aşırı sıkıştırmayı önlemek için çok önemlidir. Bu protokol laboratuvarımızda serbest tarama yapan deneyimli ultrasonografi uzmanları tarafından rutin olarak yapılmaktadır. Serbest tarama, mekanize bir platforma tercih edilir, çünkü ultrason probunun konumunu hayvanın durumuna göre ayarlamada esneklik sağlar. Mekanize bir platform kullanırken, hayvan üzerinde aşırı sıkıştırmayı önlemek için x ve y koordinatları ayarlanmalıdır. Sonuçlar, tümörlerin erken dönemde yavaş büyüdüğünü, ancak 60. günden itibaren tümörlerin önemli ölçüde daha hızlı geliştiğini ve maksimum tümör boyutunun 38.188mm2 olduğunu gösterdi. Önde gelen ölüm nedeni geç evrede boğulmaydı. Klinik çalışmalarda, ATC tümörlerinin nadirliği nedeniyle, gelişim sürecini ve mekanizmasını gözlemlemek için yeterli örnek toplamak zordur. ATC lezyonlarının yöntemi murin modelinde daha iyi gözlemlenebilir. Gelecekte, bu örnekler klinik tedaviler için daha fazla bilgi sağlayabilir.
Ultrason görüntülemenin bir sınırlaması, ATC tümörlerinin ekojenitesinin çevre dokularınkine benzeyebilmesi, böylece özellikle bir hareketsiz görüntüde tümör kenar boşluklarını gizlemesidir. Bununla birlikte, bu kenar boşlukları dinamik kontrast kullanılarak tanımlanabilir, bu nedenle dinamik görüntüler daha sonraki analizler için bu çalışmada kaydedilmiştir. En doğru ve güvenilir sonuçları elde etmek için, probun tüm tiroid ve tümörü farklı açılardan görselleştirmek için çeşitli şekillerde konumlandırılması gerekir. Bu çalışmada, tüm ölçümleri sadece bir ultrasonografi uzmanı gerçekleştirmiştir, bu nedenle farklı denetçiler arasındaki güvenilirlik ölçümleri değerlendirilmemiştir.
Bu protokol, hayvanlarda ATC tümörlerinin yerini belirlemek ve ölçmek için yüksek çözünürlüklü ultrasonografinin kullanımını kolaylaştırabilir, böylece kanser başlangıcı, ilerlemesi ve tedavisi ile ilgili ayrıntılı çalışmaların önünü açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, kamu, ticari veya kar amacı gütmeyen finansman kurumlarından özel bir hibe almamıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527 (2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731 (2017).
- Renault, G., et al.
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M.
- Aldrich, J. E.
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
