Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد للكشف المحدد عن الميكوبلازما الرئوية

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

في عدوى الميكوبلازما الرئوية ، يمكن أن تؤدي اختبارات الأمصال إلى نتائج جيدة ، ولكن مع خصوصية منخفضة بسبب التفاعل المتقاطع المناعي. يضمن ELISA الذي يلتقط المستضد الداخلي ، الموصوف في هذه الورقة ، خصوصية عالية للأنواع وقد ثبت أنه اختبار فحص موثوق به للتشخيص الدقيق للمتفطرة الرئوية.

Abstract

الميكوبلازما الرئوية هي بدائية النواة التي تعاني من نقص جدار الخلية ، والمعروفة أساسا باستعمار الجهاز التنفسي البشري وأنها مستوطنة ، مع ذروة وبائية كل 6 سنوات ، في الأطفال الأكبر سنا والشباب. يمثل تشخيص المتفطرة الرئوية تحديا بسبب الطبيعة السريعة للممرض وإمكانية النقل بدون أعراض. لا يزال التشخيص المختبري لعدوى المتفطرة الرئوية على أساس معايرة الأجسام المضادة في عينات مصل المرضى هو الطريقة الأكثر ممارسة. بسبب المشكلة المحتملة للتفاعل المناعي المتبادل مع استخدام مصل متعدد النسيلة للمتفطرة الرئوية ، تم تطوير مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد (ELISA) لتحسين خصوصية التشخيص المصلي. يتم طلاء صفائح ELISA بأجسام مضادة متعددة النسيلة M. pneumoniae ، يتم تربيتها في الأرانب وتصبح محددة بعد الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة التي تشترك في المستضدات مع أنواع M. pneumoniae و / أو من المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي . ثم يتم التعرف على المستضدات المتماثلة المتفاعلة M. pneumoniae على وجه التحديد من خلال الأجسام المضادة المقابلة لها في عينات المصل. أدى المزيد من التحسين للمعلمات الفيزيائية والكيميائية التي يتعرض لها ELISA لالتقاط المستضد إلى ELISA محدد للغاية وحساس وقابل للتكرار.

Introduction

الميكوبلازما هي من بين أصغر وأبسط بدائيات النوى المعروفة. تتميز بشكل أساسي عن البكتيريا الأخرى بعدم وجود بنية جدار الخلية. وهكذا ، تم تصنيف الميكوبلازما في فئة منفصلة تسمى Mollicutes1. يمنح نقص جدار الخلية مقاومة جوهرية لهذه الكائنات الحية الدقيقة ضد بعض العوامل المضادة للميكروبات وهو مسؤول إلى حد كبير عن تعدد أشكالها. الميكوبلازما لها جينوم صغير وحجم منخفض ، مما يحد من قدراتها الأيضية والاصطناعية الحيوية ويفسر طبيعتها الطفيلية والرمية1.

الميكوبلازما الرئوية هي واحدة من الميكوبلازما التي تصيب الإنسان ويعتقد أنها الأكثر ضراوة2. يستعمر المتفطرة الرئوية الجهاز التنفسي العلوي ، مما يؤدي إلى التهاب رئوي غير نمطي لدى الأطفال والشباب. العلامات السريرية الناتجة عن عدوى المتفطرة الرئوية تشبه الأنفلونزا ، مع الصداع والحمى والسعال3. يتم التوسط في الالتصاق الخلوي للمتفطرة الرئوية بالخلايا المضيفة بواسطة عضية مرفقة بما في ذلك الالتصاق P1 الرئيسي والعديد من البروتينات الملحقة 4,5. قد تحدث المزيد من المظاهر السريرية بسبب الالتهاب الموضعي وتحفيز الجهاز المناعي المضيف الناتج عن الالتزام الحميم للمتفطرة الرئوية بالغشاء المخاطي في مجرى الهواء6. على الرغم من أن الالتهاب الرئوي هو السمة المميزة لعدوى M. pneumoniae ، فقد تم الكشف عن أن العدوى بهذه البكتيريا يمكن أن تكون مسؤولة أيضا عن مجموعة واسعة من المظاهر غير الرئوية في مواقع تشريحية مختلفة مثل الجهاز العصبي المركزي والقلب والجلد والمفاصل7.

كما هو الحال بالنسبة لجميع أنواع الميكوبلازما ، فإن تشخيص المتفطرة الرئوية يمثل تحديا. العلامات السريرية التي تثير الميكوبلازما هي في الغالب غير واضحة وغير مميزة8. نظرا لأنه من الصعب جدا تشخيص عدوى المتفطرة الرئوية بالاعتماد فقط على المظاهر والأعراض السريرية ، فإن الفحص المختبري له أهمية خاصة9. الكشف عن مستعمرات المتفطرة الرئوية عن طريق الثقافة هو الطريقة القياسية الذهبية للتشخيص المناسب. ومع ذلك ، فإن متطلبات النمو السريعة والوقت الطويل اللازم لتقديم نتائج نهائية (1-2 أسابيع) تعقد الثقافة ، وبالتالي تعني أنها نادرا ما تستخدم للتشخيص الروتيني10. تم التحقق من صحة تقنيات تضخيم الحمض النووي من حيث السرعة والكفاءة ، على الرغم من أنها لا تعتبر اختبارات تشخيصية من الدرجة الأولى بسبب تكلفتها العالية نسبيا وعدم توفرها في بعض مرافق الرعاية الصحية. صحيح أن اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية تستخدم على نطاق واسع لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية ، لكنها لا تزال غير قادرة على استبدال الأمصال. أيضا ، أدى الحدوث المتكرر لكل من النتائج السلبية والإيجابية الخاطئة إلى الحد من استخدام PCR9. وبشكل روتيني، يظل علم الأمصال هو الأكثر ممارسة في المختبرات لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية. تم الإبلاغ عن العديد من مناهج الأمصال لعقود ، مثل الهيماجلوتينين البارد ، واختبار التثبيت المتمم 11 ، واختبار التراص الدموي غير المباشر 12 ، والتألق المناعي13 ، وتقنية ELISA ، التي تم تطبيقها لأول مرة على الأمصال الميكوبلازما في أوائل عام 198014،15،16. واحدة من القضايا الرئيسية التي واجهتها عند إجراء التشخيص المصلي ELISA لعدوى المتفطرة الرئوية هي ردود الفعل المتقاطعة ، مما يقلل بشكل كبير من خصوصية التقنية. تم الإبلاغ سابقا عن امتزاز غير محدد للأمصال البشرية مع مستضدات M. pneumoniae. في الواقع ، قد لا تكون العديد من الأجسام المضادة التي اكتشفتها ELISA في الأمصال البشرية مرتبطة دائما بمستضدات الميكوبلازم 17 ، بسبب القواسم المشتركة بين M. pneumoniae مع بعض البكتيريا18,19 وبعض الأنسجة الحيوانية والبشرية20.

بسبب القراءات الخلفية العالية التي لوحظت في اختبار ELISA التقليدي الذي كان يمارس في المختبر ، كان تفسير النتائج معقدا في كثير من الأحيان ، وبالتالي كان تقديم التشخيص المناسب للمتفطرة الرئوية مهمة صعبة. أثناء مواجهة هذه المشكلة ، اخترنا تحسين M. pneumoniae ELISA عن طريق إزالة التفاعلات غير المحددة لمستضدات M. pneumoniae مع الأجسام المضادة المراد اختبارها. لهذا الغرض ، عملنا على الاستنفاد الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae غير المحددة باستخدام تقنية الامتزاز. في الواقع ، فإن الهدف الرئيسي من ELISA الذي يلتقط المستضد هو الكشف على وجه التحديد عن الغلوبولين المناعي الرئوي (Ig) G في عينات المصل البشري. يتكون مفهوم ELISA هذا بشكل أساسي من الالتقاط الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae الخاصة ، قبل إضافة عينات المصل البشري. يتم تأمين هذه الانتقائية عن طريق احتضان مستضد M. pneumoniae الخام مع مصل مضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae ، يتم إنتاجه في الأرانب في المختبر وجعله خاصا بالأنواع عن طريق الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة ، التي تنتمي أو لا تنتمي إلى فئة Mollicutes ، وتشارك المستضدات مع M . pneumoniae الأنواع و / أو المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي. تم تكرار إجراء الامتزاز ثلاث مرات ، وتم اختبار كفاءته للقضاء على التفاعل المتبادل عن طريق النشاف المناعي. مقايسة ELISA المطورة هي مزيج من الساندويتش و ELISA غير المباشر. باختصار ، يتم طلاء آبار صفيحة ELISA أولا بمصل مضاد متعدد النسيلة خاص ب M. pneumoniae. بعد ذلك ، يضاف مستضد M. pneumoniae ويحبس بين المصل المضاد والأجسام المضادة الموجودة في عينة المصل المراد اختبارها. يتم الكشف عن المركب المناعي المتشكل بواسطة جسم مضاد ثانوي مقترن بالإنزيم (IgG المترافق البيروكسيداز). يتم تصور التفاعلات عن طريق إضافة الركيزة الكروموجينية ، ويتم قياس الامتصاص طيفيا. يتم تقديم ELISA الداخلي هذا بشكل تخطيطي في الشكل 1. أثبت ELISA محلي الصنع فعاليته في الكشف عن عدوى المتفطرة الرئوية على وجه التحديد وهو حاليا أحد أكثر الاختبارات ممارسة في النشاط التشخيصي الروتيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للجوانب الأخلاقية التي وضعتها اللجنة الأخلاقية لمعهد باستور بتونس.

1. خطوات ما قبل ELISA: المتطلبات الأساسية والمعالجة المسبقة

  1. السلالات البكتيرية ووسائط النمو
    ملاحظة: يتم سرد أنواع Mollicutes والبكتيريا المسورة المستخدمة في هذه الدراسة ووسائط نموها في الجدول 1.
    1. نمو أنواع Mollicutes
      1. تلقيح 200 ميكرولتر من مخزون الجلسرين لكل نوع في 1800 ميكرولتر من الوسائط.
      2. تنمو أنواع Mollicutes بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة2-4 أيام حتى يتم ملاحظة تغير في درجة الحموضة (مؤشر الأس الهيدروجيني أحمر الفينول).
      3. قم بتوسيع نطاق الثقافات إلى 10 مل عن طريق إضافة تخفيف 1/10من الثقافة إلى وسائل الإعلام والسماح لها بالنمو مرة أخرى في نفس الظروف.
        ملاحظة: وفقا لعملية التمثيل الغذائي ، تقوم بعض أنواع Mollicutes البشرية (M. pneumoniae و M. genitalium و M. fermentans) بتحمض الوسط بسبب تخمير الجلوكوز ، والبعض الآخر (M. hominis و Ureaplasma) قلوي الوسط عن طريق التحلل المائي للأرجينين أو التحلل المائي لليوريا ، على التوالي. فيما يتعلق بالميكوبلازما الطيرية ، فإن تحمض وسط فراي يدل على وجود M. gallisepticum ، في حين أن قلويته تثبت نمو M. imitans.
      4. انشر 50 ميكرولتر من الثقافات على ألواح أجار لتأكيد نمو البكتيريا. حافظ على صفائح الآجار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 وراقبها بانتظام تحت المجهر لظهور مستعمرات البيض المقلي النموذجية (الميكوبلازما) والمستعمرات الشبيهة بالقنفذ الداكن (Ureaplasmas).
    2. نمو الأنواع غير الرخويات
      1. استزرع البكتيريا غير Mollicutes في 3 مل من الوسائط عند 37 درجة مئوية طوال الليل (تهتز عند 200 دورة في الدقيقة).
      2. قارن تعكر الثقافات مع وسائط التحكم لتأكيد النمو.
      3. قم بتوسيع نطاق الثقافات إلى 10 مل عن طريق إضافة تخفيف 1/100من الثقافة إلى وسائل الإعلام والسماح لها بالنمو مرة أخرى في نفس الظروف.
  2. إعداد المستضد
    1. إعداد مستضد من أنواع Mollicutes
      1. حصاد البروتينات الكاملة (الموجودة في المزارع المؤكدة للمتفطرة الرئوية وأنواع Mollicutes الأخرى) عن طريق الطرد المركزي عند 40000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. تخلص من المادة الطافية واغسل الكريات ثلاث مرات باستخدام 1 مل من محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4) بواسطة سلسلة من ثلاثة أجهزة طرد مركزي بنفس الظروف.
      3. أعد تعليق كل مستضد في 500 ميكرولتر من PBS.
    2. إعداد مستضد من الأنواع غير Mollicutes
      1. جهاز طرد مركزي للمزارع المزروعة بين عشية وضحاها للبكتيريا غير Mollicutes عند 1500 × جم لمدة 15 دقيقة.
      2. أعد تعليق كل حبيبات بكتيرية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
        ملاحظة: يتم تحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد الكلاسيكية مع ألبومين مصل الأبقار كمعيار21. يتراوح تركيز البروتين لأنواع Mollicutes عادة بين 0.7-4.8 مجم / مل. بالنسبة للأنواع البكتيرية الأخرى ، يمكن أن يصل تركيز البروتين إلى 20 مجم / مل. يتم تخزين جميع المستضدات في -20 درجة مئوية حتى استخدامها لاحقا.
  3. فحص التفاعل المتبادل عن طريق النشاف المناعي
    1. قم بتحريف البروتينات البكتيرية عن طريق خلط 8 ميكرولتر من كل مستضد مع حجم متساو من المخزن المؤقت للعينة (0.5 M Tris-HCl ؛ درجة الحموضة 6.8 ، 10٪ الجلسرين [v / v] ، 10٪ SDS [w / v] ، و 0.2٪ بروموفينول الأزرق) ، احتضان الخليط عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يتم إجراء تمسخ لتغطية البروتينات ذات الشحنة السالبة وكسر هياكلها الثانوية ، مما يسمح لها بالمرور عبر هلام بولي أكريلاميد وفصلها وفقا لأوزانها الجزيئية.
    2. إخضاع البروتينات المشوهة (100 ميكروغرام بروتين / بئر) للرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) بطريقة ليملي22 مع 12 ٪ جل منفصل و 5٪ جل تكديس. بعد ذلك ، انقل البروتينات كهربائيا إلى غشاء النيتروسليلوز بطريقة Towbin et al.23.
    3. اغمر غشاء النيتروسليلوز في حليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في PBS لمدة 30 دقيقة لسد الأسطح غير المأهولة. احتضان بقع البروتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة باستخدام مصل مضاد للأرانب متعدد النسيلة M. pneumoniae (يتم إنتاجه في معهد باستور بتونس) المخفف إلى 1/200 في PBS-Tween 20 ، ثم مع بيروكسيديز الفجل (HRP) - مترافق مضاد للأرانب IgG المخفف إلى 1/2000 في PBS-Tween 20 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. اغسل الأجسام المضادة غير المنضمة باستخدام PBS واحصل على النتائج عن طريق تعريض ورقة النيتروسليلوز لمحلول الركيزة (4-chloro-1-naphthol، H 2 O2). أوقف التفاعل بإضافة الماء بعد 5-15 دقيقة.
  4. إجراء الامتزاز
    ملاحظة: للقضاء على التفاعلات المتقاطعة بين المصل المضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae ومستضدات البكتيريا غير المتجانسة ، يتم استخدام إجراء الامتزاز الذي وصفه سابقا بن عبد المومن وروي24 .
    1. قم بإعداد مجموعة مستضد من 12 بكتيريا غير متجانسة (يشتبه في مشاركة المستضدات مع M. pneumoniae) ، وامزجها في أنبوب طرد مركزي دقيق ، واضبط تركيز البروتين المقابل لنصف المصل المضاد ليتم امتصاصه في التجربة.
      ملاحظة: يختلف الحجم والتركيز بين المقايسات المختلفة. تعتمد هذه الخطوة بشكل أساسي على تركيز الجسم المضاد المراد امتصاصه. على سبيل المثال ، إذا كان تركيز الأجسام المضادة = 3.56 مجم / مل ، فيجب أن يكون تركيز تجمع المستضد (المكون من 12 بكتيريا غير متجانسة) 1.78 مجم / مل (وبالتالي ، حوالي 0.148 مجم من كل مستضد).
    2. قم بالطرد المركزي لخليط المستضد عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واجمع الحبيبات المجمعة ، واحتضانها باستخدام مضاد M. الرئوي IgG لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع التحريض البطيء.
    3. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية واستعادة المادة الطافية (التي تتوافق مع مصل مضاد النسيلة متعدد النسيلة M. pneumoniae ).
      ملاحظة: لضمان خصوصية مصل مضاد M. pneumoniae متعدد النسيلة ، كرر إجراء الامتزاز ثلاث مرات. قبل استخدامه في مقايسة ELISA ، يجب اختبار المصل المضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae الممتز عن طريق النشاف المناعي لعدم وجود تفاعلات متقاطعة ضد مجموعة البكتيريا المضمنة.

2. خطوات ELISA: الفحص نفسه

  1. طلاء الصفيحة الدقيقة مع الجسم المضاد للالتقاط
    1. قم بتخفيف الجسم المضاد للالتقاط (M. pneumoniae مضادا متعدد النسيلة ممتزا مسبقا) إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل في محلول 0.1 M كربونات بيكربونات (درجة الحموضة 9.6 ).
    2. قم بتغطية لوحة ELISA المكونة من 96 بئرا بإضافة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف للالتقاط إلى كل بئر.
    3. بعد الحضانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة محلول الطلاء واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام محلول الغسيل (التركيب [لكل لتر]: 146.29 جم من كلوريد الصوديوم ، 39.4 جم من Tris-HCl ، 0.2 جم من Thimerosal، و 0.5 مل من Tween 20 ؛ درجة الحموضة 7.3).
  2. حظر
    1. سد الأسطح الملزمة المتبقية للآبار المطلية بإضافة 100 ميكرولتر من محلول الحجب (0.5٪ كازين في PBS) إلى كل بئر.
    2. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة محلول الحجب باستخدام ماصة واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  3. تطبيق المستضد
    1. أضف كمية متساوية من بروتينات M. pneumoniae الكاملة إلى جميع الآبار المغلفة (10 نانوغرام / بئر).
    2. اسمح للتفاعل أن يحدث لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة الفائض من محلول المستضد واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  4. تطبيق عينات الاختبار والضوابط
    1. قم بتخفيف عينات الاختبار (الأمصال البشرية) والضوابط (الأمصال المرجعية الإيجابية والسلبية) إلى 1/200 و 1/400 و 1/800 في PBS-Tween 20.
    2. أضف 100 ميكرولتر من العينات المخففة والضوابط في الآبار المناسبة. نفذ كل تفاعل من نسختين. ضع علامة على الآبار التي لا تحتوي على مستضد أو أمصال فارغة.
    3. بعد احتضان اللوحة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محاليل المصل واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  5. تطبيق الجسم المضاد للكشف عن الإنزيم المترافق
    1. قم بتخفيف الأجسام المضادة للكشف عن الإنزيم ، ومضادات الأرانب المترافقة HRP ، و IgG المضادة للإنسان إلى 1/10,000 في PBS-Tween 20.
    2. ماصة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف المخفف بشكل مناسب لكل بئر.
    3. بعد احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، قم بإزالة الأجسام المضادة للكشف غير المنضمة واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  6. الكشف وتحليل البيانات
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول كروموجين رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) 3,3 '، 5,5' لتصور ارتباط الجسم المضاد بالمستضد.
    2. اترك اللوحة تتطور لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف (7.5٪ H2SO4) لإيقاف التفاعل الأنزيمي.
    3. اقرأ الامتصاص عند الطول الموجي 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة وقم بفرز النتائج بناء على حساب مؤشر الإيجابية (IP).
      IP = امتصاص المصل المختبر / امتصاص القطع
      IP < 0.7: نتيجة سلبية
      IP = 0.7: يجب تكرار الاختبار في غضون أسبوعين
      IP > 0.7: نتيجة إيجابية
      ملاحظة: يتم تصميم صيغة IP في المختبر ويتم إعداد القيمة 0.7 بعد التحسين. بالنسبة للتفاعلات المكررة ، يتم حساب متوسط قيمة الامتصاص. يتم تحديد التخفيف الأمثل للمصل وتركيز المستضد من خلال طريقة معايرة رقعة الشطرنج ELISA (البيانات غير معروضة). قيمة القطع = OD (الكثافة البصرية) لمصل إيجابي مرجعي (مخفف بنفس تخفيف العينة). يجب أن يكون هذا OD أعلى بثلاث مرات على الأقل من قيمة OD للتحكم السلبي.

3. خطوات ما بعد ELISA: تقييم النتائج والتحقق من صحة الاختبار

  1. يتم تقييم قدرة ELISA الداخلية على تشخيص عدوى المتفطرة الرئوية على وجه التحديد في المرضى الذين تم اختبارهم من خلال البقع المناعية التكميلية باستخدام مستضدات M. pneumoniae والبكتيريا غير المتجانسة لتأكيد إيجابية الأمصال البشرية المختبرة في الأجسام المضادة للمتفطرة الرئوية وسلبيتها في البكتيريا الأخرى المشتبه بها (البيانات غير معروضة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نشاط النشاف المناعي لمصل الميكوبلازما الرئوية متعدد النسيلة غير الممتز للبكتيريا غير المتجانسة
التفاعل المتقاطع موجود بالفعل كما هو موضح في نتائج النشاف المناعي (الشكل 2) ومقارنة بالتحكم الإيجابي (الممر 1) ، تتم مشاركة بعض مستضدات M. pneumoniae مع البكتيريا التي تم فحصها. كانت شدة هذه التفاعلات المتقاطعة متغيرة. على سبيل المثال ، أظهرت مستضدات M. gallisepticum و M. imitans أقوى تفاعل مع المصل المضاد ل M. pneumoniae (الممرات 9 و 10) ، إلى جانب كونها الميكوبلازما الطيور. على العكس من ذلك ، لم تظهر أي من العزلتين السريريتين البشريتين ل Ureaplasma urealyticum أي تفاعل (الممرات 7 و 8). ومع ذلك ، فإن مستضدات الأنواع المتبقية من الميكوبلازما التناسلية البشرية M. hominis و M. fermentans و M. genitalium أسفرت عن تفاعلات متقاطعة كبيرة مع المصل المضاد للمل المضاد للملتحمة الرئوية (الممرات 11 و 12 و 13 على التوالي). كما تفاعلت الإشريكية القولونية (Lane 2) و Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) و Klebsiella pneumoniae (Lane 6) مع الأجسام المضادة متعددة النسيلة M. pneumoniae ، وكان نمط ملفها المستضدي مشابها جدا. كان هذا المظهر مختلفا قليلا عن هذين النوعين من بكتيريا المكورات العقدية الرئوية والمكورات العنقودية. كان التفاعل أقل مع S . pneumoniae (Lane 3) وحتى أقل مع S.aureus (Lane 5).

خصوصية الأجسام المضادة للميكروبلازما الرئوية مضمونة عن طريق إجراء الامتزاز
بعد امتزاز مصل مضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae ضد المستضدات البكتيرية غير المتجانسة ، تم اختبار النوعية عن طريق النشاف المناعي (الشكل 3). بصرف النظر عن بعض بروتينات مستضد M. pneumoniae الذي تم الكشف عنه في Lane 1 (التحكم الإيجابي) ، لم يتم اكتشاف المستضدات الأخرى بالكامل تقريبا (الممرات 2-13). البروتينات التي تم الكشف عنها في Lane 1 هي في الواقع البروتينات المحددة التي تم اكتشافها بواسطة الأجسام المضادة المحددة M. pneumoniae المتبقية بعد الامتزاز. بناء على هذه النتيجة ، تم إثبات كفاءة إجراء الامتزاز ، حيث تم القضاء على التفاعلات غير المحددة التي واجهتها مصل M. pneumoniae متعدد النسيلة مع المستضدات غير المتجانسة ، الموصوفة أعلاه. ثم تم استخدام المصل المضاد للممتمة الرئوية المحدد في جميع الاختبارات المصلية والمناعية اللاحقة.

التقاط المستضد ELISA: مقايسة صالحة للنشاط التشخيصي المصلي الروتيني في المختبر
نظرا لأن جميع الأمصال تم اختبارها في آبار مكررة للتخفيفات المختلفة ، فقد تم حساب قيم متوسط OD وتم رسم رسم بياني شريطي يربط قيم الامتصاص هذه بتخفيفات المصل المقابلة لها (الشكل 4). استنادا إلى حساب IP ، أثبتت مجموعة الأمصال البشرية التي تم اختبارها وعرضها في هذه الورقة أنها إيجابية ل M. pneumoniae IgG. كما تم اختبار العديد من مجموعات المصل الأخرى باستخدام ELISA محلي الصنع ، وفي كل مرة أثبت الفحص فعاليته في الكشف على وجه التحديد عن M. pneumoniae IgG وبالتالي التمييز بين المرضى المصابين ب M. pneumoniae من أولئك غير المصابين (البيانات غير معروضة).

تم تأكيد نتائج ELISA دائما من خلال العديد من تحليلات البقع المناعية التي أظهرت في وقت واحد الإيجابية في M. pneumoniae والسلبية في جميع البكتيريا الأخرى لأي مصل تم اختباره وجد أنه إيجابي بواسطة مستضد التقاط M. pneumoniae ELISA الداخلي (البيانات غير معروضة).

Figure 1
الشكل 1: عرض تخطيطي ل ELISA الذي يلتقط المستضد الذي تم تطويره في المختبر للكشف المحدد عن الميكوبلازما الرئوية IgG. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تحليل اللطخة المناعية للتفاعلات المتقاطعة بين الميكوبلازما الرئوية ومجموعة من البكتيريا غير المتجانسة. تم اختبار تفاعل مصل مضاد متعدد النسيلة غير ممتز من M. pneumoniae ضد مستضدات الإشريكية القولونية (Lane 2) ، العقدية الرئوية (Lane 3) ، Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) ، المكورات العنقودية الذهبية (Lane 5) ، Klebsiella pneumoniae (Lane 6) ، عزلتان من اليوريا urealyticum (الحارات 7 و 8) ، M. imitans (Lane 9) ، M. gallisepticum (Lane 10) ، M. hominis (Lane 11) ، M. fermentans (حارة 12) ، و M. الأعضاء التناسلية (حارة 13). حارة 1: M. الرئوية (السيطرة الإيجابية). أعطيت الأوزان الجزيئية لبعض بروتينات M. pneumoniae الرئيسية على اليسار. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تأكيد اللطخة المناعية لكفاءة إجراء الامتزاز للتخلص من التفاعلات المتقاطعة. تفاعل جميع البكتيريا غير المتجانسة المختارة ؛ الإشريكية القولونية، العقدية الرئوية، الزائفة الزنجارية، المكورات العنقودية الذهبية، الكلبسيلة الرئوية، عزلتان من اليوريا urealyticum، M. imitans، M. gallisepticum، M. hominis، M. fermentans، و M. genitalium (الممرات 2-13، على التوالي) تم اختبارها ضد مصل M. pneumoniae متعدد النسيلة الممتز. تم تحميل مستضد M. pneumoniae في Lane 1 كعنصر تحكم إيجابي (تم الكشف عن بروتينات محددة فقط). لين ميغاواط: سلم بروتين ملطخ مسبقا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: نتائج ELISA لالتقاط مولد الضد. تم إجراء ELISA باستخدام مصل مضاد متعدد النسيلة Mycoplasma pneumoniae الممتز كعامل طلاء. يصور الرسم البياني الشريطي 1 و 2 عناصر التحكم السلبية والإيجابية ، على التوالي. تصور الرسوم البيانية الشريطية 3-13 أمصال مجموعة من المرضى الذين تم اختبارهم. تم اختبار كل مصل في ثلاثة تخفيفات مختلفة: 1/200 (أشرطة أرجوانية) ، 1/400 (أشرطة برتقالية) ، و 1/800 (أشرطة زرقاء). خدمت قيم OD لحساب مؤشر الإيجابية. تم تنفيذ كل رد فعل في نسختين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الكائنات الحية الدقيقة وتر* متوسط مرجع
أنواع الميكوبلازما واليوريا الميكوبلازما الرئوية ATCC 160 20030 SP4 [35]
الميكوبلازما التناسلية CIP 103767T SP4
الميكوبلازما المخمرات ATCC 160 20026 SP4
الميكوبلازما هومينيس CIP 103715T SP4 تستكمل مع أرجينين
اليوريا اليوريا 2 عزلة سريرية ** SP4 تستكمل مع اليوريا
الميكوبلازما غاليسيبتيكوم سيب S6 15302 فراي [36]
الميكوبلازما إيميتانس ATCC 160 20037 فراي
بكتيريا أخرى الإشريكية القولونية ATCC 25922 مرق LB [37]
الكلبسيلة الرئوية عزل سريري*** مرق LB
الزائفة الزنجارية ATCC 27853 مرق LB
المكورات العنقودية الذهبية ATCC 25923 مرق LB
العقدية الرئوية عزل سريري*** مرق الدم
* ATCC: مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ، CIP: مجموعة معهد باستور
** تم جمع العزلات من العينات السريرية التي تم شحنها طواعية إلى مختبر الميكوبلازما (معهد باستور بتونس) للتشخيص الروتيني
تم جمع المواد المعزولة من العينات السريرية التي تم شحنها طواعية إلى مختبر البكتريولوجيا (معهد باستور بتونس) للتشخيص الروتيني

الجدول 1: قائمة سلالات البكتيريا المستخدمة في هذه الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدم هذه الورقة وصفا عاما ل ELISA الداخلي الذي تم تطويره بشكل أساسي لضمان فحص محدد ل M. pneumoniae عدوى. يتم توفير تفاصيل حول بروتوكول اختبار ELISA نفسه بالإضافة إلى بعض خطوات المعالجة السابقة واللاحقة. يتم ضمان خصوصية هذا الفحص من خلال تقنية الامتزاز. تم وصف هذا الإجراء سابقا في اختبارات ELISA التي تم تطويرها لتشخيص الإنسان والطيور Mycoplasmas17,24. كما تم استخدامه في فحوصات ELISA لتشخيص الالتهابات البكتيرية الأخرى مثل مرض لايم25. في هذه الأوراق الثلاث ، ثبت أن الامتزاز يساعد في زيادة خصوصية ELISA دون خدش أو تقليل الحساسية17,24,25. في حالة مقايسة ELISA الحالية ، يمكن تقسيم أنواع البكتيريا المناسبة المختارة للامتزاز إلى مجموعتين: تحتوي المجموعة الأولى على بعض أنواع Mollicutes البشرية والطيور المسببة للأمراض (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumو M. imitans) ، بينما يحتوي الثاني على البكتيريا الأكثر شيوعا المعروفة بإصابة البشر (E. coli, P. aeruginosaو S. aureus) وتلك المعروفة بانتوائها إلى الجهاز التنفسي (K. pneumoniae و S. pneumoniae). استند الاختيار الواسع النطاق للبكتيريا غير المتجانسة إلى حقيقة أن عقيدة الأنواع وخصوصية الأعضاء لم تعد محترمة بعد الآن. تم نشر العديد من التقارير حول اكتشاف الكائنات الحية الدقيقة في الموائل غير المألوفة سابقا. على سبيل المثال، M. pneumoniae تم عزله من العديد من المواقع خارج الرئة ووجد أنه مرتبط بمجموعة متنوعة من المضاعفات خارج الرئة مع أعراض خفيفة إلى حادة ، على الرغم من أنه كان من المفترض أن يكون خاصا بالجهاز التنفسي6,7. الحالة المعاكسة (عزل الأعضاء التناسلية Mycoplasma الأنواع من الجهاز التنفسي) تم الإشارة إليها من أجل M. hominis و M. fermentans26,27. إدراج الطيور Mycoplasma في اختبار التشخيص المصلي للعدوى البشرية استند إلى دراسات سابقة تفيد بإمكانية إصابة البشر (لا سيما الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة والأطباء البيطريين) Mycoplasma Spp. نشأت من الحيوانات الأليفة28,29,30. صحيح أنه حتى الآن ، لم يتم العثور على ورقة تثير عزلة M. gallisepticum و M. imitans (النوعان المدرجان في إجراء الامتزاز في هذه الورقة) من البشر. على الرغم من ذلك ، لا يوجد شيء مستحيل ، خاصة وأن هذه الأنواع هي من بين الأنواع الأكثر تعاملا بانتظام من قبل الأطباء البيطريين وهي قريبة جدا من الناحية التطورية M. pneumoniae. في الواقع ، هذان الطيور اثنين Mycoplasma Spp. أظهرت أقوى تفاعل مع M. pneumoniae المصل المضاد (كما هو موضح في الشكل 2). باختصار ، أثناء تصميم إجراء الامتزاز ، مجموعة كبيرة نسبيا من البكتيريا المشبوهة التي يمكن أن تشترك في المستضدات مع M. pneumoniae تم تضمينه. استندت الخيارات المتخذة إلى الارتباط التطوري والانتحاء بالجهاز التنفسي. ومع ذلك ، نظرا لتنوع النباتات البشرية وتقلب المستضدات ، من المستحيل التنبؤ بجميع الأنواع والسلالات البكتيرية غير المتجانسة المحتملة التي يمكن أن تتفاعل مع M. pneumoniae الاجسام المضاده. وبالتالي ، فإن إمكانية تبادل ردود الفعل بين M. pneumoniae المصل المضاد ، حتى بعد الامتزاز ، والبكتيريا الأخرى لا تزال محتملة. علاوة على ذلك ، منذ M. pneumoniae من المعروف أنه يصيب الأطفال والشباب ، ويمكن تحسين إجراء الامتزاز في المستقبل عن طريق إضافة مسببات الأمراض التنفسية الأخرى للأطفال مثل Haemophilus influenzae31 و Streptococcus pyogenes32 في القائمة المختصرة للبكتيريا الامتزاز.

الغرض من ELISA هو الكشف عن وجود الجسم المضاد المستهدف (محدد M. pneumoniae-IgG) في الأمصال البشرية. لذلك ، لتكون قادرا على استخدام المصل كعينة (لأنه الأسهل في التجميع والأقل إيلاما للمرضى) ولضمان الخصوصية ، يعتمد ELISA الداخلي على مبدأ نوعين من ELISA: غير مباشر وساندويتش ELISA. ترتبط عينة المصل (الجسم المضاد الأولي) بين الجسم المضاد للكشف (المسمى الجسم المضاد الثاني) ومستضد الالتقاط ، والذي كان مرتبطا بشكل خاص بالجسم المضاد للالتقاط (تم تقديمه مسبقا عن طريق الامتزاز وتجميده على سطح الصفيحة الدقيقة). بالنظر إلى هذه الخصائص الفريدة ، يعتقد أن ELISA فعال وخاص. ومع ذلك ، فإن هذا الاختبار ليس مثاليا ، ويمكن أن تحدث مشاكل. لا يزال من الممكن مواجهة نتائج إيجابية كاذبة وسلبية خاطئة ، أحيانا بسبب جودة المصل أو مرحلة العدوى ، وأحيانا بسبب أخطاء أثناء تطبيق البروتوكول في المختبر. على سبيل المثال ، يمكن أن تتأثر نتائج التشخيص المصلي ELISA حتى لو لم يتم غسل الآبار بشكل كاف. أيضا ، يمكن أن تؤثر الحضانة (درجة الحرارة والوقت) على نتائج الاختبار. كما تم الإبلاغ عن أن اختيار الصفيحة الدقيقة وعامل الحجب هو خطوة حاسمة أثناء تطوير ELISA33,34. لكل هذه الأسباب ، من المهم العمل باستمرار على تحسين اختبار ELISA هذا من أجل تحديد المعلمات والظروف المثلى ، مثل تخفيف الأجسام المضادة المختلفة (عينات المصل ، التقاط الأجسام المضادة ، الكشف عن الأجسام المضادة) ، خطوات الحضانة والغسيل ، وإدراج الضوابط السلبية والإيجابية المناسبة.

يمكن اعتبار استزراع البكتيريا وإنتاج مستضداتها لإجراء عملية الامتزاز خطوة ثقيلة ، خاصة بالنسبة لأنواع Mollicutes. ومع ذلك ، يعتقد أن هذا مهم لأن هذه الخطوة تساعد بشكل كبير في تعزيز خصوصية ELISA وفي تجنب المزيد من اختبارات التأكيد مثل المناعة أو PCR. علاوة على ذلك ، في سياق عدوى المتفطرة الرئوية ، هناك حاجة بالتأكيد إلى تشخيص فعال وموثوق من أجل إنشاء علاج مضاد حيوي مناسب ومناسب ، حيث أن استخدام أدوية بيتا لاكتام في علاج الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع غير فعال ضد المتفطرة الرئوية8. بعد سنوات من استخدامها في النشاط التشخيصي الروتيني في المختبر ، يعتقد أن ELISA الذي يلتقط المستضد ، الموصوف في هذه الورقة ، يمثل أداة صالحة للفحص المحدد لعدوى M. pneumoniae.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة الصحة التونسية ووزارة التعليم العالي والبحث العلمي التونسية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Tags

علم الأحياء، العدد 192،
مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد للكشف المحدد عن <em>الميكوبلازما الرئوية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter