Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Antigeen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay voor specifieke detectie van Mycoplasma pneumoniae

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

Bij Mycoplasma pneumoniae-infectie kunnen serologische tests goede resultaten opleveren, maar met een lage specificiteit vanwege immunologische kruisreactie. De in-house antigeenvangst ELISA, beschreven in dit artikel, garandeert een hoge soortspecificiteit en is een betrouwbare screeningstest gebleken voor een nauwkeurige diagnose van M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae is een celwand-deficiënte prokaryoot, waarvan vooral bekend is dat het de menselijke luchtwegen koloniseert en endemisch is, met epidemische pieken om de 6 jaar, bij oudere kinderen en jonge volwassenen. De diagnose van M. pneumoniae is een uitdaging vanwege de kieskeurige aard van de ziekteverwekker en de mogelijkheid van asymptomatisch vervoer. Laboratoriumdiagnose van M. pneumoniae-infectie op basis van antilichaamtitratie in de serummonsters van patiënten blijft de meest beoefende methode. Vanwege het potentiële probleem van immunologische kruisreactiviteit met het gebruik van polyklonaal serum voor M. pneumoniae, is een antigeenvangst enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA) ontwikkeld om de specificiteit van serologische diagnose te verbeteren. ELISA-platen zijn bedekt met M. pneumoniae polyklonale antilichamen, verhoogd bij konijnen en specifiek gemaakt na adsorptie tegen een panel van heterologe bacteriën die antigenen delen met M. pneumoniae-soorten en / of waarvan bekend is dat ze de luchtwegen koloniseren. De gereageerde M. pneumoniae homologe antigenen worden dan specifiek herkend aan hun overeenkomstige antilichamen in de serummonsters. Verdere optimalisatie van de fysisch-chemische parameters waaraan de antigeenvangst ELISA wordt onderworpen, leidde tot een zeer specifieke, gevoelige en reproduceerbare ELISA.

Introduction

Mycoplasma's behoren tot de kleinste en eenvoudigste bekende prokaryoten. Ze onderscheiden zich vooral van andere bacteriën door het ontbreken van een celwandstructuur. Mycoplasma's werden dus ingedeeld in een aparte klasse genaamd Mollicutes1. De celwanddeficiëntie verleent intrinsieke resistentie tegen deze micro-organismen tegen sommige antimicrobiële middelen en is grotendeels verantwoordelijk voor hun polymorfisme. Mycoplasma's hebben een klein genoom en een kleinere omvang, wat hun metabole en biosynthetische mogelijkheden beperkt en hun parasitaire en saprofytische aard verklaart1.

Mycoplasma pneumoniae is een van de Mycoplasma's die de mens infecteren en wordt beschouwd als de meest virulente2. M. pneumoniae koloniseert de bovenste luchtwegen, wat leidt tot atypische longontsteking bij kinderen en jonge volwassenen. De klinische symptomen veroorzaakt door M. pneumoniae-infectie zijn griepachtig, met hoofdpijn, koorts en hoest3. De cytadherentie van M. pneumoniae naar gastheercellen wordt gemedieerd door een hechtingsorganel inclusief P1 major adhesie en verschillende accessoire eiwitten 4,5. Meer klinische manifestaties kunnen optreden als gevolg van lokale ontsteking en stimulatie van het immuunsysteem van de gastheer als gevolg van de intieme therapietrouw van M. pneumoniae aan het luchtwegslijmvlies6. Hoewel longontsteking een kenmerk is van M. pneumoniae-infectie, is gebleken dat infectie met deze bacterie ook verantwoordelijk kan zijn voor een breed spectrum van niet-pulmonale manifestaties op verschillende anatomische plaatsen zoals het centrale zenuwstelsel, hart, huid en gewrichten7.

Zoals voor alle Mycoplasma-soorten is de diagnose van M. pneumoniae een uitdaging. De klinische symptomen die mycoplasmose oproepen zijn meestal onaangepast en niet-karakteristiek8. Aangezien het erg moeilijk is om M. pneumoniae-infectie te diagnosticeren door alleen te vertrouwen op klinische manifestaties en symptomen, is laboratoriumscreening van bijzonder belang9. Het opsporen van M. pneumoniae kolonies door kweek is de gouden standaard methode voor een juiste diagnose. De kieskeurige groeivereisten en de lange tijd die nodig is voor de levering van definitieve resultaten (1-2 weken) compliceren de cultuur echter en betekenen dus dat het zelden wordt gebruikt voor routinematige diagnose10. Nucleïnezuurversterkingstechnologieën werden gevalideerd in termen van snelheid en efficiëntie, hoewel vanwege hun relatief hoge kosten en onbeschikbaarheid in sommige zorginstellingen, deze moleculaire technieken niet worden beschouwd als eerstelijns diagnostische tests. Het is waar dat commerciële PCR-tests op grote schaal worden gebruikt om M. pneumoniae-infecties te diagnosticeren, maar ze kunnen de serologie nog steeds niet vervangen. Ook heeft het frequent voorkomen van zowel vals negatieve als vals-positieve resultaten het gebruik van PCR9 beperkt. Routinematig blijft serologie het meest beoefend in laboratoria voor de diagnose van M. pneumoniae-infectie. Verschillende serologische benaderingen worden al tientallen jaren gemeld, zoals koude hemagglutinines, complementfixatietest11, indirecte hemagglutinatietest12, immunofluorescentie13 en de technologie van ELISA, die voor het eerst werd toegepast op mycoplasma-serologie in de vroege jaren 1980 14,15,16. Een van de belangrijkste problemen bij het uitvoeren van ELISA-serodiagnose van M. pneumoniae-infectie is kruisreacties, wat de specificiteit van de techniek aanzienlijk verlaagt. Niet-specifieke adsorptie van menselijke sera met M. pneumoniae-antigenen werd eerder gemeld; in feite zijn veel van de antilichamen die door ELISA in menselijke sera worden gedetecteerd, mogelijk niet altijd gebonden aan mycoplasmale antigenen17, vanwege de gemeenschappelijkheid van M. pneumoniae met sommige bacteriën18,19 en sommige dierlijke en menselijke weefsels20.

Vanwege de hoge achtergrondmetingen die werden waargenomen in de conventionele ELISA-test die in het laboratorium werd geoefend, was de interpretatie van de resultaten vaak gecompliceerd en dus was de levering van een goede M. pneumoniae-diagnose een moeilijke opdracht. Terwijl we met dit probleem werden geconfronteerd, hebben we ervoor gekozen om de M. pneumoniae ELISA te verbeteren door niet-specifieke reacties van M. pneumoniae-antigenen met te testen antilichamen te verwijderen. Hiervoor werkten we aan selectieve depletie van de niet-specifieke M. pneumoniae-antigenen met behulp van de adsorptietechniek. In feite is het belangrijkste doel van de antigeenvangst ELISA om specifiek M. pneumoniae immunoglobuline (Ig) G te detecteren in menselijke serummonsters. Het concept van deze ELISA bestaat voornamelijk uit de selectieve vangst van M. pneumoniae-specifieke antigenen, alvorens de menselijke serummonsters toe te voegen. Deze selectiviteit is verzekerd door M. pneumoniae ruw antigeen te incuberen met een M. pneumoniae polyklonaal antiserum, geproduceerd bij konijnen in het laboratorium en het soortspecifiek te maken door adsorptie tegen een panel van heterologe bacteriën, al dan niet behorend tot de Mollicutes-klasse, die antigenen deelt met M. pneumoniae soorten en/of waarvan bekend is dat ze de luchtwegen koloniseren. De adsorptieprocedure werd driemaal herhaald en de efficiëntie ervan om kruisreactiviteit te elimineren werd getest door immunoblotting. De ontwikkelde ELISA-test is een combinatie van sandwich en indirecte ELISA. Kortom, de putten van de ELISA-plaat worden eerst bedekt met een polyklonaal antiserum dat specifiek is voor M. pneumoniae. Vervolgens wordt M. pneumoniae-antigeen toegevoegd en gevangen tussen het antiserum en de antilichamen die aanwezig zijn in het te testen serummonster. Het gevormde immunologische complex wordt gedetecteerd door een secundair enzymgeconjugeerd antilichaam (peroxidase-geconjugeerd IgG). De reacties worden gevisualiseerd door de toevoeging van chromogeen substraat en de absorptie wordt spectrofotometrisch gemeten. Deze interne ELISA is schematisch weergegeven in figuur 1. De zelfgemaakte ELISA bleek efficiënt te zijn in het specifiek detecteren van M. pneumoniae-infectie en is momenteel een van de meest beoefende tests in routinematige diagnostische activiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De huidige studie is uitgevoerd in overeenstemming met ethische aspecten die zijn vastgesteld door de ethische commissie van het Pasteur Instituut van Tunis.

1. Pre-ELISA stappen: Vereisten en voorbewerking

  1. Bacteriestammen en groeimedia
    OPMERKING: Mollicutes soorten en de ommuurde bacteriën die in dit onderzoek worden gebruikt en hun groeimedia zijn opgenomen in tabel 1.
    1. Groei van Mollicutes soorten
      1. Ent 200 μL uit de glycerolvoorraad van elke soort in 1.800 μL van de media.
      2. Kweek Mollicutes-soorten statisch bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2-4 dagen totdat een pH-verandering wordt waargenomen (de pH-indicator is fenolrood).
      3. Schaal de culturen op tot 10 ml door een 1/10e verdunning van de cultuur aan de media toe te voegen en ze opnieuw te laten groeien in dezelfde omstandigheden.
        OPMERKING: Volgens het metabolisme verzuren sommige menselijke Mollicutes-soorten (M. pneumoniae, M. genitalium en M. fermentans) het medium als gevolg van glucosefermentatie, en sommige anderen (M. hominis en Ureaplasma) alkalineren het medium door respectievelijk argininehydrolyse of ureumhydrolyse. Wat aviaire mycoplasma's betreft, toont de verzuring van Frey's medium de aanwezigheid van M. gallisepticum aan, terwijl de alkalinisatie de groei van M. imitans bewijst.
      4. Verspreid 50 μL van de culturen op agarplaten om de groei van de bacteriën te bevestigen. Houd de agarplaten op 37 °C met 5% CO2 en observeer ze regelmatig onder de microscoop voor het verschijnen van typische gebakken eikolonies (Mycoplasma's) en donkere egelachtige kolonies (Ureaplasma's).
    2. Groei van niet-Mollicutes soorten
      1. Kweek de niet-Mollicutes bacteriën in 3 ml van de media bij 37 °C 's nachts (schudden bij 200 rpm).
      2. Vergelijk de troebelheid van de culturen met de controlemedia om de groei te bevestigen.
      3. Schaal de culturen op tot 10 ml door een 1/100e verdunning van de cultuur aan de media toe te voegen en ze in dezelfde omstandigheden opnieuw te laten groeien.
  2. Antigeenpreparaat
    1. Antigeenpreparaat van mollicutesoorten
      1. Oogst de hele eiwitten (aanwezig in bevestigde culturen van M. pneumoniae en de andere Mollicutes-soorten) door centrifugering bij 40.000 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten.
      2. Gooi het supernatant weg en was de pellets drie keer met 1 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door een reeks van drie centrifugaties met dezelfde omstandigheden.
      3. Resuspendeer elk antigeen in 500 μL PBS.
    2. Antigeenpreparaat van niet-Mollicutes-soorten
      1. Centrifugeer de 's nachts gekweekte culturen van de niet-Mollicutes bacteriën bij 1.500 x g gedurende 15 minuten.
      2. Resuspendeer elke bacteriële pellet in 500 μL PBS.
        OPMERKING: De eiwitconcentratie wordt bepaald met behulp van de klassieke Bradford-kwantificeringsmethode met runderserumalbumine als standaard21. De eiwitconcentratie van Mollicutes-soorten varieert meestal tussen 0,7-4,8 mg / ml. Voor de andere bacteriesoorten kan de eiwitconcentratie 20 mg / ml bereiken. Alle antigenen worden bewaard bij -20 °C tot hun latere gebruik.
  3. Cross-reactiviteit screening door immunoblotting
    1. Denatureer de bacteriële eiwitten door 8 μL van elk antigeen te mengen met een gelijk volume monsterbuffer (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glycerol [v/v], 10% SDS [w/v] en 0,2% broomfenolblauw), incubeer het mengsel bij 100 °C gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Denaturatie wordt uitgevoerd om de eiwitten met negatieve lading te bedekken en hun secundaire structuren te breken, waardoor ze over de polyacrylamide-gel kunnen lopen en kunnen worden gescheiden op basis van hun molecuulgewicht.
    2. Onderwerp de gedenatureerde eiwitten (100 μg eiwit/put) aan natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) volgens Laemmli's methode22 met 12% scheidingsgel en 5% stapelgel. Breng daarna de eiwitten elektroforetisch over naar het nitrocellulosemembraan volgens de methode23 van Towbin et al.
    3. Dompel het nitrocellulosemembraan gedurende 30 minuten onder in 5% magere melk in PBS om de onbezette oppervlakken te blokkeren. Incubeer de eiwitvlekken bij kamertemperatuur gedurende 2 uur met konijn polyklonaal M. pneumoniae antiserum (geproduceerd bij pasteur instituut van Tunis) verdund tot 1/200 in PBS-Tween 20, vervolgens met mierikswortelperoxidase (HRP) -geconjugeerd anti-konijn IgG verdund tot 1/2.000 in PBS-Tween 20 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    4. Was de ongebonden antilichamen af met PBS en verkrijg de resultaten door de nitrocelluloseplaat bloot te stellen aan de substraatoplossing (4-chloor-1-naftol, H2O2). Stop de reactie door water toe te voegen na 5-15 min.
  4. Adsorptieprocedure
    OPMERKING: Om kruisreacties tussen polyklonaal M. pneumoniae antiserum en heterologe bacterie-antigenen te elimineren, wordt de adsorptieprocedure gebruikt die eerder is beschreven door Ben Abdelmoumen en Roy24 .
    1. Bereid een antigeenpool van de 12 heterologe bacteriën (waarvan wordt vermoed dat ze antigenen delen met M. pneumoniae), meng het in een microcentrifugebuis en pas de eiwitconcentratie aan die overeenkomt met de helft van het antiserum dat in het experiment moet worden geadsorbeerd.
      OPMERKING: Het volume en de concentratie variëren tussen de verschillende testen. Deze stap hangt voornamelijk af van de concentratie van het te adsorberen antilichaam. Als de antilichaamconcentratie bijvoorbeeld = 3,56 mg / ml, moet de concentratie van de antigeenpool (samengesteld uit de 12 heterologe bacteriën) 1,78 mg / ml zijn (daarom ongeveer 0,148 mg van elk antigeen).
    2. Centrifugeer het antigeenmengsel bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, verzamel de gepoolde pellet en incubeer deze met de gezuiverde polyklonale anti-M. pneumoniae IgG gedurende 2 uur bij 37 °C met langzame agitatie.
    3. Na incubatie centrifugeert u de suspensie bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en herstelt u het supernatant (dat overeenkomt met het specifieke polyklonale M. pneumoniae-antiserum ).
      OPMERKING: Om de specificiteit van het polyklonale M. pneumoniae antiserum te garanderen, herhaalt u de adsorptieprocedure drie keer. Voordat het kan worden gebruikt in de ELISA-test, moet het geadsorbeerde polyklonale M. pneumoniae antiserum worden getest door immunoblotting op de afwezigheid van kruisreacties tegen de geïncludeerde set bacteriën.

2. ELISA stappen: De test zelf

  1. Microplaatcoating met het opvangantilichaam
    1. Verdun het opvangantilichaam (M. pneumoniae pre-geadsorbeerd polyklonaal antiserum) tot een concentratie van 10 μg/ml in 0,1 M carbonaat-bicarbonaatbuffer (pH 9,6).
    2. Bestrijk de ELISA-plaat met 96 putten door 100 μL van het verdunde vangantilichaam aan elke put toe te voegen.
    3. Verwijder na een nacht incubatie bij 4 °C de coatingoplossing en was de plaat vijf keer met de wasbuffer (samenstelling [per L]: 146,29 g NaCl, 39,4 g Tris-HCl, 0,2 g Thimerosal en 0,5 ml Tween 20; pH 7,3).
  2. Blokkeren
    1. Blokkeer de resterende bindingsoppervlakken van de gecoate putten door 100 μL van de blokkerende oplossing (0,5% caseïne in PBS) aan elke put toe te voegen.
    2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder de blokkeeroplossing met een pipet en was de plaat vijf keer met de wasbuffer.
  3. Toepassing van het antigeen
    1. Voeg een gelijke hoeveelheid M. pneumoniae hele eiwitten toe aan alle gecoate putten (10 ng / put).
    2. Laat de reactie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur plaatsvinden.
    3. Verwijder het teveel aan de antigeenoplossing en was de plaat vijf keer met de wasbuffer.
  4. Toepassing van de testmonsters en controles
    1. Verdun de testmonsters (menselijke sera) en controles (referentiepositieve en negatieve sera) tot 1/200, 1/400 en 1/800 in PBS-Tween 20.
    2. Voeg 100 μL van de verdunde monsters en controles toe aan de juiste putten. Voer elke reactie in tweevoud uit. Markeer de putjes die noch antigeen noch sera bevatten als blanco.
    3. Nadat u de plaat gedurende 90 minuten op kamertemperatuur hebt geïncubeerd, verwijdert u de serumoplossingen en wast u de plaat vijf keer met de wasbuffer.
  5. Toepassing van het enzym-geconjugeerde detectieantilichaam
    1. Verdun de enzym-geconjugeerde detectieantistoffen, HRP-geconjugeerde anti-konijn en anti-humane IgG tot 1/10.000 in PBS-Tween 20.
    2. Pipetteer 100 μL van het correct verdunde detectieantilichaam in elk putje.
    3. Nadat u de plaat 1 uur bij kamertemperatuur in het donker hebt ingecubeerd, verwijdert u de ongebonden detectieantistoffen en wast u de plaat vijf keer met de wasbuffer.
  6. Detectie en data-analyse
    1. Voeg 100 μL van de 3,3', 5,5' Tetramethyl-benzidine (TMB) chromogene oplossing toe om de antigeen-antilichaambinding te visualiseren.
    2. Laat de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur ontwikkelen en voeg vervolgens 100 μL van de stopoplossing (7,5% H2SO4) toe om de enzymatische reactie te stoppen.
    3. Lees de absorptie bij een golflengte van 450 nm met behulp van de microplaatlezer en sorteer de resultaten op basis van de berekening van de positiviteitsindex (IP).
      IP = Absorptie van het geteste serum / Absorptie van de cut-off
      IP < 0.7: Negatief resultaat
      IP = 0,7: Test moet binnen 2 weken worden herhaald
      IP > 0.7: Positief resultaat
      OPMERKING: De IP-formule wordt in het laboratorium bedacht en de waarde 0,7 wordt na optimalisatie ingesteld. Voor dubbele reacties wordt de gemiddelde waarde van de absorptie berekend. Optimale serumverdunning en antigeenconcentratie worden vastgesteld met behulp van de ELISA-dambordtitratiemethode (gegevens niet weergegeven). Ondergrens = OD (optische dichtheid) van een referentiepositief serum (verdund bij dezelfde verdunning als het monster). Deze OD moet ten minste drie keer hoger zijn dan de OD-waarde van het negatieve effect.

3. Post-ELISA stappen: Resultatenbeoordeling en testvalidatie

  1. Het vermogen van de interne ELISA om specifiek M. pneumoniae-infectie bij de geteste patiënten te diagnosticeren, wordt geëvalueerd door middel van aanvullende immunoblots met behulp van antigenen van M. pneumoniae en de heterologe bacteriën om de positiviteit van de geteste menselijke sera in M. pneumoniae-antilichamen en hun negativiteit in de andere verdachte bacteriën te bevestigen (gegevens niet getoond).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De immunoblotting activiteit van de niet-geadsorbeerde polyklonale Mycoplasma pneumoniae antiserum aan heterologe bacteriën
Kruisreactiviteit bestaat inderdaad zoals aangetoond in de immunoblottingresultaten (figuur 2) en vergeleken met de positieve controle (Lane 1) worden sommige van de M. pneumoniae-antigenen gedeeld met de gescreende bacteriën. De intensiteit van deze kruisreacties was variabel. M. gallisepticum en M. imitans antigenen vertoonden bijvoorbeeld de sterkste reactiviteit met M. pneumoniae antiserum (Lanes 9 en 10), naast aviaire mycoplasma's. Daarentegen vertoonde geen van de twee humane klinische isolaten van Ureaplasma urealyticum enige reactiviteit (Lanes 7 en 8). Antigenen van de resterende menselijke genitale Mycoplasma-soorten M. hominis, M. fermentans en M. genitalium leverden echter aanzienlijke kruisreacties op met M. pneumoniae antiserum (respectievelijk Lanes 11, 12 en 13). Escherichia coli (Lane 2), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) en Klebsiella pneumoniae (Lane 6) reageerden ook met polyklonale M. pneumoniae-antilichamen en hun antigene profielpatroon was zeer vergelijkbaar. Dit profiel verschilde enigszins van dat van de twee cocci-bacteriesoorten Streptococcus pneumoniae en Staphylococcusaureus; de reactiviteit was minder bij S. pneumoniae (Lane 3) en nog minder bij S.aureus (Lane 5).

Specificiteit van Mycoplasma pneumoniae antilichamen gegarandeerd door adsorptieprocedure
Na de adsorptie van M. pneumoniae polyklonaal antiserum tegen de heterologe bacteriële antigenen, werd de specificiteit getest door immunoblotting (figuur 3). Afgezien van enkele eiwitten van M. pneumoniae-antigeen die in Lane 1 werden onthuld (positieve controle), werden de andere antigenen bijna volledig niet gedetecteerd (Lanes 2-13). De onthulde eiwitten in Lane 1 zijn eigenlijk de specifieke eiwitten die worden gedetecteerd door de specifieke M. pneumoniae-antilichamen die overblijven na adsorptie. Op basis van dit resultaat werd de efficiëntie van de adsorptieprocedure bewezen, aangezien de aangetroffen niet-specifieke reacties van M. pneumoniae polyklonaal antiserum met de heterologe antigenen, zoals hierboven beschreven, werden geëlimineerd. M. pneumoniae antiserum specifiek gemaakt werd vervolgens gebruikt in alle daaropvolgende serologische en immunoblotting tests.

Capture-antigeen ELISA: Geldige test voor routinematige serodiagnostische activiteit in laboratoria
Aangezien alle sera in dubbele putjes voor de verschillende verdunningen werden getest, werden od-gemiddelde waarden berekend en werd een staafdiagram uitgezet waarin deze absorptiewaarden werden vergeleken met hun overeenkomstige serumverdunningen (figuur 4). Op basis van IP-berekening bleek de set menselijke sera die in dit artikel werden getest en gepresenteerd positief voor de M. pneumoniae IgG. Verschillende andere serumsets werden ook getest met behulp van deze zelfgemaakte ELISA, en op elk moment bleek de test efficiënt in het specifiek detecteren van de M. pneumoniae IgG en zo de M. pneumoniae-geïnfecteerde patiënten te onderscheiden van degenen die niet geïnfecteerd waren (gegevens niet getoond).

ELISA-resultaten werden altijd bevestigd door verschillende immunoblotanalyses die tegelijkertijd de positiviteit bij M. pneumoniae en de negativiteit in alle andere bacteriën van elk getest serum positief bleken te zijn door het interne capture-antigeen M. pneumoniae ELISA (gegevens niet getoond).

Figure 1
Figuur 1: Schematische presentatie van de antigeenvangst ELISA ontwikkeld in het laboratorium voor specifieke detectie van Mycoplasma pneumoniae IgG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Immunoblotanalyse van kruisreacties tussen Mycoplasma pneumoniae en een set heterologe bacteriën. De reactiviteit van M. pneumoniae niet-geadsorbeerd polyklonaal antiserum werd getest tegen antigenen van Escherichia coli (Lane 2), Streptococcus pneumoniae (Lane 3), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4), Staphylococcus aureus (Lane 5), Klebsiella pneumoniae (Lane 6), twee Ureaplasma urealyticum isolaten (Lanes 7 en 8), M. imitans (Lane 9), M. gallisepticum (Lane 10), M. hominis (Lane 11), M. fermentans (Lane 12) en M. genitalium (Lane 13). Baan 1: M. pneumoniae (positieve controle). Moleculaire gewichten van enkele belangrijke M. pneumoniae-eiwitten werden aan de linkerkant gegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Immunoblot bevestiging van de efficiëntie van de adsorptieprocedure om kruisreacties te elimineren. Reactiviteit van alle geselecteerde heterologe bacteriën; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, twee Ureaplasma urealyticum isolaten, M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans en M. genitalium (respectievelijk Lanes 2-13) werd getest tegen het geadsorbeerde M. pneumoniae polyklonaal antiserum. M. pneumoniae-antigeen werd in Lane 1 geladen als positieve controle (alleen specifieke eiwitten werden onthuld). Lane MW: voorgekleurde eiwitladder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Resultaten van de antigeenvangst ELISA. De ELISA werd uitgevoerd met behulp van het geadsorbeerde Mycoplasma pneumoniae polyklonaal antiserum als coatingmiddel. Staafdiagrammen 1 en 2 geven respectievelijk negatieve en positieve controles weer. Staafdiagrammen 3-13 tonen de sera van een groep geteste patiënten. Elk serum werd getest op drie verschillende verdunningen: 1/200 (paarse staven), 1/400 (oranje balken) en 1/800 (blauwe balken). OD-waarden dienden om de index van positiviteit te berekenen. Elke reactie werd in tweevoud uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Micro-organisme Zeven* Gemiddeld Referentie
Mycoplasma en ureaplasma soorten Mycoplasma pneumoniae ATCC 160 20030 Sp4 [35]
Mycoplasma genitalium CIP 103767t Sp4
Mycoplasma fermenten ATCC 160 20026 Sp4
Mycoplasma hominis CIP 103715T SP4 aangevuld met arginine
Ureaplasma urealyticum 2 klinische isolaten** SP4 aangevuld met ureum
Mycoplasma gallisepticum CIP S6 15302 Frey [36]
Mycoplasma imitans ATCC 160 20037 Frey
Andere bacteriën Escherichia coli ATCC 25922 LB bouillon [37]
Klebsiella pneumoniae Klinisch isolaat*** LB bouillon
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 LB bouillon
Staphylococcus aureus ATCC 25923 LB bouillon
Streptococcus pneumoniae Klinisch isolaat*** Bloedbouillon
* ATCC: American Type Culture Collection, CIP: Collectie Institut Pasteur
** Isolaten werden verzameld uit klinische monsters die vrijwillig naar het laboratorium van Mycoplasmas (Pasteur Instituut van Tunis) werden verzonden voor routinematige diagnose
Isolaten werden verzameld uit klinische monsters die vrijwillig naar het Laboratorium voor Bacteriologie (Pasteur Instituut van Tunis) werden verzonden voor routinematige diagnose

Tabel 1: Lijst van bacteriestammen die in deze studie worden gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel bevat een algemene beschrijving van een interne ELISA die voornamelijk is ontwikkeld om een specifieke screening van M. pneumoniae Infectie. De details over het protocol van de ELISA-test zelf en enkele voor- en nabewerkingsstappen worden verstrekt. De specificiteit van deze test wordt gewaarborgd door de adsorptietechniek. Deze procedure werd eerder beschreven in ELISA-tests die zijn ontwikkeld voor de diagnose van menselijke en aviaire Mycoplasmas17,24. Het werd ook gebruikt in ELISA-testen voor de diagnose van andere bacteriële infecties zoals de ziekte van Lyme25. In deze drie artikelen werd bewezen dat adsorptie helpt bij het verhogen van de ELISA-specificiteit zonder de gevoeligheid te verticuteren of te verminderen17,24,25. In het geval van de huidige ELISA-test kunnen de geschikte bacteriesoorten die voor adsorptie zijn geselecteerd, in twee groepen worden verdeeld: de eerste groep bevat enkele pathogene menselijke en aviaire mollicutesoorten (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumen M. imitans), terwijl de tweede de meest voorkomende bacteriën bevat waarvan bekend is dat ze mensen infecteren (E. coli, P. aeruginosaen S. aureus) en degenen die berucht zijn om hun tropisme naar de luchtwegen (K. pneumoniae en S. pneumoniae). De brede selectie van heterologe bacteriën was gebaseerd op het feit dat het dogma van soort- en orgaanspecificiteit niet meer wordt gerespecteerd. Veel rapporten over de detectie van micro-organismen in onbekende habitats zijn eerder gepubliceerd. Bijvoorbeeld M. pneumoniae is geïsoleerd van veel extra pulmonale plaatsen en bleek geassocieerd te zijn met een gevarieerd scala aan extra pulmonale complicaties met milde tot ernstige symptomen, hoewel werd aangenomen dat het specifiek was voor de luchtwegen6,7. Het tegenovergestelde geval (isoleren van genitale Mycoplasma soorten uit de luchtwegen) werd gesignaleerd voor M. hominis en M. fermentans26,27. De opname van aviaire Mycoplasma spp. in de serodiagnosetest van infectie bij de mens was gebaseerd op eerdere studies die de mogelijkheid van infectie van mensen (met name immuungecompromitteerde personen en dierenartsen) met Mycoplasma spp. afkomstig van huisdieren28,29,30. Het is waar dat er tot nu toe geen papier werd gevonden dat het isolement van M. gallisepticum en M. imitans (de twee soorten die zijn opgenomen in de adsorptieprocedure in dit artikel) van de mens. Desondanks is niets onmogelijk, vooral omdat deze soorten tot de meest regelmatig behandelde soorten door dierenartsen behoren en fylogenetisch te dicht bij M. pneumoniae. In feite zijn deze twee vogels Mycoplasma spp. hebben de sterkste reactiviteit getoond met M. pneumoniae antiserum (zoals geïllustreerd in Figuur 2). Kortom, tijdens het ontwerpen van de adsorptieprocedure, een relatief groot spectrum van verdachte bacteriën die antigenen kunnen delen met M. pneumoniae was inbegrepen. De gemaakte keuzes waren gebaseerd op fylogenetische verwantschap en tropisme met de luchtwegen. Niettemin is het vanwege de diversiteit van de menselijke flora en antigene variabiliteit onmogelijk om alle mogelijke heterologe bacteriesoorten en stammen te voorspellen en op te nemen die kunnen kruisreacties met M. pneumoniae Antilichamen. Dus de mogelijkheid van kruisreactie tussen M. pneumoniae antiserum, zelfs na adsorptie, en andere bacteriën blijven waarschijnlijk. Bovendien, sinds M. pneumoniae is algemeen bekend om kinderen en jonge volwassenen te infecteren, de adsorptieprocedure kan in de toekomst verder worden verbeterd door de toevoeging van andere pediatrische respiratoire pathogenen zoals Haemophilus influenzae31 en Streptococcus pyogenes32 in de adsorptie bacteriële shortlist.

Het doel van deze ELISA is om de aanwezigheid van het doelantilichaam (specifiek M. pneumoniae-IgG) in de menselijke sera te detecteren. Dus om zowel het serum als monster te kunnen gebruiken (omdat het het gemakkelijkst te verzamelen en het minder pijnlijk is voor patiënten) en om specificiteit te garanderen, is de interne ELISA gebaseerd op het principe van twee ELISA-typen: indirecte en sandwich ELISA. Het serummonster (primair antilichaam) is gebonden tussen het detectieantilichaam (gelabeld als tweede antilichaam) en het opvangantigeen, dat specifiek was gekoppeld aan het opvangantilichaam (vooraf specifiek gemaakt door adsorptie en geïmmobiliseerd op het microplaatoppervlak). Gezien deze unieke kenmerken, wordt aangenomen dat deze ELISA effectief en speciaal is. Toch is deze test niet perfect en kunnen er problemen optreden. Vals-positieve en vals-negatieve resultaten kunnen nog steeds worden aangetroffen, soms vanwege de serumkwaliteit of de infectiefase, en soms vanwege fouten tijdens de protocoltoepassing in het laboratorium. Elisa-serodiagnoseresultaten kunnen bijvoorbeeld worden beïnvloed, zelfs als de putten niet voldoende worden gewassen. Ook kan de incubatie (temperatuur en tijd) de testresultaten beïnvloeden. De selectie van microplaten en blokkeermiddelen werd ook gemeld als een kritieke stap tijdens de ontwikkeling van ELISA33,34. Om al deze redenen is het belangrijk om voortdurend te werken aan het verbeteren van deze ELISA-test om de optimale parameters en omstandigheden te bepalen, zoals de verdunning van de verschillende antilichamen (serummonsters, antilichaam vangen, antilichaam detecteren), de incubatie- en wasstappen en de opname van de juiste negatieve en positieve controles.

De kweek van bacteriën en de productie van hun antigenen om de adsorptieprocedure uit te voeren, kan als een zware stap worden beschouwd, vooral voor Mollicutes-soorten. Niettemin wordt aangenomen dat dit belangrijk is, omdat deze stap enorm helpt bij het verbeteren van de ELISA-specificiteit en bij het vermijden van verdere bevestigingstests zoals immunoblotting of PCR. Bovendien is in de context van M. pneumoniae-infectie zeker een effectieve en betrouwbare diagnose vereist om een adequate en geschikte antibioticatherapie tot stand te brengen, aangezien het gebruik van bèta-lactamgeneesmiddelen bij de behandeling van door de gemeenschap verworven pneumonie niet effectief is tegen M. pneumoniae8. Na jaren te zijn gebruikt bij routinematige diagnostische activiteit in het laboratorium, wordt aangenomen dat de antigeenvangst ELISA, beschreven in dit artikel, een geldig hulpmiddel is voor de specifieke screening van M. pneumoniae-infectie .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door het Tunesische ministerie van Volksgezondheid en het Tunesische ministerie van hoger onderwijs en wetenschappelijk onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Tags

Biologie Nummer 192
Antigeen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay voor specifieke detectie van <em>Mycoplasma pneumoniae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter