Summary
マイコプラズマ・ニューモニエ感染症では、血清学的検査は良好な結果を生み出すことができますが、免疫学的交差反応のために特異性は低くなります。この論文に記載されている社内抗原捕捉ELISAは、高い種特異性を保証し、肺炎球菌の正確な診断のための信頼できるスクリーニング検査であることが示されています。
Abstract
マイコプラズマ・ニューモニエ は細胞壁欠損原核生物であり、主にヒトの気道にコロニーを形成し、流行していることが知られており、年長の子供や若年成人では6年ごとに流行のピークがあります。 M.肺炎 の診断は、病原体の潔癖な性質と無症候性の運搬の可能性があるため、困難です。患者の血清サンプル中の抗体滴定に基づく 肺炎 菌感染症の臨床検査は、依然として最も実践されている方法である。 M. pneumoniaeに対するポリクローナル血清の使用による免疫学的交差反応性の潜在的な問題のために、血清学的診断の特異性を改善するために抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が開発されました。ELISAプレートは、 M. pneumoniae ポリクローナル抗体でコーティングされ、ウサギで飼育され、 M. pneumoniae 種と抗原を共有する、および/または気道にコロニーを形成することが知られている異種細菌のパネルに対する吸着後に特異的になります。反応した M. pneumoniae 相同抗原は、次いで、血清サンプル中のそれらの対応する抗体によって特異的に認識される。抗原捕捉ELISAが受ける物理化学的パラメータのさらなる最適化は、非常に特異的で、感度が高く、再現性の高いELISAにつながりました。
Introduction
マイコプラズマは 、最も小さく、最も単純な既知の原核生物の一つです。それらは主に細胞壁構造の欠如によって他の細菌と区別される。したがって、 マイコプラズマは モリキューテス1という名前の別のクラスに分類されました。細胞壁欠損症は、いくつかの抗菌剤に対してこれらの微生物に対する固有の耐性を与え、それらの多型の主な原因です。 マイコプラズマは ゲノムが小さく、サイズが小さく、代謝および生合成能力が制限され、寄生および腐生の性質を説明しています1。
マイコプラズマ・ニューモニエは、人間に感染するマイコプラズマの1つであり、最も毒性が高いと考えられています2。M.肺炎は上気道にコロニーを形成し、小児および若年成人に非定型肺炎を引き起こします。肺炎球菌感染によって引き起こされる臨床徴候はインフルエンザのようなもので、頭痛、発熱、咳3があります。宿主細胞に対するM. pneumoniaeの細胞付着は、P1主要な接着およびいくつかの付属品タンパク質を含む付着オルガネラによって媒介される4,5。気道粘膜へのM.肺炎の密接な付着に起因する局所的な炎症および宿主免疫系の刺激のために、より多くの臨床症状が発生する可能性があります6。肺炎は肺炎菌感染の特徴ですが、この細菌による感染は、中枢神経系、心臓、皮膚、関節などのさまざまな解剖学的部位における広範囲の非肺症状の原因にもなる可能性があることが明らかになっています7。
すべてのマイコプラズマ種に関して、M.肺炎の診断は困難です。マイコプラズマ症を誘発する臨床徴候はほとんど不明であり、特徴的ではありません8。肺炎球菌感染症を臨床症状と症状のみに頼って診断することは非常に難しいため、臨床検査は特に興味深いものです9。培養によるM.肺炎コロニーの検出は、適切な診断のためのゴールドスタンダードの方法です。しかし、慎重な成長要件と決定的な結果の提供に必要な長い時間(1〜2週間)は培養を複雑にし、したがってそれが日常的な診断に使用されることはめったにないことを意味します10。核酸増幅技術は速度と効率の点で検証されましたが、コストが比較的高く、一部の医療施設では利用できないため、これらの分子技術は第一選択の診断テストとは見なされません。市販のPCR検査が肺炎球菌感染症の診断に広く使用されているのは事実ですが、それでも血清学に取って代わることはできません。また、偽陰性と偽陽性の両方の結果が頻繁に発生するため、PCR9の使用が制限されています。日常的に、血清学は、肺炎球菌感染症の診断のために実験室で最も実践されています。冷赤血球凝集素、補体結合試験11、間接赤血球凝集試験12、免疫蛍光13、および1980年代初頭にマイコプラズマ血清学に最初に適用されたELISAの技術など、いくつかの血清学的アプローチが数十年にわたって報告されています14,15,16。肺炎球菌感染症のELISA血清診断を行う際に遭遇する主要な問題の1つは交差反応であり、これは技術の特異性をかなり低下させる。M.肺炎抗原によるヒト血清の非特異的吸着は以前に報告されています。実際、ヒト血清中のELISAによって検出された抗体の多くは、一部の細菌18,19および一部の動物およびヒト組織とのM.肺炎の共通性のために、マイコプラズマ抗原17に常に結合しているとは限りません20。
実験室で実施された従来のELISA検査で観察された高いバックグラウンド測定値のために、結果の解釈はしばしば複雑であり、したがって適切な肺炎球菌診断の提供は困難な課題でした。この問題に直面しながら、我々は、M. pneumoniae抗原と試験する抗体との非特異的反応を除去することにより、M. pneumoniae ELISAを改善することを選択しました。この目的のために、吸着技術を用いて非特異的肺炎球菌抗原の選択的枯渇に取り組みました。実際、抗原捕捉ELISAの主な目的は、ヒト血清サンプル中の肺炎球菌免疫グロブリン(Ig)Gを特異的に検出することです。このELISAの概念は、主にヒト血清サンプルを追加する前に、肺炎球菌特異的抗原を選択的に捕捉することで構成されています。この選択性は、実験室でウサギで産生されたM.肺炎粗抗原をM.肺炎ポリクローナル抗血清とインキュベートし、モリキューテスクラスに属するかどうかにかかわらず、M.肺炎と抗原を共有する異種細菌のパネルに対する吸着によって種特異的にすることによって保証されます。 種および/または気道にコロニーを形成することが知られている。吸着手順を3回繰り返し、交差反応性を排除する効率をイムノブロッティングで試験した。開発されたELISAアッセイは、サンドイッチELISAと間接ELISAの組み合わせです。簡単に説明すると、ELISAプレートのウェルは、最初にM.ニューモニエに特異的なポリクローナル抗血清でコーティングされる。次いで、M. pneumoniae抗原が添加され、抗血清と試験対象の血清サンプル中に存在する抗体との間に捕捉される。形成された免疫学的複合体は、二次酵素結合抗体(ペルオキシダーゼ結合IgG)によって検出される。反応は発色基質の添加によって視覚化され、吸光度は分光光度法で測定されます。この社内ELISAを図1に模式的に示します。自家製のELISAは、肺炎球菌感染を特異的に検出するのに効率的であることが証明され、現在、日常的な診断活動で最も実践されている検査の1つです。
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Protocol
本研究は、チュニスパスツール研究所の倫理委員会によって確立された倫理的側面に準拠して実施された。
1. ELISA前のステップ:前提条件と前処理
- 細菌株および増殖培地
注:本研究で使用されたモリキューテス種と壁に囲まれた細菌、およびそれらの増殖培地を 表1に示します。- モリキューテス種の成長
- 各種のグリセロールストックから200 μLを1,800 μLの培地に接種します。
- pH変化が観察されるまで、5%CO2 で37°Cで2〜4日間静的にモリキューテス種を成長させます(pHインジケーターはフェノールレッドです)。
- 培養物の1/10倍 希釈液を培地に加え、培養液を10 mLにスケールアップし、同じ条件で再び増殖させます。
注:代謝によると、一部のヒトモリキューテス種(M.ニューモニエ、M. ジェニタリウム、およびM. ファーメンタン)はグルコース発酵により培地を酸性化し、他の種(M.ホミニス および尿素プラズマ)はそれぞれアルギニン加水分解または 尿素加水分解によって培地をアルカリ化します。鳥類マイコプラズマに関しては、フレイ培地の酸性化はM. ガリセプティカムの存在を示し、そのアルカリ化は M.模倣物の成長を証明します。 - 50 μLの培養液を寒天プレートに広げ、細菌の増殖を確認します。寒天プレートを5%CO2 で37°Cに維持し、典型的な目玉焼きコロニー(マイコプラズマ)および暗いウニ様コロニー(尿素プラズマ)の外観について顕微鏡下で定期的に観察します。
- 非モリキューテス種の成長
- 非モリキューテス菌を3mLの培地中で37°Cで一晩培養する(200rpmで振とう)。
- 培養液の濁度を対照培地と比較して、増殖を確認します。
- 培養物の1/100番目の 希釈液を培地に加えて培養液を10 mLにスケールアップし、同じ条件で再び増殖させます。
- モリキューテス種の成長
- 抗原調製
- モリキューテス種の抗原調製
- タンパク質全体( M. pneumoniae および他のモリキューテス種の確認された培養物に存在する)を、40,000 x g で4°Cで30分間遠心分離することにより回収します。
- 上清を廃棄し、同じ条件で一連の3回の遠心分離により、1 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)でペレットを3回洗浄します。
- 各抗原を500 μLのPBSに再懸濁します。
- 非モリキューテス種の抗原調製
- 非モリキューテス菌の一晩増殖培養物を1,500 x gで15分間遠心分離します。
- 各細菌ペレットを500 μLのPBSに再懸濁します。
注:タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準21とする古典的なブラッドフォード定量法を使用して決定されます。モリキューテス種のタンパク質濃度は通常0.7〜4.8 mg / mLの範囲です。.他の細菌種の場合、タンパク質濃度は20 mg / mLに達する可能性があります。すべての抗原は、その後の使用まで-20°Cで保存されます。
- モリキューテス種の抗原調製
- イムノブロッティングによる交差反応性スクリーニング
- 各抗原8 μLを等量のサンプルバッファー(0.5 M Tris-HCl、pH 6.8、10%グリセロール[v/v]、10% SDS [w/v]、および0.2%ブロモフェノールブルー)と混合し、100°Cで5分間インキュベートして細菌タンパク質を変性させます。
注:変性は、タンパク質を負電荷で覆い、それらの二次構造を破壊するために行われ、これにより、タンパク質がポリアクリルアミドゲルを横切って走り、分子量に従って分離することができます。 - 変性タンパク質(100 μgタンパク質/ウェル)を、12%分離ゲルと5%スタッキングゲルを含むLaemmliの方法22 によるドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にかけます。その後、Towbinらの方法23によりタンパク質をニトロセルロース膜に電気泳動で移す。
- ニトロセルロースメンブレンをPBSの5%スキムミルクに30分間浸して、空いている表面をブロックします。PBS-Tween 20で1/200に希釈したウサギポリクローナル M.肺炎 抗血清(チュニスパスツール研究所で製造)を使用して室温で2時間タンパク質ブロットをインキュベートし、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗ウサギIgGをPBS-Tween 20で1/2,000に希釈して室温で1時間インキュベートします。
- 未結合の抗体をPBSで洗い流し、ニトロセルロースシートを基質溶液(4−クロロ−1−ナフトール、H2O2)にさらすことによって結果を得た。5〜15分後に水を加えて反応を停止します。
- 各抗原8 μLを等量のサンプルバッファー(0.5 M Tris-HCl、pH 6.8、10%グリセロール[v/v]、10% SDS [w/v]、および0.2%ブロモフェノールブルー)と混合し、100°Cで5分間インキュベートして細菌タンパク質を変性させます。
- 吸着手順
注:ポリクローナル M.肺炎 抗血清と異種細菌抗原との間の交差反応を排除するために、Ben AbdelmoumenとRoy24 によって以前に説明された吸着手順が採用されています。- 肺炎 球菌と抗原を共有していると疑われる12種類の異種菌の抗原プールを用意し、微量遠心管で混合し、実験で吸着させる抗血清の半分に相当するタンパク質濃度を調整します。
注:容量と濃度は、アッセイによって異なります。この工程は、主に吸着される抗体の濃度に依存する。例えば、抗体濃度=3.56mg/mLの場合、抗原プール(12個の異種細菌で構成)の濃度は1.78mg/mL(したがって、各抗原約0.148mg)である必要があります。 - 抗原混合物を14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、プールされたペレットを集めて、精製ポリクローナル抗M.肺 炎IgGをゆっくりと攪拌しながら37°Cで2時間インキュベートします。
- インキュベーション後、懸濁液を14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清(特定のポリクローナル M.肺炎 抗血清に相当)を回収します。
注:ポリクローナル M.肺炎 抗血清の特異性を確保するために、吸着手順を3回繰り返します。ELISAアッセイで使用する前に、吸着されたポリクローナル M.ニューモニエ 抗血清を、含まれている細菌セットに対する交差反応がないことをイムノブロッティングによってテストする必要があります。
- 肺炎 球菌と抗原を共有していると疑われる12種類の異種菌の抗原プールを用意し、微量遠心管で混合し、実験で吸着させる抗血清の半分に相当するタンパク質濃度を調整します。
2. ELISAステップ:アッセイ自体
- 捕捉抗体によるマイクロプレートコーティング
- 捕捉抗体(M. pneumoniae 事前吸着ポリクローナル抗血清)を0.1 M炭酸塩-重炭酸塩バッファー(pH 9.6)で10 μg/mLの濃度に希釈します。
- 希釈した捕捉抗体100 μLを各ウェルに追加して、96ウェルELISAプレートをコーティングします。
- 4°Cで一晩インキュベートした後、コーティング溶液を取り出し、プレートを洗浄バッファー(組成[Lあたり]:NaCl146.29 g、トリス塩酸塩39.4 g、チメロサール0.2 g、Tween 20 0.5 mL、pH 7.3)で5回洗浄します。
- ブロッキング
- 各ウェルに100 μLのブロッキング溶液(PBS溶液0.5%カゼイン)を加えて、コーティングしたウェルの残りの結合面をブロックします。
- 室温で1時間インキュベートします。
- ブロッキング溶液をピペットで取り除き、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。
- 抗原の応用
- 同量の M. pneumoniae 全タンパク質をすべてのコーティングウェル(10 ng/ウェル)に加えます。
- 室温で2時間反応させます。
- 過剰の抗原溶液を除去し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。
- テストサンプルとコントロールの適用
- テストサンプル(ヒト血清)とコントロール(陽性および陰性血清を参照)をPBS-Tween1で1/200、1/400、および1/800に希釈します。
- 100 μLの希釈サンプルとコントロールを適切なウェルに加えます。各反応を二重に実行する。抗原も血清も含まないウェルをブランクとしてマークします。
- プレートを室温で90分間インキュベートした後、血清溶液を取り出し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。
- 酵素結合検出抗体の応用
- 酵素結合検出抗体、HRP結合抗ウサギ、および抗ヒトIgGをPBS-Tween 20で1/10,000に希釈します。
- 検出抗体を適宜希釈した100 μLを各ウェルにピペットで入れます。
- プレートを暗所で室温で1時間インキュベートした後、結合していない検出抗体を除去し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。
- 検出とデータ分析
- 3,3', 5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)色原体溶液を100 μL添加し、抗原抗体結合を可視化します。
- プレートを室温で30分間発達させた後、100 μLの停止液(7.5%H2SO4)を加えて酵素反応を停止します。
- マイクロプレートリーダーを使用して450 nmの波長での吸光度を読み取り、陽性指数(IP)の計算に基づいて結果を整理します。
IP =テストされた血清の吸光度/カットオフの吸光度
IP < 0.7: 否定的な結果
IP = 0.7:テストは2週間以内に繰り返す必要があります
IP > 0.7: 肯定的な結果
注:IPフォーミュラは実験室で考案され、0.7値は最適化後に設定されます。重複反応については、吸光度の平均値が計算されます。最適な血清希釈および抗原濃度は、ELISAチェッカーボード滴定法によって確立される(データは示さず)。カットオフ値=基準陽性血清(サンプルと同じ希釈液で希釈)のOD(光学濃度)。このODは、ネガティブコントロールのOD値の少なくとも3倍である必要があります。
3. ELISA後のステップ:結果の評価とテストの検証
- 検査された患者の肺炎球菌感染を特異的に診断する社内ELISAの能力は、肺炎球菌と異種細菌の抗原を使用した補足イムノブロットによって評価され、肺炎球菌抗体の検査ヒト血清の陽性と他の疑わしい細菌の陰性性が確認されます(データ示さず)。
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Representative Results
異種細菌に対する非吸着ポリクローナルマイコプラズマ・ニューモニエ抗血清のイムノブロッティング活性
イムノブロッティングの結果(図2)で示されているように交差反応性は実際に存在し、ポジティブコントロール(レーン1)と比較して、肺炎球菌抗原の一部はスクリーニングされた細菌と共有されています。これらの交差反応の強度は変動した。例えば、M. gallisepticumおよびM. imitans抗原は、鳥類のマイコプラズマであることに加えて、M. pneumoniae抗血清(レーン9および10)と最も強い反応性を示した。反対に、尿素プラズマ尿素溶解の2つのヒト臨床分離株のどちらも反応性を示さなかった(レーン7および8)。しかし、残りのヒト生殖器マイコプラズマ種M.ホミニス、M.ファーメンタンス、およびM.ジェニタリウムの抗原は、M.肺炎抗血清とかなりの交差反応をもたらしました(それぞれレーン11、12、および13)。 大腸菌(レーン2)、緑膿菌(レーン4)、肺炎桿菌(レーン6)もポリクローナルM.ニューモニエ抗体と反応し、それらの抗原プロファイルパターンは非常に類似していました。このプロファイルは、2つの球菌種である肺炎球菌とブドウ球菌のプロファイルとはわずかに異なっていました。反応性は肺炎球菌(レーン3)で低く、黄色ブドウ球菌(レーン5)ではさらに低かった。
吸着手順によって保証されたマイコプラズマ肺炎抗体の特異性
異種細菌抗原に対する M. pneumoniae ポリクローナル抗血清の吸着後、特異性をイムノブロッティングにより試験した(図3)。レーン1で明らかになった 肺炎球菌 抗原のいくつかのタンパク質(陽性対照)を除いて、他の抗原はほとんど完全に検出されなかった(レーン2-13)。レーン1で明らかにされたタンパク質は、実際には吸着後に残る特定の 肺炎 球菌抗体によって検出された特定のタンパク質です。この結果に基づいて、上記の異種抗原との M.pneumoniae ポリクローナル抗血清との遭遇した非特異的反応が排除されたため、吸着手順の効率が証明された。その後、特異的に発現させた M.肺炎 抗血清を、その後のすべての血清学的およびイムノブロッティング試験で使用した。
捕捉抗原ELISA:ルーチンの実験室血清診断活性のための有効なアッセイ
すべての血清を異なる希釈液について重複ウェルで試験したため、OD平均値を計算し、これらの吸光度値を対応する血清希釈液と相関させる棒グラフをプロットしました(図4)。IP計算に基づいて、この論文でテストおよび提示されたヒト血清のセットは、 M.肺炎 IgGに対して陽性であることが証明されました。他のいくつかの血清セットもこの自家製ELISAを使用してテストされ、毎回、アッセイは M.肺 炎IgGを特異的に検出し、したがって M.肺炎感染患者を非感染患者と区別するのに効率的であることが証明されました(データは示されていません)。
ELISAの結果は、いくつかのイムノブロット分析によって常に確認され、同時にM .肺炎 の陽性率と、社内の捕捉抗原M. 肺 炎ELISAによって陽性であることが判明したテスト血清の他のすべての細菌の陰性を示しました(データは示されていません)。
図1: マイコプラズマ・ニューモニエ IgGの特異的検出のために実験室で開発された抗原捕捉ELISAの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイコプラズマ・ニューモニエと異種細菌群との交差反応のイムノブロット解析。大腸菌(レーン2)、肺炎連鎖球菌(レーン3)、緑膿菌(レーン4)、黄色ブドウ球菌(レーン5)、肺炎桿菌(レーン6)、2つの尿素プラズマ尿素リチカム分離株(レーン7および8)、M.イミタンス(レーン9)、M.ガリセプティカム(レーン10)、M.ホミニス(レーン11)、M.ファーメンタンスの抗原に対して反応性をテストしました。(レーン12)、およびM.ジェニタリウム(レーン13)。レーン1:肺炎菌(陽性対照)。いくつかの主要なM.肺炎タンパク質の分子量を左側に示しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:交差反応を排除するための吸着手順の効率のイムノブロット確認。選択された全ての異種細菌の反応性;大腸菌、肺炎連鎖球菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、2つの尿素プラズマ尿素リチカム分離株、M.イミタンス、M.ガリセプティカム、M.ホミニス、M.ファーメンタンス、およびM.ジェニタリウム(それぞれレーン2〜13)を吸着したM.ニューモニエポリクローナル抗血清に対して試験した。 M. pneumoniae抗原は、ポジティブコントロールとしてレーン1にロードされました(特定のタンパク質のみが明らかになりました)。レーンMW:事前に染色されたタンパク質ラダー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:抗原捕捉ELISAの結果。 ELISAは、吸着した マイコプラズマ・ニューモニエ ポリクローナル抗血清をコーティング剤として用いて行った。棒グラフ1と2は、それぞれネガティブコントロールとポジティブコントロールを示しています。棒グラフ3〜13は、検査された患者のグループの血清を示しています。各血清は、1/200(紫色のバー)、1/400(オレンジ色のバー)、および1/800(青いバー)の3つの異なる希釈でテストされました。OD値は、陽性の指標を計算するのに役立ちました。各反応は2回に分けて行った。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 微生物 | 濾す* | 中程度 | 参考 | |
| マイコプラズマおよび尿素プラズマ種 | マイコプラズマ・ニューモニエ | ATCC 160 20030 | SP4 | [35] |
| マイコプラズマ・ジェニタリウム | CIP 103767T | SP4 | ||
| マイコプラズマ・ファーメンタンス | ATCC 160 20026 | SP4 | ||
| マイコプラズマ・ホミニス | CIP 103715T | アルギニンを補給したSP4 | ||
| 尿素プラズマ尿素溶解 | 2つの臨床分離株** | 尿素を添加したSP4 | ||
| マイコプラズマ・ガリセプティカム | CIP S6 15302 | フレイ | [36] | |
| マイコプラズマ模倣品 | ATCC 160 20037 | フレイ | ||
| その他の細菌 | 大腸菌 | ATCC 25922 | LBブロス | [37] |
| 肺炎桿菌 | 臨床分離株*** | LBブロス | ||
| 緑膿菌 | ATCC 27853 | LBブロス | ||
| 黄色 ブドウ 球菌 | ATCC 25923 | LBブロス | ||
| 肺炎連鎖球菌 | 臨床分離株*** | ブラッドブロス | ||
| * ATCC:アメリカンタイプカルチャーコレクション、CIP:コレクションインスティテュートパスツール | ||||
| **分離株は、ルーチン診断のためにマイコプラズマ研究所(チュニスパスツール研究所)に自発的に出荷された臨床サンプルから収集されました | ||||
| 分離株は、ルーチン診断のために細菌学研究所(チュニスパスツール研究所)に自主的に出荷された臨床サンプルから収集されました | ||||
表 1: この研究で使用された細菌株のリスト。
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Discussion
この論文では、主に特定のスクリーニングを確実にするために開発された社内ELISAの一般的な説明を示します。 M. pneumoniae 感染症。ELISAアッセイ自体のプロトコルに関する詳細、およびいくつかの前処理および後処理ステップが提供されます。このアッセイの特異性は、吸着技術によって保証されます。この手順は、ヒトおよび鳥類の診断用に開発されたELISA試験で以前に説明されています。 Mycoplasmas17,24.また、ライム病などの他の細菌感染症の診断のためのELISAアッセイにも採用されました。25.これらの3つの論文では、吸着がELISA特異性を高めるのに役立つことが証明されました。17,24,25.本ELISAアッセイの場合、吸着のために選択された適切な細菌種は、2つのグループに分割することができる:第1のグループは、いくつかの病原性のヒトおよびトリのモリキューテス種(M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumそして M. imitans)、2番目は人間に感染することが知られている最も頻繁な細菌を含んでいます(E. coli, P. aeruginosaそして S. aureus)および気道への向性で悪名高いもの(K. pneumoniae そして S. pneumoniae).異種細菌の幅広い選択は、種と臓器特異性の教義がもはや尊重されていないという事実に基づいていました。なじみのない生息地での微生物の検出に関する多くの報告が以前に発表されています。例えば M. pneumoniae 多くの肺外部位から分離されており、気道に特異的であると考えられていましたが、軽度から重度の症状を伴うさまざまな肺外合併症に関連していることがわかっています。6,7.反対のケース(性器の隔離) Mycoplasma 気道からの種)は、 M. hominis そして M. fermentans26,27.鳥類の包含 Mycoplasma ヒト感染の血清診断試験におけるspp.は、ヒト(特に免疫不全の人および獣医師)の感染の可能性を報告した以前の研究に基づいていた。 Mycoplasma 家畜由来の属28,29,30.確かに、これまで、孤立を呼び起こす論文は見つかりませんでした。 M. gallisepticum そして M. imitans (本論文の吸着手順に含まれる2種)ヒト由来。それにもかかわらず、特にこれらの種は獣医師によって最も定期的に扱われる種の1つであり、系統発生的に近すぎるため、不可能なことは何もありません。 M. pneumoniae.実際、これらの2つの鳥 Mycoplasma SPP.はと最も強い反応性を示しています M. pneumoniae 抗血清( 図 2).簡単に言うと、吸着手順を設計する際に、抗原を共有する可能性のある比較的広範囲の疑わしい細菌 M. pneumoniae が含まれていました。行われた選択は、系統発生的関連性と気道への向性に基づいていました。それにもかかわらず、ヒトの細菌叢の多様性と抗原の多様性のために、交差反応する可能性のあるすべての異種細菌種および株を予測して含めることは不可能です。 M. pneumoniae 抗体。したがって、間の交差反応の可能性 M. pneumoniae 抗血清は、吸着後も、および他の細菌の可能性があります。また、 M. pneumoniae 小児および若年成人に感染することが一般的に知られており、吸着手順は、次のような他の小児呼吸器病原体を添加することによって将来さらに改善され得る。 Haemophilus influenzae31 そして Streptococcus pyogenes32 吸着細菌の候補リストに。
このELISAの目的は、ヒト血清中の標的抗体(特異的 なM.肺炎-IgG)の存在を検出することです。したがって、血清をサンプルとして使用し(収集が最も簡単で、患者にとって痛みが少ないため)、特異性を確保するために、社内ELISAは、間接ELISAとサンドイッチELISAの2つのELISAタイプの原理に基づいています。血清サンプル(一次抗体)は、検出抗体(標識された第2抗体)と捕捉抗体に特異的に結合した捕捉抗原との間に結合され、捕捉抗体に特異的に結合された(予め吸着により特異的に発現し、マイクロプレート表面に固定化される)。これらのユニークな特性を考えると、このELISAは効果的で特別であると考えられています。それにもかかわらず、このテストは完璧ではなく、問題が発生する可能性があります。偽陽性および偽陰性の結果は、血清の品質や感染段階が原因である場合もあれば、実験室でのプロトコル適用中のエラーが原因で発生することもあります。例えば、ELISA血清診断結果は、ウェルが十分に洗浄されていなくても影響を受ける可能性がある。また、インキュベーション(温度と時間)がテスト結果に影響を与える可能性があります。マイクロプレートおよびブロッキング剤の選択も、ELISA開発中の重要なステップであると報告された33、34。これらすべての理由から、さまざまな抗体(血清サンプル、捕捉抗体、検出抗体)の希釈、インキュベーションおよび洗浄ステップ、適切なネガティブコントロールとポジティブコントロールの包含など、最適なパラメーターと条件を決定するために、このELISAテストの改善に継続的に取り組むことが重要です。
吸着手順を実行するための細菌の培養およびそれらの抗原の産生は、特にモリキューテス種にとって、重いステップと見なすことができる。それにもかかわらず、このステップはELISA特異性を高め、イムノブロッティングやPCRなどのさらなる確認テストを回避するのに大いに役立つため、これは重要であると考えられています。さらに、M.肺炎感染症の状況では、市中肺炎の治療におけるベータラクタム薬の使用はM.肺炎に対して効果がないため、適切かつ適切な抗生物質療法を確立するために効果的で信頼性の高い診断が絶対に必要です8。実験室での日常的な診断活動に長年使用されてきた後、この論文に記載されている抗原捕捉ELISAは、肺炎球菌感染症の特異的スクリーニングのための有効なツールであると考えられています。
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Disclosures
著者は、競合する利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、チュニジア保健省とチュニジア高等教育科学研究省から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
References
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