Summary
在 肺炎支原体 感染中，血清学检测可产生良好的结果，但由于免疫学交叉反应，特异性较低。本文所述的内部抗原捕获ELISA保证了高物种特异性，并已被证明是准确诊断 肺炎支原体的可靠筛查测试。
Abstract
肺炎支原体是一种细胞壁缺陷的原核生物，主要在人类呼吸道定植并流行，每 6 年流行一次，在年龄较大的儿童和年轻人中流行一次。肺炎支原体的诊断具有挑战性，因为病原体的苛刻性和无症状携带的可能性。基于患者血清样本中抗体滴定的肺炎支原体感染的实验室诊断仍然是最常用的方法。由于使用多克隆血清治疗肺炎支原体存在免疫交叉反应的潜在问题，因此开发了抗原捕获酶联免疫吸附测定 （ELISA） 以提高血清学诊断的特异性。ELISA平板涂有肺炎支原体多克隆抗体，在兔子中饲养，并在吸附一组与肺炎支原体属属共享抗原和/或已知在呼吸道定植的异源细菌后具有特异性。然后，反应的肺炎支原体同源抗原被血清样品中的相应抗体特异性识别。抗原捕获ELISA所经历的物理化学参数的进一步优化导致了高度特异性，灵敏和可重复的ELISA。
Introduction
支原体 是已知最小和最简单的原核生物之一。它们与其他细菌的主要区别在于缺乏细胞壁结构。因此， 支原体 被归类为一个名为柔膜菌纲1的独立类别。细胞壁缺陷赋予这些微生物对某些抗菌剂的内在抗性，并且是其多态性的主要原因。 支原体 基因组小，体积缩小，这限制了它们的代谢和生物合成能力，并解释了它们的寄生和腐生性质1。
肺炎支原体是感染人类的支原体之一，被认为是毒性最强的支原体2。肺炎支原体定植于上呼吸道，导致儿童和年轻成人的非典型肺炎。肺炎支原体感染引起的临床症状为流感样，伴有头痛、发热和咳嗽3。肺炎支原体对宿主细胞的细胞粘附由附着细胞器介导，包括P1主要粘附和几种辅助蛋白4，5。由于肺炎支原体与气道粘膜的紧密粘附导致局部炎症和宿主免疫系统刺激，可能会出现更多的临床表现6。虽然肺炎是肺炎支原体感染的标志，但已经发现这种细菌的感染也可能是不同解剖部位（如中枢神经系统、心脏、皮肤和关节）中广泛非肺部表现的原因7。
对于所有支原体属，肺炎支原体的诊断具有挑战性。引起支原体病的临床症状大多不明显且不典型8。由于仅依靠临床表现和症状很难诊断肺炎支原体感染，因此实验室筛查特别令人感兴趣9。通过培养检测肺炎支原体菌落是正确诊断的金标准方法。然而，苛刻的生长要求和提供明确结果（1-2周）所需的时间使培养复杂化，因此意味着它很少用于常规诊断10。核酸扩增技术在速度和效率方面得到了验证，但由于其成本相对较高且在某些医疗机构中不可用，因此这些分子技术不被视为一线诊断测试。诚然，商业PCR检测被广泛用于诊断肺炎支原体感染，但它们仍然不能取代血清学。此外，假阴性和假阳性结果的频繁发生限制了PCR9的使用。常规情况下，血清学仍然是实验室中诊断肺炎支原体感染最常用的方法。几十年来已经报道了几种血清学方法，例如冷血凝素、补体固定试验 11、间接血凝试验12、免疫荧光13 和 ELISA 技术，该技术于 1980 年代初首次应用于支原体血清学 14，15，16。在对肺炎支原体感染进行ELISA血清学诊断时遇到的主要问题之一是交叉反应，这大大降低了该技术的特异性。以前报道过人血清与肺炎支原体抗原的非特异性吸附;事实上，由于肺炎支原体与一些细菌18，19和一些动物和人体组织20的共性，ELISA在人血清中检测到的许多抗体可能并不总是与支原体抗原17结合。
由于在实验室中实施的常规ELISA测试中观察到的高背景读数，结果的解释通常很复杂，因此提供正确的肺炎支原体诊断是一项艰巨的任务。在面对这个问题时，我们选择通过去除肺炎支原体抗原与待测试抗体的非特异性反应来改善肺炎支原体 ELISA。为此，我们使用吸附技术研究了非特异性肺炎支原体抗原的选择性去除。事实上，抗原捕获ELISA的主要目标是特异性检测人血清样本中的肺炎支原体免疫球蛋白（Ig）G。该ELISA的概念主要包括在添加人血清样品之前选择性捕获肺炎支原体特异性抗原。这种选择性是通过将肺炎支原体粗抗原与实验室中兔子中产生的肺炎支原体多克隆抗血清孵育来保证的，并通过吸附一组异源细菌（属于或不属于柔膜菌类）使其具有物种特异性，与肺炎支原体共享抗原 属和/或已知在呼吸道定植。吸附过程重复三次，并通过免疫印迹测试其消除交叉反应性的效率。开发的 ELISA 测定是夹心和间接 ELISA 的组合。简而言之，首先用肺炎支原体特异性多克隆抗血清包被ELISA板的孔。然后，加入肺炎支原体抗原并将其捕获在抗血清和待测血清样品中存在的抗体之间。形成的免疫复合物由二级酶偶联抗体（过氧化物酶偶联IgG）检测。通过加入显色底物来观察反应，并通过分光光度法测量吸光度。该内部 ELISA 示意图如图 1 所示。自制的ELISA被证明在特异性检测肺炎支原体感染方面是有效的，目前是常规诊断活动中最常用的测试之一。
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Protocol
本研究是根据突尼斯巴斯德研究所伦理委员会制定的伦理问题进行的。
1. 预 ELISA 步骤：先决条件和预处理
- 细菌菌株和生长培养基
注意：本研究中使用的柔膜菌种类和壁细菌及其生长培养基列于 表1中。- 柔膜菌纲物种的生长
- 从每种物质的甘油原液中接种 200 μL 到 1，800 μL 培养基中。
- 在37°C和5%CO2 下静态生长柔膜菌纲2-4天，直到观察到pH变化（pH指示剂为酚红）。
- 通过将培养物的1/10稀释液 添加到培养基中，将培养物放大至10 mL，并使其在相同条件下再次生长。
注意：根据代谢，一些人类柔膜菌属（肺炎支原体、生殖支原体和发酵支原体）由于葡萄糖发酵使培养基酸化，而其他一些（人疟原体和解脲原体）分别通过精氨酸水解或尿素水解碱化培养基。 关于禽支原体，弗雷培养基的酸化表明存在 M. gallisepticum，而其碱化证明了 M. imitans 的生长。 - 将 50 μL 培养物散布在琼脂平板上以确认细菌的生长。用5%CO2 将琼脂平板保持在37°C，并在显微镜下定期观察它们，以出现典型的煎蛋菌落（支原体）和深海胆样菌落（解脲支原体）。
- 非柔膜菌纲物种的生长
- 在37°C的3mL培养基中培养非柔膜菌纲过夜（以200rpm振荡）。
- 将培养物的浊度与对照培养基进行比较以确认生长。
- 通过将培养物的1/100稀释度添加到培养基中，将培养物放大至10 mL，并使其在相同条件下再次生长。
- 柔膜菌纲物种的生长
- 抗原制备
- 柔膜菌属的抗原制备
- 通过在4°C下以40，000×g离心30分钟来收获整个蛋白质（存在于肺炎分枝杆菌和其他柔膜菌纲物种的确认培养物中）。
- 弃去上清液，并在相同条件下通过一系列三次离心，用 1 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS，pH 7.4） 洗涤沉淀 3 次。
- 将每种抗原重悬于 500 μL PBS 中。
- 非柔膜菌属的抗原制备
- 将非柔膜菌纲的过夜生长培养物以1，500× g 离心15分钟。
- 将每个细菌沉淀重悬于 500 μL PBS 中。
注意：蛋白质浓度使用经典的布拉德福德定量方法测定，牛血清白蛋白作为标准品21。柔膜菌纲的蛋白质浓度通常在0.7-4.8毫克/毫升之间。对于其他细菌种类，蛋白质浓度可以达到20mg / mL。所有抗原储存在-20°C直至随后使用。
- 柔膜菌属的抗原制备
- 通过免疫印迹进行交叉反应性筛查
- 通过将 8 μL 每种抗原与等体积的样品缓冲液（0.5 M Tris-HCl;pH 6.8、10% 甘油 [v/v]、10% SDS [w/v] 和 0.2% 溴酚蓝）混合来变性细菌蛋白，将混合物在 100 °C 下孵育 5 分钟。
注意：进行变性以用负电荷覆盖蛋白质并破坏其二级结构，这允许它们穿过聚丙烯酰胺凝胶并根据其分子量进行分离。 - 通过Laemmli方法22，用12 %分离凝胶和5%堆积凝胶将变性蛋白质（100μg蛋白质/孔）置于十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）下。之后，通过Towbin等人的方法23将蛋白质电泳转移到硝酸纤维素膜上。
- 将硝酸纤维素膜浸入PBS中的5%脱脂牛奶中30分钟，以堵塞未占用的表面。将蛋白印迹在室温下孵育2小时，在PBS-Tween 20中稀释至1/200的兔多克隆 肺炎支原体 抗血清（在突尼斯巴斯德研究所生产），然后在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗兔IgG在PBS-吐温20中稀释至1/2，0001小时。
- 用PBS洗掉未结合的抗体，并通过将硝酸纤维素片暴露于底物溶液（4-氯-1-萘酚，H 2 O2）中获得结果。5-15分钟后加水停止反应。
- 通过将 8 μL 每种抗原与等体积的样品缓冲液（0.5 M Tris-HCl;pH 6.8、10% 甘油 [v/v]、10% SDS [w/v] 和 0.2% 溴酚蓝）混合来变性细菌蛋白，将混合物在 100 °C 下孵育 5 分钟。
- 吸附程序
注意：为了消除多克隆 肺炎支原 体抗血清和异源细菌抗原之间的交叉反应，采用了Ben Abdelmoumen和Roy24 先前描述的吸附程序。- 制备12种异源细菌（疑似与 肺炎支原体共享抗原）的抗原库，将其混合在微量离心管中，并调整对应于实验中要吸附的抗血清一半的蛋白质浓度。
注意：体积和浓度在不同的测定之间有所不同。这一步主要取决于要吸附的抗体的浓度。例如，如果抗体浓度= 3.56 mg/mL，则抗原库（由12种异源细菌组成）的浓度应为1.78 mg/mL（因此，每种抗原约为0.148 mg）。 - 将抗原混合物在4°C下以14，000× g 离心10分钟，收集混合沉淀，并将其与纯化的多克隆抗肺炎支原体 IgG在37°C缓慢搅拌孵育2小时。
- 孵育后，将悬浮液在4°C下以14，000× g 离心10分钟并回收上清液（对应于特定的 多克隆肺炎支原体 抗血清）。
注意：为确保多克隆 肺炎支原体 抗血清的特异性，请重复吸附程序三次。在将其用于 ELISA 测定之前，应通过免疫印迹测试吸附的多克隆 肺炎支原体 抗血清，以确保对所包含的一组细菌没有交叉反应。
- 制备12种异源细菌（疑似与 肺炎支原体共享抗原）的抗原库，将其混合在微量离心管中，并调整对应于实验中要吸附的抗血清一半的蛋白质浓度。
2. ELISA步骤：测定本身
- 捕获抗体微孔板包被
- 将捕获抗体（肺炎支原体 预吸附多克隆抗血清）稀释至 0.1 M 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液 （pH 9.6） 中的 10 μg/mL 浓度。
- 通过向每个孔中加入 100 μL 稀释的捕获抗体来涂覆 96 孔 ELISA 板。
- 在4°C孵育过夜后，除去包衣溶液并用洗涤缓冲液（组成[每L]：146.29gNaCl，39.4gTris-HCl，0.2g硫柳汞和0.5mL吐温20;pH 7.3）。
- 阻塞
- 通过向每个孔中加入 100 μL 封闭溶液（PBS 中的 0.5% 酪蛋白）来封闭包被孔的剩余结合表面。
- 在室温下孵育1小时。
- 用移液管取出封闭溶液，并用洗涤缓冲液洗涤板五次。
- 抗原的应用
- 向所有包被孔中加入等量的 肺炎支原体 全蛋白（10 ng /孔）。
- 让反应在室温下发生2小时。
- 除去过量的抗原溶液，并用洗涤缓冲液洗涤板五次。
- 测试样品和对照的应用
- 在PBS-Tween 20中将测试样品（人血清）和对照（参考阳性和阴性血清）稀释至1/200，1/400和1/800。
- 将 100 μL 稀释的样品和对照品加入适当的孔中。一式两份进行每个反应。将既不含抗原也不含有血清的孔标记为空白。
- 在室温下孵育板90分钟后，除去血清溶液并用洗涤缓冲液洗涤板五次。
- 酶偶联检测抗体的应用
- 在 PBS-吐温 20 中将酶偶联检测抗体、HRP 偶联抗兔和抗人 IgG 稀释至 1/10，000。
- 将100 μL适当稀释的检测抗体移液到每个孔中。
- 将板在室温下在黑暗中孵育1小时后，除去未结合的检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤板五次。
- 检测和数据分析
- 加入 100 μL 的 3，3'、5，5' 四甲基联苯胺 （TMB） 显色原溶液，以可视化抗原-抗体结合。
- 让板在室温下显影 30 分钟，然后加入 100 μL 终止溶液 （7.5% H2SO4） 以停止酶促反应。
- 使用酶标仪读取450nm波长处的吸光度，并根据阳性指数（IP）的计算整理结果。
IP = 被测血清的吸光度 / 截止值的吸光度
IP < 0.7：阴性结果
IP = 0.7：应在2周内重复测试
IP > 0.7：阳性结果
注意：IP公式是在实验室中构思的，0.7值是在优化后设置的。对于重复反应，计算吸光度的平均值。通过ELISA棋盘滴定法确定最佳血清稀释度和抗原浓度（数据未显示）。临界值 = 参比阳性血清的 OD（光密度）（以与样品相同的稀释度稀释）。该OD应至少比阴性对照的OD值高三倍。
3. ELISA后步骤：结果评估和测试验证
- 通过使用肺炎支原体和异源细菌抗原的补充免疫印迹来评估内部 ELISA 特异性诊断测试患者肺炎支原体感染的能力，以确认被测人血清在肺炎支原体抗体中的阳性性及其在其他可疑细菌中的阴性（数据未显示）。
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Representative Results
非吸附多克隆肺炎支原体抗血清对异源细菌的免疫印迹活性
交叉反应性确实存在，如免疫印迹结果所示（图2），与阳性对照（泳道1）相比，一些肺炎支原体抗原与筛选的细菌共享。这些交叉反应的强度是可变的。例如，败血症支原体和模仿支原体抗原体抗血清（泳道9和10）的反应性最强，除了是禽支原体。相反，解脲支原体的两种人类临床分离株均未显示出任何反应性（泳道7和8）。然而，剩余的人类生殖器支原体属人分枝杆菌、发酵支原体和生殖支原体的抗原与抗血清肺炎支原体产生了相当大的交叉反应（分别为泳道 11、12 和 13）。 大肠杆菌（泳道2）、铜绿假单胞菌（泳道4）和肺炎克雷伯菌（泳道6）也与多克隆肺炎支原体抗体反应，它们的抗原谱模式非常相似。该特征与两种球菌属肺炎链球菌和葡萄球菌略有不同;肺炎链球菌（泳道3）的反应性较低，金黄色葡萄球菌（泳道5）的反应性更低。
通过吸附程序保证肺炎支原体抗体的特异性
在吸附肺炎支原体多克隆抗血清对抗异源细菌抗原后，通过免疫印迹测试特异性（图3）。除了泳道1（阳性对照）中显示的一些肺炎支原体抗原蛋白外，其他抗原几乎完全未检测到（泳道2-13）。泳道1中揭示的蛋白质实际上是吸附后残留的特异性肺炎支原体抗体检测到的特定蛋白质。基于该结果，证明了吸附程序的效率，因为消除了肺炎支原体多克隆抗血清与上述异源抗原的非特异性反应。然后，将特异性的肺炎支原体抗血清用于所有随后的血清学和免疫印迹测试。
捕获抗原 ELISA：常规实验室血清诊断活性的有效检测
由于所有血清都在重复孔中测试了不同稀释度，因此计算OD平均值，并绘制了将这些吸光度值与其相应的血清稀释度相关联的条形图（图4）。基于IP计算，本文中测试和介绍的一组人血清被证明对 肺炎支原体 IgG呈阳性。还使用这种自制的ELISA测试了其他几种血清组，并且每次测定都证明可以有效地特异性检测 肺炎支原体 IgG，从而区分 肺炎支原体感染患者和未感染患者（数据未显示）。
ELISA结果总是通过几个免疫印迹分析同时显示肺炎支原体的阳性性和内部捕获抗原肺炎支原体ELISA发现阳性的任何测试血清的所有其他细菌的阴性（数据未显示）。
图 1：实验室开发的用于特异性检测肺炎支原体 IgG 的抗原捕获 ELISA 示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图2：肺炎支原体与一组异源细菌之间交叉反应的免疫印迹分析。对肺炎支原体非吸附多克隆抗血清抗血清对大肠埃希菌（泳道 2）、肺炎链球菌（泳道 3）、铜绿假单胞菌（泳道 4）、金黄色葡萄球菌（泳道 5）、肺炎克雷伯菌（泳道 6）、两种解脲支原体分离株（泳道 7 和 8）、模仿分枝杆菌（泳道 9）、败血症分枝杆菌（泳道 10）、人分枝杆菌（泳道 11）、发酵支原体的抗原反应性（12 号车道）和生殖分枝杆菌（13 号泳道）。泳道 1：肺炎分枝杆菌（阳性对照）。左侧给出了一些主要肺炎支原体蛋白的分子量。请点击此处查看此图的大图。
图 3：免疫印迹确认吸附程序的效率以消除交叉反应。所有选定的异源细菌的反应性;对吸附的肺炎支原体多克隆抗血清进行了大肠杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、两种解脲支原体分离株、模仿支原体、败血症支原体、人分枝杆菌、发酵支原体和生殖 支原体（分别为泳道 2-13）的测试。 在泳道1中加载肺炎支原原体抗原作为阳性对照（仅显示特异性蛋白质）。泳道分子量：预染色的蛋白质分子量标准。请点击此处查看此图的大图。
图 4：抗原捕获 ELISA 的结果。 使用吸附的 肺炎支原体 多克隆抗血清作为包衣剂进行ELISA。条形图 1 和 2 分别描述了阴性和阳性对照。条形图3-13描述了一组测试患者的血清。每种血清在三种不同的稀释度下进行测试：1/200（紫色条），1/400（橙色条）和1/800（蓝色条）。OD值用于计算阳性指数。每个反应一式两份。 请点击此处查看此图的大图。
| 微生物 | 应变* | 中等 | 参考 | |
| 支原体和解脲支原体种类 | 肺炎支原体 | ATCC 160 20030 | SP4 | [35] |
| 生殖支原体 | CIP 103767T | SP4 | ||
| 支原体发酵菌 | ATCC 160 20026 | SP4 | ||
| 人支原体 | CIP 103715T | SP4补充精氨酸 | ||
| 解脲支原体 | 2 种临床分离株** | SP4 补充尿素 | ||
| 败血症支原体 | CIP S6 15302 | 弗雷 | [36] | |
| 支原体模仿者 | ATCC 160 20037 | 弗雷 | ||
| 其他细菌 | 大肠杆菌 | ATCC 25922 | 磅肉汤 | [37] |
| 肺炎克雷伯菌 | 临床分离*** | 磅肉汤 | ||
| 铜绿假单胞菌 | ATCC 27853 | 磅肉汤 | ||
| 金黄色葡萄球菌 | ATCC 25923 | 磅肉汤 | ||
| 肺炎链球菌 | 临床分离*** | 血汤 | ||
| * ATCC：美国型菌种收藏，CIP：巴斯德收藏研究所 | ||||
| ** 从自愿运往支原体实验室（突尼斯巴斯德研究所）进行常规诊断的临床样本中收集分离物 | ||||
| 从自愿运往细菌学实验室（突尼斯巴斯德研究所）进行常规诊断的临床样本中收集分离物 | ||||
表 1： 本研究中使用的细菌菌株列表。
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Discussion
本文介绍了一种内部 ELISA 的一般描述，主要用于确保特定筛选 M. pneumoniae 感染。提供了有关ELISA测定本身的方案以及一些预处理和后处理步骤的详细信息。吸附技术确保了该测定的特异性。该程序先前在为诊断人类和禽而开发的ELISA测试中有所描述 Mycoplasmas17,24.它还用于 ELISA 测定，用于诊断其他细菌感染，如莱姆病25.在这三篇论文中，吸附被证明有助于提高ELISA特异性，而不会降低或降低灵敏度17,24,25.在本ELISA测定的情况下，选择用于吸附的适当细菌种类可分为两组：第一组含有一些致病的人和禽柔膜菌纲（M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticum和 M. imitans），而第二个含有已知感染人类的最常见细菌（E. coli, P. aeruginosa和 S. aureus）和那些以呼吸道嗜性而闻名的人（K. pneumoniae 和 S. pneumoniae).异源细菌的广泛选择是基于这样一个事实，即物种和器官特异性的教条不再得到尊重。以前已经发表了许多关于在陌生栖息地中检测微生物的报告。例如 M. pneumoniae 已从许多肺外部位分离出来，发现与各种伴有轻度至重度症状的肺外并发症有关，尽管它被认为是呼吸道特异性的6,7.相反的情况（隔离生殖器 Mycoplasma 来自呼吸道的物种）发出信号 M. hominis 和 M. fermentans26,27.包括鸟类 Mycoplasma 在人类感染的血清诊断试验中，Spp.基于先前报告人类（特别是免疫功能低下的人和兽医）感染的可能性 Mycoplasma 源自家畜的属28,29,30.的确，直到现在，还没有发现任何论文唤起孤立 M. gallisepticum 和 M. imitans （本文吸附程序中包含的两个物种）来自人类。尽管如此，没有什么是不可能的，特别是因为这些物种是兽医最常处理的物种之一，并且在系统发育上过于接近 M. pneumoniae.事实上，这两种鸟类 Mycoplasma 已显示出最强的反应性 M. pneumoniae 抗血清（如 图2).简而言之，在设计吸附程序时，可以与 M. pneumoniae 包括在内。所做的选择基于系统发育相关性和对呼吸道的嗜性。然而，由于人类菌群多样性和抗原变异性，不可能预测和包括所有可能的异源细菌物种和菌株，这些细菌物种和菌株可能与 M. pneumoniae 抗体。因此，交叉反应的可能性 M. pneumoniae 抗血清，即使在吸附后，和其他细菌仍然可能。而且，由于 M. pneumoniae 众所周知，会感染儿童和年轻人，将来可以通过添加其他儿科呼吸道病原体（例如 Haemophilus influenzae31 和 Streptococcus pyogenes32 进入吸附细菌候选名单。
该 ELISA 的目的是检测人血清中靶抗体（特异性 肺炎支原体-IgG）的存在。因此，为了能够使用血清作为样本（因为它最容易收集，对患者来说痛苦较小）并确保特异性，内部 ELISA 基于两种 ELISA 类型的原理：间接和夹心 ELISA。血清样品（一抗）结合在检测抗体（标记的第二抗体）和捕获抗原之间，捕获抗原与捕获抗体特异性连接（事先通过吸附产生特异性并固定在微孔板表面上）。鉴于这些独特的特性，据信这种ELISA是有效和特殊的。然而，这个测试并不完美，可能会出现麻烦。仍然可能遇到假阳性和假阴性结果，有时是因为血清质量或感染阶段，有时是因为实验室方案应用过程中的错误。例如，即使孔未充分清洗，ELISA血清诊断结果也会受到影响。此外，孵育（温度和时间）可能会影响测试结果。据报道，微孔板和封闭剂的选择也是ELISA开发过程中的关键步骤33，34。由于所有这些原因，重要的是不断努力改进该ELISA测试，以确定最佳参数和条件，例如不同抗体（血清样品，捕获抗体，检测抗体）的稀释，孵育和洗涤步骤，以及包含适当的阴性和阳性对照。
细菌的培养及其抗原的生产以执行吸附程序可以被认为是一个沉重的步骤，特别是对于柔膜菌属物种。然而，据信这很重要，因为此步骤极大地有助于增强ELISA特异性并避免进一步的确认测试，例如免疫印迹或PCR。此外，在肺炎支原体感染的情况下，为了建立充分和适当的抗生素治疗，肯定需要有效和可靠的诊断，因为使用β-内酰胺类药物治疗社区获得性肺炎对肺炎支原体无效8。经过多年用于实验室的常规诊断活动，据信本文中描述的抗原捕获ELISA代表了肺炎支原体感染特异性筛查的有效工具。
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Disclosures
作者声明不存在竞争利益。
Acknowledgments
这项研究由突尼斯卫生部和突尼斯高等教育和科学研究部资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
References
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- Chanock, R. M.
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