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Biology

DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE DE CAPTURE D’ANTIGÈNE POUR LA DÉTECTION SPÉCIFIQUE DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

Dans l’infection à Mycoplasma pneumoniae, les tests sérologiques peuvent générer de bons résultats, mais avec une faible spécificité en raison de la réaction immunologique croisée. Le test ELISA interne de capture d’antigènes, décrit dans cet article, garantit une spécificité élevée de l’espèce et s’est avéré être un test de dépistage fiable pour un diagnostic précis de M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae est un procaryote déficient de la paroi cellulaire, principalement connu pour coloniser les voies respiratoires humaines et être endémique, avec des pics épidémiques tous les 6 ans, chez les enfants plus âgés et les jeunes adultes. Le diagnostic de M. pneumoniae est difficile en raison de la nature fastidieuse de l’agent pathogène et de la possibilité d’un portage asymptomatique. Le diagnostic en laboratoire de l’infection à M. pneumoniae basé sur le titrage des anticorps dans les échantillons de sérum des patients reste la méthode la plus pratiquée. En raison du problème potentiel de réactivité immunologique croisée avec l’utilisation de sérum polyclonal pour M. pneumoniae, un test immuno-enzymatique de capture d’antigènes (ELISA) a été développé pour améliorer la spécificité du diagnostic sérologique. Les plaques ELISA sont recouvertes d’anticorps polyclonaux contre M. pneumoniae, élevés chez le lapin et rendus spécifiques après adsorption contre un panel de bactéries hétérologues qui partagent des antigènes avec des espèces de M. pneumoniae et/ou sont connues pour coloniser les voies respiratoires . Les antigènes homologues de M. pneumoniae ayant réagi sont alors spécifiquement reconnus par leurs anticorps correspondants dans les échantillons de sérum. L’optimisation ultérieure des paramètres physico-chimiques auxquels l’ELISA de capture d’antigènes est soumis a conduit à un ELISA hautement spécifique, sensible et reproductible.

Introduction

Les mycoplasmes sont parmi les procaryotes connus les plus petits et les plus simples. Elles se distinguent principalement des autres bactéries par l’absence de structure de paroi cellulaire. Ainsi, les mycoplasmes ont été classés dans une classe distincte appelée Mollicutes1. La déficience de la paroi cellulaire confère une résistance intrinsèque à ces micro-organismes contre certains agents antimicrobiens et est en grande partie responsable de leur polymorphisme. Les mycoplasmes ont un génome restreint et une taille réduite, ce qui limite leurs capacités métaboliques et biosynthétiques et explique leur nature parasitaire et saprophyte1.

Mycoplasma pneumoniae est l’un des mycoplasmes qui infectent l’homme et est considéré comme le plus virulent2. M. pneumoniae colonise les voies respiratoires supérieures, entraînant une pneumonie atypique chez les enfants et les jeunes adultes. Les signes cliniques engendrés par l’infection à M. pneumoniae sont pseudo-grippaux, avec maux de tête, fièvre et toux3. La cytadhésion de M. pneumoniae aux cellules hôtes est médiée par un organite de fixation comprenant une adhérence majeure P1 et plusieurs protéines accessoires 4,5. D’autres manifestations cliniques peuvent survenir en raison d’une inflammation locale et d’une stimulation du système immunitaire de l’hôte résultant de l’adhérence intime de M. pneumoniae à la muqueuse des voies respiratoires6. Bien que la pneumonie soit une caractéristique de l’infection à M. pneumoniae, il a été révélé que l’infection par cette bactérie peut également être responsable d’un large éventail de manifestations non pulmonaires dans différents sites anatomiques tels que le système nerveux central, le cœur, la peau et les articulations7.

Comme pour toutes les espèces de Mycoplasma, le diagnostic de M. pneumoniae est difficile. Les signes cliniques évoquant la mycoplasmose sont pour la plupart inapparents et non caractéristiques8. Comme il est très difficile de diagnostiquer l’infection à M. pneumoniae en se fiant uniquement aux manifestations cliniques et aux symptômes, le dépistage en laboratoire présente un intérêt particulier9. La détection des colonies de M. pneumoniae par culture est la méthode de référence pour un diagnostic approprié. Cependant, les exigences de croissance fastidieuses et le long temps nécessaire pour obtenir des résultats définitifs (1-2 semaines) compliquent la culture, et signifie donc qu’elle est rarement utilisée pour le diagnostic de routine10. Les technologies d’amplification des acides nucléiques ont été validées en termes de rapidité et d’efficacité, bien qu’en raison de leur coût relativement élevé et de leur indisponibilité dans certains établissements de soins de santé, ces techniques moléculaires ne soient pas considérées comme des tests diagnostiques de première intention. Il est vrai que les tests PCR commerciaux sont largement utilisés pour diagnostiquer les infections à M. pneumoniae, mais ils ne peuvent toujours pas remplacer la sérologie. En outre, l’occurrence fréquente de résultats faussement négatifs et faux positifs a limité l’utilisation de la PCR9. Systématiquement, la sérologie reste la plus pratiquée dans les laboratoires pour le diagnostic de l’infection à M. pneumoniae. Plusieurs approches sérologiques ont été rapportées depuis des décennies, telles que les hémagglutinines froides, le test de fixation du complément 11, le test d’hémagglutination indirecte12, l’immunofluorescence 13 et la technologie ELISA, qui a été appliquée pour la première fois à la sérologie des mycoplasmes au début des années1980 14,15,16. L’un des principaux problèmes rencontrés lors de la réalisation du sérodiagnostic ELISA de l’infection à M. pneumoniae est les réactions croisées, ce qui réduit considérablement la spécificité de la technique. L’adsorption non spécifique de sérums humains avec des antigènes de M. pneumoniae a déjà été signalée; en fait, bon nombre des anticorps détectés par ELISA dans les sérums humains ne sont pas toujours liés aux antigènes mycoplasmiques 17, en raison de la similitude de M. pneumoniae avec certaines bactéries18,19 et certains tissus animaux et humains20.

En raison des lectures de fond élevées observées dans le test ELISA conventionnel pratiqué en laboratoire, l’interprétation des résultats était souvent compliquée et, par conséquent, la délivrance d’un diagnostic correct de M. pneumoniae était une tâche difficile. Face à ce problème, nous avons choisi d’améliorer le test ELISA de M. pneumoniae en supprimant les réactions non spécifiques des antigènes de M. pneumoniae avec des anticorps à tester. À cette fin, nous avons travaillé sur la déplétion sélective des antigènes non spécifiques de M. pneumoniae en utilisant la technique d’adsorption. En fait, l’objectif principal du test ELISA de capture d’antigènes est de détecter spécifiquement l’immunoglobuline (Ig) G de M. pneumoniae dans des échantillons de sérum humain. Le concept de ce test ELISA consiste principalement en la capture sélective d’antigènes spécifiques de M. pneumoniae, avant l’ajout des échantillons de sérum humain. Cette sélectivité est assurée par l’incubation de l’antigène brut M. pneumoniae avec un antisérum polyclonal M. pneumoniae, produit chez le lapin en laboratoire et en le rendant spécifique à l’espèce par adsorption contre un panel de bactéries hétérologues, appartenant ou non à la classe des Mollicutes, partageant des antigènes avec M. pneumoniae espèces et/ou connues pour coloniser les voies respiratoires. La procédure d’adsorption a été répétée trois fois et son efficacité à éliminer la réactivité croisée a été testée par immunobuvardage. Le test ELISA développé est une combinaison d’ELISA sandwich et indirect. Brièvement, les puits de la plaque ELISA sont d’abord recouverts d’un antisérum polyclonal spécifique à M. pneumoniae. Ensuite, l’antigène M. pneumoniae est ajouté et piégé entre l’antisérum et les anticorps présents dans l’échantillon de sérum à tester. Le complexe immunologique formé est détecté par un anticorps secondaire conjugué à l’enzyme (IgG conjuguées à la peroxydase). Les réactions sont visualisées par l’ajout de substrat chromogène et l’absorbance est mesurée par spectrophotométrique. Ce test ELISA interne est présenté schématiquement à la figure 1. Le test ELISA maison s’est avéré efficace pour détecter spécifiquement l’infection à M. pneumoniae et est actuellement l’un des tests les plus pratiqués dans l’activité diagnostique de routine.

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Protocol

La présente étude a été menée conformément aux aspects éthiques établis par le comité d’éthique de l’Institut Pasteur de Tunis.

1. Étapes pré-ELISA : Prérequis et prétraitement

  1. Souches bactériennes et milieux de croissance
    REMARQUE : Les espèces de mollicutes et les bactéries à paroi utilisées dans la présente étude ainsi que leurs milieux de croissance sont énumérés dans le tableau 1.
    1. Croissance des espèces de Mollicutes
      1. Inoculer 200 μL du stock de glycérol de chaque espèce dans 1 800 μL du milieu.
      2. Cultiver les espèces de Mollicutes statiquement à 37 °C avec 5% de CO 2 pendant2-4 jours jusqu’à ce qu’un changement de pH soit observé (l’indicateur de pH est rouge de phénol).
      3. Augmenter les cultures à 10 mL en ajoutantune dilution de 1/10e de la culture dans le milieu et leur permettre de repousser dans les mêmes conditions.
        NOTE: Selon le métabolisme, certaines espèces humaines de Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium et M. fermentans) acidifient le milieu en raison de la fermentation du glucose, et d’autres (M. hominis et Ureaplasma) alcalinisent le milieu par hydrolyse de l’arginine ou hydrolyse de l’urée, respectivement. En ce qui concerne les mycoplasmes aviaires, l’acidification du milieu de Frey démontre la présence de M. gallisepticum, tandis que son alcalinisation prouve la croissance de M. imitans.
      4. Étaler 50 μL des cultures sur des plaques de gélose pour confirmer la croissance de la bactérie. Maintenir les plaques de gélose à 37 °C avec 5% de CO2 et les observer régulièrement au microscope pour l’apparition de colonies typiques d’œufs au plat (mycoplasmes) et de colonies d’oursins foncés (Ureaplasmas).
    2. Croissance des espèces non-Mollicutes
      1. Culture des bactéries non mollicites dans 3 mL du milieu à 37 °C pendant une nuit (agitation à 200 tr/min).
      2. Comparer la turbidité des cultures avec le milieu témoin pour confirmer la croissance.
      3. Augmenter les cultures à 10 mL en ajoutantune dilution de 1/100e de la culture dans le milieu et leur permettre de repousser dans les mêmes conditions.
  2. Préparation de l’antigène
    1. Préparation d’antigènes d’espèces de Mollicutes
      1. Récolter les protéines entières (présentes dans les cultures confirmées de M. pneumoniae et des autres espèces de Mollicutes) par centrifugation à 40 000 x g à 4 °C pendant 30 min.
      2. Jeter le surnageant et laver les pastilles trois fois avec 1 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) par une série de trois centrifugations dans les mêmes conditions.
      3. Remettez chaque antigène en suspension dans 500 μL de PBS.
    2. Préparation d’antigènes d’espèces non Mollicutes
      1. Centrifuger les cultures cultivées pendant la nuit des bactéries non-Mollicutes à 1 500 x g pendant 15 minutes.
      2. Remettez chaque pastille bactérienne en suspension dans 500 μL de PBS.
        NOTE: La concentration en protéines est déterminée à l’aide de la méthode classique de quantification de Bradford avec l’albumine sérique bovine comme norme21. La concentration en protéines des espèces de Mollicutes varie habituellement entre 0,7 et 4,8 mg/mL. Pour les autres espèces bactériennes, la concentration en protéines peut atteindre 20 mg/mL. Tous les antigènes sont conservés à -20 °C jusqu’à leur utilisation ultérieure.
  3. Criblage de réactivité croisée par immunoblot
    1. Dénaturer les protéines bactériennes en mélangeant 8 μL de chaque antigène avec un volume égal de tampon échantillon (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glycérol [v/v], 10% SDS [p/v] et 0,2% bleu de bromophénol), incuber le mélange à 100 °C pendant 5 min.
      REMARQUE: La dénaturation est effectuée pour couvrir les protéines de charge négative et pour briser leurs structures secondaires, ce qui leur permet de traverser le gel de polyacrylamide et d’être séparées en fonction de leur poids moléculaire.
    2. Soumettre les protéines dénaturées (100 μg de protéines/puits) à l’électrophorèse sur gel dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) par la méthode 22 de Laemmli avec12 % de gel de séparation et 5% de gel empilable. Après cela, transférer les protéines par électrophorétie sur la membrane de nitrocellulose par la méthode23 de Towbin et al.
    3. Immerger la membrane de nitrocellulose dans du lait écrémé à 5 % dans du PBS pendant 30 minutes pour bloquer les surfaces inoccupées. Incuber les transferts de protéines à température ambiante pendant 2 h avec l’antisérum polyclonal de lapin M. pneumoniae (produit à l’Institut Pasteur de Tunis) dilué à 1/200 dans du PBS-Tween 20, puis avec des IgG anti-lapin conjuguées à la peroxydase de raifort (HRP) diluées à 1/2 000 dans PBS-Tween 20 pendant 1 h à température ambiante.
    4. Laver les anticorps non liés avec du PBS et obtenir les résultats en exposant la feuille de nitrocellulose à la solution de substrat (4-chloro-1-naphtol,H2O2). Arrêtez la réaction en ajoutant de l’eau après 5-15 min.
  4. Procédure d’adsorption
    NOTE: Pour éliminer les réactions croisées entre l’antisérum polyclonal M. pneumoniae et les antigènes de bactéries hétérologues, la procédure d’adsorption précédemment décrite par Ben Abdelmoumen et Roy24 est utilisée.
    1. Préparer un pool d’antigènes des 12 bactéries hétérologues (suspectées de partager des antigènes avec M. pneumoniae), le mélanger dans un tube de microcentrifugation et ajuster la concentration en protéines correspondant à la moitié de l’antisérum à adsorber dans l’expérience.
      NOTE: Le volume et la concentration varient entre les différents essais. Cette étape dépend principalement de la concentration de l’anticorps à adsorber. Par exemple, si la concentration d’anticorps = 3,56 mg/mL, la concentration du pool d’antigènes (composé des 12 bactéries hétérologues) devrait être de 1,78 mg/mL (donc environ 0,148 mg de chaque antigène).
    2. Centrifuger le mélange d’antigènes à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C, recueillir la pastille groupée et l’incuber avec les IgG polyclonales purifiées anti-M. pneumoniae pendant 2 h à 37 °C avec agitation lente.
    3. Après incubation, centrifuger la suspension à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C et récupérer le surnageant (qui correspond au polyclonal spécifique M . pneumoniae antisérum).
      NOTE: Pour assurer la spécificité de l’antisérum polyclonal M. pneumoniae , répétez la procédure d’adsorption trois fois. Avant de pouvoir être utilisé dans le test ELISA, l’antisérum polyclonal M. pneumoniae adsorbé doit être testé par immunoblot pour l’absence de réactions croisées contre l’ensemble de bactéries inclus.

2. Étapes ELISA : le test lui-même

  1. Revêtement de microplaques avec l’anticorps de capture
    1. Diluer l’anticorps de capture (antisérum polyclonal pré-adsorbé par M. pneumoniae ) à une concentration de 10 μg/mL dans un tampon carbonate-bicarbonate 0,1 M (pH 9,6).
    2. Enduire la plaque ELISA de 96 puits en ajoutant 100 μL d’anticorps de capture dilué à chaque puits.
    3. Après une nuit d’incubation à 4 °C, retirer la solution d’enrobage et laver la plaque cinq fois avec le tampon de lavage (composition [par L]: 146,29 g de NaCl, 39,4 g de Tris-HCl, 0,2 g de Thimérosal et 0,5 mL de Tween 20; pH 7,3).
  2. Bloquant
    1. Bloquer les surfaces de liaison restantes des puits revêtus en ajoutant 100 μL de solution de blocage (0,5 % de caséine dans PBS) à chaque puits.
    2. Incuber pendant 1 h à température ambiante.
    3. Retirez la solution bloquante à l’aide d’une pipette et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
  3. Application de l’antigène
    1. Ajouter une quantité égale de protéines entières de M. pneumoniae à tous les puits enrobés (10 ng/puits).
    2. Laisser la réaction se produire pendant 2 h à température ambiante.
    3. Retirez l’excès de solution antigénique et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
  4. Application des échantillons d’essai et des témoins
    1. Diluer les échantillons d’essai (sérums humains) et les témoins (sérums de référence positifs et négatifs) à 1/200, 1/400 et 1/800 dans PBS-Tween 20.
    2. Ajouter 100 μL des échantillons dilués et des témoins dans les puits appropriés. Effectuez chaque réaction en double. Marquez les puits ne contenant ni antigène ni sérum comme étant vides.
    3. Après avoir incubé la plaque pendant 90 min à température ambiante, retirez les solutions de sérum et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
  5. Application de l’anticorps de détection conjugué enzymatique
    1. Diluer les anticorps de détection conjugués enzymatiques, l’anticorps anti-lapin conjugué HRP et les IgG anti-humains à 1/10 000 dans PBS-Tween 20.
    2. Pipeter 100 μL de l’anticorps de détection dilué de manière appropriée à chaque puits.
    3. Après avoir incubé la plaque pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité, retirez les anticorps de détection non liés et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
  6. Détection et analyse des données
    1. Ajouter 100 μL de la solution chromogène 3,3', 5,5' tétraméthylbenzidine (TMB) pour visualiser la liaison antigène-anticorps.
    2. Laisser la plaque se développer pendant 30 min à température ambiante puis ajouter 100 μL de la solution stop (7,5%H2SO4) pour arrêter la réaction enzymatique.
    3. Lire l’absorbance à une longueur d’onde de 450 nm à l’aide du lecteur de microplaques et trier les résultats en fonction du calcul de l’indice de positivité (IP).
      IP = Absorbance du sérum testé / Absorbance du seuil
      IP < 0.7 : Résultat négatif
      IP = 0,7 : Le test doit être répété dans les 2 semaines
      IP > 0.7 : Résultat positif
      REMARQUE: La formule IP est conçue en laboratoire et la valeur 0.7 est configurée après optimisation. Pour les réactions en double, la valeur moyenne de l’absorbance est calculée. La dilution sérique optimale et la concentration d’antigène sont établies par la méthode de titrage en damier ELISA (données non présentées). Valeur seuil = DO (densité optique) d’un sérum positif de référence (dilué à la même dilution que l’échantillon). Cette DO doit être au moins trois fois supérieure à la valeur OD du témoin négatif.

3. Étapes post-ELISA : évaluation des résultats et validation des tests

  1. La capacité du test ELISA interne à diagnostiquer spécifiquement l’infection à M. pneumoniae chez les patients testés est évaluée par immunoblots supplémentaires utilisant des antigènes de M. pneumoniae et des bactéries hétérologues pour confirmer la positivité des sérums humains testés dans les anticorps de M. pneumoniae et leur négativité dans les autres bactéries suspectées (données non présentées).

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Representative Results

L’activité immunoblotting de l’antisérum polyclonal non adsorbé Mycoplasma pneumoniae contre les bactéries hétérologues
La réactivité croisée existe bel et bien comme le montrent les résultats de l’immunoblot (Figure 2) et par rapport au témoin positif (Lane 1), certains des antigènes de M. pneumoniae sont partagés avec les bactéries dépistées. L’intensité de ces réactions croisées était variable. Par exemple, les antigènes de M. gallisepticum et de M. imitans ont montré la plus forte réactivité avec l’antisérum M. pneumoniae (Lanes 9 et 10), en plus d’être des mycoplasmes aviaires. À l’opposé, aucun des deux isolats cliniques humains d’Ureaplasma urealyticum n’a montré de réactivité (voies 7 et 8). Cependant, les antigènes des espèces génitales restantes de Mycoplasma humain M. hominis, M. fermentans et M. genitalium ont produit des réactions croisées considérables avec l’antisérum M. pneumoniae (Lanes 11, 12 et 13, respectivement). Escherichia coli (Lane 2), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) et Klebsiella pneumoniae (Lane 6) ont également réagi avec des anticorps polyclonaux de M. pneumoniae , et leur profil antigénique était très similaire. Ce profil était légèrement différent de celui des deux espèces de bactéries cocci Streptococcus pneumoniae et Staphylococcusaureus; la réactivité était moindre avec S. pneumoniae (Lane 3) et encore moindre avec S. aureus (Lane 5).

Spécificité des anticorps de Mycoplasma pneumoniae garantie par la procédure d’adsorption
Après adsorption de l’antisérum polyclonal M. pneumoniae contre les antigènes bactériens hétérologues, la spécificité a été testée par immunoblot (Figure 3). À l’exception de certaines protéines de l’antigène de M. pneumoniae révélées dans la voie 1 (témoin positif), les autres antigènes n’ont presque pas été détectés (voies 2-13). Les protéines révélées dans la voie 1 sont en fait les protéines spécifiques détectées par les anticorps spécifiques de M. pneumoniae restant après l’adsorption. Sur la base de ce résultat, l’efficacité de la procédure d’adsorption a été prouvée, puisque les réactions non spécifiques rencontrées de l’antisérum polyclonal M. pneumoniae avec les antigènes hétérologues, décrites ci-dessus, ont été éliminées. L’antisérum de M. pneumoniae rendu spécifique a ensuite été utilisé dans tous les tests sérologiques et immunoblotting ultérieurs.

ELISA à l’antigène de capture : Essai valide pour l’activité sérodiagnostique de routine en laboratoire
Étant donné que tous les sérums ont été testés dans des puits en double pour les différentes dilutions, les valeurs moyennes de DO ont été calculées et un graphique à barres corrélant ces valeurs d’absorbance à leurs dilutions sériques correspondantes a été tracé (figure 4). Sur la base du calcul de la PI, l’ensemble de sérums humains testés et présentés dans cet article s’est avéré positif pour les IgG de M. pneumoniae. Plusieurs autres ensembles de sérums ont également été testés à l’aide de cet ELISA maison, et à chaque fois, le test s’est avéré efficace pour détecter spécifiquement les IgG de M. pneumoniae et ainsi distinguer les patients infectés par M. pneumoniae de ceux non infectés (données non présentées).

Les résultats ELISA ont toujours été confirmés par plusieurs analyses immunoblot montrant simultanément la positivité chez M. pneumoniae et la négativité dans toutes les autres bactéries de tout sérum testé positif par l’antigène de capture interne M. pneumoniae ELISA (données non présentées).

Figure 1
Figure 1 : Présentation schématique de l’ELISA de capture d’antigènes développé en laboratoire pour la détection spécifique des IgG de Mycoplasma pneumoniae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse immunoblot des réactions croisées entre Mycoplasma pneumoniae et un ensemble de bactéries hétérologues. La réactivité de l’antisérum polyclonal non adsorbé de M. pneumoniae a été testée contre les antigènes d’Escherichia coli (Lane 2), Streptococcus pneumoniae (Lane 3), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4), Staphylococcus aureus (Lane 5), Klebsiella pneumoniae (Lane 6), deux isolats d’Ureaplasma urealyticum (Lanes 7 et 8), M. imitans (Lane 9), M. gallisepticum (Lane 10), M. hominis (Lane 11), M. fermentans (Lane 12) et M. genitalium (Lane 13). Lane 1 : M. pneumoniae (témoin positif). Les masses moléculaires de certaines protéines majeures de M. pneumoniae ont été données à gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Confirmation par immunotransfert de l’efficacité de la procédure d’adsorption pour éliminer les réactions croisées. Réactivité de toutes les bactéries hétérologues sélectionnées; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, deux isolats d’Ureaplasma urealyticum, M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans et M. genitalium (Lanes 2-13, respectivement) ont été testés contre l’antisérum polyclonal M. pneumoniae adsorbé. L’antigène de M. pneumoniae a été chargé dans la voie 1 en tant que témoin positif (seules des protéines spécifiques ont été révélées). Lane MW : échelle protéique pré-colorée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats de l’ELISA sur la capture de l’antigène. Le test ELISA a été réalisé en utilisant l’antisérum polyclonal adsorbé de Mycoplasma pneumoniae comme agent d’enrobage. Les diagrammes à barres 1 et 2 représentent respectivement les témoins négatifs et positifs. Les diagrammes à barres 3 à 13 représentent les sérums d’un groupe de patients testés. Chaque sérum a été testé à trois dilutions différentes : 1/200 (barres violettes), 1/400 (barres orange) et 1/800 (barres bleues). Les valeurs OD ont servi à calculer l’indice de positivité. Chaque réaction a été réalisée en double. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Micro-organisme Filtrer* Douleur moyenne Référence
Espèces de mycoplasmes et d’ureaplasma Mycoplasma pneumoniae ATCC 160 20030 SP4 [35]
Mycoplasma genitalium CIP 103767T SP4
Mycoplasma fermentans ATCC 160 20026 SP4
Mycoplasma hominis CIP 103715T SP4 complété par de l’arginine
Ureaplasma urealyticum 2 isolats cliniques** SP4 supplémenté en urée
Mycoplasma gallisepticum CIP S6 15302 Frey [36]
Mycoplasma imitans ATCC 160 20037 Frey
Autres bactéries Escherichia coli ATCC 25922 Bouillon LB [37]
Klebsiella pneumoniae Isolat clinique*** Bouillon LB
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bouillon LB
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bouillon LB
Streptococcus pneumoniae Isolat clinique*** Bouillon de sang
* ATCC : American Type Culture Collection, CIP : Collection Institut Pasteur
** Les isolats ont été prélevés sur des échantillons cliniques expédiés volontairement au Laboratoire des Mycoplasmes (Institut Pasteur de Tunis) pour diagnostic de routine
Des isolats ont été prélevés sur des échantillons cliniques expédiés volontairement au Laboratoire de Bactériologie (Institut Pasteur de Tunis) pour diagnostic de routine

Tableau 1 : Liste des souches bactériennes utilisées dans cette étude.

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Discussion

Cet article présente une description générale d’un test ELISA interne principalement développé pour assurer un dépistage spécifique des M. pneumoniae Infection. Les détails sur le protocole du test ELISA lui-même ainsi que certaines étapes de pré et de post-traitement sont fournis. La spécificité de ce dosage est assurée par la technique d’adsorption. Cette procédure a déjà été décrite dans des tests ELISA développés pour le diagnostic des humains et des oiseaux. Mycoplasmas17,24. Il a également été utilisé dans les tests ELISA pour le diagnostic d’autres infections bactériennes telles que la maladie de Lyme25. Dans ces trois articles, il a été prouvé que l’adsorption aidait à augmenter la spécificité ELISA sans scarifier ou diminuer la sensibilité17,24,25. Dans le cas du présent test ELISA, les espèces bactériennes appropriées sélectionnées pour l’adsorption peuvent être divisées en deux groupes : le premier groupe contient certaines espèces pathogènes de Mollicutes humaines et aviaires (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumet M. imitans), tandis que le second contient les bactéries les plus fréquentes connues pour infecter les humains (E. coli, P. aeruginosaet S. aureus) et ceux notoirement connus pour leur tropisme des voies respiratoires (K. pneumoniae et S. pneumoniae). La large sélection de bactéries hétérologues était basée sur le fait que le dogme de la spécificité des espèces et des organes n’est plus respecté. De nombreux rapports sur la détection de micro-organismes dans des habitats inconnus ont déjà été publiés. Par exemple M. pneumoniae a été isolé dans de nombreux sites extrapulmonaires et s’est avéré associé à une gamme variée de complications extrapulmonaires avec des symptômes légers à graves, bien qu’il ait été supposé être spécifique aux voies respiratoires6,7. Le cas inverse (isolement génital Mycoplasma des voies respiratoires) a été signalé pour M. hominis et M. fermentans26,27. L’inclusion de l’aviaire Mycoplasma dans le test de sérodiagnostic de l’infection humaine était basé sur des études antérieures rapportant la possibilité d’infection des humains (notamment les personnes immunodéprimées et les vétérinaires) avec Mycoplasma Les espèces du genre proviennent d’animaux domestiques28,29,30. Il est vrai que, jusqu’à présent, aucun article évoquant l’isolement des M. gallisepticum et M. imitans (les deux espèces incluses dans la procédure d’adsorption dans cet article) chez l’homme. Malgré cela, rien n’est impossible, d’autant plus que ces espèces sont parmi les plus régulièrement manipulées par les vétérinaires et sont phylogénétiquement trop proches de M. pneumoniae. En fait, ces deux oiseaux Mycoplasma ont montré la plus forte réactivité avec M. pneumoniae antisérum (comme illustré dans Graphique 2). Brièvement, lors de la conception de la procédure d’adsorption, un spectre relativement large de bactéries suspectes qui pourraient partager des antigènes avec M. pneumoniae a été incluse. Les choix faits étaient basés sur la parenté phylogénétique et le tropisme avec les voies respiratoires. Néanmoins, en raison de la diversité de la flore humaine et de la variabilité antigénique, il est impossible de prédire et d’inclure toutes les espèces et souches bactériennes hétérologues possibles qui pourraient réagir de manière croisée avec M. pneumoniae anticorps. Ainsi, la possibilité de réaction croisée entre M. pneumoniae L’antisérum, même après adsorption, et d’autres bactéries restent probables. De plus, depuis M. pneumoniae est communément connu pour infecter les enfants et les jeunes adultes, la procédure d’adsorption peut être encore améliorée à l’avenir par l’ajout d’autres pathogènes respiratoires pédiatriques tels que Haemophilus influenzae31 et Streptococcus pyogenes32 dans la liste restreinte des bactéries d’adsorption.

Le but de ce test ELISA est de détecter la présence de l’anticorps cible (M. pneumoniae-IgG spécifique) dans les sérums humains. Ainsi, pour pouvoir à la fois utiliser le sérum comme échantillon (puisqu’il est le plus facile à prélever et le moins douloureux pour les patients) et pour assurer la spécificité, l’ELISA interne repose sur le principe de deux types ELISA : ELISA indirect et sandwich. L’échantillon de sérum (anticorps primaire) est lié entre l’anticorps de détection (second anticorps marqué) et l’antigène de capture, qui était spécifiquement lié à l’anticorps de capture (préalablement rendu spécifique par adsorption et immobilisé sur la surface de la microplaque). Compte tenu de ces caractéristiques uniques, on pense que ce test ELISA est efficace et spécial. Néanmoins, ce test n’est pas parfait et des problèmes peuvent survenir. Des résultats faussement positifs et faux négatifs peuvent encore être rencontrés, parfois en raison de la qualité du sérum ou de la phase d’infection, et parfois en raison d’erreurs lors de l’application du protocole en laboratoire. Par exemple, les résultats du sérodiagnostic ELISA peuvent être affectés même si les puits ne sont pas suffisamment lavés. En outre, l’incubation (température et temps) pourrait influencer les résultats du test. La sélection des microplaques et des agents bloquants a également été signalée comme une étape critique du développement d’ELISA33,34. Pour toutes ces raisons, il est important de travailler continuellement à l’amélioration de ce test ELISA afin de déterminer les paramètres et les conditions optimaux, tels que la dilution des différents anticorps (échantillons de sérum, anticorps de capture, détection d’anticorps), les étapes d’incubation et de lavage, et l’inclusion des témoins négatifs et positifs appropriés.

La culture de bactéries et la production de leurs antigènes pour effectuer la procédure d’adsorption pourraient être considérées comme une étape lourde, en particulier pour les espèces de Mollicutes. Néanmoins, on pense que cela est important car cette étape contribue grandement à renforcer la spécificité ELISA et à éviter d’autres tests de confirmation tels que l’immunoblot ou la PCR. De plus, dans le contexte de l’infection à M. pneumoniae, un diagnostic efficace et fiable est absolument nécessaire pour établir une antibiothérapie adéquate et appropriée, car l’utilisation de médicaments bêta-lactamines dans le traitement de la pneumonie acquise dans la communauté est inefficace contre M. pneumoniae8. Après des années d’utilisation dans l’activité diagnostique de routine en laboratoire, on pense que l’ELISA de capture d’antigène, décrite dans cet article, représente un outil valide pour le dépistage spécifique de l’infection à M. pneumoniae.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par le ministère tunisien de la Santé et le ministère tunisien de l’Enseignement supérieur et de la Recherche scientifique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

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Biologie numéro 192
DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE DE CAPTURE D’ANTIGÈNE POUR LA DÉTECTION SPÉCIFIQUE DE <em>MYCOPLASMA PNEUMONIAE</em>
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Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

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