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Biology

Ensaio de imunoadsorção enzimática de captura de antígenos para detecção específica de Mycoplasma pneumoniae

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

Na infecção por Mycoplasma pneumoniae, os exames de sorologia podem gerar bons resultados, porém com baixa especificidade devido à reação cruzada imunológica. O ELISA interno de captura de antígenos, descrito neste artigo, garante alta especificidade de espécies e tem se mostrado um teste de triagem confiável para o diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Abstract

O Mycoplasma pneumoniae é um procariota deficiente em parede celular, conhecido principalmente por colonizar o trato respiratório humano e ser endêmico, com picos epidêmicos a cada 6 anos, em crianças mais velhas e adultos jovens. O diagnóstico de M. pneumoniae é um desafio devido à natureza fastidiosa do patógeno e à possibilidade de transporte assintomático. O diagnóstico laboratorial da infecção por M. pneumoniae com base na titulação de anticorpos nas amostras de soro dos pacientes continua sendo o método mais praticado. Devido ao potencial problema de reatividade cruzada imunológica com o uso de soro policlonal para M. pneumoniae, um ensaio imunoenzimático de captura de antígenos (ELISA) foi desenvolvido para melhorar a especificidade do diagnóstico sorológico. As placas ELISA são revestidas com anticorpos policlonais de M. pneumoniae, criadas em coelhos e tornadas específicas após adsorção contra um painel de bactérias heterólogas que compartilham antígenos com espécies de M. pneumoniae e/ou são conhecidas por colonizar o trato respiratório. Os antígenos homólogos de M. pneumoniae reagidos são então especificamente reconhecidos por seus anticorpos correspondentes nas amostras de soro. Uma otimização adicional dos parâmetros físico-químicos aos quais o ELISA de captura de antígeno é submetido levou a um ELISA altamente específico, sensível e reprodutível.

Introduction

Os micoplasmas estão entre os menores e mais simples procariontes conhecidos. Eles se distinguem principalmente de outras bactérias pela falta de uma estrutura de parede celular. Assim, os Mycoplasmas foram classificados em uma classe separada denominada Mollicutes1. A deficiência da parede celular confere resistência intrínseca a esses microrganismos contra alguns agentes antimicrobianos e é em grande parte responsável pelo seu polimorfismo. Os micoplasmas têm genoma pequeno e tamanho reduzido, o que limita suas capacidades metabólicas e biossintéticas e explica sua natureza parasitária e saprófita1.

O Mycoplasma pneumoniae é um dos Mycoplasmas que infectam o homem e acredita-se que seja o mais virulento2. M. pneumoniae coloniza o trato respiratório superior, levando a pneumonia atípica em crianças e adultos jovens. Os sinais clínicos engendrados pela infecção por M. pneumoniae são gripais, com cefaleia, febre e tosse3. A ciaderência de M. pneumoniae às células hospedeiras é mediada por uma organela de fixação que inclui a adesão maior de P1 e várias proteínas acessórias 4,5. Mais manifestações clínicas podem ocorrer devido à inflamação local e estimulação do sistema imunológico do hospedeiro resultante da adesão íntima de M. pneumoniae à mucosa das vias aéreas6. Embora a pneumonia seja uma característica da infecção por M. pneumoniae, tem sido revelado que a infecção por essa bactéria também pode ser responsável por um amplo espectro de manifestações não pulmonares em diferentes locais anatômicos, como sistema nervoso central, coração, pele e articulações7.

Como para todas as espécies de Mycoplasma, o diagnóstico de M. pneumoniae é desafiador. Os sinais clínicos que evocam micoplasmose são, em sua maioria, inaparentes e não característicos8. Como é muito difícil diagnosticar a infecção por M. pneumoniae baseando-se apenas em manifestações e sintomas clínicos, o rastreamento laboratorial é de particular interesse9. A detecção de colônias de M. pneumoniae por cultura é o método padrão-ouro para um diagnóstico adequado. No entanto, as necessidades de crescimento exigente e o longo tempo necessário para a entrega de resultados definitivos (1-2 semanas) complicam a cultura e, portanto, significam que ela raramente é usada para o diagnóstico de rotina10. As tecnologias de amplificação de ácido nucleico foram validadas em termos de velocidade e eficiência, embora devido ao seu custo relativamente alto e indisponibilidade em algumas unidades de saúde, essas técnicas moleculares não sejam consideradas testes diagnósticos de primeira linha. É verdade que os testes PCR comerciais são amplamente utilizados para diagnosticar infecções por M. pneumoniae, mas ainda não podem substituir a sorologia. Além disso, a ocorrência frequente de resultados falsos negativos e falsos positivos limitou o uso da PCR9. Rotineiramente, a sorologia continua sendo a mais praticada em laboratórios para o diagnóstico da infecção por M. pneumoniae. Várias abordagens sorológicas têm sido relatadas há décadas, como hemaglutininas frias, teste de fixação do complemento 11, teste de hemaglutinação indireta12, imunofluorescência 13 e a tecnologia ELISA, que foi aplicada pela primeira vez à sorologia para micoplasma no início da década de 198014,15,16. Um dos principais problemas encontrados ao realizar o sorodiagnóstico por ELISA da infecção por M. pneumoniae são as reações cruzadas, o que reduz consideravelmente a especificidade da técnica. A adsorção inespecífica de soros humanos com antígenos de M. pneumoniae foi previamente relatada; de fato, muitos dos anticorpos detectados pelo ELISA em soros humanos podem nem sempre estar ligados a antígenos micoplasmáticos 17, devido à semelhança de M. pneumoniae com algumas bactérias18,19 e alguns tecidos animais e humanos20.

Devido às altas leituras de fundo observadas no teste ELISA convencional que foi praticado em laboratório, a interpretação dos resultados foi muitas vezes complicada e, portanto, a entrega de um diagnóstico adequado de M. pneumoniae foi uma tarefa difícil. Ao enfrentar esse problema, optamos por melhorar o ELISA de M. pneumoniae removendo reações inespecíficas de antígenos de M. pneumoniae com anticorpos a serem testados . Para tanto, foi trabalhada a depleção seletiva dos antígenos inespecíficos de M. pneumoniae utilizando a técnica de adsorção. De fato, o principal objetivo do ELISA de captura de antígeno é detectar especificamente a imunoglobulina (Ig) G de M. pneumoniae em amostras de soro humano. O conceito deste ELISA consiste principalmente na captura seletiva de antígenos específicos de M. pneumoniae, antes da adição das amostras de soro humano. Esta seletividade é assegurada pela incubação do antígeno bruto de M. pneumoniae com um antissoro policlonal de M. pneumoniae, produzido em coelhos em laboratório e tornando-o espécie-específico por adsorção contra um painel de bactérias heterólogas, pertencentes ou não à classe Mollicus, compartilhando antígenos com M. pneumoniae espécies e/ou conhecidas por colonizar o trato respiratório. O procedimento de adsorção foi repetido três vezes, e sua eficiência para eliminar a reatividade cruzada foi testada por immunoblotting. O ensaio ELISA desenvolvido é uma combinação de sanduíche e ELISA indireto. Resumidamente, os poços da placa ELISA são primeiro revestidos com um antissoro policlonal específico para M. pneumoniae. Em seguida, o antígeno de M. pneumoniae é adicionado e preso entre o antissoro e os anticorpos presentes na amostra de soro a ser testada. O complexo imunológico formado é detectado por um anticorpo conjugado enzimático secundário (IgG conjugada com peroxidase). As reações são visualizadas pela adição de substrato cromogênico, e a absorbância é medida espectrofotometricamente. Esse ELISA interno é apresentado esquematicamente na Figura 1. O ELISA caseiro mostrou-se eficiente na detecção específica da infecção por M. pneumoniae e é atualmente um dos testes mais praticados na atividade diagnóstica de rotina.

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Protocol

O presente estudo foi realizado em conformidade com os aspectos éticos estabelecidos pelo comitê de ética do Instituto Pasteur de Túnis.

1. Etapas pré-ELISA: Pré-requisitos e pré-processamento

  1. Cepas bacterianas e meios de crescimento
    NOTA: As espécies de Mollicutes e as bactérias muradas utilizadas no presente estudo e seus meios de crescimento estão listados na Tabela 1.
    1. Crescimento de espécies de Mollicutes
      1. Inocular 200 μL do estoque de glicerol de cada espécie em 1.800 μL do meio.
      2. Cultivar espécies de Mollicutes estaticamente a 37 °C com 5% de CO 2 por2-4 dias até que uma mudança de pH seja observada (o indicador de pH é vermelho de fenol).
      3. Aumente as culturas para 10 mL adicionando uma diluição de 1/10da cultura ao meio e permita que elas cresçam novamente nas mesmas condições.
        NOTA: De acordo com o metabolismo, algumas espécies humanas de Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium e M. fermentans) acidificam o meio devido à fermentação da glicose, e algumas outras (M. hominis e Ureaplasma) alcalinizam o meio por hidrólise de arginina ou hidrólise de ureia, respectivamente. Em relação aos micoplasmas aviários, a acidificação do meio de Frey demonstra a presença de M. gallisepticum, enquanto sua alcalinização comprova o crescimento de M. imitans.
      4. Espalhe 50 μL das culturas em placas de ágar para confirmar o crescimento das bactérias. Manter as placas de ágar a 37 °C com 5% de CO2 e observá-las regularmente ao microscópio para o aparecimento de colónias típicas de ovos fritos (Mycoplasmas) e colónias semelhantes a ouriços escuros (Ureaplasmas).
    2. Crescimento de espécies não-Mollicutes
      1. Cultivar as bactérias não-Mollicutes em 3 mL do meio a 37 °C durante a noite (agitação a 200 rpm).
      2. Compare a turbidez das culturas com os meios de controle para confirmar o crescimento.
      3. Aumente as culturas para 10 mL adicionando uma diluição de 1/100da cultura ao meio e permita que elas cresçam novamente nas mesmas condições.
  2. Preparação de antígenos
    1. Preparação de antígenos de espécies de Mollicutes
      1. Colher as proteínas inteiras (presentes em culturas confirmadas de M. pneumoniae e das outras espécies de Mollicutes) por centrifugação a 40.000 x g a 4 °C durante 30 min.
      2. Descarte o sobrenadante e lave os pellets três vezes com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS, pH 7,4) por uma série de três centrifugações com as mesmas condições.
      3. Ressuspender cada antígeno em 500 μL de PBS.
    2. Preparação de antígenos de espécies não-Mollicutes
      1. Centrifugar as culturas cultivadas durante a noite das bactérias não-Mollicutes a 1.500 x g por 15 min.
      2. Ressuscite cada pellet bacteriano em 500 μL de PBS.
        NOTA: A concentração de proteína é determinada usando o método clássico de quantificação de Bradford com albumina sérica bovina como padrão21. A concentração de proteína das espécies de Mollicutes geralmente varia entre 0,7-4,8 mg/mL. Para as demais espécies bacterianas, a concentração de proteína pode chegar a 20 mg/mL. Todos os antigénios são armazenados a -20 °C até à sua utilização subsequente.
  3. Rastreio de reatividade cruzada por immunoblotting
    1. Desnaturar as proteínas bacterianas misturando 8 μL de cada antígeno com um volume igual de tampão de amostra (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% de glicerol [v/v], 10% de SDS [p/v] e 0,2% de azul de bromofenol), incubar a mistura a 100 °C por 5 min.
      NOTA: A desnaturação é realizada para cobrir as proteínas com carga negativa e quebrar suas estruturas secundárias, o que lhes permite atravessar o gel de poliacrilamida e ser separados de acordo com seus pesos moleculares.
    2. Submeter as proteínas desnaturadas (100 μg de proteína/poço) à eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) pelo método de Laemmli 22 com gel separador a12 % e gel empilhador a 5%. Em seguida, transferir as proteínas eletroforeticamente para a membrana de nitrocelulose pelo método de Towbin et al.23.
    3. Mergulhe a membrana de nitrocelulose em leite desnatado a 5% em PBS por 30 min para bloquear as superfícies desocupadas. Incubar as manchas de proteína à temperatura ambiente durante 2 h com antissoro policlonal de coelho M. pneumoniae (produzido no Instituto Pasteur de Tunes) diluído a 1/200 em PBS-Tween 20, depois com IgG anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano (HRP) diluída a 1/2.000 em PBS-Tween 20 durante 1 h à temperatura ambiente.
    4. Lavar os anticorpos não ligados com PBS e obter os resultados expondo a folha de nitrocelulose à solução de substrato (4-cloro-1-naftol, H 2 O2). Pare a reação adicionando água após 5-15 min.
  4. Procedimento de adsorção
    NOTA: Para eliminar as reações cruzadas entre o antissoro policlonal de M. pneumoniae e antígenos de bactérias heterólogas, o procedimento de adsorção descrito anteriormente por Ben Abdelmoumen e Roy24 é empregado.
    1. Preparar um pool de antígenos das 12 bactérias heterólogas (suspeitas de compartilhar antígenos com M. pneumoniae), misturá-lo em um tubo de microcentrífuga e ajustar a concentração de proteína correspondente à metade do antissoro a ser adsorvido no experimento.
      NOTA: O volume e a concentração variam entre os diferentes ensaios. Esta etapa depende principalmente da concentração do anticorpo a ser adsorvido. Por exemplo, se a concentração de anticorpos = 3,56 mg/mL, a concentração do pool de antígenos (composto pelas 12 bactérias heterólogas) deve ser de 1,78 mg/mL (portanto, aproximadamente 0,148 mg de cada antígeno).
    2. Centrifugar a mistura de antigénios a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C, recolher o pellet agrupado e incubá-lo com a IgG policlonal purificada anti-M. pneumoniae durante 2 h a 37 °C com agitação lenta.
    3. Após a incubação, centrifugar a suspensão a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C e recuperar o sobrenadante (que corresponde ao antissoro policlonal específico de M. pneumoniae ).
      NOTA: Para garantir a especificidade do antissoro policlonal de M. pneumoniae , repita o procedimento de adsorção três vezes. Antes de poder ser usado no ensaio ELISA, o antissoro policlonal adsorvido de M. pneumoniae deve ser testado por imunoblotting para a ausência de reações cruzadas contra o conjunto incluído de bactérias.

2. Etapas ELISA: O ensaio em si

  1. Revestimento de microplacas com o anticorpo de captura
    1. Diluir o anticorpo de captura (antissoro policlonal pré-adsorvido de M. pneumoniae ) até uma concentração de 10 μg/mL em tampão carbonato-bicarbonato 0,1 M (pH 9,6).
    2. Revestir a placa ELISA de 96 poços adicionando 100 μL do anticorpo de captura diluído a cada poço.
    3. Após incubação durante a noite a 4 °C, retirar a solução de revestimento e lavar a placa cinco vezes com o tampão de lavagem (composição [por L]: 146,29 g de NaCl, 39,4 g de Tris-HCl, 0,2 g de timerosal e 0,5 mL de Tween 20; pH 7,3).
  2. Bloqueio
    1. Bloquear as superfícies de ligação restantes dos poços revestidos adicionando 100 μL da solução de bloqueio (0,5% de caseína em PBS) a cada poço.
    2. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
    3. Retire a solução de bloqueio com uma pipeta e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
  3. Aplicação do antigénio
    1. Adicione uma quantidade igual de proteínas inteiras de M. pneumoniae a todos os poços revestidos (10 ng / poço).
    2. Deixe a reação ocorrer por 2 h à temperatura ambiente.
    3. Retire o excesso da solução antigénica e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
  4. Aplicação das amostras de ensaio e dos controlos
    1. Diluir as amostras de ensaio (soros humanos) e os controlos (soros positivos e negativos de referência) para 1/200, 1/400 e 1/800 em PBS-Tween 20.
    2. Adicionar 100 μL das amostras diluídas e dos controlos aos poços adequados. Realize cada reação em duplicata. Marque os poços que não contêm antígeno nem soros como em branco.
    3. Depois de incubar a placa por 90 min à temperatura ambiente, remova as soluções séricas e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
  5. Aplicação do anticorpo de detecção conjugado enzimático
    1. Diluir os anticorpos de detecção conjugados enzimáticos, anticoelho conjugado com HRP e IgG anti-humana para 1/10.000 em PBS-Tween 20.
    2. Pipetar 100 μL do anticorpo de detecção adequadamente diluído para cada poço.
    3. Depois de incubar a placa por 1 h à temperatura ambiente no escuro, remova os anticorpos de detecção não ligados e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
  6. Detecção e análise de dados
    1. Adicionar 100 μL da solução cromogénica Tetrametil-benzidina (TMB) de 3,3', 5,5' para visualizar a ligação antígeno-anticorpo.
    2. Deixar que a placa se desenvolva durante 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar 100 μL da solução de paragem (7,5% H2SO4) para parar a reacção enzimática.
    3. Leia a absorbância no comprimento de onda de 450 nm usando o leitor de microplacas e classifique os resultados com base no cálculo do índice de positividade (IP).
      IP = Absorvância do soro ensaiado / Absorvância do ponto de corte
      IP < 0.7: Resultado negativo
      IP = 0,7: O teste deve ser repetido dentro de 2 semanas
      IP > 0.7: Resultado positivo
      Observação : A fórmula IP é concebida no laboratório e o valor 0,7 é configurado após a otimização. Para reações duplicadas, calcula-se o valor médio da absorbância. A diluição sérica óptima e a concentração de antigénios são estabelecidas pelo método de titulação do tabuleiro de xadrez ELISA (dados não apresentados). Valor de corte = OD (densidade óptica) de um soro positivo de referência (diluído na mesma diluição que a amostra). Essa OD deve ser pelo menos três vezes maior do que o valor OD do controle negativo.

3. Etapas pós-ELISA: Avaliação dos resultados e validação do teste

  1. A capacidade do ELISA interno de diagnosticar especificamente a infecção por M. pneumoniae nos pacientes testados é avaliada por meio de imunoblots suplementares usando antígenos de M. pneumoniae e bactérias heterólogas para confirmar a positividade dos soros humanos testados em anticorpos contra M. pneumoniae e sua negatividade nas outras bactérias suspeitas (dados não mostrados).

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Representative Results

A atividade imunoblotting do antissoro policlonal não adsorvido Mycoplasma pneumoniae a bactérias heterólogas
A reatividade cruzada de fato existe, como mostrado nos resultados do immunoblotting (Figura 2) e, em comparação com o controle positivo (Lane 1), alguns dos antígenos de M. pneumoniae são compartilhados com as bactérias rastreadas. A intensidade dessas reações cruzadas foi variável. Por exemplo, os antígenos de M . gallisepticum e M. imitans apresentaram a maior reatividade com o antissoro de M. pneumoniae (Faixas 9 e 10), além de serem micoplasmas aviários. Em oposição, nenhum dos dois isolados clínicos humanos de Ureaplasma urealyticum apresentou qualquer reatividade (Faixas 7 e 8). No entanto, antígenos das espécies restantes de Mycoplasma humano M. hominis, M. fermentans e M. genitalium produziram reações cruzadas consideráveis com M. pneumoniae antiserum (Lanes 11, 12 e 13, respectivamente). Escherichia coli (Faixa 2), Pseudomonas aeruginosa (Faixa 4) e Klebsiella pneumoniae (Faixa 6) também reagiram com anticorpos policlonais M. pneumoniae , e seu padrão de perfil antigênico foi muito semelhante. Esse perfil foi ligeiramente diferente dos das duas espécies de bactérias cocci Streptococcus pneumoniae e Staphylococcusaureus; a reatividade foi menor com S. pneumoniae (Pista 3) e ainda menor com S.aureus (Pista 5).

Especificidade dos anticorpos contra o Mycoplasma pneumoniae garantida pelo procedimento de adsorção
Após a adsorção do antissoro policlonal de M. pneumoniae contra os antígenos bacterianos heterólogos, a especificidade foi testada por imunoblotting (Figura 3). Além de algumas proteínas do antígeno de M. pneumoniae reveladas na Pista 1 (controle positivo), os outros antígenos foram quase completamente não detectados (Faixas 2-13). As proteínas reveladas na Pista 1 são, na verdade, as proteínas específicas detectadas pelos anticorpos específicos de M. pneumoniae remanescentes após a adsorção. Com base nesse resultado, comprovou-se a eficiência do procedimento de adsorção, uma vez que foram eliminadas as reações inespecíficas encontradas do antissoro policlonal de M. pneumoniae com os antígenos heterólogos, descritos acima. O antissoro de M. pneumoniae tornado específico foi então utilizado em todos os testes sorológicos e imunoblotting subsequentes.

ELISA do antígeno de captura: Ensaio válido para a atividade sorodiagnóstica laboratorial de rotina
Como todos os soros foram testados em poços duplicados para as diferentes diluições, os valores médios da DO foram calculados e um gráfico de barras correlacionando esses valores de absorbância com suas diluições séricas correspondentes foi plotado (Figura 4). Com base no cálculo da PI, o conjunto de soros humanos testados e apresentados neste trabalho mostrou-se positivo para a IgG de M. pneumoniae. Vários outros conjuntos de soro também foram testados usando este ELISA caseiro e, em cada momento, o ensaio mostrou-se eficiente em detectar especificamente a IgG de M. pneumoniae e, assim, distinguir os pacientes infectados por M. pneumoniae daqueles não infectados (dados não mostrados).

Os resultados do ELISA foram sempre confirmados por várias análises de immunoblot simultaneamente mostrando a positividade em M. pneumoniae e a negatividade em todas as outras bactérias de qualquer soro testado que fosse positivo pelo antígeno de captura interno M. pneumoniae ELISA (dados não mostrados).

Figure 1
Figura 1: Apresentação esquemática do ELISA de captura de antígeno desenvolvido em laboratório para detecção específica de IgG de Mycoplasma pneumoniae. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise imunoblot das reações cruzadas entre Mycoplasma pneumoniae e um conjunto de bactérias heterólogas. A reatividade do antissoro policlonal não adsorvido de M. pneumoniae foi testada contra antígenos de Escherichia coli (Lane 2), Streptococcus pneumoniae (Lane 3), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4), Staphylococcus aureus (Lane 5), Klebsiella pneumoniae (Lane 6), dois isolados de Ureaplasma urealyticum (Lanes 7 e 8), M. imitans (Lane 9), M. gallisepticum (Lane 10), M. hominis (Lane 11), M. fermentans (Faixa 12) e M. genitalium (Faixa 13). Faixa 1: M. pneumoniae (controle positivo). Pesos moleculares de algumas das principais proteínas de M. pneumoniae foram administrados à esquerda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Confirmação imunoblot da eficiência do procedimento de adsorção para eliminar reações cruzadas. Reatividade de todas as bactérias heterólogas selecionadas; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, dois isolados de Ureaplasma urealyticum , M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans e M. genitalium (Lanes 2-13, respectivamente) foram testados contra o antissoro policlonal adsorvido de M. pneumoniae. O antígeno de M. pneumoniae foi carregado na Faixa 1 como controle positivo (apenas proteínas específicas foram reveladas). Lane MW: escada proteica pré-corada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados do ELISA de captura de antígenos. O ELISA foi realizado utilizando-se o antissoro policlonal adsorvido Mycoplasma pneumoniae como agente de revestimento. Os gráficos de barras 1 e 2 representam controles negativos e positivos, respectivamente. Os gráficos de barras 3-13 retratam os soros de um grupo de pacientes testados. Cada soro foi testado em três diluições diferentes: 1/200 (barras roxas), 1/400 (barras laranja) e 1/800 (barras azuis). Os valores de DO serviram para calcular o índice de positividade. Cada reação foi realizada em duplicata. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Microrganismo Coar* Média Referência
Espécies de Mycoplasma e ureaplasma Mycoplasma pneumoniae ATCC 160 20030 SP4 (em inglês) [35]
Mycoplasma genitalium CIP 103767T SP4 (em inglês)
Mycoplasma fermentans ATCC 160 20026 SP4 (em inglês)
Mycoplasma hominis CIP 103715T SP4 suplementado com arginina
Ureaplasma urealyticum 2 isolados clínicos** SP4 suplementado com ureia
Mycoplasma gallisepticum CIP S6 15302 Frey [36]
Imitanas de micoplasma ATCC 160 20037 Frey
Outras bactérias Escherichia coli ATCC 25922 Caldo LB [37]
Klebsiella pneumoniae Isolado clínico*** Caldo LB
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Caldo LB
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Caldo LB
Streptococcus pneumoniae Isolado clínico*** Caldo de sangue
* ATCC: American Type Culture Collection, CIP: Coleção Institut Pasteur
** Os isolados foram coletados de amostras clínicas enviadas voluntariamente para o Laboratório de Micoplasmas (Instituto Pasteur de Túnis) para diagnóstico de rotina
Os isolados foram coletados de amostras clínicas enviadas voluntariamente para o Laboratório de Bacteriologia (Instituto Pasteur de Túnis) para diagnóstico de rotina

Tabela 1: Lista de cepas de bactérias utilizadas neste estudo.

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Discussion

Este artigo apresenta uma descrição geral de um ELISA interno desenvolvido principalmente para garantir a triagem específica de M. pneumoniae Infeção. Os detalhes sobre o protocolo do ensaio ELISA em si, bem como algumas etapas de pré e pós-processamento são fornecidos. A especificidade deste ensaio é assegurada pela técnica de adsorção. Este procedimento foi previamente descrito em testes ELISA desenvolvidos para o diagnóstico de humanos e aves Mycoplasmas17,24. Também foi empregado em ensaios ELISA para o diagnóstico de outras infecções bacterianas, como a doença de Lyme25. Nestes três artigos, a adsorção provou ajudar a aumentar a especificidade do ELISA sem escarificação ou diminuição da sensibilidade17,24,25. No caso do presente ensaio ELISA, as espécies de bactérias apropriadas selecionadas para adsorção podem ser divididas em dois grupos: o primeiro grupo contém algumas espécies patogênicas de Mollicutes humanas e aviárias (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticume M. imitans), enquanto o segundo contém as bactérias mais frequentes conhecidas por infectar seres humanos (E. coli, P. aeruginosae S. aureus) e aqueles notoriamente conhecidos por seu tropismo ao trato respiratório (K. pneumoniae e S. pneumoniae). A ampla seleção de bactérias heterólogas foi baseada no fato de que o dogma da especificidade das espécies e dos órgãos não é mais respeitado. Muitos relatórios sobre a detecção de microrganismos em habitats desconhecidos foram publicados anteriormente. Por exemplo M. pneumoniae foi isolado de muitos locais extrapulmonares e mostrou-se associado a uma gama variada de complicações extrapulmonares com sintomas leves a graves, embora tenha sido assumido que era específico do trato respiratório6,7. O caso oposto (isolamento genital Mycoplasma espécies do trato respiratório) foi sinalizado para M. hominis e M. fermentans26,27. A inclusão das aves Mycoplasma spp. no teste de sorodiagnóstico de infecção humana foi baseado em estudos anteriores que relataram a possibilidade de infecção de seres humanos (notavelmente pessoas imunocomprometidas e veterinários) com Mycoplasma spp. originárias de animais domésticos28,29,30. É verdade que, até agora, nenhum papel foi encontrado evocando o isolamento de M. gallisepticum e M. imitans (as duas espécies incluídas no procedimento de adsorção neste artigo) de seres humanos. Apesar disso, nada é impossível, especialmente porque essas espécies estão entre as espécies mais regularmente manuseadas por veterinários e são filogeneticamente muito próximas de M. pneumoniae. Na verdade, esses dois aviários Mycoplasma spp. mostraram a reatividade mais forte com M. pneumoniae antissoro (conforme ilustrado em Figura 2). Resumidamente, ao projetar o procedimento de adsorção, um espectro relativamente grande de bactérias suspeitas que poderiam compartilhar antígenos com M. pneumoniae foi incluído. As escolhas feitas foram baseadas na relação filogenética e tropismo com o trato respiratório. No entanto, devido à diversidade da flora humana e à variabilidade antigênica, é impossível prever e incluir todas as possíveis espécies e cepas bacterianas heterólogas que poderiam reagir cruzadamente com M. pneumoniae Anticorpos. Assim, a possibilidade de reação cruzada entre M. pneumoniae antissoro, mesmo após a adsorção, e outras bactérias permanecem prováveis. Além disso, uma vez que M. pneumoniae é comumente conhecido por infectar crianças e adultos jovens, o procedimento de adsorção pode ser melhorado no futuro pela adição de outros patógenos respiratórios pediátricos, como Haemophilus influenzae31 e Streptococcus pyogenes32 na lista restrita de bactérias de adsorção.

O objetivo deste ELISA é detectar a presença do anticorpo alvo (M. pneumoniae-IgG específico) nos soros humanos. Assim, para poder usar o soro como amostra (uma vez que é o mais fácil de coletar e o menos doloroso para os pacientes) e garantir a especificidade, o ELISA interno é baseado no princípio de dois tipos de ELISA: ELISA indireto e sanduíche. A amostra de soro (anticorpo primário) está ligada entre o anticorpo de detecção (segundo anticorpo marcado) e o antígeno de captura, que foi especificamente ligado ao anticorpo de captura (previamente tornado específico por adsorção e imobilizado na superfície da microplaca). Dadas estas características únicas, acredita-se que este ELISA é eficaz e especial. No entanto, este teste não é perfeito e podem ocorrer problemas. Resultados falsos positivos e falsos negativos ainda podem ser encontrados, às vezes por causa da qualidade do soro ou da fase de infecção, e às vezes por causa de erros durante a aplicação do protocolo no laboratório. Por exemplo, os resultados do sorodiagnóstico ELISA podem ser afetados mesmo que os poços não estejam suficientemente lavados. Além disso, a incubação (temperatura e tempo) pode influenciar os resultados do teste. A seleção de microplacas e agentes bloqueadores também foi relatada como uma etapa crítica durante o desenvolvimento do ELISA33,34. Por todas estas razões, é importante trabalhar continuamente para melhorar este teste ELISA, a fim de determinar os parâmetros e condições ideais, tais como a diluição dos diferentes anticorpos (amostras de soro, anticorpos de captura, anticorpos de detecção), as etapas de incubação e lavagem e a inclusão dos controlos negativos e positivos adequados.

A cultura de bactérias e a produção de seus antígenos para a realização do procedimento de adsorção podem ser consideradas um passo pesado, principalmente para as espécies de Mollicutes. No entanto, acredita-se que isso seja importante, pois essa etapa ajuda muito a aumentar a especificidade do ELISA e a evitar novos testes de confirmação, como imunoblotting ou PCR. Além disso, no contexto da infecção por M. pneumoniae, um diagnóstico efetivo e confiável é definitivamente necessário para estabelecer uma antibioticoterapia adequada e apropriada, uma vez que o uso de drogas betalactâmicas no tratamento da pneumonia adquirida na comunidade é ineficaz contra M. pneumoniae8. Após anos de uso em atividade diagnóstica de rotina em laboratório, acredita-se que o ELISA de captura de antígenos, descrito neste trabalho, represente uma ferramenta válida para o rastreamento específico da infecção por M. pneumoniae.

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Disclosures

Os autores declaram que não há interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este estudo foi financiado pelo Ministério da Saúde da Tunísia e pelo Ministério do Ensino Superior e Investigação Científica da Tunísia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

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Biologia Edição 192
Ensaio de imunoadsorção enzimática de captura de antígenos para detecção específica de <em>Mycoplasma pneumoniae</em>
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Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

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