Summary
该协议描述了胫神经瘤转位模型，该模型需要胫神经病变，随后近端神经末梢向皮下胫前或外侧位置转位。神经瘤疼痛和足底痛觉过敏的行为测试使用冯弗雷单丝进行定量。
Abstract
胫神经瘤转位 （TNT） 是一种大鼠模型，其中神经瘤部位（胫神经）的异常性疼痛可以从由完整腓肠神经支配的后爪足底表面的异常性疼痛中独立评估。这种TNT模型适用于测试神经瘤疼痛的疗法，例如临床上已经使用的某些手术疗法的潜在优越性，或评估新药及其对同一动物两种疼痛方式的影响。在该模型中，在胫神经中制造远端病变（神经畸形），近端神经末梢移位并在皮下和胫前固定，以便能够用 15 g Von Frey 单丝评估神经瘤部位。为了评估腓肠神经异常性疼痛，可以通过后爪足底外侧区域的上下方法 使用 Von Frey单丝。切除胫神经后，神经瘤部位在手术后1周内发生机械超敏反应，并至少持续到手术后12周。与对侧肢体相比，腓肠支配足底表面的异常性疼痛在手术后 3 周内发生。在 12 周时，在切断的胫神经的近端形成神经瘤，表现为轴突的弥散和旋转。对于TNT模型手术，需要遵循多个关键（显微）手术步骤，并建议在终末麻醉下进行一些手术实践。与其他神经性疼痛模型（例如保留神经损伤模型）相比，在TNT模型中，可以从腓肠神经超敏反应中独立测试神经瘤部位的异常性疼痛。然而，神经瘤部位只能在大鼠身上测试，不能在小鼠身上测试。该协议中提供的提示和方向可以帮助从事疼痛研究的研究小组在其设施中成功实施TNT模型。
Introduction
每个伤口，从简单的撕裂伤到整个肢体截肢，都伴随着不同程度的周围神经损伤。这种神经损伤可导致神经瘤的形成，即发芽的神经纤维的无序缠绕。8%-30%的患者出现神经瘤疼痛，严重影响他们的生活质量1，2，3，4，5。截肢后，50% 的患者出现神经瘤疼痛6，7，8。报告的症状包括压痛、自发性疼痛、异常性疼痛、痛觉过敏以及神经支配区域的机械或热超敏反应9。如果在 1 年内没有得到充分治疗，神经瘤疼痛会发展为慢性疼痛状态，导致高社会负担和相关医疗费用10，11，12，13，14。由于目前药物干预的疗效较差，疼痛神经瘤优选通过手术切除疼痛的神经瘤来治疗，并且通过各种手术技术治疗神经，如文献15所述。重要的是要注意，完全缓解疼痛的情况很少见，疼痛通常会随着时间的推移而恶化，并且40%的患者无法从手术中受益，这表明需要新的治疗方法1，16。
神经瘤疼痛的标准化大鼠模型有助于理解驱动神经瘤疼痛的机制，并可能有助于确定新的治疗方法或评估临床中使用的现有治疗方法。胫神经瘤转位（TNT）模型于2008年由Dorsi等人首次描述17，并已被不同的研究小组使用18，19，20。这种方法的总体目标是能够测试神经瘤疼痛的不同治疗技术。与例如备用神经损伤（SNI）模型21相比，该模型的优势在于它允许在神经瘤部位测试异常性疼痛。这是因为该模型涉及将胫神经的近端神经末梢转置到皮下胫前位置，在那里可以用冯弗雷单丝探测。此外，异常性疼痛发生在由完整腓肠神经支配的后爪足底表面，这可以独立于同一动物的神经瘤疼痛进行评估。这类似于患者的神经瘤疼痛症状，其中切除疼痛性神经瘤后的持续性神经性疼痛有时由邻近神经引起22。此外，断神经异常性疼痛伴神经瘤与完整邻近神经异常性疼痛不同。因此，该模型有助于评估新疗法对神经瘤部位存在的异常性疼痛和在后爪足底表面测试的更广泛的神经性疼痛的影响。由于为创建TNT模型而进行的手术可能具有挑战性，因此本文详细阐述了支持研究人员在其设施中实施该模型的程序。
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Protocol
这项研究是根据IVD（Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht）和动物研究指南进行的，项目编号AVD1150020198824。
1. 冯弗雷基线测量
- 手术前，根据冯弗雷测试程序进行基线测量，如下文第 5 节和第 6 节所述。
2. 麻醉和准备
注意：这项研究是在 15 只 12 周龄的雄性 Sprague Dawley 大鼠上进行的。
- 用5%异氟醚诱导麻醉动物，并用2%-3%异氟醚维持麻醉。
注意：用2%异氟醚维持通常会导致足够的麻醉和自主呼吸，而无需气管插管或机械通气。 - 用镊子捏住脚来检查动物的反应。在继续之前，请确保动物没有反应。用电动剃须刀从膝盖到脚踝剃除手术区域，并在眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。腹部皮下注射0.5mg/kg镇痛药卡洛芬。
- 将麻醉的大鼠放在其背部，头部向左或向右，将要手术的腿靠近外科医生。将下踝向外旋转，使内踝朝上。将大鼠置于6倍放大倍率的立体手术显微镜下。
- 用三轮交替的碘基磨砂膏对剃光的区域进行消毒，然后用酒精消毒。在腿上放置一张带有手术孔的无菌床单，这样只有手术区域可见。确保在手术过程中保持这些无菌条件。
3. 手术
- 将小棉签放在脚踝下方，以保持手术区域水平。找到膝盖，用手术刀在后爪内侧从小腿中部到脚踝轻轻地做一个 1-2 厘米的纵向切口。如果需要，用微型剪刀进一步打开皮肤和皮下，直到肌肉层可见。
- 将浅表神经血管束识别为两条或三条白色和一条较粗的紫色/红色线，有时有小分支，可以在肌肉层上自由移动。使用电烙术（见 材料表），凝固手术区域的任何活动性出血或渗出。注意不要损坏神经血管束。
- 钝切解剖以打开腓肠肌之间的筋膜，就在 3.2 的浅表神经血管束的后方。在肌肉筋膜之间，可以找到胫神经。胫神经的大小约为神经血管束中浅神经的三倍。使用胫骨作为附加标志（胫骨位于胫骨的后方）。
- 识别胫神经及其分叉。
注意：分叉通常可见，在神经上纵向有一条较浅的线。 - 小心地解剖胫神经，使其脱离周围的血管束。通过钝性移动胫神经并切割暴露的组织来进行解剖，这些组织在移动胫神经时显示出一些拉伸。
注意：如果解剖后胫神经连接到交叉静脉，则可以凝固这些静脉以暴露整个胫神经。注意不要凝固胫骨束本身。 - 将胫神经暴露在近端，直到它消失在交叉肌肉层下方。此时，胫神经似乎更深入地深入到膝盖的后爪。将胫神经远端暴露至脚踝。
注意：当胫神经暴露在更远端时，穿过胶原纤维（即垂直于神经纤维方向的纤维）的量会增加。这些胶原纤维需要切割，以提供足够的长度来转位胫神经。- 当整个胫神经暴露在外时，将肌肉层向后放置以避免神经脱水。如果神经脱水（即，它变得更加僵硬、暗沉和皱纹），并且用肌肉层覆盖是不够的，请添加几滴生理盐水来补充水分。
- 使用钝的显微手术工具，最好是微型针架，从皮下肌肉层解剖胫前皮肤，以形成皮下隧道。为此，将皮肤向上并推动钝尖进入组织，平行于皮肤。确保隧道末端位于胫骨前或更侧向，以确保易于进入该区域以测试神经瘤。
- 将异氟醚增加至5%。返回胫神经并将其暴露（即，回到步骤3.6中描述的位置）。在踝关节附近的最远端切开胫神经（即两个足底分支）。将异氟醚降低至2%-3%的正常水平。
- 将显微镜放大倍率更改为10倍或16倍。识别步骤3.8中切口近端的胫神经外神经，或者在胫神经更近端分叉的情况下，识别步骤3.8中切口近端的内侧和外侧足底分支的外神经。
注意：与内部的神经纤维相比，外神经外神经更白更坚硬，后者更黄更柔软。 - 小心放置一个 8-0尼龙缝合线（见 材料表）通过近端神经末梢的外神经，用镊子小心地握住外神经，并将针放在神经和外神经之间，咬合约0.5毫米。将缝合线拉过，并在步骤3.7中制作的皮下隧道末端皮下咬一口。打一个结，将神经横向转置到皮下隧道中。
注意：如果两个足底分支共享一个共同的表外神经，则一条缝合线就足够了。如果两个足底分支都有自己的表观神经，则应单独固定每个外在神经。避免将缝合线穿过皮肤;只能皮下固定。 - 放置一条较厚的深色缝合线（最好是蓝色或黑色 4-0 缝合线）齐平到固定的神经末梢，不要穿透皮肤。确保缝合线从皮肤外部可见。检查移动爪子和肌肉后神经是否保持在原位。在 4-0 上用比 8-0 上稍长的缝合端切断缝合端缝合。
- 将显微镜的放大倍率改回6倍。使用8-0用表皮内缝合线闭合皮肤缝合并用棉签用0.9%NaCl轻轻清洁皮肤。
4. 术后治疗
- 将老鼠放在干净的笼子里，放在纸巾下的舒适位置。如果房间很冷，请在笼子的一部分下放置一个加热垫（仅在笼子的一部分下方，因为动物应该能够在需要时逃脱热量）。确保轻松获得食物和水。
- 在手术后大鼠恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让手术后大鼠无人看管。当大鼠在手术后从麻醉中完全恢复时，它可以回到其他动物的陪伴下。这通常是在1小时后，当大鼠表现出正常的行走模式和行为时。
- 在手术后24小时和48小时，皮下（腹部区域）给予0.5mg / kg卡洛芬的剂量以治疗术后疼痛。
5. 后爪足底侧的冯弗雷测试
注意：Von Frey测试（步骤5和6）在手术前（用于基线测量）进行，从手术后3天开始。
- 在基线测量前1周或手术前2周将大鼠置于网丝底笼中，以确保适应测试环境。
- 在手术前至少 1 周开始基线测量。确保在不同的日子进行三次独立的基线测量。
- 验证大鼠在网状有线底部笼子中是否平静。应用一系列冯弗雷单丝，其对数刻度垂直于后爪的足底表面。
- 为了刺激腓肠神经（超敏反应），将单丝应用于靠近毛发边界的侧侧。避免触摸脚垫，因为它们更敏感。
- 为了刺激胫神经（低敏感性），在后爪足底表面的中间应用单丝。如果将单丝应用于最内侧区域，这也可能刺激隐神经，即股神经的一个分支（图1）。避免触摸脚垫。
- 从4克单丝开始。对单丝施加足够的力，使毛发弯曲并保持3秒，然后检查动物对单丝的反应。积极的反应是突然的爪子撤回、突然退缩、突然舔爪子或发声。在某些情况下，老鼠会移动并试图找到/攻击单丝。
- 根据通过上下方法23对刺激的响应选择下一个单丝。例如，如果大鼠有反应，则用2g单丝刺激下一步;如果大鼠没有反应，用6g单丝刺激，依此类推。总共根据反应施加5-10次刺激。
6. 神经瘤部位的冯弗雷测试
- 每天处理动物，至少在基线测量前 5-7 天或手术前 2 周。确保按照步骤6.2中的说明握住动物，以便它们对姿势感到满意。
- 握住老鼠的鼻子指向肘部折叠。如果右手握住老鼠，它们的左后爪应该自由地悬挂在右手拇指和食指之间（第一网空间）。如果用左手握住老鼠，它们的右后爪应该自由地悬挂在左手拇指和食指之间。
- 在手术前至少 1 周开始基线测量。确保在不同的日子进行三次独立的基线测量。
- 验证大鼠在被抱着时是否平静和舒适。在基线时，将 15 g 单丝轻轻地放在暴露的后爪的前胫骨表面上。手术后，将 15 g 单丝放在可见缝合线上（例如，在神经瘤的位置）。对单丝施加足够的力，使头发弯曲并保持1秒。
- 记录对每个刺激的反应。反应选项包括无反应、缓慢退出、快速退出和发声。将反应记录为 0 分表示无反应，1 分表示缓慢退出、快速退出或发声。
- 重复五簇，每簇五次应用单丝，每次施用2-3秒，五簇之间2-3分钟或更长时间。总共，每个后爪应该有25次单丝应用，并记录反应。
7. 用于组织学和制备的标本回收
注意：组织学检查在初次手术后12周进行。
- 诱导麻醉并按照步骤2.2，2.3和2.4中所述制备动物。
- 用手术刀在初次手术造成的疤痕上轻轻切开2-3厘米的切口，但注意不要切得太深，因为神经是表面放置的。
- 确定神经瘤的位置，仔细解剖神经瘤和神经，从周围瘢痕组织中游离，并将收获的神经瘤置于固定剂中。为了评估神经瘤形态，优选将组织纵向包埋在石蜡或环氧树脂中，如Tork等人18所述。
- 收获组织后，通过心脏穿刺或斩首 在 终末麻醉（5%异氟醚）下对大鼠实施安乐死。
注意：建议在杀死大鼠之前先收获神经瘤，因为这样更容易在 体内将神经瘤与其周围组织区分开来。
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Representative Results
神经瘤部位的评估显示，对施用15g冯弗雷单丝的敏感性增加。在基线时，大鼠通常对15g单丝的25次应用中的10%-15%（±13%）有反应。TNT手术后1周，反应率增加到45%-50%（±24%）。在对侧，手术后的反应数量与基线相似（图2A）。大约20%的大鼠没有发生疼痛的神经瘤;与基线相比，反应率没有增加（图2B）。这与人类的情况相当，并非所有患者（截肢后50%）在形成神经瘤后都会出现疼痛。所有大鼠在手术后12周在横断和转位的胫神经残端发生神经瘤（图3）。这种神经瘤的特征是胶原沉积物中的旋转轴突和微束。
胫神经横断降低了后爪足底侧中部的机械敏感性，该中心由胫神经支配（图1）。术后1周出现低敏反应，术后3周与对侧和基线显著不同，并持续到术后至少12周（图4）。在由完整腓肠神经支配的后爪足底侧的外侧，大鼠从术后1周开始出现机械超敏反应，与对侧和基线显着不同（图4）。这种超敏反应持续到手术后至少12周。在对侧爪，与基线相比，腓肠神经或胫神经支配区域的机械敏感性不受影响（图4）。
图1：后爪足底侧的神经分布。 红色=腓肠神经分布（外侧）;紫色=胫神经分布（中）;绿色 = 隐神经分布（内侧）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：神经瘤部位的冯弗雷。 对胫神经进行横断面切除，并评估神经瘤部位的机械敏感性过程，将15g单丝分五簇施用，每簇施用5次，共施用25次。响应得分为 1 分。（A）与基线和对侧相比，术后1周神经瘤部位的反应明显更高。N = 15;误差线：平均值的标准误差 （SEM）;具有多重比较和Tukey测试的混合模型分析。* = p < 0.05， ** = p < 0.01， *** = p < 0.001。 （B）同侧部位的个体值显示反应的多样性。三只大鼠（20%）的基线评分相对较高，三只大鼠（20%）的胫前敏感性没有任何变化。请点击此处查看此图的大图。
图3：神经瘤的形态。 12周龄神经瘤的组织学图像。（A）苏木精-伊红染色，（B）马森三色染色和（C）神经丝染色。绿色箭头 = 神经瘤近端的胫神经。橙色箭头 = 神经瘤，通过轴突的旋转和束的扩散来识别。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：足底后爪（胫神经和腓肠神经）的冯弗雷。胫神经横断，并通过后爪足底表面的Von Frey测试评估机械敏感性的过程。受胫神经支配的同侧手术后爪中部显示低敏感性。受腓肠神经支配的同侧手术后爪外侧部分表现出超敏反应。与基线相比，足底对侧后爪的中部和外侧部分的敏感性没有变化。N = 15;误差线：平均值的标准误差 （SEM）;具有多重比较和Tukey测试的混合模型分析。* = p < 0.05， ** = p < 0.01， *** = p < 0.001， **** = p < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
协议中的关键步骤
TNT模型包括切割胫神经并将其横向和皮下移位到胫前位置，以便对神经瘤进行敏感性测试，此外还可以对腓肠神经进行足底痛觉过敏。在TNT模型中，关键是研究人员可以看到神经瘤的位置。因此，首选白化大鼠菌株，因为皮下缝合线很容易通过皮肤看到，并且缝合线的颜色最好为深蓝色或黑色。
当进行手术并暴露胫神经时，胫神经分叉的位置（例如近端或远端）存在变化。如果大鼠有近端分叉，则可能在踝关节近端发现两条神经（内侧和外侧足底神经）（图5A），而不仅仅是一条胫神经（图5B）。重要的是，两个分支都被切割和移位，以诱导腓肠神经上的足底痛觉过敏。人们可以选择只转置一条足底神经;然而，在这个水平上不容易区分足底外侧神经和内侧神经，并且可能会影响结果。因此，建议转置两条神经。此外，一些大鼠可能有更远端的胫神经分叉，并且仅转置一条足底神经可能是不可能的。
图 5：胫神经的近端和远端分叉。 胫神经分叉水平（*）的解剖学变化。（A）胫神经近端分叉;（B）胫神经远端分叉。缩写：MPN = 跖内侧神经，LPN = 足底外侧神经。 请点击此处查看此图的大图。
在Dorsi等人的原始论文中17，在胫骨近端神经末端周围放置一个结扎，并通过该结扎缝合线 转 置和固定神经。由于神经周围的结扎可以诱发收缩性疼痛24，因此该方法中描述的替代方法是使用神经外膜缝合线固定神经。如果胫神经被切开并移位，重要的是皮下固定神经的缝合线通过外神经膜而不是神经束本身放置，因为这也可能影响疼痛措施。此外，应避免将缝合线穿过皮肤，因为大鼠倾向于啃咬任何可见的缝合线，导致神经瘤移位，从而导致疼痛措施的结果不可靠。
当皮肤闭合时，使用表皮内缝合线以避免导致开放性伤口的啃咬也很重要。此外，在转位胫神经后，它将位于皮肤下方的更浅层。开放性伤口与浅表放置的神经相结合是不可取的。
可以进行 Von Frey 测量以测试神经瘤部位的神经瘤疼痛，并测试后爪外侧腓肠神经的足底痛觉过敏。由于缝合线的颜色较深，手术后可见神经瘤部位。为了测试腓肠神经超敏反应，应选择一个应用冯弗雷单丝的位置。这可以是外侧食物垫的近端或远端，但在基线测量和手术后几周的测量期间应该大致相同的位置。
方法的故障排除
如果大鼠在基线测量期间已经对施加到胫前区域的所有刺激做出反应，请确保它们平静和放松，并且它们已适当地适应测试区域。重复基线测量，直到大鼠对刺激的反应较小。此外，在进行测量时最好不要喷任何香水。理想情况下，当手术前施用15g单丝时，大鼠对胫前刺激没有反应。但是，如果大鼠平静，并且50%-100%的大鼠仍然对15g单丝有反应，则将其更改为基线期间具有10%-20%反应率的单丝。但是，如果改变单丝，建议首先进行先进行先导实验，以测试TNT大鼠是否对这种较低强度的单丝有反应。在TNT模型的最初论文中，通过有机玻璃盒17底部的开口施加单丝来测量神经瘤部位。在试点实验中，发现大鼠在 通过 笼子底部施加时对每种刺激都有反应，并倾向于攻击单丝。当研究人员紧紧握住时，大鼠处于平静状态，导致基线测量期间单丝的反应率较低。
如果胫骨近端神经末梢在皮下隧道中无法到达足够远的距离，请遵循更近端的胫神经病程，并去除神经周围的任何胶原和脂肪组织。切断任何将神经固定在其周围地区的小神经分支或血管。这将使神经具有更宽的运动范围，可以更横向地转位。请注意，在Dorsi等人的原始论文中17，神经更横向地转位。在试点实验中，发现不可能到达横向位置。因此，该方法描述了神经瘤部位的胫前位置。
方法的局限性
TNT模型的局限性在于手术涉及多个（微）手术步骤。另一个限制是TNT模型不容易转化为小鼠。根据经验，小鼠往往对施加在胫骨前区域的刺激相当敏感，即使应用0.008g单丝也是如此。
该方法相对于现有/替代方法的重要性
在TNT模型中，神经瘤疼痛可以独立于腓肠神经上的足底痛觉过敏进行检测。后者也在其他神经性疼痛模型（如SNI模型）中诱导，但在这里，神经瘤疼痛无法独立测试21。此外，在SNI模型中，胫神经和腓神经都被切断，导致更多的运动功能丧失，从而导致爪子21的内在肌肉麻痹。因为在TNT模型中，只有胫神经在远端水平被切断，所以脚的内在肌肉只能显示可以忽略不计的运动功能丧失。
该方法的潜在应用
先前的研究已经表明，TNT模型可用于测试各种止痛药，神经帽或其他用于神经瘤治疗的手术工具18，19，20。然而，所有对疼痛感兴趣的研究小组都可以从使用TNT模型中获得潜在的好处，因为可以在同一只动物身上测试两种不同的疼痛方式。
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Disclosures
作者报告说没有利益冲突。尽管这项研究工作部分由Axogen资助，但该公司对研究的执行和结果没有影响。
Acknowledgments
我们要感谢Sabine Versteeg在显微外科手术期间的协助，以及来自普通动物实验室（Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium）的Anja van der Sar和Trudy Oosterveld-Romijn，感谢他们在准备显微镜和手术室以及照顾动物方面的帮助。
这项研究由Axogen资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
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