Summary
Bu protokol, tibial sinirin lezyonunu ve ardından proksimal sinir ucunun subkutan pretibial veya lateral pozisyona doğru transpozisyonunu gerektiren tibial nöroma transpozisyon modelini tanımlar. Nöroma ağrısı ve plantar hiperaljezinin davranışsal testleri, Von Frey monofilamentleri kullanılarak ölçülür.
Abstract
Tibial nöroma transpozisyonu (TNT), nöroma bölgesindeki (tibial sinir) allodininin, sağlam sural sinir tarafından innerve edilen arka pençenin plantar yüzeyindeki allodinyadan bağımsız olarak değerlendirilebildiği bir sıçan modelidir. Bu TNT modeli, klinikte halihazırda kullanılan bazı cerrahi tedavilerin potansiyel üstünlüğü gibi nöroma ağrısı için tedavileri test etmek veya yeni ilaçları ve bunların aynı hayvandaki her iki ağrı modalitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için uygundur. Bu modelde, tibial sinirde distal bir lezyon (nörotmesis) yapılır ve proksimal sinir ucu, 15 g'lık bir Von Frey monofilamenti ile nöroma bölgesinin değerlendirilmesini sağlamak için deri altından ve pretibiyal olarak transpoze edilir ve sabitlenir. Sural sinir üzerindeki allodiniyi değerlendirmek için, Von Frey monofilamentleri arka pençenin plantar lateral bölgesinde yukarı-aşağı yöntemle kullanılabilir. Tibial siniri kestikten sonra, ameliyattan sonraki 1 hafta içinde nöroma bölgesinde mekanik aşırı duyarlılık gelişir ve ameliyattan en az 12 hafta sonrasına kadar devam eder. Sural innerve plantar yüzeydeki allodinya, kontralateral ekstremite ile karşılaştırıldığında ameliyattan sonraki 3 hafta içinde gelişir. 12 haftada, kopmuş tibial sinirin proksimal ucunda, aksonların dağılması ve dönmesi ile gösterilen bir nöroma oluşur. TNT modeli cerrahi için çok sayıda kritik (mikro) cerrahi adımın izlenmesi gerekir ve terminal anestezi altında bazı cerrahi uygulamalar önerilmektedir. Korunmuş sinir hasarı modeli gibi diğer nöropatik ağrı modelleriyle karşılaştırıldığında, nöroma bölgesi üzerindeki allodinya, TNT modelinde sural sinir aşırı duyarlılığından bağımsız olarak test edilebilir. Bununla birlikte, nöroma bölgesi farelerde değil, sadece sıçanlarda test edilebilir. Bu protokolde verilen ipuçları ve talimatlar, ağrı üzerinde çalışan araştırma gruplarının TNT modelini tesislerinde başarıyla uygulamalarına yardımcı olabilir.
Introduction
Basit yırtılmalardan tüm ekstremite amputasyonuna kadar değişen her yaraya değişen derecelerde periferik sinir hasarı eşlik eder. Bu tür sinir hasarı, filizlenen sinir liflerinin düzensiz bir dolaşıklığı olan bir nörom oluşumuna neden olabilir. Nöromlar hastaların %8-30'unda ağrılı hale gelir ve yaşam kalitelerini ciddi şekilde etkiler1,2,3,4,5. Ekstremite amputasyonundan sonra hastaların %50'sinde nöroma ağrısı gelişir6,7,8. Bildirilen semptomlar arasında hassasiyet, spontan ağrı, allodini, hiperaljezi ve innerve bölgede mekanik veya termal aşırı duyarlılık bulunur9. 1 yıl içinde yeterince tedavi edilmediğinde, nöroma ağrısı kronik bir ağrı durumuna ilerleyebilir ve bu da yüksek toplumsal yüke ve buna bağlı tıbbi maliyetlere neden olabilir 10,11,12,13,14. Mevcut farmakolojik girişimlerin etkinliğinin zayıf olması nedeniyle, nöroma ağrısı tercihen ağrılı nöromun cerrahi olarak çıkarılması ve literatürde açıklandığı gibi sinirin çeşitli cerrahi tekniklerle tedavi edilmesi ile tedavi edilmektedir15. Tam ağrı kesicinin nadir olduğunu, ağrının genellikle zamanla kötüleştiğini ve hastaların% 40'ının ameliyattan fayda görmediğini ve yeni tedavilere ihtiyaç duyulduğunu belirtmek önemlidir 1,16.
Nöroma ağrısının standartlaştırılmış bir sıçan modeli, nöroma ağrısını yönlendiren mekanizmaları anlamada yardımcı olur ve yeni tedavilerin belirlenmesine veya klinikte kullanılanların değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Tibial nöroma transpozisyonu (TNT) modeli ilk olarak Dorsi ve ark. tarafından 2008yılında tanımlanmıştır 17 ve farklı araştırma grupları tarafından kullanılmıştır18,19,20. Bu yöntemin genel amacı, nöroma ağrısı için farklı tedavi tekniklerini test edebilmektir. Modelin, örneğin, korunmuş sinir hasarı (SNI) model21'e göre avantajı, nöroma bölgesinde allodiniyi test etmesine izin vermesidir. Bunun nedeni, modelin tibial sinirin proksimal sinir ucunu, von Frey monofilamentleri ile araştırılabileceği deri altı pretibial bir pozisyona aktarmayı içermesidir. Dahası, allodinya, aynı hayvandaki nöroma ağrısından bağımsız olarak değerlendirilebilen sağlam sural sinir tarafından innerve edilen arka pençenin plantar yüzeyinde gelişir. Bu, ağrılı bir nöromun çıkarılmasından sonra kalıcı nöropatik ağrının bazen komşu sinirlerden kaynaklandığı hastalarda nöroma ağrısı semptomlarına benzer22. Dahası, nöroma ile kopmuş bir sinir üzerindeki allodinya, sağlam komşu sinir üzerindeki allodinyadan farklı bir ağrı modalitesidir. Bu nedenle, bu model, yeni tedavilerin hem nöroma bölgesinde bulunan allodini hem de arka pençenin plantar yüzeyinde test edilen daha yaygın nöropatik ağrı üzerindeki etkisinin değerlendirilmesini kolaylaştırır. TNT modelini oluşturmak için yapılan ameliyat zor olabileceğinden, bu makale modeli tesislerinde uygulayan araştırmacıları destekleme prosedürünü detaylandırmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) ve AVD1150020198824 proje numaralı hayvan araştırmaları kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Von Frey taban çizgisi ölçümleri
- Ameliyattan önce, aşağıda bölüm 5 ve bölüm 6'da açıklanan Von Frey test prosedürüne göre temel ölçümleri yapın.
2. Anestezi ve hazırlık
NOT: Bu çalışma, 12 haftalık 15 erkek Sprague Dawley sıçanı üzerinde gerçekleştirilmiştir.
- Hayvanları %5 izofluran ile indüksiyon ile uyuşturun ve %2-3 izofluran ile anesteziyi sürdürün.
NOT: %2 izofluran ile idame genellikle trakeal entübasyon veya mekanik ventilasyona gerek kalmadan yeterli anestezi ve spontan solunum ile sonuçlanır. - Ayağı cımbızla sıkıştırarak hayvanların reflekslerini kontrol edin. Devam etmeden önce hayvanın yanıt vermediğinden emin olun. Ameliyat alanını dizden ayak bileğine kadar elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin ve kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın. Karın bölgesine deri altından 0.5 mg / kg analjezik karprofen enjekte edin.
- Anestezi uygulanan sıçanı başı sola veya sağa ve ameliyat edilecek bacağı cerrahın yanına gelecek şekilde sırt üstü yerleştirin. Alt arka ekstremiteyi ekzorotatee edin, böylece medial malleolus yukarı doğru bakar. Sıçanı 6x büyütmeli bir stereo cerrahi mikroskop altına yerleştirin.
- Tıraş edilen bölgeyi üç alternatif iyot bazlı ovma ve ardından alkol ile dezenfekte edin. Bacağın üzerine operatif bir delik bulunan steril bir tabaka yerleştirin, böylece sadece ameliyat alanı görülebilir. Ameliyat sırasında bu steril koşulların korunduğundan emin olun.
3. Ameliyat
- Ameliyat alanını yatay tutmak için ayak bileğinin altına küçük bir pamuklu çubuk yerleştirin. Dizin yerini belirleyin ve baldırın ortasından ayak bileğine kadar arka pençenin medial tarafında bir neşter kullanarak yavaşça 1-2 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın. Gerekirse, cildi açın ve kas katmanları görünene kadar mikro makasla daha fazla subkutis yapın.
- Yüzeysel nörovasküler demeti iki veya üç beyaz ve kas katmanları üzerinde serbestçe hareket edebilen bazen küçük dalları olan daha kalın bir mor / kırmızı çizgi olarak tanımlayın. Bir elektrokoter kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), ameliyat alanındaki herhangi bir aktif kanamayı veya sızmayı pıhtılaştırın. Nörovasküler demetlere zarar vermemeye dikkat edin.
- Fasyayı gastroknemius kasları arasında, yüzeysel nörovasküler demet 3.2'nin hemen arkasında açmak için açıkça disseke edin. Kasların fasyası arasında tibial sinir bulunabilir. Tibial sinir, nörovasküler demetteki yüzeysel sinirin yaklaşık üç katı büyüklüğündedir. Tibial kemiği ek bir dönüm noktası olarak kullanın (tibial sinir, tibial kemiğin hemen arkasında bulunur).
- Tibial siniri ve bifurkasyonunu tanımlayın.
NOT: Bifurkasyon genellikle sinir üzerinde uzunlamasına daha hafif bir çizgi ile görülebilir. - Tibial siniri çevreleyen vasküler demetlerden arındırılmış olarak dikkatlice diseke edin. Tibial siniri künt bir şekilde hareket ettirerek ve tibial siniri hareket ettirirken biraz gerilme gösteren maruz kalan dokuyu keserek diseksiyonu gerçekleştirin.
NOT: Tibial sinir diseksiyondan sonra çapraz damarlara bağlanırsa, bu damarlar tüm tibial siniri açığa çıkarmak için pıhtılaşabilir. Tibial demetin kendisini pıhtılaştırmamaya dikkat edin. - Tibial siniri, çapraz bir kas tabakasının altında kaybolana kadar proksimal olarak açığa çıkarın. Bu noktada, tibial sinir arka pençeye diz doğru daha derine dalıyor gibi görünmektedir. Tibial siniri distal olarak ayak bileğine kadar maruz bırakın.
NOT: Tibial sinir daha distal olarak maruz kaldığında, çapraz kollajen liflerinin miktarı (yani, sinir liflerinin yönüne dik olan lifler) artacaktır. Bu kollajen liflerinin, tibial sinirin transpoze edilmesi için yeterli uzunluğu sağlamak için kesilmesi gerekir.- Tüm tibial sinir açığa çıktığında, sinirin dehidrasyonunu önlemek için kas katmanlarını geri yerleştirin. Sinir dehidrate olursa (yani, daha sert, donuk ve kırışmış hale gelirse) ve kas katmanlarıyla kaplamak yeterli olmazsa, nemlendirmek için tuzlu su damlaları ekleyin.
- Künt bir mikrocerrahi aleti, tercihen bir mikro iğne tutucu kullanarak, deri altı tünel yapmak için pretibial cildi deri altı kas tabakasından diseke edin. Bunu yapmak için, cildi yukarı doğru tutun ve künt ucu cilde paralel olarak dokuya itin. Nöromun test edilmesi için alanın kolay erişilebilirliğini sağlamak için tünelin ucunun pretibiyal veya daha lateral olarak yerleştirildiğinden emin olun.
- İzofluranı% 5'e yükseltin. Tibial sinire geri dönün ve onu açığa çıkarın (yani, adım 3.6'da açıklanan yere geri dönün). Tibial siniri (yani her iki plantar dalı) ayak bileğinin yakınındaki en distal seviyede kesin. İzofluranı% 2 -% 3'lük normal seviyeye düşürün.
- Mikroskop büyütme işlemini 10x veya 16x olarak değiştirin. Tibial sinirin pinöryumunu adım 3.8'de yapılan kesime proksimal olarak tanımlayın veya tibial sinirin daha proksimal bifurkasyonu durumunda, adım 3.8'de kesiğe proksimal olan hem medial hem de lateral plantar dalların epineuriumunu tanımlayın.
NOT: Epineurium, içindeki sinir liflerine kıyasla daha beyaz ve sıkıdır, bu da daha sarı ve yumuşaktır. - Dikkatlice 8-0 yerleştirin naylon sütür (bakınız Malzeme Tablosu) proksimal sinir ucunun epinöryumundan epinöryumu cımbızla dikkatlice tutarak ve iğneyi sinir ile epineurium arasına yaklaşık 0.5 mm'lik bir ısırıkla koyarak. Dikişi çekin ve adım 3.7'de yapılan deri altı tünelinin sonunda iğne ile deri altından bir ısırık alın. Siniri yanal olarak deri altı tüneline dönüştürecek bir düğüm yapın.
NOT: Her iki plantar dal da ortak bir epineurium'u paylaşıyorsa, bir dikiş yeterli olmalıdır. Her iki plantar dalın da kendi epineurium'u varsa, her bir epineurium ayrı ayrı sabitlenmelidir. Sütürü deriden geçirmekten kaçının; sadece deri altından düzeltin. - Sabitlenmiş sinir ucuna hizalanmış koyu renkli (tercihen mavi veya siyah 4-0 sütür) daha kalın bir dikiş yerleştirin, cilde nüfuz etmeyin. Dikişin cildin dışından görülebildiğinden emin olun. Pençeyi ve kasları hareket ettirdikten sonra sinirin yerinde kalıp kalmadığını kontrol edin. Dikiş uçlarını 4-0'da 8-0'dan biraz daha uzun bir dikiş ucu ile kesin Dikiş.
- Mikroskobun büyütme oranını tekrar 6x olarak değiştirin. 8-0'ı kullanarak cildi intraepidermal dikişlerle kapatın Dikiş atın ve pamuklu çubukla cildinizi% 0.9 NaCl ile nazikçe temizleyin.
4. Ameliyat sonrası tedavi
- Sıçanı temiz bir kafese, bir kağıt havlunun altına rahat bir pozisyonda yerleştirin. Oda soğuksa, kafesin bir kısmının altına bir ısı yastığı yerleştirin (hayvanın gerektiğinde ısıdan kaçabilmesi gerektiğinden, kafesin sadece bir kısmının altına). Yiyecek ve suya kolay erişim sağlayın.
- Sternal yatmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar ameliyat sonrası sıçanı gözetimsiz bırakmayın. Sıçan, ameliyattan sonra anesteziden tamamen iyileştiğinde diğer hayvanların şirketine iade edilebilir. Bu genellikle 1 saat sonra ve sıçan normal yürüyüş düzenini ve davranışını sergilediğinde.
- Ameliyattan 24 saat ve 48 saat sonra, ameliyat sonrası ağrıyı tedavi etmek için deri altından (karın bölgesi) 0.5 mg / kg karprofen dozu uygulayın.
5. Von Frey, arka pençelerin plantar tarafının test edilmesini sağlar
NOT: Von Frey testi (adım 5 ve 6) ameliyattan önce (başlangıç ölçümü için) ve ameliyattan 3 gün sonra yapılır.
- Test ortamına alışmayı sağlamak için sıçanları temel ölçümden 1 hafta önce veya ameliyattan 2 hafta önce örgü tel alt kafeslere yerleştirin.
- Ameliyattan en az 1 hafta önce temel önlemlerle başlayın. Ayrı günlerde üç bağımsız taban çizgisi ölçümünün yapıldığından emin olun.
- Sıçanların ağ kablolu alt kafeslerde sakin olduklarını doğrulayın. Arka pençenin plantar yüzeyine dik logaritmik bir ölçekle bir dizi Von Frey monofilamenti uygulayın.
- Sural siniri (aşırı duyarlılık) uyarmak için, monofilamenti saç sınırına yakın lateral tarafa uygulayın. Ayak tabanlarına dokunmaktan kaçının, çünkü bunlar daha hassastır.
- Tibial siniri (hiposensitivite) uyarmak için, monofilamenti arka pençenin plantar yüzeyinin ortasına uygulayın. Monofilament en medial bölgeye uygulanırsa, bu aynı zamanda femoral sinirin bir dalı olan safen siniri de uyarabilir (Şekil 1). Ayak tabanlarına dokunmaktan kaçının.
- 4 g monofilament ile başlayın. Monofilamente yeterli kuvvet uygulayın, böylece saç bükülür ve 3 s boyunca tutulur ve ardından hayvanın monofilament üzerindeki tepkilerini kontrol edin. Olumlu bir yanıt ani pençe çekilmesi, ani çırpınma, ani pençe yalama veya seslendirmedir. Bazı durumlarda, sıçan hareket eder ve monofilamenti bulmaya / saldırmaya çalışır.
- Yukarı-aşağı yöntemiyle uyarana verilen cevaba bağlı olarak bir sonraki monofilamenti seçin23. Örneğin, sıçan yanıt verirse, 2 g monofilament ile bir sonraki uyarın; sıçan cevap vermezse, 6 g monofilament ile uyarın, vb. Toplamda, reaksiyona bağlı olarak 5-10 uyaran uygulayın.
6. Von Frey'in nöroma bölgesi testi
- Hayvanları günlük olarak temel önlemlerden en az 5-7 gün önce veya ameliyattan 2 hafta önce tutun. Hayvanların adım 6.2'de açıklandığı gibi tutulduğundan emin olun, böylece pozisyonda rahat olurlar.
- Sıçanları burunları dirsek kıvrımına doğru bakacak şekilde tutun. Sıçan sağ elde tutulursa, sol arka pençeleri sağ başparmak ve işaret parmağı arasında serbestçe asılmalıdır (ilk web alanı). Sıçan sol elde tutulursa, sağ arka pençeleri sol baş parmak ve işaret parmağı arasında serbestçe asılmalıdır.
- Ameliyattan en az 1 hafta önce temel önlemlerle başlayın. Ayrı günlerde üç bağımsız taban çizgisi ölçümünün yapıldığından emin olun.
- Sıçanların tutulurken sakin ve rahat olduklarından emin olun. Başlangıçta, 15 g monofilamenti yavaşça açıkta kalan arka pençenin pretibial yüzeyine yerleştirin. Ameliyattan sonra, 15 g monofilamenti görünür dikiş üzerine yerleştirin (örneğin, nöromun bulunduğu yere). Monofilamente yeterli kuvvet uygulayın, böylece saç bükülür ve 1 s boyunca tutulur.
- Her uyarana verilen tepkiyi kaydedin. Reaksiyon seçenekleri arasında reaksiyon yok, yavaş geri çekilme, hızlı geri çekilme ve seslendirme bulunur. Yanıtı, tepki vermemek için 0 puan ve yavaş geri çekilme, hızlı geri çekilme veya seslendirme için bir puan olarak kaydedin.
- Monofilamentin beş uygulamasından oluşan beş kümeyi, her uygulama arasında 2-3 s ve beş küme arasında 2-3 dakika veya daha fazla olacak şekilde tekrarlayın. Toplamda, her bir arka pençe, kaydedilen yanıtlarla monofilamentin 25 uygulamasına sahip olmalıdır.
7. Histoloji ve hazırlık için numune geri kazanımı
NOT: Histolojik inceleme ilk ameliyattan 12 hafta sonra yapılır.
- Anesteziyi indükleyin ve hayvanları adım 2.2, 2.3 ve 2.4'te açıklandığı gibi hazırlayın.
- İlk ameliyatta yapılan yara izi üzerinde bir neşter kullanarak nazikçe 2-3 cm'lik bir kesi yapın, ancak sinir yüzeysel olarak yerleştirildiği için çok derin kesmemeye dikkat edin.
- Nöromun pozisyonunu belirleyin, nöromu ve siniri çevreleyen skar dokusundan arındırılmış olarak dikkatlice inceleyin ve hasat edilen nöromu fiksatif içine yerleştirin. Nöroma morfolojisini değerlendirmek için, doku tercihen Tork ve ark.18 tarafından tarif edildiği gibi parafin veya epoksi reçinesine uzunlamasına gömülür.
- Dokuyu topladıktan sonra, sıçanları terminal anestezi altında (% 5 izofluran) kardiyak delinme veya kafa kesme yoluyla ötenazi yapın.
NOT: Sıçanları öldürmeden önce nöromanın toplanması tavsiye edilir, çünkü o zaman nöromayı çevreleyen dokusundan in vivo olarak ayırt etmek daha kolaydır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nöroma bölgesinde yapılan değerlendirme, 15 g von Frey monofilamentinin uygulanmasına karşı artan duyarlılık göstermiştir. Başlangıçta, sıçanlar tipik olarak 15 g'lık bir monofilamentin 25 uygulamasının% 10-15'ine (±% 13) yanıt verdi. TNT cerrahisinden 1 hafta sonra yanıt oranı %45-50'ye (%24± yükselmiştir. Kontralateral tarafta, ameliyat sonrası yanıt sayısı başlangıçtakilere benzerdi (Şekil 2A). Sıçanların yaklaşık% 20'si ağrılı bir nöroma geliştirmedi; yanıt oranı taban çizgisine kıyasla artmamıştır (Şekil 2B). Bu, tüm hastaların (amputasyondan sonra% 50) bir nörom oluşumundan sonra ağrı geliştirmediği insan durumuyla karşılaştırılabilir. Tüm sıçanlarda ameliyattan 12 hafta sonra transekte edilmiş ve transpoze tibial sinir güdüğünün sonunda bir nöroma gelişti (Şekil 3). Bu nöroma, kollajen birikintileri içinde dönen aksonlar ve mikrofasiküller ile karakterizeydi.
Tibial sinirin transeksiyonu, tibial sinir tarafından innerve edilen arka pençenin plantar tarafının ortasındaki mekanik duyarlılığı azaltmıştır (Şekil 1). Hiposensitivite ameliyattan 1 hafta sonra mevcuttu, kontralateral taraftan ve ameliyattan 3 hafta sonra başlangıçtan anlamlı olarak farklıydı ve ameliyattan en az 12 hafta sonrasına kadar kaldı (Şekil 4). Arka pençenin plantar tarafının sağlam sural sinir tarafından innerve edilen lateral kısmında, sıçanlar kontralateral taraftan ve ameliyattan 1 hafta sonra başlayan hattan önemli ölçüde farklı mekanik aşırı duyarlılık geliştirdiler (Şekil 4). Bu aşırı duyarlılık ameliyattan sonra en az 12 hafta devam etti. Kontralateral pençede, sural veya tibial sinir tarafından innerve edilen bölgelerde mekanik duyarlılık başlangıç çizgisine kıyasla etkilenmedi (Şekil 4).
Resim 1: Arka pençenin plantar tarafındaki sinir dağılımı. Kırmızı = sural sinir dağılımı (lateral); mor = tibial sinir dağılımı (orta); yeşil = safen sinir dağılımı (medial). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Nöroma bölgesinden Von Frey. Tibial sinir transekte edildi ve nöroma bölgesi üzerindeki mekanik duyarlılığın seyri, her biri beş uygulamadan oluşan beş küme halinde uygulanan 15 g'lık bir monofilament ile toplam 25 uygulama ile değerlendirildi. Bir yanıt bir puan olarak puanlanır. (A) Nöroma bölgesi, ameliyattan 1 hafta sonra başlangıç çizgisine ve kontralateral tarafa kıyasla anlamlı derecede daha yüksek bir yanıt gösterdi. N = 15; hata çubukları: ortalamanın standart hatası (SEM); çoklu karşılaştırmalar ve Tukey testi ile karışık model analizi. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 . (B) İpsilateral bölgenin bireysel değerleri reaksiyonda çeşitlilik gösterir. Üç sıçan (%20) nispeten yüksek bir başlangıç skoruna sahipti ve üç sıçan (%20) pretibial duyarlılıkta herhangi bir değişiklik göstermedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nöromun morfolojisi. 12 haftalık bir nöromun histolojik görüntüleri. (A) Hematoksilin-Eozin boyama, (B) Masson'un trikrom boyaması ve (C) Nörofilament boyama. Yeşil ok = tibial sinir nöroma sadece proksimal. Turuncu ok = nöroma, aksonların dönmesi ve fasiküllerin difüzyonu ile tanımlanır. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Plantar arka pençeden Von Frey (tibial ve sural sinir). Tibial sinir transekte edildi ve mekanik duyarlılığın seyri arka pençenin plantar yüzeyinde Von Frey testi ile değerlendirildi. Tibial sinir tarafından innerve edilen ipsilateral operatif arka pençenin orta kısmı hiposensitivite gösterdi. İpsilateral operatif arka pençenin sural sinir tarafından innerve edilen lateral kısmı aşırı duyarlılık gösterdi. Plantar kontralateral arka pençenin orta ve yan kısımları, taban çizgisine kıyasla duyarlılıkta hiçbir değişiklik göstermedi. N = 15; hata çubukları: ortalamanın standart hatası (SEM); çoklu karşılaştırmalar ve Tukey testi ile karışık model analizi. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokoldeki kritik adımlar
TNT modeli, tibial sinirin kesilmesini ve sural sinir üzerindeki plantar hiperaljeziye ek olarak, nöromun duyarlılık testini sağlamak için lateral ve subkutan olarak pretibial bir bölgeye transpoze edilmesini içerir. TNT modelinde, nöromun yerinin araştırmacılar tarafından görülebilmesi anahtardır. Bu nedenle, bir albino sıçan suşu tercih edilir, çünkü deri altı dikişler deriden kolayca görülebilir ve dikişin rengi tercihen koyu mavi veya siyah olmalıdır.
Ameliyat yapıldığında ve tibial sinir açığa çıktığında, tibial sinirin bifurkasyonunun yerinde (örneğin, proksimal veya distal) farklılıklar vardır. Sıçanlarda proksimal bifurkasyon varsa, sadece bir tibial sinir (Şekil 5B) yerine, ayak bileğine proksimal iki sinirin (medial ve lateral plantar sinir) bulunması mümkündür (Şekil 5A). Sural sinir üzerinde plantar hiperaljezi indüklemek için her iki dalın da kesilmesi ve transpoze edilmesi önemlidir. Kişi sadece bir plantar siniri transpoze etmeyi seçebilir; Bununla birlikte, lateral ve medial plantar sinir arasında bir ayrım bu düzeyde kolayca yapılamaz ve sonuçları etkileyebilir. Bu nedenle, her iki sinirin de transpoze edilmesi önerilir. Dahası, bazı sıçanlarda tibial sinirin daha distal bir bifurkasyonu olabilir ve sadece bir plantar sinirin transpoze edilmesi imkansız olabilir.
Şekil 5: Tibial sinirin proksimal ve distal bifurkasyonu. Tibial sinirin bifurkasyon (*) seviyesindeki anatomik varyasyon. (A) Tibial sinirin proksimal bifurkasyonu; (B) tibial sinirin distal bifurkasyonu. Kısaltmalar: MPN = medial plantar sinir, LPN = lateral plantar sinir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Dorsi ve ark.17'nin orijinal makalesinde, proksimal tibial sinir ucunun etrafına bir ligatür yerleştirilir ve sinir bu ligatür sütürü ile transpoze edilir ve sabitlenir. Sinir çevresindeki bağ daralma ağrısına neden olabileceğinden,24, bu yöntemde açıklanan bir alternatif, siniri epinörinal sütürler kullanarak düzeltmektir. Tibial sinir kesilir ve transpoze edilirse, siniri deri altından sabitlemek için dikişin sinir fasiküllerinin kendisinden değil, epineuryumdan yerleştirilmesi önemlidir, çünkü bu ağrı önlemlerini de etkileyebilir. Ek olarak, sıçanlar görünür dikişleri kemirme eğiliminde olduklarından, nöromun yer değiştirmesine ve dolayısıyla ağrı önlemlerinin güvenilir olmayan sonuçlarına neden olduklarından, sütürü deriden yerleştirmekten kaçınılmalıdır.
Cilt kapalıyken, açık bir yara ile sonuçlanacak kemirmeyi önlemek için epidermal dikişlerin kullanılması da önemlidir. Dahası, tibial sinir transpoze edildikten sonra, cildin hemen altında daha yüzeysel bir tabaka halinde yer alacaktır. Yüzeysel olarak yerleştirilmiş bir sinir ile kombinasyon halinde açık bir yara istenmez.
Von Frey ölçümleri, nöroma bölgesinde nöroma ağrısını test etmek ve arka pençenin lateral tarafında, sural sinir üzerinde plantar hiperaljezi test etmek için yapılabilir. Nöroma bölgesi, dikişin koyu rengi nedeniyle ameliyattan sonra görülebilir. Sural sinir aşırı duyarlılığını test etmek için, Von Frey monofilamentinin uygulandığı bir yer seçilmelidir. Bu, lateral gıda pedine proksimal veya distal olabilir, ancak ameliyattan sonraki haftalarda temel ölçümler ve ölçümler sırasında yaklaşık olarak aynı yerde olmalıdır.
Yöntemin sorunlarını giderme
Sıçanlar, temel ölçümler sırasında pretibial bölgeye uygulanan tüm uyaranlara tepki gösterirse, sakin ve rahat olduklarından ve test alanına uygun şekilde alıştıklarından emin olun. Sıçanlar uyaranlara daha az tepki verene kadar temel ölçümü tekrarlayın. Ayrıca ölçümler yapılırken parfüm kullanılmaması tercih edilir. İdeal olarak, sıçanlar ameliyattan önce 15 g'lık bir monofilament uygulandığında pretibial uyarana tepki vermezler. Bununla birlikte, sıçanlar sakinse ve sıçanların% 50-100'ü hala 15 g monofilamente tepki gösteriyorsa, başlangıçta% 10-20 yanıt oranına sahip bir monofilamente değiştirin. Bununla birlikte, monofilament değiştirilirse, TNT sıçanlarının bu düşük monofilament mukavemetine tepki gösterip göstermediğini test etmek için önce bir pilot deney yapılması önerilir. TNT modelinin ilk makalesinde, nöroma bölgesi, monofilamentin bir Perspex kutusunun altındaki bir açıklıktan uygulanmasıyla ölçüldü17. Pilot deneylerde, sıçanların kafesin dibinden uygulandığında her bir uyarana tepki verdikleri ve monofilamente saldırma eğiliminde oldukları bulunmuştur. Araştırmacı tarafından yakından tutulduğunda, sıçanlar sakin bir durumdaydı ve bu da taban çizgisi ölçümü sırasında monofilament üzerinde daha düşük bir tepki oranına neden oldu.
Proksimal tibial sinir ucu subkutan tünelde yeterince uzağa ulaşamazsa, tibial sinirin seyrini daha proksimal olarak takip edin ve sinir çevresindeki kollajenöz ve yağ dokusunu çıkarın. Siniri çevresine sabit tutan küçük sinir dallarını veya damarlarını kesin. Bu, sinire daha yanal olarak aktarılması için daha geniş bir hareket aralığı verecektir. Dorsi ve ark.17'nin orijinal makalesinde, sinirin daha lateral olarak transpoze edildiğini unutmayın. Pilot deneylerde, yanal pozisyona ulaşmanın imkansız olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, bu yöntem nöroma bölgesinin pretibial pozisyonunu tanımlar.
Yöntemin sınırlamaları
TNT modelinin bir sınırlaması, ameliyatın izlenmesi gereken birden fazla (mikro) cerrahi adımı içermesidir. Diğer bir sınırlama, TNT modelinin farelere kolayca çevrilememesidir. Deneyimlere göre, fareler, 0.008 g'lık bir monofilament uygulamasıyla bile, pretibial bir alanda uygulanan uyaranlara karşı oldukça hassas olma eğilimindedir.
Yöntemin mevcut/alternatif yöntemler açısından önemi
TNT modelinde nöroma ağrısı, sural sinir üzerindeki plantar hiperaljeziden bağımsız olarak test edilebilir. İkincisi, SNI modeli gibi diğer nöropatik ağrı modellerinde de indüklenir, ancak burada, nöroma ağrısı bağımsız olarak test edilemez21. Ek olarak, hem tibial hem de peroneal sinir SNI modelinde kesilir, bu da pençe21'in felçli intrinsik kaslarına neden olan daha fazla motor fonksiyon kaybına neden olur. TNT modelinde sadece tibial sinir distal seviyede kesildiğinden, ayakların intrinsik kasları sadece ihmal edilebilir bir motor fonksiyon kaybı gösterir.
Yöntemin potansiyel uygulamaları
Önceki araştırmalar, TNT modelinin nöroma tedavisi için çeşitli ağrı kesici ilaçları, sinir kapaklarını veya diğer cerrahi aletleri test etmek için kullanılabileceğini göstermiştir18,19,20. Bununla birlikte, ağrı ile ilgilenen tüm araştırma grupları, aynı hayvanda iki farklı ağrı yöntemi test edilebildiğinden, TNT modelini kullanmaktan potansiyel fayda sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir. Bu araştırma çalışması kısmen Axogen tarafından finanse edilmesine rağmen, şirketin çalışmanın yürütülmesi ve sonuçlar üzerinde hiçbir etkisi yoktu.
Acknowledgments
Mikrocerrahi sırasında yardımcı oldukları için Sabine Versteeg'e ve Ortak Hayvan Laboratuvarı'ndan (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) Anja van der Sar ve Trudy Oosterveld-Romijn'e mikroskop ve ameliyathanenin hazırlanmasında ve hayvanlara bakmadaki yardımları için teşekkür ederiz.
Bu araştırma Axogen tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
