Summary
Этот протокол описывает модель транспозиции невриномы большеберцовой кости, которая влечет за собой поражение большеберцового нерва с последующей транспозицией проксимального нервного конца в подкожное претибиальное или латеральное положение. Поведенческое тестирование боли при невриноме и подошвенной гипералгезии количественно оценивается с использованием монофиламентов фон Фрея.
Abstract
Транспозиция невриномы большеберцовой кости (TNT) представляет собой модель крысы, в которой аллодиния в месте невриномы (большеберцовый нерв) может быть независимо оценена от аллодинии на подошвенной поверхности задней лапы, иннервируемой интактным икроножным нервом. Эта модель TNT подходит для тестирования методов лечения боли при невриноме, таких как потенциальное превосходство определенных хирургических методов лечения, которые уже используются в клинике, или для оценки новых лекарств и их влияния на оба метода боли у одного и того же животного. В этой модели дистальное поражение (нейротмезис) делается в большеберцовом нерве, а проксимальный нервный конец транспонируется и фиксируется подкожно и претибиально, чтобы можно было оценить участок невриномы с помощью мононити фон Фрея 15 г. Для оценки аллодинии над икроножным нервом монофиламенты фон Фрея можно использовать методом вверх-вниз на подошвенной латеральной области задней лапы. После перерезания большеберцового нерва механическая гиперчувствительность развивается в месте невриномы в течение 1 недели после операции и сохраняется, по крайней мере, до 12 недель после операции. Аллодиния на икроножной иннервированной подошвенной поверхности развивается в течение 3 недель после операции по сравнению с контралатеральной конечностью. На 12 неделе на проксимальном конце разорванного большеберцового нерва образуется невринома, о чем свидетельствует дисперсия и закрученность аксонов. Для хирургии модели TNT необходимо выполнить несколько критических (микро)хирургических шагов, и рекомендуется некоторая хирургическая практика под терминальной анестезией. По сравнению с другими моделями нейропатической боли, такими как модель спасенного повреждения нерва, аллодиния над участком невриномы может быть независимо протестирована на гиперчувствительность икроножного нерва в модели TNT. Тем не менее, сайт невриномы может быть протестирован только на крысах, а не на мышах. Советы и указания, представленные в этом протоколе, могут помочь исследовательским группам, работающим с болью, успешно внедрить модель TNT в своем учреждении.
Introduction
Каждая рана, варьирующаяся от простых рваных ран до ампутации всей конечности, сопровождается различной степенью повреждения периферических нервов. Такое повреждение нерва может привести к образованию невриномы, дезорганизованной запутанности прорастающих нервных волокон. Невриномы становятся болезненными у 8-30% пациентов, серьезно влияя на качество их жизни 1,2,3,4,5. После ампутации конечности боль при невриноме развивается у 50% пациентов 6,7,8. Зарегистрированные симптомы включают болезненность, спонтанную боль, аллодинию, гипералгезию и механическую или термическую гиперчувствительность в иннервируемой области9. При отсутствии адекватного лечения в течение 1 года боль при невриноме может перейти в состояние хронической боли, что приводит к высокому социальному бремени и связанным с этим медицинским расходам 10,11,12,13,14. Из-за низкой эффективности современных фармакологических вмешательств боль при невриноме предпочтительно лечат хирургическим удалением болезненной невриномы, а нерв лечат различными хирургическими методами, как описано в литературе15. Важно отметить, что полное обезболивание встречается редко, боль часто усиливается с течением времени, и 40% пациентов не получают пользы от операции, что указывает на необходимость новых методов лечения 1,16.
Стандартизированная модель боли в невриноме на крысах помогает понять механизмы, которые вызывают боль в невриноме, и может помочь определить новые методы лечения или оценить существующие, используемые в клинике. Модель транспозиции невриномы большеберцовой кости (TNT) была впервые описана Dorsi et al. в 2008 году17 и использовалась различными исследовательскими группами18,19,20. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы иметь возможность тестировать различные методы лечения боли при невриноме. Преимущество модели по сравнению, например, с травмой избавленного нерва (SNI) модели21, заключается в том, что она позволяет тестировать аллодинию в месте невриномы. Это связано с тем, что модель включает в себя транспонирование проксимального нервного окончания большеберцового нерва в подкожное претибиальное положение, где его можно исследовать с помощью монофиламентов фон Фрея. Кроме того, аллодиния развивается на подошвенной поверхности задней лапы, иннервируемой интактным икроножным нервом, что может быть оценено независимо от боли при невриноме у того же животного. Это похоже на симптомы боли при невриноме у пациентов, у которых постоянная нейропатическая боль после удаления болезненной невриномы иногда вызвана соседними нервами22. Более того, аллодиния над разорванным нервом с невриномой - это другой метод боли, чем аллодиния над интактным соседним нервом. Таким образом, эта модель облегчает оценку влияния новых методов лечения как на аллодинию, присутствующую в месте невриномы, так и на более распространенную невропатическую боль, протестированную на подошвенной поверхности задней лапы. Поскольку операция, выполняемая для создания модели TNT, может быть сложной, в этой статье подробно описывается процедура поддержки исследователей, внедряющих модель в своем учреждении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было выполнено в соответствии с IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) и руководством по исследованиям на животных, номер проекта AVD1150020198824.
1. Базовые измерения фон Фрея
- Перед операцией проведите базовые измерения в соответствии с процедурой тестирования фон Фрея, описанной ниже в разделе 5 и разделе 6.
2. Анестезия и подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было проведено на 15 самцах крыс Sprague Dawley в возрасте 12 недель.
- Анестезируйте животных индукцией 5% изофлурана и поддерживайте анестезию 2%-3% изофлураном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживающая терапия 2% изофлураном обычно приводит к достаточной анестезии и спонтанному дыханию без необходимости интубации трахеи или искусственной вентиляции легких. - Проверьте рефлексы животных, ущипнув лапу пинцетом. Прежде чем продолжить, убедитесь, что животное не реагирует. Побрейте операционное поле от колена до лодыжки электробритвой и нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. Вводят 0,5 мг/кг обезболивающего карпрофена подкожно в область живота.
- Положите анестезированную крысу на спину так, чтобы ее голова была влево или вправо, а нога, подлежащая операции, находилась рядом с хирургом. Экзовращайте нижнюю заднюю конечность так, чтобы медиальная лодыжка была обращена вверх. Поместите крысу под стереохирургический микроскоп с 6-кратным увеличением.
- Продезинфицируйте выбритый участок тремя чередующимися раундами скраба на основе йода, а затем спиртом. Положите стерильную простыню с операционным отверстием на ногу, чтобы было видно только операционное поле. Убедитесь, что эти стерильные условия поддерживаются во время операции.
3. Хирургия
- Поместите небольшой ватный тампон под лодыжку, чтобы операционное поле было горизонтальным. Найдите колено и аккуратно сделайте продольный разрез 1-2 см с помощью скальпеля по медиальной стороне задней лапы от середины голени до лодыжки. При необходимости вскрывайте кожу и подкожную клетчатку микроножницами, пока не станут видны мышечные слои.
- Определите поверхностный сосудисто-нервный пучок как два или три белых и более толстую фиолетово-красную линию, иногда с небольшими ветвями, которые могут свободно перемещаться по мышечным слоям. С помощью электрокоагуляции (см. Таблицу материалов) коагулируют любое активное кровотечение или сочащееся в операционном поле. Будьте осторожны, чтобы не повредить сосудисто-нервный пучок.
- Тупо рассекают, чтобы открыть фасцию между икроножными мышцами, чуть позади поверхностного сосудисто-нервного пучка 3,2. Между фасциями мышц может находиться большеберцовый нерв. Большеберцовый нерв примерно в три раза больше поверхностного нерва в сосудисто-нервном пучке. Используйте большеберцовую кость в качестве дополнительного ориентира (большеберцовый нерв лежит чуть позади большеберцовой кости).
- Определите большеберцовый нерв и его раздвоение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бифуркация обычно видна более светлой линией в продольном направлении над нервом. - Осторожно рассеките большеберцовый нерв, освободив его от окружающих сосудистых пучков. Выполните рассечение, тупо перемещая большеберцовый нерв и разрезая открытую ткань, которая показывает некоторое растяжение при движении большеберцового нерва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если большеберцовый нерв прикреплен к пересекающимся венам после рассечения, эти вены могут быть коагулированы, чтобы обнажить весь большеберцовый нерв. Будьте осторожны, чтобы не коагулировать сам пучок большеберцовой кости. - Обнажайте большеберцовый нерв проксимально, пока он не исчезнет под пересекающимся мышечным слоем. В этот момент большеберцовый нерв, кажется, глубже погружается в заднюю лапу к колену. Обнажить большеберцовый нерв дистально до лодыжки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда большеберцовый нерв обнажается более дистально, количество пересекающихся коллагеновых волокон (т.е. волокон, перпендикулярных направлению нервных волокон) увеличивается. Эти коллагеновые волокна необходимо разрезать, чтобы обеспечить достаточную длину для транспонирования большеберцового нерва.- Когда весь большеберцовый нерв обнажен, поместите мышечные слои обратно, чтобы избежать обезвоживания нерва. Если нерв обезвоживается (т.е. становится более жестким, тусклым и морщинистым), а покрытия мышечными слоями недостаточно, добавьте капли физиологического раствора, чтобы увлажнить его.
- Используя тупой микрохирургический инструмент, предпочтительно держатель микроиглы, рассеките претибиальную кожу от подкожного мышечного слоя, чтобы сделать подкожный туннель. Для этого удерживают кожу вверх и проталкивают тупой кончик в ткань, параллельно коже. Убедитесь, что конец туннеля расположен претибиально или более латерально, чтобы обеспечить легкий доступ к области для тестирования невриномы.
- Увеличьте изофлуран до 5%. Вернитесь к большеберцовому нерву и обнаживите его (т. е. вернитесь в место, описанное в шаге 3.6). Перережьте большеберцовый нерв (т.е. обе подошвенные ветви) на самом дистальном уровне возле лодыжки. Снижение изофлурана до нормального уровня 2%-3%.
- Измените увеличение микроскопа на 10-кратное или 16-кратное. Определите эпиневрий большеберцового нерва, проксимальный разрезу, сделанному на шаге 3.8, или, в случае более проксимального раздвоения большеберцового нерва, определите эпиневрий как медиальной, так и латеральной подошвенной ветвей проксимальнее разреза на шаге 3.8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпиневрий белее и тверже по сравнению с нервными волокнами внутри, которые более желтые и мягкие. - Аккуратно поставьте 8-0 нейлоновый шов (см. Таблицу материалов) через эпиневрий проксимального нервного окончания, осторожно придерживая пинцетом эпиневрий и вставляя иглу между нервом и эпиневрием с прикусом примерно 0,5 мм. Протяните шов и прикусите иглой подкожно в конце подкожного туннеля, сделанного на шаге 3.7. Сделайте узел, который будет транспонировать нерв латерально в подкожный туннель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если обе подошвенные ветви имеют общий эпиневрий, одного шва должно быть достаточно. Если обе подошвенные ветви имеют свой эпиневрий, каждый эпиневрий следует фиксировать индивидуально. Избегайте наложения шва через кожу; Только зафиксируйте его подкожно. - Накладывают более толстый шов темного цвета (желательно синий или черный шов 4-0) вровень с фиксируемым нервным концом, не проникая в кожу. Убедитесь, что шов виден снаружи кожи. Проверьте, остается ли нерв на месте после движения лапы и мышц. Отрежьте концы швов чуть более длинным концом шва на 4-0, чем на 8-0 шов.
- Измените увеличение микроскопа обратно на 6x. Закройте кожу внутриэпидермальными швами с помощью 8-0 Наложите швы и аккуратно очистите кожу 0,9% NaCl с помощью ватного тампона.
4. Послеоперационное лечение
- Поместите крысу в чистую клетку под бумажное полотенце в удобном положении. Если в помещении холодно, поместите грелку под часть клетки (только под часть клетки, так как животное должно иметь возможность избежать тепла, когда это необходимо). Обеспечьте легкий доступ к пище и воде.
- Не оставляйте послеоперационную крысу без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание достаточно для поддержания лежачего положения на грудине. Крысу можно вернуть в компанию других животных, когда она полностью оправится от наркоза после операции. Обычно это происходит через 1 час, когда крыса проявляет свою нормальную модель ходьбы и поведение.
- Через 24 ч и 48 ч после операции вводят дозу 0,5 мг/кг карпрофена подкожно (абдоминальная область) для лечения послеоперационной боли.
5. Тест фон Фрея на подошвенную сторону задних лап
ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование фон Фрея (шаги 5 и 6) проводится до операции (для исходного измерения) и через 3 дня после операции.
- Поместите крыс в клетки из сетчатой проволоки за 1 неделю до исходного измерения или за 2 недели до операции, чтобы обеспечить акклиматизацию к тестовой среде.
- Начните с исходных показателей не менее чем за 1 неделю до операции. Убедитесь, что три независимых базовых измерения выполняются в разные дни.
- Убедитесь, что крысы спокойны в сетчатых проволочных нижних клетках. Нанесите серию мононитей фон Фрея с логарифмической шкалой, перпендикулярной подошвенной поверхности задней лапы.
- Чтобы стимулировать икроножный нерв (гиперчувствительность), наложите мононить на боковую сторону близко к границе волоса. Не прикасайтесь к подушечкам ног, так как они более чувствительны.
- Для стимуляции большеберцового нерва (гипочувствительность) накладывают мононить на середину подошвенной поверхности задней лапы. Если мононить применяется в самой медиальной области, это может также стимулировать подкожный нерв, ветвь бедренного нерва (рис. 1). Не прикасайтесь к подушечкам ног.
- Начните с 4 г мононити. Приложите достаточное усилие к монофиламенту, чтобы волосы сгибались, и удерживайте в течение 3 с, а затем проверьте реакцию животного на мононить. Положительным ответом является внезапное отдергивание лапы, внезапное вздрагивание, внезапное облизывание лап или вокализация. В некоторых случаях крыса двигается и пытается найти/атаковать мононить.
- Выберите следующую мононить в зависимости от реакции на стимул с помощью метода23 вверх-вниз. Например, если крыса реагирует, стимулируйте затем 2 г мононити; Если крыса не реагирует, стимулируют мононитью 6 г и так далее. Всего применяют 5-10 стимулов в зависимости от реакции.
6. Тестирование фон Фрея на месте невриномы
- Обрабатывайте животных ежедневно в течение как минимум 5-7 дней до исходных мер или за 2 недели до операции. Убедитесь, что животные держатся, как описано в шаге 6.2, чтобы им было удобно в этом положении.
- Держите крыс носом, направленным к локтевому сгибу. Если крысу держат в правой руке, ее левая задняя лапа должна свободно висеть между большим и указательным пальцами правой руки (первое пространство паутины). Если крысу держат в левой руке, ее правая задняя лапа должна свободно висеть между большим и указательным пальцами левой руки.
- Начните с исходных показателей не менее чем за 1 неделю до операции. Убедитесь, что три независимых базовых измерения выполняются в разные дни.
- Убедитесь, что крысы спокойны и чувствуют себя комфортно во время удержания. В начале исследования аккуратно положите 15 г мононити на пребербиальную поверхность обнаженной задней лапы. После операции поместите мононить весом 15 г на видимый шов (например, в месте расположения невриномы). Приложите достаточное усилие к монофиламенту, чтобы волосы сгибались, и удерживайте в течение 1 с.
- Записывайте реакцию на каждый раздражитель. Варианты реакции включают отсутствие реакции, медленный уход, быстрый вывод и вокализацию. Запишите ответ как 0 баллов за отсутствие реакции и один балл за медленный уход, быстрый вывод или вокализацию.
- Повторите пять кластеров по пять применений мононити, с 2-3 с между каждым нанесением и 2-3 мин или более между пятью кластерами. В общей сложности каждая задняя лапа должна иметь 25 применений мононити с записанными ответами.
7. Забор образцов для гистологии и подготовки
ПРИМЕЧАНИЕ: Гистологическое исследование проводится через 12 недель после первоначальной операции.
- Индуцируют анестезию и подготавливают животных, как описано в шагах 2.2, 2.3 и 2.4.
- Аккуратно сделайте разрез в 2-3 см с помощью скальпеля над шрамом, который был сделан во время первоначальной операции, но будьте осторожны, чтобы не разрезать слишком глубоко, так как нерв расположен поверхностно.
- Определите положение невриномы, тщательно рассеките невриному и нерв, свободные от окружающей рубцовой ткани, и поместите собранную невриному в фиксатор. Для оценки морфологии невриномы ткань предпочтительно продольно встраивают в парафин или эпоксидную смолу, как описано Tork et al.18.
- После сбора ткани усыпьте крыс под терминальной анестезией (5% изофлурана) с помощью пункции сердца или обезглавливания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала собрать невриному перед убийством крыс, потому что тогда легче отличить невриному от окружающих ее тканей in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка в месте невриномы показала повышенную чувствительность к применению монофиламента фон Фрея 15 г. В начале исследования крысы обычно реагировали на 10-15% (± 13%) из 25 применений 15-граммовой мононити. Частота ответа увеличилась до 45-50% (± 24%) через 1 неделю после операции TNT. На контралатеральной стороне количество ответов после операции было аналогично исходным (рис. 2А). Примерно у 20% крыс не развилась болезненная невринома; процент ответивших не увеличился по сравнению с исходным уровнем (рис. 2B). Это сравнимо с человеческой ситуацией, когда не у всех пациентов (50% после ампутации) развиваются боли после образования невриномы. У всех крыс развилась невринома в конце пересеченной и транспонированной культи большеберцового нерва через 12 недель после операции (рис. 3). Эта невринома характеризовалась закрученными аксонами и микропучками в отложениях коллагена.
При пересечении большеберцового нерва снижается механическая чувствительность в середине подошвенной стороны задней лапы, иннервируемой большеберцовым нервом (рис. 1). Гипочувствительность присутствовала через 1 неделю после операции, значительно отличалась от контралатеральной стороны и исходного уровня через 3 недели после операции и сохранялась по крайней мере до 12 недель после операции (рис. 4). В латеральной части подошвенной стороны задней лапы, иннервируемой интактным икроножным нервом, у крыс развилась механическая гиперчувствительность, которая значительно отличалась от контралатеральной стороны и исходного уровня через 1 неделю после операции (рис. 4). Эта гиперчувствительность сохранялась, по крайней мере, до 12 недель после операции. В контралатеральной лапе механическая чувствительность не была затронута по сравнению с исходным уровнем в областях, иннервируемых икроножным или большеберцовым нервом (рис. 4).
Рисунок 1: Распределение нервов на подошвенной стороне задней лапы. Красный = распределение икроножного нерва (латеральное); фиолетовый = распределение большеберцового нерва (посередине); зеленый = распределение подкожного нерва (медиальное). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Фон Фрей о месте невриномы. Большеберцовый нерв был пересечен, и курс механической чувствительности по участку невриномы оценивали с помощью мононити 15 г, применяемой в пяти кластерах по пять аппликаций в каждом, в общей сложности 25 применений. Ответ засчитывается как одно очко. (A) Участок невриномы показал значительно более высокий ответ через 1 неделю после операции по сравнению с исходным уровнем и контралатеральной стороной. N = 15; полосы погрешностей: стандартная погрешность среднего значения (SEM); смешанный модельный анализ с множественными сравнениями и тестом Тьюки. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (B) Индивидуальные значения ипсилатерального сайта показывают разнообразие реакции. Три крысы (20%) имели относительно высокий исходный балл, а три крысы (20%) не показали каких-либо изменений в претибиальной чувствительности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Морфология невриномы. Гистологические изображения невриномы 12-недельного возраста. (А) окрашивание гематоксилин-эозином, (Б) трихромное окрашивание Массона и (В) окрашивание нейрофиламентами. Зеленая стрелка = большеберцовый нерв проксимальнее невриномы. Оранжевая стрелка = невринома, идентифицируемая по закручению аксонов и диффузии пучков. Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Фон Фрей подошвенной задней лапы (большеберцовый и икроножный нервы). Большеберцовый нерв был пересечен, и ход механической чувствительности был оценен с помощью теста фон Фрея на подошвенной поверхности задней лапы. Средняя часть ипсилатеральной оперированной задней лапы, иннервируемая большеберцовым нервом, показала гипочувствительность. Латеральная часть ипсилатеральной оперированной задней лапы, иннервируемая икроножным нервом, показала гиперчувствительность. Средняя и боковая части подошвенной контралатеральной задней лапы не показали изменений чувствительности по сравнению с исходным уровнем. N = 15; полосы погрешностей: стандартная погрешность среднего значения (SEM); смешанный модельный анализ с множественными сравнениями и тестом Тьюки. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в протоколе
Модель TNT включает в себя разрезание большеберцового нерва и транспонирование его латерально и подкожно в претибиальное расположение, чтобы обеспечить тестирование чувствительности невриномы в дополнение к подошвенной гипералгезии над икроножным нервом. В модели TNT ключевым моментом является то, что место невриномы видно исследователям. Поэтому предпочтительнее использовать штамм крысы-альбиноса, потому что подкожные швы легко видны через кожу, а цвет шва предпочтительно должен быть темно-синим или черным.
Когда проводится операция и обнажается большеберцовый нерв, происходит изменение места (например, проксимального или дистального) бифуркации большеберцового нерва. Если у крыс есть проксимальная бифуркация, возможно, что два нерва (медиальный и латеральный подошвенный нерв) могут быть обнаружены проксимальнее лодыжки (рис. 5A), а не только один большеберцовый нерв (рис. 5B). Важно, чтобы обе ветви были разрезаны и транспонированы, чтобы вызвать подошвенную гипералгезию над икроножным нервом. Можно было бы транспонировать только один подошвенный нерв; Однако различие между латеральным и медиальным подошвенным нервом нелегко провести на этом уровне и может повлиять на результаты. Поэтому рекомендуется транспонировать оба нерва. Кроме того, у некоторых крыс может быть более дистальная бифуркация большеберцового нерва, и транспонирование только одного подошвенного нерва может быть невозможным.
Рисунок 5: Проксимальная и дистальная бифуркация большеберцового нерва. Анатомическое изменение уровня бифуркации (*) большеберцового нерва. (А) проксимальная бифуркация большеберцового нерва; (Б) дистальная бифуркация большеберцового нерва. Сокращения: MPN = медиальный подошвенный нерв, LPN = латеральный подошвенный нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В оригинальной статье Dorsi et al.17 лигатура помещается вокруг проксимального конца большеберцового нерва, и нерв транспонируется и фиксируется с помощью этого лигатурного шва. Поскольку лигатура вокруг нерва может вызывать сжимающую боль24, альтернативой, описанной в этом методе, является фиксация нерва с помощью эпиневринальных швов. Если большеберцовый нерв перерезан и транспонирован, важно, чтобы шов для подкожной фиксации нерва был наложен через эпиневрий, а не через сами нервные пучки, так как это также может повлиять на болевые ощущения. Кроме того, следует избегать наложения шва через кожу, так как крысы, как правило, грызут любые видимые швы, что приводит к смещению невриномы и, следовательно, к ненадежным результатам обезболивающих мер.
Когда кожа закрыта, также важно использовать внутриэпидермальные швы, чтобы избежать грызения, которое приведет к открытой ране. Более того, после транспонирования большеберцового нерва он будет расположен в более поверхностном слое прямо под кожей. Открытая рана в сочетании с поверхностно расположенным нервом нежелательна.
Измерения фон Фрея могут быть выполнены для проверки боли в невриноме на месте невриномы и для проверки подошвенной гипералгезии над икроножным нервом на боковой стороне задней лапы. Место невриномы видно после операции из-за темного цвета шва. Для тестирования гиперчувствительности икроножного нерва следует выбрать одно место, где применяется мононить фон Фрея. Это может быть проксимальнее или дистальнее боковой пищевой подушечки, но должно быть примерно в одном и том же месте во время исходных измерений и измерений в течение нескольких недель после операции.
Устранение неисправностей метода
Если крысы реагируют на все раздражители, приложенные к претибиальной области уже во время исходных измерений, убедитесь, что они спокойны и расслаблены, и что они должным образом акклиматизированы в зоне тестирования. Повторяйте исходное измерение до тех пор, пока крысы не будут меньше реагировать на раздражители. Кроме того, желательно не использовать духи при выполнении измерений. В идеале крысы не реагируют на претибиальный стимул, когда перед операцией накладывается мононить весом 15 г. Однако, если крысы спокойны, и 50-100% крыс все еще реагируют на 15-граммовую мононить, измените ее на мононить, которая имеет частоту ответа 10-20% в течение исходного уровня. Однако, если мононить изменена, рекомендуется сначала провести пилотный эксперимент, чтобы проверить, реагируют ли крысы TNT на эту более низкую прочность мононити. В первоначальной работе модели TNT участок невриномы измеряли путем введения мононити через отверстие в нижней части коробки17 Perspex. В пилотных экспериментах было обнаружено, что крысы реагируют на каждый стимул при воздействии через дно клетки и, как правило, атакуют мононить. Когда исследователь держал их под пристальным вниманием, крысы находились в спокойном состоянии, что приводило к более низкой частоте реакции на мононить во время исходного измерения.
Если проксимальный конец большеберцового нерва не может простираться достаточно далеко в подкожном туннеле, проследите за ходом большеберцового нерва более проксимальным и удалите всю коллагеновую и жировую ткань вокруг нерва. Разрежьте все второстепенные нервные ветви или сосуды, которые удерживают нерв прикрепленным к его окружению. Это даст нерву более широкий диапазон движений, который будет транспонирован более латерально. Обратите внимание, что в оригинальной статье Dorsi et al.17 нерв был транспонирован более латерально. В экспериментальных экспериментах было обнаружено, что достичь бокового положения невозможно. Таким образом, этот метод описывает претибиальное положение участка невриномы.
Ограничения метода
Ограничением модели TNT является то, что операция включает в себя несколько (микро)хирургических этапов, которые необходимо выполнить. Еще одно ограничение заключается в том, что модель TNT нелегко перевести на мышей. По опыту, мыши, как правило, довольно чувствительны к стимулам, применяемым в претибиальной области, даже при применении мононити 0,008 г.
Значимость метода по отношению к существующим/альтернативным методам
В модели TNT боль при невриноме может быть протестирована независимо от подошвенной гипералгезии над икроножным нервом. Последнее также индуцируется в других моделях невропатической боли, таких как модель SNI, но здесь боль в невриноме не может быть независимо протестирована21. Кроме того, в модели SNI перерезаны как большеберцовый, так и малоберцовый нерв, что приводит к большей потере двигательной функции, что приводит к параличу внутренних мышц лапы21. Поскольку только большеберцовый нерв перерезан на дистальном уровне в модели TNT, внутренние мышцы ног показывают лишь незначительную потерю двигательной функции.
Возможные области применения метода
Предыдущие исследования уже показали, что модель TNT может быть использована для тестирования различных обезболивающих препаратов, нервных колпачков или других хирургических инструментов для лечения невриномы18,19,20. Тем не менее, все исследовательские группы, которые интересуются болью, могут получить потенциальную выгоду от использования модели TNT, поскольку два разных метода боли могут быть протестированы на одном и том же животном.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают, что у них нет конфликта интересов. Хотя эта исследовательская работа была частично профинансирована Axogen, компания не имела никакого влияния на выполнение исследования и на результаты.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Сабину Верстег за помощь во время микрохирургии, а также Аню ван дер Сар и Труди Остервельд-Ромин из Лаборатории обычных животных (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) за их помощь в подготовке микроскопа и хирургического кабинета, а также в уходе за животными.
Это исследование финансировалось компанией Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
