Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde Caenorhabditis elegans op vaste media in multiwell-apparaten

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.

Abstract

De nematode Caenorhabditis elegans is een van de meest voorkomende modelsystemen die worden gebruikt in verouderingsonderzoek vanwege de eenvoudige en goedkope kweektechnieken, snelle reproductiecyclus (~ 3 dagen), korte levensduur (~ 3 weken) en tal van beschikbare hulpmiddelen voor genetische manipulatie en moleculaire analyse. De meest gebruikelijke benadering voor het uitvoeren van verouderingsstudies bij C. elegans, inclusief overlevingsanalyse, omvat het kweken van populaties van tientallen tot honderden dieren samen op vaste nematodengroeimedia (NGM) in petrischolen. Hoewel deze aanpak gegevens verzamelt over een populatie dieren, volgen de meeste protocollen individuele dieren niet in de loop van de tijd. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het langdurig kweken van individuele dieren op microgefabriceerde polydimethylsiloxaan (PDMS) -apparaten genaamd WorMotels. Met elk apparaat kunnen tot 240 dieren worden gekweekt in kleine putten die NGM bevatten, waarbij elke put wordt geïsoleerd door een kopersulfaathoudende gracht die voorkomt dat de dieren vluchten. Voortbouwend op de oorspronkelijke WorMotel-beschrijving, biedt dit artikel een gedetailleerd protocol voor het vormen, voorbereiden en vullen van elk apparaat, met beschrijvingen van veelvoorkomende technische complicaties en advies voor het oplossen van problemen. Binnen dit protocol zijn technieken voor het consistent laden van kleine hoeveelheden NGM, het consistent drogen van zowel de NGM als bacterieel voedsel, opties voor het leveren van farmacologische interventies, instructies voor en praktische beperkingen voor het hergebruik van PDMS-apparaten en tips voor het minimaliseren van uitdroging, zelfs in omgevingen met een lage luchtvochtigheid. Deze techniek maakt de longitudinale monitoring van verschillende fysiologische parameters mogelijk, waaronder gestimuleerde activiteit, niet-gestimuleerde activiteit, lichaamsgrootte, bewegingsgeometrie, gezondheid en overleving, in een omgeving die vergelijkbaar is met de standaardtechniek voor groepscultuur op vaste media in petrischplaten. Deze methode is compatibel met gegevensverzameling met hoge doorvoer wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met geautomatiseerde microscopie- en analysesoftware. Ten slotte worden de beperkingen van deze techniek besproken, evenals een vergelijking van deze aanpak met een recent ontwikkelde methode die microtrays gebruikt om geïsoleerde nematoden op vaste media te kweken.

Introduction

Caenorhabditis elegans worden vaak gebruikt in verouderingsstudies vanwege hun korte generatietijd (ongeveer 3 dagen), korte levensduur (ongeveer 3 weken), gemak van kweken in het laboratorium, hoge mate van evolutionair behoud van moleculaire processen en routes met zoogdieren, en brede beschikbaarheid van genetische manipulatietechnieken. In de context van verouderingsstudies maken C. elegans het mogelijk om snel gegevens over de levensduur en verouderde populaties te genereren voor de analyse van fenotypen op latere leeftijd bij levende dieren. De typische aanpak voor het uitvoeren van wormverouderingsstudies omvat het handmatig meten van de levensduur van een populatie wormen die in groepen van 20 tot 70 dieren wordt gehouden op vaste agarnematodengroeimedia (NGM) in 6 cm petriplaten1. Het gebruik van leeftijdsgesynchroniseerde populaties maakt het mogelijk om de levensduur of cross-sectionele fenotypes in individuele dieren in de hele populatie te meten, maar deze methode sluit het monitoren van de kenmerken van individuele dieren in de loop van de tijd uit. Deze aanpak is ook arbeidsintensief, waardoor de omvang van de populatie die kan worden getest, wordt beperkt.

Er is een beperkt aantal kweekmethoden die de longitudinale monitoring van individuele C. elegans gedurende hun hele levensduur mogelijk maken, en elk heeft een verschillende reeks voor- en nadelen. Microfluïdica-apparaten, waaronder WormFarm2, NemaLife3 en de "gedrags"-chip4, onder andere 5,6,7, maken het mogelijk om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen. Het kweken van wormen in vloeibare cultuur met behulp van multi-well platen maakt het op dezelfde manier mogelijk om individuele dieren of kleine populaties van C. elegans in de loop van de tijd te volgen 8,9. De vloeibare omgeving vertegenwoordigt een andere omgevingscontext dan de gemeenschappelijke kweekomgeving op vaste media in petrischlaten, die aspecten van de dierfysiologie kunnen veranderen die relevant zijn voor veroudering, waaronder het vetgehalte en de expressie van stressresponsgenen10,11. Het vermogen om deze studies direct te vergelijken met de meerderheid van de verzamelde gegevens over ouder wordende C. elegans wordt beperkt door verschillen in potentieel belangrijke omgevingsvariabelen. De Worm Corral12 is een benadering die is ontwikkeld om individuele dieren te huisvesten in een omgeving die de typische vaste mediacultuur beter nabootst. De Worm Corral bevat een afgesloten kamer voor elk dier op een microscoopglaasje met behulp van hydrogel, waardoor geïsoleerde dieren longitudinaal kunnen worden gevolgd. Deze methode maakt gebruik van standaard brightfield-beeldvorming om morfologische gegevens vast te leggen, zoals lichaamsgrootte en activiteit. Dieren worden echter als embryo's in de hydrogelomgeving geplaatst, waar ze hun hele leven ongestoord blijven. Dit vereist het gebruik van voorwaardelijk steriele mutante of transgene genetische achtergronden, wat zowel de capaciteit voor genetische screening beperkt, aangezien elke nieuwe mutatie of transgen moet worden gekruist naar een achtergrond met voorwaardelijke steriliteit, als de capaciteit voor geneesmiddelenscreening, aangezien behandelingen slechts eenmaal kunnen worden toegepast op de dieren als embryo's.

Een alternatieve methode ontwikkeld door het Fang-Yen lab maakt het mogelijk om wormen te kweken op vaste media in individuele putten van een microgefabriceerd polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat genaamd een WorMotel13,14. Elk apparaat wordt in een lade met één put geplaatst (d.w.z. met dezelfde afmetingen als een plaat met 96 putten) en heeft 240 putten gescheiden door een gracht gevuld met een aversieve oplossing om te voorkomen dat de wormen tussen putten reizen. Elke put kan een enkele worm huisvesten voor de duur van zijn levensduur. Het apparaat is omgeven door waterabsorberende polyacrylamide-gelpellets (aangeduid als "waterkristallen") en de lade is verzegeld met Parafilm-laboratoriumfilm om de luchtvochtigheid te handhaven en de uitdroging van de media te minimaliseren. Met dit systeem kunnen gegevens over gezondheid en levensduur voor individuele dieren worden verzameld, terwijl het gebruik van vaste media de omgeving die dieren ervaren in de overgrote meerderheid van de gepubliceerde C. elegans levensduurstudies beter samenvat, waardoor directere vergelijkingen mogelijk zijn. Onlangs is een vergelijkbare techniek ontwikkeld met behulp van polystyreenmicrotrays die oorspronkelijk werden gebruikt voor microcytotoxiciteitstests15 in plaats van het PDMS-apparaat16. De microtray-methode maakt het mogelijk om geïndividualiseerde gegevens te verzamelen voor wormen die op vaste media zijn gekweekt en heeft een verbeterde capaciteit voor het bevatten van wormen onder omstandigheden die normaal gesproken vluchten zouden veroorzaken (bijv. Stressoren of dieetbeperking), met als afweging dat elke microtray slechts 96 dieren kan bevatten16, terwijl het multi-well apparaat dat hier wordt gebruikt tot 240 dieren kan bevatten.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het voorbereiden van multi-well-apparaten dat is geoptimaliseerd voor plaat-tot-plaatconsistentie en de voorbereiding van meerdere apparaten parallel. Dit protocol is aangepast van het oorspronkelijke protocol van het Fang-Yen laboratorium13. Specifiek zijn er beschrijvingen voor technieken om besmetting te minimaliseren, de consistente droging van zowel de vaste media als de bacteriële voedselbron te optimaliseren en RNAi en medicijnen te leveren. Dit systeem kan worden gebruikt om individuele gezondheid, levensduur en andere fenotypen te volgen, zoals lichaamsgrootte en -vorm. Deze multi-well apparaten zijn compatibel met bestaande high-throughput systemen om de levensduur te meten, die veel van de handmatige arbeid die betrokken is bij traditionele levensduurexperimenten kan verwijderen en de mogelijkheid biedt voor geautomatiseerde, directe levensduurmeting en gezondheidstracking in individuele C. elegans op schaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van stockoplossingen en media

OPMERKING: Voordat u begint met de voorbereiding van de multi-well-apparaten, bereidt u de volgende voorraadoplossingen en media voor.

  1. Stamoplossingen voor nematodengroeimedia (NGM) en laagsmeltende NGM (lmNGM):
    1. Bereid 1 MK2 HPO4: Voeg 174,18 g K2HPO4 toe aan een fles van 1 L en vul deze tot 1 L met steriel gedeïoniseerd water. Autoclaaf (121 °C, 15 psig) gedurende 30 min, en bewaren bij kamertemperatuur (RT).
    2. Bereid 1 M KPi, pH 6,0: Voeg 136,09 g KH2HPO4 toe aan een fles van 1 L en vul deze tot 1 L met steriel gedeïoniseerd water. Titreer met 1 M K2HPO4 tot pH 6,0. Autoclaaf (121 °C, 15 psig) gedurende 30 min, en bewaren bij RT.
    3. Bereid 1 M CaCl 2: Voeg 73,5 g CaCl2 toe aan een fles van 500 ml en vul deze tot 500 ml met steriel gedeïoniseerd water. Autoclaaf (121 °C, 15 psig) gedurende 30 min, en bewaren bij RT.
    4. Bereid 1 M MgSO 4: Voeg 123,25 g MgSO4 toe aan een fles van 500 ml en vul deze tot 500 ml met steriel gedeïoniseerd water. Autoclaaf (121 °C, 15 psig) gedurende 30 min, en bewaren bij RT.
    5. Bereid 5 mg / ml cholesterol: combineer 2,5 g cholesterol, 275 ml 100% ethanol en 25 ml steriel gedeïoniseerd water in een amberkleurige fles van 500 ml. Winkel bij RT.
    6. Bereid 50 mM floxuridine: Combineer 0,1231 g floxuridine en 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Filtersteriliseer het met een filter van 0,22 μm met een spuit van 10 ml. Aliquot 1 ml elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar ze bij −20 °C.
    7. Bereid 50 mg / ml carbenicilline: Combineer in een conische buis van 15 ml 500 mg carbenicilline met 10 ml steriel gedeïoniseerd water. Filtersteriliseer het met een filter van 0,22 μm met een spuit van 10 ml. Aliquot 1 ml elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar ze bij −20 °C.
    8. Bereid 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG): Combineer in een conische buis van 15 ml 2,38 g IPTG met 10 ml steriel gedeïoniseerd water. Filtersteriliseer het met een filter van 0,22 μm met een spuit van 10 ml. Aliquot 1 ml elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar ze bij −20 °C.
    9. Bereid 100 mg / ml ampicilline: Combineer in een conische buis van 15 ml 1 g ampicilline met 10 ml steriel gedeïoniseerd water. Filtersteriliseer het met een filter van 0,22 μm met een spuit van 10 ml. Aliquot 1 ml elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar ze bij −20 °C.
  2. Voorbereiding van nematodengroeimedia (NGM) voor algemeen onderhoud van C. elegans
    1. Om 50 platen te maken, in een kolf van 1 L, combineer 10 g Bacto agar, 1,5 g NaCl, 1,25 g Bacto pepton en 486 ml ultrapuur water. Autoclaaf op een vloeibare cyclus (121 °C, 15 psig) gedurende ten minste 30 minuten om te steriliseren.
    2. Voeg na de autoclaaf, nadat de media zijn afgekoeld tot 55 °C, 12,5 ml 1 M KPi, 500 μl 1 M MgSO4, 500 μl 1 M CaCl2 en 500 μl 5 mg/ml cholesterol toe.
    3. Giet met behulp van een steriele techniek 10 ml media in elke plaat van 60 mm (50 in totaal). Nadat de media zijn gestold (ten minste 30 minuten na het gieten), pipet 300 μL bacteriecultuur (bereid volgens stap 4 en stap 10) die 's nachts op het midden van de plaat is gegroeid. Laat de plaat op de bank liggen, laat de bacteriecultuur drogen en dikker worden (1-2 dagen). Bewaar de borden bij 4 °C.
  3. Bereid het laagsmeltende nematodengroeimedium (lmNGM) voormengsel:
    1. Combineer in een kolf van 500 ml 4 g smeltarme agarose, 0,5 g Bacto Peptone en 195 ml ultrapuur water. Autoclaaf op een vloeibare cyclus (121 °C, 15 psig) gedurende ten minste 30 minuten om te steriliseren.
    2. Terwijl de media nog steeds gesmolten zijn, verdeelt u 10 ml aliquots in steriele glazen reageerbuizen. Sluit elke reageerbuis af met Parafilm, gevolgd door een reageerbuisdop om het lmNGM-voormengsel te behouden en uitdroging te voorkomen. De media zullen stollen en kunnen voor gebruik ~ 2 weken bij RT worden bewaard.
  4. Bereid 142,8 mM NaCl: Combineer in een fles van 250 ml 0,8345 g NaCl en 100 ml steriel gedeïoniseerd water. Autoclaaf (121 °C, 15 psig) gedurende 30 min, en bewaren bij RT.
  5. Bereid wasmiddeloplossing: Combineer in een conische buis van 15 ml 3 ml Tween 20 en 7 ml steriel gedeïoniseerd water. Meng grondig, filtersteriliseer met een filter van 0,22 μm met een spuit van 10 ml en bewaar bij RT.
  6. Bereid kopersulfaatoplossing: Combineer in een steriele fles van 50 ml 20 ml steriel gedeïoniseerd water, 0,5 g CuSO4 en 100 μl wasmiddeloplossing (bereid in stap 1.5). Meng tot de CuSO4 is opgelost. Winkel bij RT.
  7. Bereid waterabsorberende polyacrylamidekristallen voor: combineer in een autoclaafveilige knijpfles 150 ml gedeïoniseerd water en 1 g type S superabsorberend polymeer. Meng voorzichtig door de fles meerdere keren om te keren. Autoclaaf op een vloeibare cyclus (121 °C, 15 psig) gedurende ten minste 20 minuten, en bewaren bij RT.
  8. Bereid lysogene bouillon (LB): Combineer in een bekerglas van 1 L of groter 20 g LB-poeder met 1 L gedeïoniseerd water. Aliquot in twee bekers van 500 ml. Autoclaaf (121 °C, 15 psig) gedurende 30 min, en bewaren bij RT
  9. Bereid lysogenie bouillon (LB) agar platen:
    1. Meng in een kolf van 1 L 10 g LB-poeder, 7,5 g Bacto Agar en 500 ml gedeïoniseerd water. Autoclaaf op een vloeibare cyclus (121 °C, 15 psig) gedurende 30 min.
    2. Voeg desgewenst optionele antibiotica toe (post-autoclaaf, nadat de media zijn afgekoeld tot 55 °C): 500 μL of 100 mg/ml ampicilline. Giet met behulp van een steriele techniek 20 ml media in elke plaat van 100 mm (25 in totaal) en bewaar bij 4 °C.

2. Het printen van de 3D multi-well apparaat mal

OPMERKING: Elk apparaat is gegoten uit PDMS met behulp van een aangepaste 3D-geprinte mal. Een enkele mal kan zoveel apparaten produceren als nodig is; Als u echter meerdere apparaten tegelijkertijd probeert voor te bereiden, is één 3D-geprinte mal vereist voor elk apparaat dat parallel moet worden gemaakt.

  1. Download het STL-bestand (zie Aanvullend Dossier 1).
  2. Print de mal met een 3D-printer met hoge resolutie.
    OPMERKING: De resolutie van de printer moet hoog genoeg zijn om consistente put- en slotgrachtvolumes mogelijk te maken. De voorgestelde printerresolutie is een minimale XY-resolutie van ~40 μm en een laagresolutie van 28 μm. Het materiaal dat door de 3D-printer wordt gebruikt, is net zo belangrijk, omdat veel materiaalsoorten voorkomen dat het PDMS uithardt. Uit ervaring blijkt dat mallen geproduceerd door PolyJet-printers met hoge resolutie (resolutie: X-as = 600 dpi, Y-as = 600 dpi, Z-as = 1.600 dpi) met behulp van het Vero Black-afdrukmateriaal consistent werken. Het 3D-printen van de mallen die in dit onderzoek zijn gebruikt, is uitbesteed (printdetails zijn te vinden in de Materiaaltabel).

3. Voorbereiding van het multi-well apparaat

OPMERKING: In dit gedeelte wordt beschreven hoe de 3D-geprinte mal wordt gebruikt om het PDMS multi-well-apparaat te maken.

  1. Stel de uithardingsoven in op 55 °C om voorverwarmen mogelijk te maken.
  2. Bepaal het aantal apparaten dat in één batch moet worden bereid. Meng voor elk apparaat 60 g PDMS-basis en 6 g uithardingsmiddel in een grote wegwerpweegboot (of een vergelijkbare wegwerpcontainer) met behulp van een wegwerpspatel.
  3. Plaats het PDMS-mengsel gedurende 30 minuten in een vacuümkamer bij −0,08 MPa om bubbels te verwijderen.
  4. Giet het PDMS-mengsel in elke 3D-geprinte mal. Vul de mal volledig, waarbij het PDMS-mengsel iets boven de bovenkant van de mal uitsteekt. Bewaar overtollig PDMS-mengsel om de mal bij te vullen in geval van morsen.
  5. Plaats de gevulde mal en elk extra PDMS-mengsel gedurende 25 minuten in de vacuümkamer bij −0,08 MPa om eventuele bubbels te verwijderen die tijdens het gietproces zijn ontstaan.
  6. Verwijder de gevulde vorm uit de vacuümkamer en knal eventuele resterende bubbels met een wegwerpspatel. Gebruik de spatel om zichtbaar vuil of resterende bubbels naar de rand van de mal weg te borstelen van de putjes. Eventueel achtergebleven vuil of bubbels kunnen de beeldvorming in de latere stappen mogelijk verstoren.
  7. Zorg ervoor dat de mal volledig is gevuld met het PDMS-mengsel; Het is gebruikelijk dat een klein deel van het mengsel uitlekt terwijl het zich in de vacuümkamer bevindt of tijdens het overbrengen. Bijvullen met het extra PDMS-mengsel dat in stap 3.5 is ontgast. Dit zou geen bubbels moeten creëren, maar als ze zich vormen, kunnen ze voorzichtig met de spatel naar de zijkant van de mal worden geborsteld.
  8. Plaats een vlakke acrylplaat bovenop de met PDMS gevulde mal door eerst de ene rand te plaatsen en de andere langzaam te laten zakken totdat het acryl plat op de mal zit, waarbij elk PDMS-mengsel dat zich boven de rand uitstrekt, wordt verplaatst. Als er zich bellen vormen tijdens het plaatsen van de acrylplaat, verwijder dan langzaam het acrylaat, vul de mal indien nodig opnieuw met PDMS-mengsel en start de acrylplaatsing opnieuw. De acrylplaat vormt een vlakke bodem voor het gegoten apparaat en zorgt ervoor dat alle putten zich op hetzelfde niveau bevinden ten opzichte van de basis.
  9. Plaats een gewicht van 2,5 lb bovenop het acrylaat. Meerdere mallen, elk met een aparte acrylplaat, kunnen worden gestapeld. Plaats de verzwaarde vormen in de oven en laat ze een nacht uitharden bij 55 °C.
  10. Haal de volgende dag de gewichten en de vormpjes uit de oven.
  11. Werk voorzichtig een scheermesje tussen het acryl en uitgeharde PDMS om de verzegeling te verbreken. Verwijder voorzichtig het acryl van de bovenkant van de mal. Het PDMS zal op dit punt zijn ingesteld en het verwijderen van het acryl kan enige kracht vergen.
  12. Maak met behulp van een scheermes of een metalen spatel voorzichtig de zijkanten van het uitgeharde PDMS los van de mal. Het is gemakkelijk om het PDMS in dit stadium te scheuren; werk langzaam en voorzichtig rond de rand om het PDMS-apparaat intact te verwijderen.
    OPMERKING: Vers geprinte mallen zijn bijzonder kleverig voor de eerste drie toepassingen en het PDMS scheurt vaak tijdens het verwijderen van het apparaat. Met meer toepassingen wordt het gemakkelijker om het uitgeharde PDMS uit de mal te verwijderen.
  13. Wikkel het apparaat in aluminiumfolie en sluit het af met autoclaaftape. Autoclaaf op een droge cyclus gedurende ten minste 15 minuten bij 121 °C, 15 psig om te steriliseren. Na het autoclaveren bewaart u de ingepakte apparaten op de bank en gebruikt u ze indien nodig.

4. Streaking van de bacteriën

OPMERKING: Begin met het bereiden van de bacteriën die zullen worden gebruikt als de voedselbron van de wormen terwijl ze zich op het multi-well-apparaat bevinden. De meest voorkomende bacterie is Escherichia coli stam OP50 (of stam HT115 voor RNAi experimenten). Voer deze stap ten minste 2 dagen uit voordat u de wormen aan het apparaat toevoegt.

  1. Streep de bacteriën op een verse LB-plaat. Zorg ervoor dat eventuele stamspecifieke selectieve additieven (bijv. ampicilline om een plasmide te selecteren dat ampicillineresistentie tegen de bacteriën verleent) in de LB-platen zijn opgenomen.
  2. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende een nacht (~ 18 uur) om de kolonies te laten groeien.

5. Voorbereiding van het multi-well apparaat voor het laden van media

OPMERKING: Het oppervlak van het siliconen PDMS-materiaal waaruit het apparaat bestaat, is hydrofoob, wat voorkomt dat de kleine putjes en aversieve grachten worden gevuld met respectievelijk NGM en kopersulfaat. Om dit probleem te omzeilen, wordt een zuurstofplasma gebruikt om de oppervlakte-eigenschappen van het apparaat tijdelijk hydrofiel te wijzigen, waardoor de putten en gracht binnen een beperkt tijdvenster (tot ~ 2 uur) kunnen worden gevuld. In dit gedeelte worden de stappen beschreven voor het voltooien van het plasmareinigingsproces. Voltooi deze stap ten minste 1 dag voordat u het apparaat met bacteriën spot, omdat slepende effecten van de plasmareiniging het spotten kunnen verstoren. Gezien de timing van secties 5-7, is de praktische limiet voor deze stappen per technicus drie apparaten parallel.

  1. Verwarm een droge kraalbadincubator voor op 90 °C ter voorbereiding op rubriek 6.
  2. Aangezien het totale mediavolume dat nodig is om de putten van een apparaat met meerdere putten te vullen klein is in vergelijking met dat voor petriplaten, bereidt u een grote partij NGM voor en aliquoteert u deze in reageerbuizen (zie stap 1.3).
    OPMERKING: Dit kan van tevoren worden gedaan, omdat de buisjes media ~ 2 weken op de bank kunnen worden bewaard. Als de media zijn voorbereid en in buizen zijn gealiciteerd, gaat u verder met stap 5.3.
  3. Terwijl u handschoenen draagt, pakt u een autoclaaf multi-well-apparaat uit; Vermijd het aanraken van een van de putten. Knip een kleine inkeping in de rechterbovenhoek van het apparaat om aan te geven hoe vaak het is gebruikt/hergebruikt (zie sectie 15 hieronder voor instructies en aanbevelingen voor het reinigen en hergebruiken van elk apparaat).
  4. Plaats maximaal drie onverpakte apparaten in de plasmareiniger met de putjes naar boven gericht. Voer de plasmareiniger uit.
    OPMERKING: De volgende gedetailleerde instructies zijn voor de Plasma Etch PE-50 plasmareiniger. De specifieke stappen en instellingen moeten worden aangepast en mogelijk opnieuw worden geoptimaliseerd voor andere plasmareinigers.
    1. Controleer of het vermogensniveau van de plasmareiniger is ingesteld op 75%.
    2. Zorg ervoor dat de ontluchtings- en isolatiekleppen beide in de UIT-stand staan.
    3. Open de hoofdklep op de zuurstoftank. Wacht tot de druk van de regelaar daalt tot tussen 15 psig en 20 psig en draai vervolgens de isolatieklep naar de AAN-positie .
    4. Zet de vacuümpomp en plasmareiniger aan.
    5. Voer de volgende instellingen in op de plasmareiniger (eerste gebruik) of controleer of de eerder geprogrammeerde instellingen correct zijn:
      Plasma tijd: 3:00 min
      Vacuüm instelpunt: 149,5 mTorr
      Atmosferische ventilatieopening: 45 s
      Leegspoeling: 5 s
      Gas stabiliseren: 15 s
      Vacuüm alarm: 3:00 min
      Automatische uitschakeling: AAN
    6. Druk op Enter om naar het menu Opdrachten te gaan. Gebruik de toets Pijl-rechts om Setup-menu te selecteren en druk op Enter. Blader door alle instellingen door op Enter te drukken om elke huidige instelling te bevestigen en vervolgens op de pijl-rechts om naar de volgende instelling te gaan.
    7. Ga terug naar het menu Opdrachten door op pijl-omhoog en vervolgens op pijl-links te drukken.
    8. Druk in het scherm Opdrachtenmenu op Enter. Selecteer Commands PLASMA door op Enter te drukken. Het systeem doorloopt de volgende fasen:
      Plasma Pompdown
      Gasstabilisator: Stel tijdens deze fase de Gas 1-knop op de plasmareiniger in totdat de flowmeter op 10 cc / min staat.
      Plasma tijd
      Pompdown leegmaken
      Plasmacyclus voltooid
      Kamer ventilatie
      OPMERKING: Dit proces duurt ongeveer 5-10 minuten om te voltooien. Wanneer alle fasen zijn voltooid, wordt het opdrachtenmenu opnieuw op het scherm weergegeven. Als tijdens de Plasma Pumpdown-fase de druk niet laag genoeg wordt, gaat de plasmareiniger niet door naar de volgende fase en geeft het scherm een foutmelding weer. Als dit gebeurt, controleer dan de olie van de vacuümpomp. Als de olieniveaus laag zijn of de olie troebel/vuil is, kan het verversen van de olie ervoor zorgen dat de vacuümdruk het benodigde niveau bereikt.
    9. Schakel de hoofdklep op de zuurstoftank uit.
    10. Draai heel langzaam de ontluchtingsklep naar de AAN-positie en laat de regeldruk van de zuurstoftank terugkeren naar nul.
    11. Zet de isolatieklep in de UIT-stand .
    12. Zet de stofzuiger en plasmareiniger uit.
      OPMERKING: De hydrofiele oppervlaktemodificatie van het multiwell-apparaat door de plasmareiniger is tijdelijk en wordt in de loop van de tijd (tot ongeveer 2 uur) steeds minder effectief. Doorloop sectie 6 en sectie 7 zo snel mogelijk.

6. De putten vullen met lmNGM

OPMERKING: Een droge kraalbadincubator moet zijn ingeschakeld en voorverwarmd vanaf stap 5.1. Zorg ervoor dat het bad 90 °C heeft bereikt.

  1. Steriliseer één polystyreenbakje met één put per apparaat door de binnenkant van de lade met 70% ethanol te besproeien en droog te vegen met een taakdoekje.
  2. Verwijder elk apparaat met een gehandschoende hand uit de plasmareiniger en plaats het in een schoongemaakte lade.
  3. Plaats een wegwerppipetbak van 25 ml in de broedmachine voor kraalbaden na verhitting tot 90 °C.
  4. Verzamel één buisje gestolde lmNGM-voormengsel per te vullen apparaat (zie stap 1.3).
  5. Plaats de lmNGM voormengsel reageerbuizen in een glazen bekerglas van 200 ml en verwijder de doppen en Parafilm. Magnetron gedurende ~ 20 s totdat de media voldoende smelt om te gieten (de aanwezigheid van sommige vaste media is in dit stadium prima).
  6. Combineer het gesmolten lmNGM-voormengsel uit meerdere reageerbuizen in een ander steriel bekerglas van 200 ml. Ga door met microwaving voor nog eens 20 s om een totaal van 40 s te bereiken. Als het lmNGM-voormengsel begint over te koken, stop dan de magnetron en laat het lmNGM-voormengsel bezinken voordat u doorgaat.
  7. Haal het gesmolten lmNGM-voormengsel uit de magnetron en laat het afkoelen tot ~60 °C.
    OPMERKING: In dit stadium zal de media afkoelen en resolideren na ~ 5 min. Ga onmiddellijk verder met stap 6.8 en stap 6.9.
  8. Voeg voor elke 10 ml lmNGM-voormengsel het volgende toe (in volgorde): 250 μl 1 M KPi, 10 μl 1 M MgSO4, 10 μl 1 M CaCl2 en 10 μl 5 mg/ml cholesterol.
    1. Om het uitkomen van eieren te voorkomen bij het controleren van volwassenen op het apparaat, voegt u 10 μL floxuridine van 50 mM toe.
    2. Om te selecteren op een RNAi-plasmide en om de expressie van het RNA te induceren, voegt u 5 μL van 50 mg / ml carbenicilline en 12 μL van 1 mM IPTG toe.
      OPMERKING: De antibiotica of andere additieven kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van het ontwerp van het experiment. Testmiddelen/geneesmiddelen kunnen in dit stadium ook aan de media worden toegevoegd.
  9. Giet de gesmolten lmNGM in het bassin van 25 ml in het kralenbad.
  10. Vul de putjes van het apparaat met lmNGM met behulp van een 200 μL meerkanaals repeaterpipet.
    1. Stel de repeater in op het afgeven van aliquots van 14 μL (14 μL kan tot 14 keer worden gedoseerd bij gebruik van een pipetpunt van 200 μL).
    2. Monteer vijf pipetpunten. De putten van het apparaat hebben dezelfde afstand als een plaat met 384 putten. Standaard meerkanaals pipetten zijn zo verdeeld dat de gebruiker in elke andere put in een rij/kolom kan pipetten.
    3. Laad de tips met gesmolten lmNGM. Doseer de eerste 14 μL terug in het lmNGM-bevattende bassin.
    4. Beweeg snel maar voorzichtig, doseer 14 μL in de binnenste putten (wit in figuur 1B), beginnend met die gemarkeerd met een "x" in figuur 1B en beweeg over de plaat naar rechts en vervolgens naar beneden, waarbij in totaal 12 keer (60 putjes) wordt uitgedeeld.
    5. Doseer de resterende lmNGM terug in het bassin, omdat het uiteindelijke aliquot meestal minder dan 14 μL is.
    6. Herhaal stap 6.10.3-6.10.5 totdat alle binnenste putten zijn gevuld.
    7. Stel vervolgens de repeater in op het afgeven van aliquots van 15 μL. Herhaal stap 6.10.3-6.10.5, maar vul in plaats van de binnenste putjes de buitenste ring van putjes (grijs in figuur 1B), beginnend met de putjes gemarkeerd met "+" in figuur 1B en bewegend rond de buitenrand van de plaat.
      OPMERKING: Werk snel zodat het medium niet stolt in de pipetpunten. Vermijd het morsen van lmNGM in de gracht. De buitenste putten hebben de neiging om sneller te drogen. De extra 1 μL lmNGM zorgt ervoor dat de uiteindelijke gedroogde put een vlak oppervlak heeft in dezelfde droogtijd als de binnenste putten.
  11. Als een stap voor kwaliteitscontrole, onderzoekt u elke put om die te identificeren met gebreken die de beeldvorming kunnen verstoren, inclusief putten die ondergevuld zijn (het lmNGM-oppervlak is verzonken onder de rand van de put), overgevuld (het lmNGM-oppervlak heeft een koepelvormige bovenkant) en bellen of puin bevatten.
  12. Verwijder de gestolde lmNGM uit de onbevredigende putjes met een korte platina draadprikker of vacuümaspirator. Vul de lege putjes opnieuw met vers gesmolten lmNGM. Verwijder ook alle media die in de gracht zijn overgelopen met een korte platina draadprikker of vacuümaspirator.

7. Kopersulfaat toevoegen aan de gracht

OPMERKING: De putten van dit apparaat zijn omgeven door een doorlopende gracht. Hier is de gracht gevuld met kopersulfaat, dat als een afweermiddel werkt en de wormen ervan weerhoudt om uit hun putten te vluchten.

  1. Breng met behulp van een pipet van 200 μL 200 μL kopersulfaatoplossing (zie stap 1.6) in elke hoek in de slotgracht van het apparaat, 2x per hoek. Dit moet een voldoende groot volume zijn om het kopersulfaat door de hele gracht te laten stromen. Pas op dat u de gracht op geen enkel moment overvult; Het kopersulfaat mag het bovenoppervlak van de putten niet raken.
  2. Als het kopersulfaat niet gemakkelijk door de hele gracht stroomt, gebruik dan een korte platinadraadprikker om de spanning te doorbreken en het kopersulfaat door de gracht te slepen.
  3. Nadat het kopersulfaat door de gehele gracht is gestroomd, verwijdert u zoveel mogelijk kopersulfaat uit de gracht met behulp van een pipet van 200 μL of aspiratie met een vacuüm. Het residu dat achterblijft, zal voldoende zijn om de wormen ervan te weerhouden hun putten te verlaten. Als u de gracht vol met kopersulfaatoplossing verlaat, loopt u het risico dat kopersulfaat in de putten terechtkomt, waardoor wormen zouden vluchten.

8. Autoclaaf waterkristallen toevoegen

OPMERKING: Om de luchtvochtigheid in de plaat te behouden en uitdroging van de lmNGM te voorkomen, is elk apparaat omgeven door verzadigde waterabsorberende polyacrylamidekristallen.

  1. Bereid de waterkristallen voor (zie stap 1.7).
  2. Voeg met behulp van een knijpfles de waterkristallen toe in de ruimtes tussen het apparaat en de wanden van de lade. Sluit het deksel van de lade en wikkel alle vier de zijden met een stuk Parafilm. Voeg twee extra stukjes Parafilm toe om de plaat volledig af te sluiten.
    OPMERKING: Waterkristallen kunnen in een bekerglas worden bereid en met een gesteriliseerde spatel in de lade worden geschept. Dit voegt echter tijd toe aan de procedure en verhoogt de tijd dat elke tray open is en wordt blootgesteld aan potentiële verontreinigingen.
  3. Laat het verzegelde apparaat op de bank liggen tot de volgende dag wanneer de bacteriën klaar zijn om te worden opgemerkt. Zorg ervoor dat de apparaten worden opgeslagen met de putten naar boven gericht nadat de lmNGM is toegevoegd.

9. Bereiding van een leeftijdsgesynchroniseerde populatie wormen

OPMERKING: De volgende stappen leveren een gesynchroniseerde populatie wormen op die klaar zijn om toe te voegen aan het multi-well-apparaat in het vierde larvale stadium (L4). Wormen in verschillende stadia van ontwikkeling kunnen echter ook worden toegevoegd. Deze stap moet 2 dagen voordat u de wormen aan het apparaat toevoegt worden voltooid als L4's gewenst zijn. Pas de timing van de synchronisatie aan voor de gewenste levensfase.

  1. Voor consistente verouderingsstudies moet u C. elegans op standaard NGM-platen handhaven (zie stap 1.2 bij 20 °C onder goed gevoede omstandigheden).
  2. Verkrijg een gesynchroniseerde populatie dieren uit een voorraadplaat via standaardmethoden, bijvoorbeeld het bleken van17 of het leggen van getimede eieren1.
  3. Voeg geïsoleerde eieren toe aan een NGM-plaat die is bevlekt met bacteriën. De eieren komen op deze plaat uit en de wormen bereiken het L4-larvale stadium in 2 dagen voor wilde dieren.

10. Inenten van de bacteriecultuur

OPMERKING: Bacteriën worden gebruikt als de primaire voedselbron voor C. elegans, meestal E. coli-stammen OP50 of HT115 . De bacteriën zijn 10-voudig geconcentreerd, wat moet worden verantwoord in het volume van de bereide cultuur. Bereid een bacteriecultuur voor de dag voordat u het apparaat spot.

  1. Kies uit de LB-plaat die in stap 4 is voorbereid een enkele kolonie en ent 12 ml steriele LB per te spotten apparaat. Voeg selectieve middelen toe indien nodig voor de bacteriestam die wordt gebruikt.
  2. Kweek de bacteriecultuur 's nachts (~18 uur) in een 37 °C incubator met schudden bij ~250 tpm.

11. De putten spotten met geconcentreerde bacteriën

OPMERKING: Aan elke put wordt een klein volume geconcentreerde bacteriën toegevoegd, wat voldoende is om de wormen gedurende hun hele levensduur op het apparaat te voeden. De bacteriecultuur moet worden gedroogd voordat de wormen aan de putten kunnen worden toegevoegd. Omdat het mediavolume in elke put klein is (14-15 μL) ten opzichte van het toegevoegde bacterievolume (5 μL), kan het chemische gehalte van de bacteriële media de chemische omgeving van de put beïnvloeden. Om dit te verklaren, worden de bacteriën geconcentreerd en geresuspendeerd in zout water om uitgeputte LB te verwijderen terwijl hypoosmotische stress wordt vermeden. Er is geen zout toegevoegd aan het lmNGM-recept (zie stappen 1.3-1.4) omdat het in dit stadium wordt toegevoegd.

  1. Nadat de bacteriën een nacht zijn gekweekt zoals beschreven in rubriek 10, concentreer je de bacteriecultuur 10x. Pellet de bacteriën door gedurende 20 minuten te centrifugeren bij ~3.400 x g , gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 1/10 van het oorspronkelijke kweekvolume van 142,8 mM NaCl (zie stap 1.4). Als u bijvoorbeeld een apparaat met 240 putten wilt herkennen, spint u 12 ml cultuur en resuspensie in 1,2 ml 142,8 mM NaCl.
    OPMERKING: Teststoffen /geneesmiddelen kunnen worden toegevoegd aan de geresuspendeerde bacteriecultuur voordat ze worden gespot.
  2. Gebruik een herhaalpipet om elk putje te spotten met 5 μL van de geconcentreerde bacteriën. Vermijd direct contact met het lmNGM-oppervlak, omdat de pipetpunt de lmNGM kan doorboren en de worm onder het oppervlak van de put kan laten graven. Pas op dat de bacteriën niet in de gracht terechtkomen, want de wormen zullen erdoor worden aangetrokken en in de gracht vluchten.
  3. Droog de gevlekte bacteriën met de deksels van de lade verwijderd. Deze stap is belangrijk voor de integriteit van de putomgeving op de lange termijn en er zijn verschillende manieren om de gevlekte apparaten te drogen. Welke methode ook wordt gebruikt, zorg ervoor dat het apparaat in een steriele omgeving blijft, omdat het onbedekt moet blijven terwijl de bacteriën drogen. Een verhoogde luchtstroom vermindert de droogtijd aanzienlijk. Drogen kan worden uitgevoerd zoals beschreven in de onderstaande stappen:
    1. Laat het apparaat onbedekt in een schone, afgesloten container, zoals een plastic bak die is gereinigd met 10% bleekmiddel, gevolgd door 70% ethanol. Deze droogmethode kan enkele uren duren.
    2. Plaats de apparaten onbedekt in een steriele laminaire stroomkap (vergelijkbaar met de voorkeursmethode hieronder).
    3. Droog de apparaten met behulp van een op maat gemaakte "droogbox" (de geoptimaliseerde methode die in deze studie wordt gevolgd), die tegen minimale kosten kan worden geconstrueerd met behulp van computerbehuizingsventilatoren en HEPA-filters (zie het aanvullende bestand 1).
      OPMERKING: Ongeacht de gebruikte methode moet de droogstap worden geoptimaliseerd voor de lokale omgeving. Controleer regelmatig hoe snel de putten drogen totdat de typische droogtijd is geïdentificeerd. In een omgeving met een lage luchtvochtigheid resulteert het gebruik van een droogbox in een droogtijd van ~30-40 min. Laat de platen niet te droog worden, omdat de media in de putten zullen krimpen en zinken. Het is beter om het apparaat uit het drogen te halen terwijl een paar putten nog nat zijn dan om het langer te laten drogen en mogelijk een groot aantal putten te drogen.
  4. Controleer de waterkristallen. Als de meerderheid van de waterkristallen in de lade is uitgedroogd en volume heeft verloren tijdens het droogproces, voeg dan meer toe aan de lade.
  5. Nadat de bacteriën droog zijn, voegt u de wormen onmiddellijk toe (sectie 12) of sluit u de lade af om later te gebruiken. Om af te sluiten, sluit u het deksel van de lade en wikkelt u alle vier de zijden met een enkel stuk Parafilm. Herhaal dit twee keer voor een totaal van drie Parafilm-lagen. Nadat de lade volledig is ingepakt, kan het apparaat tot 4 dagen op de bank bij kamertemperatuur worden achtergelaten voordat de wormen worden toegevoegd (sectie 12).

12. Wormen toevoegen aan het multi-well apparaat

  1. Voeg handmatig één worm per put toe aan elke put met behulp van een platina pick om de dieren over te brengen van de in sectie 9 bereide wormenplaten. Kies alleen wormen die zich in de gewenste levensfase en leeftijd bevinden.
    OPMERKING: Het duurt meer dan 1 uur om de wormen aan het apparaat toe te voegen, kan leiden tot lmNGM-uitdroging, dus de wormen moeten zo snel mogelijk worden toegevoegd. Het kiezen van meerdere wormen (20+) tegelijk voordat u ze aan de apparaatputten toevoegt, kan helpen de snelheid te verhogen.

13. Afwerking van de voorbereiding van het hulpmiddel voor langdurig gebruik

OPMERKING: Deze stappen zorgen ervoor dat de putjes van het apparaat gehydrateerd blijven gedurende de duur van het experiment.

  1. Onderzoek de waterkristallen. Zorg ervoor dat de waterkristallen op gelijke hoogte staan met de bovenkant van het apparaat, maar er niet overheen lopen. Voeg indien nodig extra waterkristallen toe aan de lade.
  2. Voeg een druppel bereide reinigingsmiddeloplossing (zie stap 1.5) toe aan de binnenkant van het deksel van de lade en wrijf in met een taakveeg totdat de reinigingsmiddeloplossing is opgedroogd. Dit voorkomt beslaan op het deksel nadat het apparaat in de lade is verzegeld, zodat de wormen duidelijk zichtbaar zijn.
  3. Wikkel de tray met drie stukken Parafilm met behulp van een specifieke techniek die de integriteit van de Parafilm-afdichting op lange termijn bevordert.
    1. Rek een stuk Parafilm iets uit, zodat het slechts twee zijden van het bakje bedekt. Herhaal dit met een tweede stukje Parafilm om de andere twee kanten te bedekken.
    2. Gelaagd op de eerste laag Parafilm, neem een laatste stuk Parafilm, rek het volledig uit en wikkel alle vier de zijden. Indien goed afgesloten, moeten de putjes van het apparaat gedurende ~ 2 maanden gehydrateerd blijven.
      OPMERKING: De integriteit van de Parafilm moet elke 1-2 weken worden gecontroleerd en de Parafilm moet worden vervangen als deze is gebroken.
  4. Verwijder eventuele vingerafdrukken van de bovenkant van de lade met behulp van een taakveeg bevochtigd met 70% ethanol.

14. Verzameling van de gegevens

OPMERKING: Het doel van deze studie is om de cultuurmethodologie te beschrijven. Eenmaal gevuld, zijn multi-well apparaten compatibel met de longitudinale monitoring van een verscheidenheid aan fenotypen. Hier worden basisrichtlijnen gegeven voor het meten van verschillende van de meest voorkomende parameters.

  1. Levensduur: Controleer de levensduur door op de plaat te tikken of de wormen elke 1-3 dagen bloot te stellen aan een helder blauw licht. Scoor als dood als er geen beweging wordt waargenomen. Deze multi-well apparaten zijn ook compatibel met geautomatiseerde beeldvormings- en analysepijplijnen voor het schatten van de levensduur13,18.
  2. Activiteit: Volg de activiteit van individuele dieren gedurende het hele leven door statische afbeeldingen of video's van de dieren in de apparaatputten te maken en de afgelegde afstand, snelheid of andere bewegingsstatistieken te beoordelen. De apparaten zijn ook compatibel met geautomatiseerde beeldvormings- en analysepijplijnen voor het schatten van activiteit13,18.
  3. Lichaamsgrootte en -vorm: Controleer de veranderingen in lichaamsgrootte en -vorm door statische beelden van de dieren in de apparaatputten te maken en de visuele parameters te kwantificeren met behulp van standaard beeldvormingstechnieken. In principe zou deze kweekmethode compatibel moeten zijn met bestaande software voor een meer geavanceerde beoordeling van de vorm van het wormlichaam 19,20,21.

15. Hergebruik van de apparaten

OPMERKING: Nadat een experiment is voltooid, kunnen de multi-well apparaten maximaal drie keer worden gereinigd en hergebruikt. Extra hergebruik begint de wormfenotypen te beïnvloeden, mogelijk veroorzaakt door chemicaliën uit de media of bacteriën die zich ophopen in de wanden van het PDMS-materiaal.

  1. Gooi de Parafilm weg en verwijder het apparaat uit de lade. Controleer de inkepingen in de rechterbovenhoek van het apparaat, die aangeven hoe vaak het is gebruikt. Als het drie keer is gebruikt, gooit u het apparaat weg. Als het minder dan drie keer is gebruikt, reinig en hergebruik het dan.
    OPMERKING: De trays zijn gemaakt van polystyreen en komen niet direct in contact met de lmNGM, bacteriën of additieven aan de media. Ze kunnen vele malen worden hergebruikt, zolang ze visueel helder blijven.
  2. Spoel eventuele resterende waterkristallen uit de lade. Spuit de binnenkant van de bak met 10% bleekoplossing en laat het 10 minuten zitten. Spoel af met gedeïoniseerd water en droog onmiddellijk om watervlekken te voorkomen.
  3. Houd het apparaat onder stromend water om te beginnen met het reinigen van de media uit de putten. Buig en draai het apparaat voorzichtig onder water om de media van de putten los te maken, maar buig niet zo ver dat het apparaat scheurt. Kies alle resterende media die vastzitten in putjes met een pipetpunt van 200 μL.
  4. Vul een bekerglas van 2 L met een roerstaaf ~3/4 vol met gedeïoniseerd water en breng aan de kook op een hete plaat.
  5. Voeg een of twee multi-well apparaten en een roerstaaf toe aan het kokende water. Zet het magnetisch roeren aan tot een lage snelheid (~ 200 tpm) om de apparaten voorzichtig in het water te roeren. Laat de apparaten 10 minuten koken.
  6. Haal de apparaten met een metalen pincet uit het water en leg ze goed naar beneden op keukenpapier om af te tappen. Laat de apparaten minimaal een nacht drogen.
  7. Wanneer de apparaten volledig droog zijn, wikkelt u ze in folie en sluit u ze af met autoclaaftape. Schrijf op de autoclaafband het aantal keren dat het apparaat is gebruikt. Autoclaaf op een droge cyclus gedurende 15 minuten bij 121 °C om te steriliseren. De apparaten zijn nu klaar voor hergebruik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het WorMotel-cultuursysteem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan gegevens te verzamelen, waaronder over levensduur, gezondheid en activiteit. Gepubliceerde studies hebben multi-well-apparaten gebruikt om levensduur en gezondheid 13,14, rust en slaap 22,23,24 en gedrag 25 te bestuderen. De levensduur kan handmatig worden gescoord of door middel van een verzameling afbeeldingen en downstream beeldanalyse. In de eerste benadering kunnen de wormen handmatig worden waargenomen na een stimulus (bijvoorbeeld tikken op de plaat of blootstelling aan blauw licht) om de 1-3 dagen en als dood worden gescoord als er geen beweging wordt waargenomen, vergelijkbaar met standaardmethoden op petriplaten1. De laatste benadering is vergelijkbaar, behalve dat wormbeweging kan worden bepaald door frame-tot-frame-verschillen te vergelijken tussen de beelden die zijn gemaakt nadat de stimulus is toegepast. Dit biedt een extra voordeel omdat beweging informatie biedt over zowel het activiteitsniveau van individuele dieren op dat tijdstip als een metriek waarmee de levensduur (bijvoorbeeld het stoppen van beweging) en de gezondheid (er zijn meerdere definities voorgesteld) kunnen worden bepaald. De beelden kunnen verder worden gebruikt om extra fysiologische parameters te extraheren, zoals lichaamsgrootte, lichaamsvorm en lichaamshouding.

Om de capaciteit van het systeem aan te tonen, onderzochten we de klassieke epistatische relatie tussen de insulinereceptor, gecodeerd door het gen daf-2, en de downstream FOXO-familietranscriptiefactor gecodeerd door daf-16 in de context van levensduur, gezondheid en dagelijkse activiteit voor individuele dieren. Wild-type (stam N2) en daf-16(mu68) functieverlies (stam CF1038) C. elegans gevoed met E. coli (stam HT115) die ofwel controle uitdrukken (lege vector; EV) of daf-2 RNAi-voedingsconstructies werden gekweekt in multi-well-apparaten en elk dier werd gecontroleerd op levensduur (figuur 2A), gezondheid (figuur 2B) en dagelijkse activiteit (figuur 2C). De activiteit werd dagelijks gecontroleerd door elke 5 s gedurende 2 minuten een reeks stilstaande beelden te maken, waarbij de wormen gedurende 5 s op 1 minuut werden blootgesteld aan helder blauw licht om de activiteit te stimuleren (volgens Churgin et al.13). De dagelijkse activiteit voor elk dier werd geschat door de achtergrond over putten en afbeeldingen te normaliseren, het wormgebied in elke afbeelding te identificeren en de verandering in gebied tussen aangrenzende afbeeldingen te berekenen. Levensduur werd gedefinieerd als de leeftijd waarop activiteit voor het laatst werd waargenomen voor elke worm, en gezondheidspanne werd gedefinieerd als de leeftijd waarop een worm niet langer een volledige lichaamslengte kon bewegen. Zoals verwacht van talrijke eerdere studies (bijv. Kenyon et al.26, Murphy et al.27), resulteerde de daf-16(mu86) mutatie in een korte levensduur en voorkwam levensduurverlenging door de RNAi knockdown van daf-2 (Figuur 2A). Een vergelijkbaar patroon werd waargenomen voor de gezondheidsspanne (figuur 2B). Als een voordeel van het gebruik van multi-well apparaatcultuursystemen, maakt de capaciteit om individuele dieren gedurende het hele leven te volgen een gedetailleerde analyse mogelijk van de individuele variatie in elk gemeten fenotype in de populatie. De variatie in levensduur en gezondheid tussen individuele dieren kan bijvoorbeeld worden vergeleken in absolute termen (figuur 2D) of als een fractie van de totale levensduur (figuur 2E). Fenotypen in het vroege leven kunnen verder worden vergeleken met fenotypen in het late leven, inclusief de levensduur, bij individuele dieren in een populatie. De cumulatieve activiteit voor elk individueel dier gedurende de hele levensduur (d.w.z. het gebied onder de curve [AUC] voor individuele activiteit) correleerde bijvoorbeeld beter met de levensduur (figuur 2F) dan de cumulatieve levensduur tot dag 5 van het leven (figuur 2G) over alle gemeten omstandigheden. We benadrukken dat het doel van dit werk is om een gedetailleerd protocol te bieden voor het construeren van de multi-well omgeving voor het volgen van individuele dieren in de loop van de tijd, niet voor het meten van een specifiek fenotype met behulp van het apparaat. De representatieve resultaten in figuur 2 geven slechts één voorbeeld van de fenotypen die in dit systeem kunnen worden gemeten. Eenmaal gebouwd, is de multi-well omgeving compatibel met een breed scala aan technieken voor het meten van de fenotypen van vrij kruipende wormen op vaste media.

Figure 1
Figuur 1: Schema van de microfabricated multi-well apparaten . (A) Individuele C. elegans worden gekweekt op vaste laagsmeltende nematode groeimedia (lmNGM) agarose pads bezaaid met bacterieel voedsel in individuele putten. De ruimte tussen de putten is bedekt met een aversieve chemische stof (kopersulfaat) om elke worm in zijn put te isoleren. Elk apparaat is vastgezet in een lade met één put. De omtrek van de lade is gevuld met waterkristallen om de luchtvochtigheid te handhaven. De tray is afgesloten met Parafilm om zuurstofuitwisseling mogelijk te maken. Afbeelding gemaakt met BioRender.com. (B) Overzicht van de multiputinrichting met vermelding van de voorgestelde volgorde voor het laden van de putten. De binnenste putjes (wit) ontvangen 14 μL lmNGM. De buitenste putten (grijs) ontvangen 15 μL lmNGM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Correlatie van gemeten fenotypes tussen populaties bij individuele dieren met behulp van multi-well apparaten. Alle panels leveren gegevens van hetzelfde experiment waarin vier groepen dieren worden vergeleken: wilde dieren (N2) die onderworpen zijn aan lege vector EV (RNAi) (N = 138), wilde dieren die onderworpen zijn aan daf-2 (RNAi) (N = 151), daf-16 (mu86) dieren onderworpen aan EV (RNAi) (N = 123) en daf-16 (mu86) dieren onderworpen aan daf-2 (RNAi ) (N = 135). (A) De levensduurverlenging van daf-2(RNAi) wordt geblokkeerd door de daf-16(mu86) nulmutatie. Paarsgewijze significantie tussen groepen bepaald door de log-rank test (survdiff functie in R). (B) De gezondheidsspanne die hier wordt gedefinieerd als de dag waarop een dier niet langer een volledige lichaamslengteverlenging van daf-2 (RNAi) kan bewegen, wordt geblokkeerd door de daf-16 (mu86) nulmutatie. Paarsgewijze significantie tussen groepen bepaald door de log-rank test (survdiff functie in R). (C) Het 3-daags voortschrijdend gemiddelde van activiteit gedurende de levensduur wordt verminderd met zowel daf-16(mu86) als daf-2(RNAi). Significantie berekend door de Mann-Whitney U-test om het gebied onder de curve te vergelijken voor activiteit gedurende de levensduur voor individuele dieren tussen groepen. (D) Gezondheid en levensduur voor elke populatie als absolute waarden (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde). (E) Gezondheid en levensduur voor elke populatie genormaliseerd tot totale levensduur binnen elke groep (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde). (F) De cumulatieve activiteit gedurende de levensduur (oppervlakte onder de curve [AUC] gedurende de levensduur) voor individuele dieren correleert beter met de levensduur dan (G) de activiteit voor individuele dieren op een specifieke dag gedurende de levensduur (de activiteitscorrelatie op dag 8, die het punt weergeeft waarop de gemiddelde activiteit wordt gemaximaliseerd, wordt weergegeven), zoals berekend door lineaire regressie (lm-functie in R). n.s. = niet significant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alle p-waarden werden gecorrigeerd voor meerdere vergelijkingen met behulp van de Bonferroni-methode voor vergelijkingen binnen elk paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: STL-bestand voor het afdrukken van de 3D multi-well apparaatmal Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het WorMotel-systeem is een krachtig hulpmiddel voor het verzamelen van geïndividualiseerde gegevens voor honderden geïsoleerde C. elegans in de loop van de tijd. Na de eerdere studies met behulp van multi-well-apparaten voor toepassingen in ontwikkelingsrust, locomotorisch gedrag en veroudering, was het doel van dit werk om de voorbereiding van multi-well-apparaten te optimaliseren voor de langetermijnmonitoring van activiteit, gezondheid en levensduur op een manier met een hogere doorvoer. Dit werk biedt een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van multi-well-apparaten dat veel van de stappen van het oorspronkelijke protocol13 optimaliseert, belangrijke punten benadrukt die technische problemen kunnen opleveren en een discussie biedt over het hergebruik van de platen en andere materialen.

Voor het opschalen - als een laboratorium dat momenteel tussen de 10 en 20 apparaten in een typische week voorbereidt - was een topoverweging of de apparaten konden worden hergebruikt en, zo ja, in welke mate. Er zijn hogere kosten in termen van zowel tijd als geld bij het voorbereiden van PDMS-apparaten in vergelijking met het uitvoeren van traditionele cultuur op petrischlaten, maar deze hogere kosten kunnen worden verlaagd door het PDMS of andere componenten van het systeem opnieuw te gebruiken. Bij veel hergebruik begon het PDMS een gele kleuring te ontwikkelen, waarschijnlijk als gevolg van de accumulatie van verbindingen uit de lmNGM-media of bacteriën. De dieren die op deze platen werden gekweekt, vertoonden ook een hogere vluchtsnelheid en een kortere levensduur. Op basis van tientallen experimenten zijn drie toepassingen optimaal voor het hergebruik van deze PDMS-apparaten, waardoor leeftijdsgerelateerde fenotypen kunnen worden beoordeeld zonder een meetbare impact van PDMS-degradatie, terwijl het aantal nieuwe apparaten dat moet worden gegoten wordt verminderd (waardoor kosten worden bespaard). We bevestigden verder dat experiment-gematchte dieren gekweekt op apparaten bij hun eerste, tweede en derde gebruik overlevingscurves produceerden die bijna niet te onderscheiden waren en niet statistisch verschillend (gegevens niet getoond). De trays die worden gebruikt om de apparaten te bevatten, zijn gemaakt van polystyreen en kunnen voor onbepaalde tijd worden gereinigd en hergebruikt als ze vrij blijven van krassen of andere vlekken die het visualiseren van de wormen kunnen verstoren.

Een belangrijke uitdaging voor het voorbereiden van multi-well apparaten voor toepassingen die langer dan ~ 2 weken duren, is het voorkomen van plaatverontreiniging door omgevingsbacteriën en schimmels. Er zijn meerdere stappen waarbij sterilisatie van cruciaal belang is om besmetting te voorkomen. Deze omvatten het autoclaveren van alle apparaten voorafgaand aan gebruik, het koken van de apparaten die bedoeld zijn voor hergebruik, het autoclaveren van de absorberende waterkristallen die worden gebruikt om de luchtvochtigheid te handhaven, het reinigen van de trays die de apparaten bevatten met zowel bleekmiddel als ethanol voor gebruik, en het filtersteriliseren van de reinigingsmiddeloplossing die op het deksel van de tray wordt aangebracht om beslaan te voorkomen en toegevoegd aan de kopersulfaatoplossing. Het implementeren van elk van deze veranderingen verminderde met name de besmettingsgebeurtenissen, waardoor de verzegelde apparaten consistent kunnen worden gebruikt voor longitudinale monitoring gedurende de hele levensduur, zelfs onder pro-longevity-omstandigheden (bijv. Knock-out van daf-2) die >45 dagen moeten worden bewaakt. Het hier beschreven protocol bevat twee wijzigingen in het oorspronkelijke protocol voor langdurige toepassingen die zijn ontworpen om een consistente putdroging te behouden en uitdroging te voorkomen. Eerst werd de totale diepte van het apparaat met 2 mm vergroot om de capaciteit voor waterkristallen te vergroten. Tijdens lange experimenten, vooral in een omgeving met een lage luchtvochtigheid, leidden te weinig waterkristallen in de lade tot de uitdroging van de lmNGM. Samen met meer waterkristallen was het noodzakelijk om het volume agarose te vergroten dat aan de putten langs de rand van het apparaat werd toegevoegd. Deze putten hadden de neiging om eerst te drogen na de putbelasting (sectie 6) en te krimpen. Het gebruik van 14 μL agarose aan de binnenkant van de putten was voldoende volume om de putten volledig te vullen zonder de koepelvormige bovenkant te creëren die het gevolg is van het overvullen van de putten. Het toevoegen van 15 μL agarose aan de buitenste putten leverde voldoende volume op dat, toen de putten begonnen uit te drogen, ze krompen tot een niveau dat vergelijkbaar was met de 14 μL die in de binnenste putten werd toegevoegd.

Een van de grootste afwijkingen van het oorspronkelijke protocol was het omkeren van de volgorde waarin de gebruiker het lmNGM (sectie 6) en kopersulfaat (sectie 7) laadt. Oorspronkelijk werd het kopersulfaat eerst aan de gracht toegevoegd, gevolgd door het vullen van de putten met lmNGM13. Er werd waargenomen dat het vullen van de putten met lmNGM zo snel mogelijk na plasmareiniging de hechting van de lmNGM aan de putwanden verbeterde. Te lang wachten na de plasmareiniging resulteerde in putten met bellen en koepelvormige toppen, die het visualiseren van de wormen kunnen verstoren. Prioriteit geven aan het vullen van de putten boven het toevoegen van het kopersulfaat is vooral belangrijk bij het voorbereiden van meerdere apparaten tegelijkertijd om consistente, hoogwaardige lmNGM-oppervlakken te garanderen. Een nadeel van het eerst vullen van de putten is dat de hydrofiele oppervlaktemodificatie geproduceerd door de plasmareiniger merkbaar zal zijn versleten tegen de tijd dat de gebruiker overgaat tot het toevoegen van het kopersulfaat. Kopersulfaat stroomt niet gemakkelijk door de gracht wanneer het oppervlak minder hydrofiel wordt, waardoor het een uitdaging is om volledige dekking te bereiken. Het toevoegen van reinigingsmiddel aan de kopersulfaatoplossing om als oppervlakteactieve stof te fungeren, verbetert de stroom van de oplossing door de gracht. Een platinadraadprikker kan ook worden gebruikt om het kopersulfaat voorzichtig door de gracht te leiden door de spanning te verbreken op alle punten waar het kopersulfaat moeite heeft met stromen. Bovendien, als de kopersulfaatoplossing in de gracht zou worden achtergelaten, zou deze gemakkelijk in de putten terechtkomen en het lmNGM-oppervlak verontreinigen bij het kantelen van de lade. De aard van het laadproces maakt het bijna onmogelijk om het apparaat voldoende waterpas te houden om te voorkomen dat koper een deel van de putten verontreinigt. Om dit te verklaren, wordt de kopersulfaatoplossing uit de gracht verwijderd (stap 7.3) en het resterende kopersulfaat dat achterblijft is voldoende om de meeste wormen ervan te weerhouden te vluchten. Als laatste opmerking over het gebruik van kopersulfaat als een aversieve barrière, kunnen sommige insectenwerende middelen leeftijdsgebonden fenotypen beïnvloeden, waaronder de levensduur. Het gebruik van kopersulfaat in deze multi-well apparaten werd onderzocht door Churgin et al.13 en bleek geen detecteerbare impact te hebben op de levensduur of ontwikkeling.

Andere kleine updates van het protocol zijn gericht op het verbeteren van de stappen die zijn genomen om het PDMS voor te bereiden. Een extra ontgassingsstap na het mengen van de PDMS-basis en het uithardingsmiddel werd toegevoegd, omdat dit een proces is dat veel bellen genereert. Het verwijderen van de meerderheid van de bubbels voordat het mengsel aan de vormvormen van het apparaat wordt toegevoegd, minimaliseert de bellen die overblijven na de tweede ontgassingsstap. Om ervoor te zorgen dat de onderkant van het apparaat volledig vlak en gelijkmatig is, een kenmerk dat belangrijk is voor beeldvorming van de hele plaat, werd een stuk glas of acryl over de bovenkant van de gevulde mal gelegd. Deze stap is niet essentieel - hoewel nog steeds nuttig - voor toepassingen die slechts één put tegelijk onderzoeken, omdat de gebruiker de focus voor elke put handmatig kan aanpassen. Ten slotte was het uitharden van het PDMS bij een hogere temperatuur (55 °C) noodzakelijk op de plaats waar deze versie van het protocol was geoptimaliseerd (Tucson, Arizona, USA), in tegenstelling tot de 40 °C aangegeven door het oorspronkelijke protocol (geoptimaliseerd in Philadelphia, Pennsylvania, USA). Dit suggereert dat verschillen tussen locaties (zoals het klimaat of de precieze reagentia en apparatuur die worden gebruikt) van invloed kunnen zijn op de specifieke stappen in het protocol, zoals de uithardingstemperatuur of droogtechnieken, en dat deze mogelijk op elke locatie moeten worden geoptimaliseerd. Zo speelt omgevingsvochtigheid een grote rol bij het bepalen van de droogtijd voor de platen na het spotten, en dit kan sterk variëren tussen locaties of seizoenen.

In principe kan dit multi-well apparaatsysteem worden gebruikt om gegevens te verzamelen over elk fenotype dat kan worden gemeten onder standaard brightfield-microscopie op petriplaten - levensduur, gezondheidspanne, niet-gestimuleerde / gestimuleerde beweging, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie - met de toegevoegde mogelijkheid om die statistieken voor individuele wormen in de loop van de tijd te volgen. Zoals opgemerkt in de inleiding, zijn er andere methoden voor het verkrijgen van individuele gegevens over de hele levensduur. Microfluïdica-apparaten28 of multi-well platen29 bieden de mogelijkheid om de levensgeschiedenis van individuele dieren te volgen, maar alleen door de wormen in vloeibare media te kweken. Een vloeibare omgeving kan het transcriptoom van de wormen 10,11,30 ten opzichte van vaste media veranderen en induceert verschillende fysiologische en gedragsveranderingen, waaronder episodisch zwemmen 31, verhoogd energieverbruik 10,32 en verhoogde oxidatieve stress 10. De mate waarin levensduur en andere statistieken met betrekking tot gezond ouder worden direct kunnen worden vergeleken tussen vloeibare en vaste media is onduidelijk. Solid culture multi-well apparaten maken het mogelijk om één worm te volgen in een omgeving die vergelijkbaar is met standaard groepscultuur op petriplaten. De gebogen structuur van de wand van het apparaat maakt het mogelijk om wormen overal in de put af te beelden, waardoor deze apparaten in principe compatibel zijn met meer geavanceerde hulpmiddelen voor analyse van één worm, zoals Worm Tracker33.

De mogelijkheid om individuele dieren te volgen in de loop van een experiment op een multi-well apparaat gaat gepaard met verschillende beperkingen. Ten eerste hebben deze apparaten, zelfs met een geoptimaliseerd protocol, meer tijd nodig om per dier in te stellen dan standaardkweek op petrioplaten, waardoor gegevens van één dier worden verstrekt ten koste van de totale steekproefgrootte. De wormen zijn echter ook geïsoleerd tot geïndividualiseerde putten, waardoor enkele van de complicaties worden verwijderd die gepaard gaan met geautomatiseerde levensduurmeting, zoals het automatisch detecteren van individuele dieren die stoppen met bewegen terwijl ze elkaar aanraken. Automatisering herovert meer dan de tijd die verloren is gegaan aan de complexere installatie en biedt de mogelijkheid voor meer high-throughput screening13,18. Ten tweede zullen experimentele omstandigheden waar de wormen meer een hekel aan hebben dan aan de kopersulfaatgracht, zoals sterke stressveroorzakende middelen (bijv. Paraquat) of dieetbeperking, ertoe leiden dat de wormen uit de putten en in de gracht vluchten. Ten derde, terwijl de PDMS-apparaten brightfield- en darkfield-microscopie mogelijk maken, heeft het PDMS-materiaal de neiging om zowel hoge als ongelijke achtergrondfluorescentie te hebben, de laatste waarschijnlijk als gevolg van stof of andere microdeeltjes die tijdens het gieten in het PDMS worden ingebed, wat hun toepassing in fluorescerende microscopie beperkt. Ten slotte suggereert de verkleuring die is waargenomen in het PDMS voor apparaten die tijdens meerdere experimenten zijn hergebruikt en de bijbehorende verkorting van de levensduur en toename van het vluchten, dat de mediacomponenten en andere toegevoegde chemicaliën na verloop van tijd in het PDMS terechtkomen. De mate waarin dit van invloed kan zijn op verouderingsfenotypes of medicamenteuze behandelingen wordt momenteel onderzocht. Zoals eerder vermeld, is er een alternatieve methode voor een cultuur met één worm die vergelijkbaar is met PDMS multi-well-apparaten, maar in plaats daarvan commercieel verkrijgbare microtrays gebruikt om geïsoleerde dieren te kweken16. Deze microtrays zijn gemaakt van polystyreen, waardoor het potentiële probleem van bloedzuigermediacomponenten wordt vermeden, en hebben een consistente fluorescentieachtergrond, waardoor directe in vivo fluorescentiebeeldvorming rechtstreeks op de plaat mogelijk is. De microtrayputten zijn ook omgeven door palmitinezuur in plaats van het kopersulfaat dat wordt gebruikt in het hier beschreven protocol, dat meer aversief is en de fractie van wormen vermindert die hun putten verlaten, zelfs in het geval van stressveroorzakende middelen en dieetbeperking. Deze voordelen worden gerealiseerd ten koste van een lagere verpakkingsefficiëntie van de putten, omdat de microtrays het mogelijk maken om maximaal 96 wormen in één tray te kweken in tegenstelling tot de 240 wormcapaciteit van de PDMS-apparaten. De details van de gewenste uitkomst van een experiment zullen van invloed zijn op welke van deze systemen moet worden gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs stellen dat ze geen belangenconflicten openbaar te maken hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH R35GM133588 aan G.L.S., een United States National Academy of Medicine Catalyst Award aan G.L.S., het State of Arizona Technology and Research Initiative Fund beheerd door de Arizona Board of Regents en de Ellison Medical Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  2. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  3. Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
  4. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  5. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. Liu, X., Sun, Y. 13, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 13 295-321 (2021).
  6. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  7. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
  8. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  9. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  10. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  11. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  12. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  13. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  14. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  15. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  16. Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Freitas, S. Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , Tucson, USA. Master's thesis (2021).
  19. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
  20. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
  21. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
  22. Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
  23. Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
  24. McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
  25. Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
  26. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  27. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  28. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  29. Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
  30. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
  31. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
  32. Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
  33. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).

Tags

Intrekking Nummer 190
Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde <em>Caenorhabditis elegans</em> op vaste media in multiwell-apparaten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardea, E. A., DeNicola, D.,… More

Gardea, E. A., DeNicola, D., Freitas, S., Peterson, W., Dang, H., Shuck, K., Fang-Yen, C., Sutphin, G. L. Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices. J. Vis. Exp. (190), e64681, doi:10.3791/64681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter