Summary
Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per la coltura di singoli nematodi isolati su supporti solidi in dispositivi multipozzetto microfabbricati. Questo approccio consente ai singoli animali di essere monitorati per tutta la vita per una varietà di fenotipi legati all'invecchiamento e alla salute, tra cui attività, dimensioni e forma del corpo, geometria del movimento e sopravvivenza.
Abstract
Il nematode Caenorhabditis elegans è tra i sistemi modello più comuni utilizzati nella ricerca sull'invecchiamento grazie alle sue tecniche di coltura semplici e poco costose, al ciclo di riproduzione rapido (~ 3 giorni), alla breve durata della vita (~ 3 settimane) e ai numerosi strumenti disponibili per la manipolazione genetica e l'analisi molecolare. L'approccio più comune per condurre studi sull'invecchiamento in C. elegans, compresa l'analisi di sopravvivenza, prevede la coltura di popolazioni da decine a centinaia di animali insieme su terreni di crescita di nematodi solidi (NGM) in piastre di Petri. Mentre questo approccio raccoglie dati su una popolazione di animali, la maggior parte dei protocolli non traccia i singoli animali nel tempo. Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la coltura a lungo termine di singoli animali su dispositivi microfabbricati in polidimetilsilossano (PDMS) chiamati WorMotels. Ogni dispositivo consente di coltivare fino a 240 animali in piccoli pozzi contenenti NGM, con ogni pozzo isolato da un fossato contenente solfato di rame che impedisce agli animali di fuggire. Basandosi sulla descrizione originale di WorMotel, questo documento fornisce un protocollo dettagliato per lo stampaggio, la preparazione e il popolamento di ciascun dispositivo, con descrizioni di complicazioni tecniche comuni e consigli per la risoluzione dei problemi. All'interno di questo protocollo ci sono tecniche per il carico costante di piccoli volumi di NGM, l'essiccazione coerente sia dell'NGM che del cibo batterico, opzioni per fornire interventi farmacologici, istruzioni e limitazioni pratiche al riutilizzo dei dispositivi PDMS e suggerimenti per ridurre al minimo l'essiccazione, anche in ambienti a bassa umidità. Questa tecnica consente il monitoraggio longitudinale di vari parametri fisiologici, tra cui attività stimolata, attività non stimolata, dimensioni corporee, geometria del movimento, durata della salute e sopravvivenza, in un ambiente simile alla tecnica standard per la cultura di gruppo su supporti solidi in piastre di Petri. Questo metodo è compatibile con la raccolta di dati ad alto rendimento se utilizzato in combinazione con software di microscopia e analisi automatizzati. Infine, vengono discussi i limiti di questa tecnica, nonché un confronto di questo approccio con un metodo recentemente sviluppato che utilizza microvassoi per coltivare nematodi isolati su supporti solidi.
Introduction
I Caenorhabditis elegans sono comunemente usati negli studi sull'invecchiamento a causa del loro breve tempo di generazione (circa 3 giorni), breve durata della vita (circa 3 settimane), facilità di coltivazione in laboratorio, alto grado di conservazione evolutiva dei processi molecolari e dei percorsi con i mammiferi e ampia disponibilità di tecniche di manipolazione genetica. Nel contesto degli studi sull'invecchiamento, C. elegans consente la rapida generazione di dati sulla longevità e popolazioni invecchiate per l'analisi dei fenotipi in età avanzata negli animali vivi. L'approccio tipico per condurre studi sull'invecchiamento dei vermi prevede la misurazione manuale della durata della vita di una popolazione di vermi mantenuti in gruppi da 20 a 70 animali su terreni di crescita solidi di nematodi agar (NGM) in piastre di Petri da 6 cm1. L'utilizzo di popolazioni sincronizzate per età consente la misurazione della durata della vita o dei fenotipi trasversali nei singoli animali in tutta la popolazione, ma questo metodo preclude il monitoraggio delle caratteristiche dei singoli animali nel tempo. Questo approccio è anche ad alta intensità di manodopera, limitando così le dimensioni della popolazione che può essere testata.
Esistono un numero limitato di metodi di coltura che consentono il monitoraggio longitudinale dei singoli C. elegans per tutta la loro durata di vita, e ognuno ha una serie distinta di vantaggi e svantaggi. I dispositivi microfluidici, tra cui WormFarm2, NemaLife3 e il chip "behavior"4, tra gli altri 5,6,7, consentono il monitoraggio dei singoli animali nel tempo. La coltura di vermi in coltura liquida utilizzando piastre multi-pozzetto consente allo stesso modo il monitoraggio di singoli animali o piccole popolazioni di C. elegans nel tempo 8,9. L'ambiente liquido rappresenta un contesto ambientale distinto dall'ambiente di coltura comune su terreni solidi in piastre di Petri, che può alterare aspetti della fisiologia animale che sono rilevanti per l'invecchiamento, incluso il contenuto di grassi e l'espressione dei geni di risposta allo stress10,11. La capacità di confrontare direttamente questi studi con la maggior parte dei dati raccolti sull'invecchiamento di C. elegans è limitata dalle differenze nelle variabili ambientali potenzialmente importanti. Il Worm Corral12 è un approccio sviluppato per ospitare singoli animali in un ambiente che replica più da vicino la tipica cultura dei media solidi. Il Worm Corral contiene una camera sigillata per ogni animale su un vetrino da microscopio che utilizza idrogel, consentendo il monitoraggio longitudinale di animali isolati. Questo metodo utilizza l'imaging standard in campo chiaro per registrare dati morfologici, come le dimensioni e l'attività del corpo. Tuttavia, gli animali vengono collocati nell'ambiente idrogel come embrioni, dove rimangono indisturbati per tutta la durata della loro vita. Ciò richiede l'uso di background genetici mutanti o transgenici condizionatamente sterili, che limitano sia la capacità di screening genetico, poiché ogni nuova mutazione o transgene deve essere incrociato in uno sfondo con sterilità condizionale, sia la capacità di screening farmacologico, poiché i trattamenti possono essere applicati solo una volta agli animali come embrioni.
Un metodo alternativo sviluppato dal laboratorio Fang-Yen consente la coltivazione di vermi su supporti solidi in singoli pozzetti di un dispositivo microfabbricato in polidimetilsilossano (PDMS) chiamato WorMotel13,14. Ogni dispositivo è posto in un vassoio a pozzetto singolo (cioè con le stesse dimensioni di una piastra a 96 pozzetti) e ha 240 pozzi separati da un fossato riempito con una soluzione avversiva per impedire ai vermi di viaggiare tra i pozzi. Ogni pozzo può ospitare un singolo verme per tutta la durata della sua vita. Il dispositivo è circondato da pellet di gel di poliacrilammide che assorbono l'acqua (denominati "cristalli d'acqua") e il vassoio è sigillato con pellicola da laboratorio Parafilm per mantenere l'umidità e ridurre al minimo l'essiccazione del supporto. Questo sistema consente di raccogliere dati sulla durata della salute e sulla durata della vita per i singoli animali, mentre l'uso di supporti solidi ricapitola meglio l'ambiente vissuto dagli animali nella stragrande maggioranza degli studi pubblicati sulla durata della vita di C. elegans, consentendo così confronti più diretti. Recentemente, una tecnica simile è stata sviluppata utilizzando microvassoi in polistirene originariamente utilizzati per i saggi di microcitotossicità15 al posto del dispositivo PDMS16. Il metodo del microvassoio consente la raccolta di dati individualizzati per i vermi coltivati su terreni solidi e ha migliorato la capacità di contenere i vermi in condizioni che tipicamente causerebbero la fuga (ad esempio, fattori di stress o restrizioni dietetiche), con il compromesso che ogni microvassoio può contenere solo 96 animali16, mentre il dispositivo multi-pozzo utilizzato qui può contenere fino a 240 animali.
Di seguito è presentato un protocollo dettagliato per la preparazione di dispositivi multi-pozzetto ottimizzato per la coerenza da piastra a piastra e la preparazione di più dispositivi in parallelo. Questo protocollo è stato adattato dal protocollo originale del laboratorio Fang-Yen13. In particolare, ci sono descrizioni per le tecniche per ridurre al minimo la contaminazione, ottimizzare l'essiccazione coerente sia dei mezzi solidi che della fonte di cibo batterico e fornire RNAi e farmaci. Questo sistema può essere utilizzato per monitorare la durata della salute individuale, la durata della vita e altri fenotipi, come le dimensioni e la forma del corpo. Questi dispositivi multi-pozzetto sono compatibili con i sistemi esistenti ad alta produttività per misurare la durata della vita, che possono rimuovere gran parte del lavoro manuale coinvolto negli esperimenti tradizionali sulla durata della vita e fornire l'opportunità di misurare la longevità automatizzata e diretta e il monitoraggio della salute nei singoli C. elegans su larga scala.
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Protocol
1. Preparazione di soluzioni stock e supporti
NOTA: prima di iniziare la preparazione dei dispositivi multi-pozzetto, preparare le seguenti soluzioni e supporti stock.
- Soluzioni stock per terreni di crescita di nematodi (NGM) e NGM a basso punto di fusione (lmNGM):
- Preparare 1 M K 2 HPO4: aggiungere 174,18 g di K2HPO4 inuna bottiglia da 1 L e riempirla fino a 1 L con acqua deionizzata sterile. Autoclave (121 °C, 15 psig) per 30 minuti e conservare a temperatura ambiente (RT).
- Preparare 1 M KPi, pH 6,0: aggiungere 136,09 g di KH2HPO4 in una bottiglia da 1 L e riempirla fino a 1 L con acqua deionizzata sterile. Titolare con 1 M K2HPO4 a pH 6,0. Autoclave (121 °C, 15 psig) per 30 minuti e conservare presso RT.
- Preparare 1 M CaCl 2: aggiungere 73,5 g di CaCl2 in un flacone da 500 ml e riempirlo fino a 500 ml con acqua deionizzata sterile. Autoclave (121 °C, 15 psig) per 30 minuti e conservare presso RT.
- Preparare 1 M MgSO 4: aggiungere 123,25 g di MgSO4 in un flacone da 500 ml e riempirlo fino a 500 ml con acqua deionizzata sterile. Autoclave (121 °C, 15 psig) per 30 minuti e conservare presso RT.
- Preparare 5 mg / ml di colesterolo: combinare 2,5 g di colesterolo, 275 ml di etanolo al 100% e 25 ml di acqua deionizzata sterile in una bottiglia ambrata da 500 ml. Negozio su RT.
- Preparare 50 mM di floxuridina: unire 0,1231 g di floxuridina e 10 ml di acqua deionizzata sterile in un tubo conico da 15 ml. Filtrare e sterilizzare con un filtro da 0,22 μm utilizzando una siringa da 10 ml. Aliquot 1 mL ciascuno in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a -20 °C.
- Preparare 50 mg/ml di carbenicillina: in un tubo conico da 15 ml, combinare 500 mg di carbenicillina con 10 ml di acqua deionizzata sterile. Filtrare e sterilizzare con un filtro da 0,22 μm utilizzando una siringa da 10 ml. Aliquot 1 mL ciascuno in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a -20 °C.
- Preparare 1 mM di isopropile ß-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG): in un tubo conico da 15 ml, combinare 2,38 g di IPTG con 10 ml di acqua deionizzata sterile. Filtrare e sterilizzare con un filtro da 0,22 μm utilizzando una siringa da 10 ml. Aliquot 1 mL ciascuno in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a -20 °C.
- Preparare 100 mg/ml di ampicillina: in un tubo conico da 15 ml, unire 1 g di ampicillina con 10 mL di acqua deionizzata sterile. Filtrare e sterilizzare con un filtro da 0,22 μm utilizzando una siringa da 10 ml. Aliquot 1 mL ciascuno in 10 provette da microcentrifuga e conservarle a -20 °C.
- Preparazione dei terreni di crescita dei nematodi (NGM) per il mantenimento generale di C. elegans
- Per fare 50 piatti, in un matraccio da 1 L, unire 10 g di agar Bacto, 1,5 g di NaCl, 1,25 g di Bacto peptone e 486 ml di acqua ultrapura. Autoclave a ciclo liquido (121 °C, 15 psig) per almeno 30 minuti per sterilizzare.
- Dopo l'autoclave, dopo che il fluido si è raffreddato a 55 °C, aggiungere 12,5 ml di 1 M KPi, 500 μL di 1 M MgSO4, 500 μL di 1 M CaCl2 e 500 μL di 5 mg/ml di colesterolo.
- Utilizzando una tecnica sterile, versare 10 ml di supporto in ciascuna lastra da 60 mm (50 in totale). Dopo che il terreno si è solidificato (almeno 30 minuti dopo il versamento), pipettare 300 μL di coltura batterica (preparata secondo la fase 4 e la fase 10) che è stata coltivata durante la notte al centro della piastra. Lasciare la piastra sul banco, permettendo alla coltura batterica di asciugarsi e diventare più spessa (1-2 giorni). Conservare le piastre a 4 °C.
- Preparare la premiscela di terreni di crescita dei nematodi a basso punto di fusione (lmNGM):
- In un matraccio da 500 ml, unire 4 g di agarosio a basso punto di fusione, 0,5 g di Bacto Peptone e 195 ml di acqua ultrapura. Autoclave a ciclo liquido (121 °C, 15 psig) per almeno 30 minuti per sterilizzare.
- Mentre il fluido è ancora fuso, distribuire 10 mL di aliquote in provette sterili di vetro. Sigillare ogni provetta con Parafilm seguito da un tappo della provetta per preservare la premiscela lmNGM e prevenire l'essiccazione. Il supporto si solidifica e può essere conservato per ~ 2 settimane a RT prima dell'uso.
- Preparare 142,8 mM di NaCl: in un flacone da 250 ml, unire 0,8345 g di NaCl e 100 mL di acqua deionizzata sterile. Autoclave (121 °C, 15 psig) per 30 minuti e conservare presso RT.
- Preparare la soluzione detergente: in un tubo conico da 15 ml, unire 3 ml di Tween 20 e 7 mL di acqua deionizzata sterile. Mescolare accuratamente, filtrare e sterilizzare con un filtro da 0,22 μm utilizzando una siringa da 10 ml e conservare presso RT.
- Preparare la soluzione di solfato di rame: in un flacone sterile da 50 ml, unire 20 ml di acqua deionizzata sterile, 0,5 g di CuSO4 e 100 μL di soluzione detergente (preparata al punto 1.5). Mescolare fino a quando il CuSO4 non si è sciolto. Negozio su RT.
- Preparare cristalli di poliacrilammide che assorbono l'acqua: in un flacone di compressione sicuro per autoclave, combinare 150 ml di acqua deionizzata e 1 g di polimero super assorbente di tipo S. Mescolare delicatamente capovolgendo più volte la bottiglia. Autoclavare a ciclo liquido (121 °C, 15 psig) per almeno 20 minuti e conservare a RT.
- Preparare il brodo lisogeno (LB): In un becher da 1 L o più grande, unire 20 g di polvere LB con 1 L di acqua deionizzata. Aliquot in due becher da 500 ml. Autoclave (121 °C, 15 psig) per 30 minuti e conservare presso RT
- Preparare le piastre di agar di brodo lisogenico (LB):
- In un matraccio da 1 L, unire 10 g di polvere LB, 7,5 g di Bacto Agar e 500 ml di acqua deionizzata. Autoclave a ciclo liquido (121 °C, 15 psig) per 30 min.
- Se lo si desidera, aggiungere antibiotici opzionali (post-autoclave, dopo che il terreno si è raffreddato a 55 °C): 500 μL di 100 mg/ml di ampicillina. Utilizzando una tecnica sterile, versare 20 ml di terreno in ciascuna lastra da 100 mm (25 in totale) e conservare a 4 °C.
2. Stampa dello stampo del dispositivo multi-pozzetto 3D
NOTA: Ogni dispositivo è stampato da PDMS utilizzando uno stampo personalizzato stampato in 3D. Un singolo stampo può produrre tutti i dispositivi necessari; tuttavia, se si tenta di preparare più dispositivi contemporaneamente, è necessario uno stampo stampato in 3D per realizzare ciascun dispositivo in parallelo.
- Scaricare il file STL (vedere il file supplementare 1).
- Stampa lo stampo con una stampante 3D ad alta risoluzione.
NOTA: la risoluzione della stampante deve essere sufficientemente elevata da consentire volumi di pozzo e fossato costanti. La risoluzione della stampante consigliata è una risoluzione XY minima di ~40 μm e una risoluzione dello strato di 28 μm. Il materiale utilizzato dalla stampante 3D è altrettanto importante, poiché molti tipi di materiali impediranno al PDMS di polimerizzare. Per esperienza, gli stampi prodotti da stampanti PolyJet ad alta risoluzione (risoluzione: asse X = 600 dpi, asse Y = 600 dpi, asse Z = 1.600 dpi) utilizzando il materiale di stampa Vero Black funzionano in modo coerente. La stampa 3D degli stampi utilizzati in questo studio è stata esternalizzata (i dettagli di stampa possono essere trovati nella tabella dei materiali).
3. Preparazione del dispositivo multi-pozzetto
NOTA: questa sezione descrive come viene utilizzato lo stampo stampato in 3D per creare il dispositivo multipozzetto PDMS.
- Impostare il forno di polimerizzazione a 55 °C per consentire il preriscaldamento.
- Determinare il numero di dispositivi da preparare in un lotto. Per ciascun dispositivo, mescolare 60 g di base PDMS e 6 g di agente polimerizzante in un grande contenitore di pesatura usa e getta (o contenitore monouso simile) utilizzando una spatola usa e getta.
- Posizionare la miscela PDMS in una camera a vuoto per 30 minuti a -0,08 MPa per rimuovere le bolle.
- Versare la miscela PDMS in ogni stampo stampato in 3D. Riempire completamente lo stampo, con la miscela PDMS che si estende leggermente sopra la parte superiore dello stampo. Mantenere la miscela PDMS in eccesso per riempire nuovamente lo stampo in caso di fuoriuscite.
- Mettere lo stampo riempito e qualsiasi miscela PDMS extra nella camera a vuoto per 25 minuti a -0,08 MPa per rimuovere eventuali bolle create durante il processo di versamento.
- Rimuovere lo stampo riempito dalla camera a vuoto e far scoppiare eventuali bolle rimanenti con una spatola usa e getta. Utilizzare la spatola per spazzolare eventuali detriti visibili o bolle rimanenti sul bordo dello stampo lontano dai pozzetti. Eventuali detriti o bolle rimanenti possono potenzialmente interferire con l'imaging nelle fasi successive.
- Assicurarsi che lo stampo sia riempito completamente con la miscela PDMS; È comune che una piccola parte della miscela fuoriesca mentre si trova nella camera a vuoto o durante il trasferimento. Riempire utilizzando la miscela PDMS aggiuntiva che è stata degassata nel passaggio 3.5. Questo non dovrebbe creare bolle, ma se si formano qualcuna, possono essere delicatamente spazzolate sul lato dello stampo con la spatola.
- Posizionare un foglio acrilico piatto sopra lo stampo riempito con PDMS posizionando prima un bordo e abbassando lentamente l'altro fino a quando l'acrilico non si trova piatto sopra lo stampo, spostando qualsiasi miscela PDMS che si estende sopra il bordo. Se si formano bolle durante il posizionamento del foglio acrilico, rimuovere lentamente l'acrilico, riempire nuovamente lo stampo con la miscela PDMS, se necessario, e riavviare il posizionamento acrilico. Il foglio acrilico formerà un fondo piatto per il dispositivo stampato e assicurerà che tutti i pozzetti siano allo stesso livello rispetto alla base.
- Posizionare un peso di 2,5 libbre sopra l'acrilico. È possibile impilare più stampi, ciascuno con un foglio acrilico separato. Mettere gli stampini appesantiti nel forno e lasciarli polimerizzare a 55 °C per una notte.
- Il giorno dopo, rimuovere i pesi e gli stampi dal forno.
- Lavorare con cura una lametta tra l'acrilico e il PDMS polimerizzato per rompere il sigillo. Rimuovere con attenzione l'acrilico dalla parte superiore dello stampo. Il PDMS avrà impostato a questo punto, e la rimozione dell'acrilico può richiedere una certa forza.
- Utilizzando un rasoio o una spatola metallica, allentare con cura i lati del PDMS polimerizzato dallo stampo. È facile strappare il PDMS in questa fase; lavorare lentamente e delicatamente attorno al bordo per rimuovere intatto il dispositivo PDMS.
NOTA: gli stampi appena stampati sono particolarmente appiccicosi per i primi tre usi e il PDMS spesso si strappa mentre tenta di rimuovere il dispositivo. Con più usi, diventa più facile rimuovere il PDMS polimerizzato dallo stampo. - Avvolgere il dispositivo in un foglio di alluminio e sigillarlo con nastro adesivo. Autoclave a ciclo asciutto per almeno 15 minuti a 121 °C, 15 psig per sterilizzare. Dopo l'autoclave, conservare i dispositivi avvolti sul banco e utilizzarli secondo necessità.
4. Striature dei batteri
NOTA: Iniziare a preparare i batteri che verranno utilizzati come fonte di cibo dei vermi mentre sono sul dispositivo multi-pozzetto. Il batterio più comune è il ceppo OP50 di Escherichia coli (o ceppo HT115 per esperimenti con RNAi). Completare questo passaggio almeno 2 giorni prima di aggiungere i worm al dispositivo.
- Strisciare i batteri su una piastra LB fresca. Assicurarsi che eventuali additivi selettivi specifici del ceppo (ad esempio, ampicillina per selezionare un plasmide che conferisce resistenza all'ampicillina ai batteri) siano inclusi nelle piastre LB.
- Incubare la piastra a 37 °C durante la notte (~18 h) per consentire alle colonie di crescere.
5. Preparazione del dispositivo multipozzetto per il caricamento dei supporti
NOTA: La superficie del materiale siliconico PDMS che costituisce il dispositivo è idrofoba, il che impedisce ai pozzi di piccolo volume e ai fossati avversivi di essere riempiti rispettivamente con NGM e solfato di rame. Per aggirare questo problema, un plasma di ossigeno viene utilizzato per modificare temporaneamente le proprietà superficiali del dispositivo in modo che siano idrofile, consentendo di riempire i pozzi e il fossato entro una finestra temporale limitata (fino a ~ 2 ore). Questa sezione illustra i passaggi per completare il processo di pulizia al plasma. Completa questo passaggio almeno 1 giorno prima di individuare i pozzetti del dispositivo con i batteri, poiché gli effetti persistenti del plasma pulito possono interferire con lo spotting. Data la tempistica delle sezioni 5-7, il limite pratico per questi passaggi per tecnico è di tre dispositivi in parallelo.
- Preriscaldare un'incubatrice a bagno a perline asciutte a 90 °C in preparazione della sezione 6.
- Poiché il volume totale di supporto necessario per riempire i pozzetti di un dispositivo multipozzetto è piccolo rispetto a quello delle piastre di Petri, preparare un grande lotto di NGM e distribuirlo in provette (vedere il passaggio 1.3).
NOTA: Questo può essere fatto in anticipo, poiché i tubi di supporto possono essere conservati sul banco per ~ 2 settimane. Se il mezzo è stato preparato e aliquotato in provette, procedere al punto 5.3. - Mentre si indossano i guanti, scartare un dispositivo multipozzetto autoclavato; Evitare di toccare uno qualsiasi dei pozzi. Tagliare una piccola tacca nell'angolo in alto a destra del dispositivo per indicare quante volte è stato utilizzato/riutilizzato (vedere la sezione 15 di seguito per istruzioni e raccomandazioni per la pulizia e il riutilizzo di ciascun dispositivo).
- Posizionare fino a tre dispositivi non avvolti nel pulitore al plasma con i pozzetti rivolti verso l'alto. Eseguire il pulitore al plasma.
NOTA: Le seguenti istruzioni dettagliate sono per il pulitore al plasma Etch PE-50. I passaggi e le impostazioni specifiche devono essere adattati e possibilmente riottimizzati per altri detergenti al plasma.- Verificare che il livello di potenza del pulitore al plasma sia impostato su 75%.
- Assicurarsi che le valvole di sfiato e di isolamento siano entrambe in posizione OFF .
- Aprire la valvola principale sul serbatoio dell'ossigeno. Attendere che la pressione del regolatore scenda tra 15 psig e 20 psig, quindi ruotare la valvola di isolamento in posizione ON .
- Accendere la pompa per vuoto e l'aspirapolvere.
- Immettere le seguenti impostazioni sul pulitore al plasma (primo utilizzo) o verificare che le impostazioni programmate in precedenza siano corrette:
Tempo di plasma: 3:00 min
Set Point del vuoto: 149,5 mTorr
Sfiato atmosferico: 45 s
Sfogo di spurgo: 5 s
Stabilizzazione del gas: 15 s
Allarme vuoto: 3:00 min
Spegnimento automatico: ON - Premere Invio per accedere al menu Comandi. Utilizzare la freccia DESTRA per selezionare Menu impostazioni, quindi premere INVIO. Scorrere tutte le impostazioni premendo Invio per confermare ogni impostazione corrente e quindi la freccia destra per passare all'impostazione successiva.
- Tornare al menu Comandi premendo la freccia su e quindi la freccia sinistra.
- Nella schermata Menu comandi premere INVIO. Selezionare Comandi PLASMA premendo Invio. Il sistema attraverserà le seguenti fasi:
Pompaggio al plasma
Stabilizzazione del gas: durante questa fase, regolare la manopola Gas 1 sul pulitore al plasma fino a quando il flussometro è a 10 cc / min.
Tempo di plasma
Spurgo Pumpdown
Ciclo al plasma completo
Sfiato della camera
NOTA: il completamento di questo processo dovrebbe richiedere circa 5-10 minuti. Al termine di tutte le fasi, il menu Comandi viene nuovamente visualizzato sullo schermo. Se durante la fase di pompaggio del plasma, la pressione non si abbassa abbastanza, il pulitore al plasma non procederà alla fase successiva e lo schermo visualizzerà un messaggio di errore. Se ciò accade, controllare l'olio della pompa per vuoto. Se i livelli dell'olio sono bassi o l'olio è torbido / sporco, la sostituzione dell'olio può consentire alla pressione del vuoto di raggiungere il livello necessario. - Spegnere la valvola principale sul serbatoio dell'ossigeno.
- Molto lentamente, ruotare la valvola di sfiato in posizione ON e consentire alla pressione del regolatore del serbatoio di ossigeno di tornare a zero.
- Ruotare la valvola di isolamento in posizione OFF .
- Spegnere la pompa per vuoto e l'aspirapolvere.
NOTA: La modifica superficiale idrofila del dispositivo multipozzetto da parte del pulitore al plasma è temporanea e diventa progressivamente meno efficace nel tempo (fino a circa 2 ore). Procedere attraverso la sezione 6 e la sezione 7 il più rapidamente possibile.
6. Riempire i pozzi con lmNGM
NOTA: un'incubatrice per bagno a corde asciutte deve essere accesa e preriscaldata dal punto 5.1. Assicurarsi che il bagno abbia raggiunto i 90 °C.
- Sterilizzare un vassoio in polistirolo a pozzetto singolo per dispositivo spruzzando l'interno del vassoio con etanolo al 70% e asciugandolo con una salvietta operativa.
- Rimuovere ciascun dispositivo dal detergente al plasma con una mano guantata e metterlo in un vassoio pulito.
- Posizionare una bacinella monouso da 25 ml nell'incubatore a bagno di perline dopo averla riscaldata a 90 °C.
- Raccogliere un tubo di premiscela lmNGM solidificata per ogni dispositivo da riempire (vedere il punto 1.3).
- Collocare le provette di premiscela lmNGM in un becher di vetro da 200 mL e rimuovere i tappi e il parafilm. Microonde per ~ 20 s fino a quando il supporto si scioglie sufficientemente per versare (la presenza di alcuni supporti solidi va bene in questa fase).
- Unire la premiscela lmNGM fusa da più provette in un altro becher sterile da 200 ml. Continuare a microonde per altri 20 s per raggiungere un totale di 40 s. Se la premiscela lmNGM inizia a bollire, fermare il microonde e lasciare che la premiscela lmNGM si depositi prima di continuare.
- Rimuovere la premiscela lmNGM fusa dal microonde e lasciarla raffreddare a ~60 °C.
NOTA: In questa fase, il supporto si raffredderà e si risolidificerà dopo ~ 5 minuti. Procedere immediatamente ai passaggi 6.8 e 6.9. - Per ogni 10 mL di premiscela lmNGM, aggiungere quanto segue (nell'ordine): 250 μL di 1 M KPi, 10 μL di 1 M MgSO4, 10 μL di 1 M CaCl2 e 10 μL di 5 mg/ml di colesterolo.
- Per prevenire la schiusa delle uova durante il monitoraggio degli adulti sul dispositivo, aggiungere 10 μL di 50 mM di floxuridina.
- Per selezionare un plasmide RNAi e indurre l'espressione dell'RNA, aggiungere 5 μL di 50 mg/mL di carbenicillina e 12 μL di 1 mM IPTG.
NOTA: Gli antibiotici o altri additivi possono essere modificati a seconda del design dell'esperimento. I composti / farmaci di prova possono anche essere aggiunti ai media in questa fase.
- Versare lmNGM fuso nella bacinella da 25 mL nel bagno di perline.
- Riempire i pozzetti del dispositivo con lmNGM utilizzando una pipetta ripetitrice multicanale da 200 μL.
- Impostare il ripetitore in modo da erogare aliquote di 14 μL (14 μL possono essere erogati fino a 14 volte se si utilizza una punta per pipetta da 200 μL).
- Montare cinque punte per pipette. I pozzetti del dispositivo hanno la stessa spaziatura di una piastra da 384 pozzetti. Le pipette multicanale standard sono distanziate in modo tale che l'utente possa pipettare in ogni altro pozzetto in una riga/colonna.
- Caricare le punte con lmNGM fuso. Erogare nuovamente i primi 14 μL nel bacino contenente lmNGM.
- Muovendosi rapidamente ma con attenzione, erogare 14 μL nei pozzetti interni (bianco nella figura 1B), iniziando da quelli contrassegnati con una "x" nella figura 1B e spostandosi attraverso la piastra verso destra e poi verso il basso, erogando un totale di 12 volte (60 pozzetti).
- Erogare nuovamente lmNGM rimanente nel bacino, poiché l'aliquota finale è tipicamente inferiore a 14 μL.
- Ripetere i passaggi 6.10.3-6.10.5 fino a riempire tutti i pozzetti interni.
- Quindi, impostare il ripetitore in modo da erogare aliquote di 15 μL. Ripetere i passaggi 6.10.3-6.10.5, ma invece dei pozzetti interni, riempire l'anello più esterno dei pozzetti (grigio nella figura 1B), iniziando dai pozzetti contrassegnati con "+" nella figura 1B e spostandosi attorno al bordo esterno della piastra.
NOTA: Lavorare rapidamente in modo che il supporto non si solidifichi nelle punte delle pipette. Evitare di versare qualsiasi lmNGM nel fossato. I pozzi esterni tendono ad asciugarsi più rapidamente. L'extra di 1 μL di lmNGM consente al pozzo finale essiccato di avere una superficie piana nello stesso tempo di asciugatura dei pozzetti interni.
- Come fase di controllo qualità, esaminare ogni pozzetto per identificare quelli con difetti che possono interferire con l'imaging, compresi i pozzi che sono sottoriempiti (la superficie lmNGM è affondata sotto il bordo del pozzo), troppo riempiti (la superficie lmNGM ha una parte superiore a cupola) e contengono bolle o detriti.
- Rimuovere lmNGM solidificato dai pozzetti insoddisfacenti con un corto filo di platino o aspiratore a vuoto. Riempire i pozzetti vuoti con lmNGM fresco fuso. Inoltre, rimuovere qualsiasi mezzo che trabocchi nel fossato con un corto filo di platino o aspiratore a vuoto.
7. Aggiunta di solfato di rame al fossato
NOTA: i pozzetti di questo dispositivo sono circondati da un fossato continuo. Qui, il fossato è pieno di solfato di rame, che agisce come repellente e scoraggia i vermi dalla fuga dai loro pozzi.
- Utilizzando una pipetta da 200 μL, erogare 200 μL di soluzione di solfato di rame (vedere punto 1.6) nel fossato del dispositivo in ciascun angolo, 2 volte per angolo. Questo dovrebbe essere un volume abbastanza grande da consentire al solfato di rame di fluire attraverso l'intero fossato. Fare attenzione a non riempire eccessivamente il fossato in nessun punto; Il solfato di rame non deve toccare la superficie superiore dei pozzetti.
- Se il solfato di rame non scorre facilmente attraverso l'intero fossato, utilizzare un corto filo di platino per aiutare a rompere la tensione e trascinare il solfato di rame attraverso il fossato.
- Dopo che il solfato di rame ha attraversato l'intero fossato, rimuovere quanto più solfato di rame possibile dal fossato utilizzando una pipetta da 200 μL o un'aspirazione con vuoto. Il residuo lasciato sarà sufficiente a dissuadere i vermi dal lasciare i loro pozzi. Lasciare il fossato pieno di soluzione di solfato di rame rischia di riversarsi nel solfato di rame nei pozzi, il che causerebbe la fuga dei vermi.
8. Aggiunta di cristalli d'acqua autoclavati
NOTA: Per mantenere l'umidità all'interno della piastra e prevenire l'essiccazione dell'lmNGM, ogni dispositivo è circondato da cristalli di poliacrilammide saturi che assorbono acqua.
- Preparare i cristalli d'acqua (vedere il punto 1.7).
- Utilizzando una bottiglia di spremitura, aggiungere i cristalli d'acqua negli spazi tra il dispositivo e le pareti del vassoio. Chiudere il coperchio del vassoio e avvolgere tutti e quattro i lati con un pezzo di Parafilm. Aggiungere altri due pezzi di Parafilm per sigillare completamente la piastra.
NOTA: I cristalli d'acqua possono essere preparati in un becher e raccolti nel vassoio con una spatola sterilizzata. Tuttavia, questo aggiunge tempo alla procedura e aumenta il tempo in cui ogni vassoio è aperto ed esposto a potenziali contaminanti. - Lasciare il dispositivo sigillato sul banco fino al giorno successivo quando i batteri sono pronti per essere individuati. Assicurarsi che i dispositivi siano conservati con i pozzetti rivolti verso l'alto dopo l'aggiunta di lmNGM.
9. Preparazione di una popolazione di vermi sincronizzata per età
NOTA: i seguenti passaggi producono una popolazione sincronizzata di worm pronti per essere aggiunti al dispositivo multipozzetto al quarto stadio larvale (L4). Tuttavia, è possibile aggiungere anche vermi in diverse fasi di sviluppo. Questo passaggio deve essere completato 2 giorni prima di aggiungere i worm al dispositivo se si desidera L4s. Regolare i tempi di sincronizzazione per la fase di vita desiderata.
- Per studi di invecchiamento coerenti, mantenere C. elegans su piastre NGM standard (vedere punto 1.2 a 20 °C in condizioni ben alimentate).
- Ottenere una popolazione sincronizzata di animali da una piastra di riserva tramite metodi standard, ad esempio, sbiancamento17 o deposizione delle uova temporizzata1.
- Aggiungi uova isolate a una piastra NGM macchiata di batteri. Le uova si schiuderanno su questo piatto e i vermi raggiungeranno lo stadio larvale L4 in 2 giorni per gli animali selvatici.
10. Inoculare la coltura batterica
NOTA: I batteri sono utilizzati come fonte primaria di cibo per C. elegans, più comunemente ceppi di E. coli OP50 o HT115. I batteri sono concentrati 10 volte, che dovrebbero essere considerati nel volume della coltura preparata. Preparare una coltura batterica il giorno prima di individuare il dispositivo.
- Dalla piastra LB preparata al punto 4, prelevare una singola colonia e inoculare 12 ml di LB sterile per dispositivo da individuare. Includere agenti selettivi se necessario per il ceppo batterico utilizzato.
- Coltivare la coltura batterica durante la notte (~18 h) in un'incubatrice a 37 °C con agitazione a ~250 giri/min.
11. Individuare i pozzetti con batteri concentrati
NOTA: Un piccolo volume di batteri concentrati viene aggiunto a ciascun pozzetto, che è sufficiente per nutrire i vermi per tutta la loro durata sul dispositivo. La coltura batterica deve essere asciugata prima che i vermi possano essere aggiunti ai pozzetti. Poiché il volume del mezzo in ciascun pozzetto è piccolo (14-15 μL) rispetto al volume dei batteri aggiunti (5 μL), il contenuto chimico dei mezzi batterici può influire sull'ambiente chimico del pozzo. Per tenere conto di ciò, i batteri sono concentrati e risospesi in acqua salata per rimuovere LB impoverito evitando lo stress ipoosmotico. Non c'è sale aggiunto alla ricetta lmNGM (vedi passaggi 1.3-1.4) come viene aggiunto in questa fase.
- Dopo aver coltivato i batteri durante la notte come descritto nel paragrafo 10, concentrare la coltura batterica 10x. Pellettare i batteri centrifugando a ~3.400 x g per 20 minuti, smaltire il surnatante e risospendere il pellet in 1/10 del volume di coltura originale di 142,8 mM NaCl (vedere punto 1.4). Ad esempio, per individuare un dispositivo da 240 pozzetti, ruotare 12 ml di coltura e risospendere in 1,2 ml di NaCl da 142,8 mM.
NOTA: I composti / farmaci in esame possono essere aggiunti alla coltura batterica risospesa prima dell'individuazione. - Utilizzando una pipetta ripetuta, individuare ciascun pozzetto con 5 μL di batteri concentrati. Evitare il contatto diretto con la superficie lmNGM, poiché la punta della pipetta può perforare lmNGM e consentire al verme di scavare sotto la superficie del pozzetto. Fai attenzione a non lasciare che i batteri si riversino nel fossato perché i vermi saranno attratti da esso e fuggiranno nel fossato.
- Asciugare i batteri maculati con i coperchi del vassoio rimossi. Questo passaggio è importante per l'integrità a lungo termine dell'ambiente del pozzo e ci sono una varietà di modi per asciugare i dispositivi maculati. Qualunque sia il metodo utilizzato, assicurarsi che il dispositivo rimanga in un ambiente sterile, poiché deve rimanere scoperto mentre i batteri si asciugano. L'aumento del flusso d'aria riduce notevolmente il tempo di asciugatura. L'asciugatura può essere eseguita come descritto nei passaggi seguenti:
- Lasciare il dispositivo scoperto in un contenitore pulito e sigillato, come un bidone di plastica che è stato pulito con candeggina al 10%, seguito da etanolo al 70%. Questo metodo di asciugatura può richiedere diverse ore.
- Posizionare i dispositivi scoperti in una cappa a flusso laminare sterile (simile al metodo preferito di seguito).
- Asciugare i dispositivi utilizzando una "scatola di asciugatura" costruita su misura (il metodo ottimizzato seguito in questo studio), che può essere costruita a costi minimi utilizzando ventole per case per computer e filtri HEPA (vedere il file supplementare 1).
NOTA: Indipendentemente dal metodo utilizzato, la fase di essiccazione deve essere ottimizzata per l'ambiente locale. Monitorare frequentemente la velocità con cui i pozzetti si stanno asciugando fino a quando non è stato identificato il tempo di asciugatura tipico. In un ambiente a bassa umidità, l'uso di una scatola di essiccazione si traduce in un tempo di asciugatura di ~ 30-40 min. Non lasciare che le piastre si asciughino troppo, poiché i media nei pozzetti si restringono e affondano. È meglio rimuovere il dispositivo dall'asciugatura mentre alcuni pozzetti sono ancora bagnati piuttosto che lasciarlo asciugare più a lungo e potenzialmente asciugare eccessivamente un gran numero di pozzetti.
- Controllare i cristalli d'acqua. Se la maggior parte dei cristalli d'acqua nel vassoio si è asciugata e ha perso volume durante il processo di asciugatura, aggiungerne altri al vassoio.
- Dopo che i batteri sono asciutti, aggiungere immediatamente i vermi (sezione 12) o sigillare il vassoio per utilizzarlo in seguito. Per sigillare, chiudere il coperchio del vassoio e avvolgere tutti e quattro i lati con un unico pezzo di Parafilm. Ripetete due volte per un totale di tre livelli di parafilm. Dopo aver avvolto completamente il vassoio, il dispositivo può essere lasciato sul banco a temperatura ambiente per un massimo di 4 giorni prima di aggiungere i vermi (sezione 12).
12. Aggiunta di worm al dispositivo multi-pozzetto
- Aggiungere manualmente un verme per pozzetto a ciascun pozzetto utilizzando un plettro di platino per trasferire gli animali dalle piastre di vermi preparate nella sezione 9. Scegli solo vermi che si trovano nella fase di vita e nell'età desiderate.
NOTA: l'impiego di più di 1 ora per aggiungere i worm al dispositivo può causare l'essiccazione di lmNGM, quindi i worm devono essere aggiunti il più rapidamente possibile. Raccogliere più worm (20+) alla volta prima di aggiungerli ai pozzetti del dispositivo può aiutare ad aumentare la velocità.
13. Completamento della preparazione del dispositivo per l'uso a lungo termine
NOTA: questi passaggi assicurano che i pozzetti del dispositivo rimangano idratati per tutta la durata dell'esperimento.
- Esamina i cristalli d'acqua. Assicurarsi che i cristalli d'acqua siano allineati con la parte superiore del dispositivo ma non traboccanti su di esso. Se necessario, aggiungere altri cristalli d'acqua al vassoio.
- Aggiungere una goccia di soluzione detergente preparata (vedere il punto 1.5) all'interno del coperchio del vassoio e strofinare con una salvietta fino a quando la soluzione detergente non si è asciugata. Ciò impedisce l'appannamento sul coperchio dopo che il dispositivo è stato sigillato all'interno del vassoio in modo che i vermi siano chiaramente visibili.
- Avvolgere il vassoio con tre pezzi di Parafilm utilizzando una tecnica specifica che promuova l'integrità a lungo termine del sigillo Parafilm.
- Allungare leggermente un pezzo di Parafilm in modo che copra solo due lati del vassoio. Ripeti questo con un secondo pezzo di Parafilm per coprire gli altri due lati.
- Stratificato sopra il primo strato di Parafilm, prendi un ultimo pezzo di Parafilm, allungalo completamente e avvolgi tutti e quattro i lati. Se sigillati correttamente, i pozzetti del dispositivo dovrebbero rimanere idratati per ~ 2 mesi.
NOTA: L'integrità del parafilm deve essere monitorata ogni 1-2 settimane e il parafilm deve essere sostituito se rotto.
- Rimuovere eventuali impronte digitali dalla parte superiore del vassoio utilizzando una salvietta bagnata con etanolo al 70%.
14. Raccolta dei dati
NOTA: Lo scopo di questo studio è descrivere la metodologia della cultura. Una volta popolati, i dispositivi multi-pozzetto sono compatibili con il monitoraggio longitudinale di una varietà di fenotipi. Qui viene fornita una guida di base per misurare alcuni dei parametri più comuni.
- Durata della vita: monitorare la durata della vita toccando la piastra o esponendo i vermi a una luce blu brillante ogni 1-3 giorni. Punteggio come morto se non si osserva alcun movimento. Questi dispositivi multi-pozzetto sono inoltre compatibili con pipeline di imaging e analisi automatizzate per la stima della durata di vita13,18.
- Attività: monitorare l'attività dei singoli animali per tutta la vita scattando immagini statiche o video degli animali nei pozzetti del dispositivo e valutando la distanza percorsa, la velocità o altre metriche di movimento. I dispositivi sono inoltre compatibili con pipeline automatizzate di imaging e analisi per la stima dell'attività13,18.
- Dimensioni e forma del corpo: monitorare i cambiamenti nelle dimensioni e nella forma del corpo prendendo immagini statiche degli animali nei pozzetti del dispositivo e quantificando i parametri visivi utilizzando tecniche di imaging standard. In linea di principio, questo metodo di coltura dovrebbe essere compatibile con il software esistente per una valutazione più sofisticata della forma del corpo del verme 19,20,21.
15. Riutilizzo dei dispositivi
NOTA: al termine di un esperimento, i dispositivi multipozzetto possono essere puliti e riutilizzati fino a tre volte. Un ulteriore riutilizzo inizia ad avere un impatto sui fenotipi dei vermi, probabilmente causato da sostanze chimiche provenienti dai mezzi o da batteri che si accumulano nelle pareti del materiale PDMS.
- Eliminare il parafilm e rimuovere il dispositivo dal vassoio. Controlla le tacche nell'angolo in alto a destra del dispositivo, che indicano quante volte è stato utilizzato. Se è stato utilizzato tre volte, scartare il dispositivo. Se è stato utilizzato meno di tre volte, pulirlo e riutilizzarlo.
NOTA: I vassoi sono realizzati in polistirene e non sono direttamente a contatto con lmNGM, batteri o additivi per il supporto. Possono essere riutilizzati molte volte purché rimangano visivamente chiari. - Risciacquare eventuali cristalli d'acqua rimanenti dal vassoio. Spruzzare l'interno del vassoio con una soluzione di candeggina al 10% e lasciarlo riposare per 10 minuti. Risciacquare con acqua deionizzata e asciugare immediatamente per evitare macchie d'acqua.
- Tenere il dispositivo sotto l'acqua corrente per iniziare a pulire i supporti dai pozzi. Piegare delicatamente e torcere il dispositivo sotto l'acqua per allentare il supporto dai pozzi, ma non piegarsi così lontano da strappare il dispositivo. Individuare eventuali supporti rimanenti bloccati nei pozzetti con una punta per pipetta da 200 μL.
- Riempire un becher da 2 litri con una barra mescola ~3/4 piena di acqua deionizzata e portare a ebollizione su una piastra calda.
- Aggiungere uno o due dispositivi multi-pozzetto e una barra di agitazione all'acqua bollente. Accendere l'agitazione magnetica a bassa velocità (~ 200 giri / min) per agitare delicatamente i dispositivi nell'acqua. Lasciare bollire i dispositivi per 10 minuti.
- Rimuovere i dispositivi dall'acqua con una pinzetta metallica e posizionarli ben rivolti verso il basso su carta assorbente per drenarli. Lasciare asciugare i dispositivi almeno durante la notte.
- Quando i dispositivi sono completamente asciutti, avvolgerli in un foglio e sigillarli con nastro adesivo. Scrivere sul nastro dell'autoclave il numero di volte che il dispositivo è stato utilizzato. Autoclavare a ciclo asciutto per 15 minuti a 121 °C per sterilizzare. I dispositivi sono ora pronti per il riutilizzo.
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Representative Results
Il sistema di coltura WorMotel può essere utilizzato per raccogliere una varietà di dati, tra cui la durata della vita, la durata della salute e l'attività. Gli studi pubblicati hanno utilizzato dispositivi multi-pozzo per studiare la durata della vita e la durata della salute 13,14, la quiescenza e il sonno 22,23,24 e il comportamento 25. La durata della vita può essere valutata manualmente o attraverso una raccolta di immagini e analisi di imaging a valle. Nel primo approccio, i vermi possono essere osservati manualmente a seguito di uno stimolo (ad esempio, toccando la piastra o l'esposizione alla luce blu) ogni 1-3 giorni e segnati come morti se non si osserva alcun movimento, simile ai metodi standard sulle piastre di Petri1. Quest'ultimo approccio è simile, tranne per il fatto che il movimento del verme può essere determinato confrontando le differenze frame-to-frame tra le immagini scattate dopo che lo stimolo è stato applicato. Ciò fornisce un ulteriore vantaggio in quanto il movimento fornisce informazioni sia sul livello di attività dei singoli animali in quel momento sia fornisce una metrica con cui è possibile determinare la durata della vita (ad esempio, la cessazione del movimento) e la durata della salute (sono state proposte più definizioni). Le immagini possono essere ulteriormente utilizzate per estrarre parametri fisiologici aggiuntivi come le dimensioni del corpo, la forma del corpo e la postura del corpo.
Per dimostrare la capacità del sistema, abbiamo esaminato la classica relazione epistatica tra il recettore dell'insulina, codificato dal gene daf-2, e il fattore di trascrizione della famiglia FOXO a valle codificato da daf-16 nel contesto della durata della vita, della durata della salute e dell'attività quotidiana per i singoli animali. C. elegans wild-type (ceppo N2) e daf-16(mu68) con perdita di funzione (ceppo CF1038) alimentato con E. coli (ceppo HT115) che esprime entrambi i controlli (vettore vuoto; EV) o costrutti di alimentazione RNAi daf-2 sono stati coltivati in dispositivi multi-pozzetto e ogni animale è stato monitorato per durata della vita (Figura 2A), durata della salute (Figura 2B) e attività quotidiana (Figura 2C). L'attività è stata monitorata quotidianamente prendendo una serie di immagini fisse ogni 5 s per 2 minuti, con i vermi esposti a luce blu brillante per 5 s a 1 minuto per stimolare l'attività (come per Churgin et al.13). L'attività giornaliera per ciascun animale è stata stimata normalizzando lo sfondo tra pozzi e immagini, identificando l'area del verme in ciascuna immagine e calcolando il cambiamento di area tra immagini adiacenti. La durata della vita è stata definita come l'età in cui l'attività è stata osservata l'ultima volta per ciascun verme e la durata della salute è stata definita come l'età in cui un verme non poteva più muoversi di una lunghezza del corpo intero. Come previsto da numerosi studi precedenti (ad esempio, Kenyon et al.26, Murphy et al.27), la mutazione daf-16 (mu86) ha provocato una breve durata della vita e ha impedito l'estensione della durata della vita dal knockdown dell'RNAi di daf-2 (Figura 2A). Un modello simile è stato osservato per la durata della salute (Figura 2B). Come vantaggio dell'utilizzo di sistemi di coltura multi-pozzetto, la capacità di tracciare i singoli animali per tutta la vita consente un'analisi dettagliata della variazione individuale in ciascun fenotipo misurato in tutta la popolazione. Ad esempio, la variazione della durata della vita e della durata della salute tra i singoli animali può essere confrontata in termini assoluti (Figura 2D) o come frazione della durata totale della vita (Figura 2E). I fenotipi della prima infanzia possono essere ulteriormente confrontati con i fenotipi in età avanzata, compresa la durata della vita, nei singoli animali in una popolazione. Ad esempio, l'attività cumulativa per ogni singolo animale nel corso della vita (cioè l'area sotto la curva [AUC] per l'attività individuale) è correlata meglio con la durata della vita (Figura 2F) rispetto alla durata cumulativa della vita fino al giorno 5 della vita (Figura 2G) in tutte le condizioni misurate. Sottolineiamo che lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo dettagliato per la costruzione dell'ambiente multi-pozzo per tracciare i singoli animali nel tempo, non per misurare un fenotipo specifico utilizzando il dispositivo. I risultati rappresentativi presentati nella Figura 2 forniscono solo un esempio dei fenotipi che possono essere misurati in questo sistema. Una volta costruito, l'ambiente multi-pozzo è compatibile con una vasta gamma di tecniche per misurare i fenotipi di worm a strisciare liberamente su supporti solidi.
Figura 1: Schema dei dispositivi microfabbricati multipozzetto . (A) I singoli C. elegans sono coltivati su cuscinetti di agarosio solidi a basso punto di fusione (lmNGM) seminati con cibo batterico in singoli pozzetti. Lo spazio tra i pozzetti è rivestito con una sostanza chimica avversiva (solfato di rame) per isolare ogni verme all'interno del suo pozzo. Ogni dispositivo è fissato all'interno di un vassoio a pozzetto singolo. Il perimetro del vassoio è riempito con cristalli d'acqua per mantenere l'umidità. Il vassoio è sigillato con Parafilm per consentire lo scambio di ossigeno. Immagine creata con BioRender.com. (B) Panoramica del dispositivo multipozzetto con indicazione dell'ordine suggerito per il caricamento dei pozzi. I pozzetti interni (bianchi) ricevono 14 μL di lmNGM. I pozzetti esterni (grigi) ricevono 15 μL di lmNGM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Correlazione dei fenotipi misurati tra le popolazioni nei singoli animali utilizzando dispositivi multi-pozzetto. Tutti i pannelli forniscono dati dallo stesso esperimento confrontando quattro gruppi di animali: animali wild-type (N2) soggetti a EV vettore vuoto (RNAi) (N = 138), animali wild-type soggetti a daf-2 (RNAi) (N = 151), animali daf-16 (mu86) soggetti a EV (RNAi) (N = 123) e animali daf-16 (mu86) soggetti a daf-2 (RNAi ) (N = 135). (A) L'estensione della durata della vita da daf-2 (RNAi) è bloccata dalla mutazione nulla daf-16 (mu86). Significato a coppie tra gruppi determinato dal test log-rank (funzione survdiff in R). (B) La durata della salute qui definita come il giorno in cui un animale non può più spostare un'estensione della lunghezza di tutto il corpo da daf-2 (RNAi) è bloccata dalla mutazione nulla daf-16 (mu86). Significato a coppie tra gruppi determinato dal test log-rank (funzione survdiff in R). (C) La media mobile di 3 giorni di attività per tutta la durata della vita è ridotta sia da daf-16 (mu86) che da daf-2 (RNAi). Significatività calcolata dal test U di Mann-Whitney per confrontare l'area sotto la curva per l'attività nel corso della vita dei singoli animali tra i gruppi. (D) Durata della salute e durata della vita per ciascuna popolazione come valori assoluti (errore medio ± standard della media). (E) Durata della salute e durata della vita per ogni popolazione normalizzata alla durata totale della vita all'interno di ciascun gruppo (errore medio ± standard della media). (F) L'attività cumulativa nel corso della vita (area sotto la curva [AUC] nel corso della vita) per i singoli animali è correlata meglio con la durata della vita rispetto a (G) l'attività per i singoli animali in un giorno specifico per tutta la durata della vita (viene mostrata la correlazione dell'attività al giorno 8, che rappresenta il punto in cui l'attività media è massimizzata), calcolata dalla regressione lineare (funzione lm in R). n.s. = non significativo, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Tutti i valori p sono stati aggiustati per confronti multipli utilizzando il metodo Bonferroni per i confronti effettuati all'interno di ciascun pannello. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: file STL per la stampa dello stampo del dispositivo multi-pozzetto 3D Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il sistema WorMotel è un potente strumento per raccogliere dati individualizzati per centinaia di C. elegans isolati nel tempo. A seguito degli studi precedenti che utilizzavano dispositivi multi-pozzetto per applicazioni nella quiescenza dello sviluppo, nel comportamento locomotore e nell'invecchiamento, l'obiettivo di questo lavoro era ottimizzare la preparazione di dispositivi multi-pozzo per il monitoraggio a lungo termine di attività, salute e durata della vita in modo più elevato. Questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di dispositivi multi-pozzetto che ottimizza molti dei passaggi del protocollo originale13, evidenzia i punti chiave che possono presentare difficoltà tecniche e fornisce una discussione sul riutilizzo delle piastre e di altri materiali.
Ai fini della scalabilità, come laboratorio che attualmente prepara tra 10 e 20 dispositivi in una settimana tipica, una considerazione principale era se i dispositivi potessero essere riutilizzati e, in caso affermativo, in quale misura. C'è un costo più elevato in termini di tempo e denaro nella preparazione dei dispositivi PDMS rispetto alla conduzione della coltura tradizionale su piastre di Petri, ma questi costi più elevati possono essere ridotti riutilizzando il PDMS o altri componenti del sistema. Con molti riutilizzi, il PDMS ha iniziato a sviluppare una colorazione gialla, probabilmente riflettendo l'accumulo di composti dai mezzi lmNGM o dai batteri. Gli animali allevati su queste tavole hanno anche mostrato un più alto tasso di fuga e una durata della vita ridotta. Sulla base di decine di esperimenti, tre usi sono ottimali per il riutilizzo di questi dispositivi PDMS, consentendo di valutare i fenotipi legati all'età senza un impatto misurabile dalla degradazione del PDMS riducendo al contempo il numero di nuovi dispositivi che devono essere stampati (risparmiando così sui costi). Abbiamo inoltre confermato che gli animali abbinati all'esperimento cresciuti su dispositivi al loro primo, secondo e terzo utilizzo hanno prodotto curve di sopravvivenza che erano quasi indistinguibili e non statisticamente diverse (dati non mostrati). I vassoi utilizzati per contenere i dispositivi sono realizzati in polistirolo e possono essere puliti e riutilizzati all'infinito se rimangono privi di graffi o altri segni che potrebbero interferire con la visualizzazione dei vermi.
Una sfida chiave per la preparazione di dispositivi multi-pozzetto per applicazioni che durano più di ~ 2 settimane è la prevenzione della contaminazione delle piastre da batteri e funghi ambientali. Ci sono più fasi in cui la sterilizzazione è fondamentale per prevenire la contaminazione. Questi includono l'autoclave di tutti i dispositivi prima dell'uso, l'ebollizione dei dispositivi destinati al riutilizzo, l'autoclave dei cristalli di acqua assorbente utilizzati per mantenere l'umidità, la pulizia dei vassoi che contengono i dispositivi con candeggina ed etanolo prima dell'uso e la sterilizzazione con filtro della soluzione detergente che viene applicata al coperchio del vassoio per evitare l'appannamento e aggiunta alla soluzione di solfato di rame. L'implementazione di ciascuno di questi cambiamenti ha ridotto notevolmente gli eventi di contaminazione, consentendo ai dispositivi sigillati di essere utilizzati in modo coerente per il monitoraggio longitudinale per tutta la durata della vita, anche in condizioni di pro-longevità (ad esempio, knockout di daf-2) che richiedono un monitoraggio per >45 giorni. Il protocollo qui descritto include due modifiche al protocollo originale per applicazioni a lungo termine progettate per mantenere un'essiccazione costante del pozzo e prevenire l'essiccazione. Innanzitutto, la profondità complessiva del dispositivo è stata aumentata di 2 mm per aumentare la capacità dei cristalli d'acqua. Nel corso di lunghi esperimenti, in particolare in un ambiente a bassa umidità, troppo pochi cristalli d'acqua nel vassoio hanno portato all'essiccazione dell'lmNGM. Insieme a più cristalli d'acqua, è stato necessario aumentare il volume di agarosio che è stato aggiunto ai pozzetti lungo il bordo del dispositivo. Questi pozzi tendevano ad asciugarsi prima dopo il carico del pozzo (sezione 6) e a restringersi. L'uso di 14 μL di agarosio sui pozzetti interni era un volume sufficiente per riempire completamente i pozzetti senza creare la parte superiore a cupola che deriva dal riempimento eccessivo dei pozzi. L'aggiunta di 15 μL di agarosio ai pozzetti esterni ha fornito un volume sufficiente che, quando i pozzi hanno iniziato a prosciugarsi, si sono ridotti a un livello paragonabile ai 14 μL aggiunti nei pozzi interni.
Una delle maggiori deviazioni dal protocollo originale è stata quella di invertire l'ordine in cui l'utente carica lmNGM (sezione 6) e solfato di rame (sezione 7). Originariamente, il solfato di rame è stato aggiunto al fossato per primo, seguito dal riempimento dei pozzi con lmNGM13. È stato osservato che riempire i pozzetti con lmNGM il più presto possibile dopo la pulizia del plasma ha migliorato l'aderenza dell'lmNGM alle pareti del pozzo. Aspettare troppo a lungo dopo la pulizia del plasma ha portato a pozzi con bolle e cime a cupola, che possono interferire con la visualizzazione dei vermi. Dare priorità al riempimento dei pozzetti rispetto all'aggiunta del solfato di rame è particolarmente importante quando si preparano più dispositivi contemporaneamente per garantire superfici lmNGM uniformi e di alta qualità. Uno svantaggio del riempimento dei pozzetti è che la modifica della superficie idrofila prodotta dal pulitore al plasma si sarà consumata notevolmente nel momento in cui l'utente passa all'aggiunta del solfato di rame. Il solfato di rame non scorre facilmente attraverso il fossato quando la superficie diventa meno idrofila, rendendo così difficile ottenere una copertura completa. L'aggiunta di detergente alla soluzione di solfato di rame per agire come tensioattivo migliora il flusso della soluzione attraverso il fossato. Un plettro di filo di platino può anche essere utilizzato per guidare delicatamente il solfato di rame attraverso il fossato rompendo la tensione in qualsiasi punto in cui il solfato di rame ha difficoltà a fluire. Inoltre, se la soluzione di solfato di rame fosse lasciata nel fossato, si riverserebbe facilmente nei pozzetti e contaminerebbe la superficie lmNGM quando si inclina il vassoio. La natura del processo di caricamento rende quasi impossibile mantenere il dispositivo sufficientemente livellato per evitare che il rame contamini un sottoinsieme dei pozzi. Per tenere conto di ciò, la soluzione di solfato di rame viene rimossa dal fossato (fase 7.3) e il solfato di rame residuo lasciato è sufficiente a dissuadere la maggior parte dei vermi dalla fuga. Come nota finale sull'uso del solfato di rame come barriera avversiva, alcuni repellenti possono influenzare i fenotipi associati all'età, compresa la durata della vita. L'uso del solfato di rame in questi dispositivi multi-pozzetto è stato esaminato da Churgin et al.13 e non ha riscontrato alcun impatto rilevabile sulla durata della vita o sullo sviluppo.
Altri aggiornamenti minori al protocollo si concentrano sul miglioramento delle misure adottate per preparare il PDMS. È stata aggiunta un'ulteriore fase di degasaggio dopo aver miscelato la base PDMS e l'agente di polimerizzazione, poiché si tratta di un processo che genera molte bolle. La rimozione della maggior parte delle bolle prima di aggiungere la miscela agli stampi del dispositivo riduce al minimo le bolle rimanenti dopo la seconda fase di degasaggio. Per garantire che la parte inferiore del dispositivo sia completamente piatta e uniforme, una caratteristica importante per l'imaging dell'intera piastra, è stato posato un pezzo di vetro o acrilico sulla parte superiore dello stampo riempito. Questo passaggio non è essenziale, anche se comunque utile, per le applicazioni che esaminano solo un pozzetto alla volta, poiché l'utente può regolare manualmente la messa a fuoco per ciascun pozzetto. Infine, l'indurimento del PDMS a una temperatura più elevata (55 °C) era necessario nel luogo in cui questa versione del protocollo era ottimizzata (Tucson, Arizona, USA), in contrasto con i 40 °C indicati dal protocollo originale (ottimizzato a Philadelphia, Pennsylvania, USA). Ciò suggerisce che le differenze tra le posizioni (come il clima o i reagenti precisi e le attrezzature utilizzate) possono influenzare le fasi specifiche del protocollo, come la temperatura di polimerizzazione o le tecniche di essiccazione, e che potrebbero dover essere ottimizzate in ciascun sito. Ad esempio, l'umidità ambientale gioca un ruolo importante nel determinare il tempo di asciugatura delle piastre dopo lo spotting, e questo può variare notevolmente tra luoghi o stagioni.
In linea di principio, questo sistema di dispositivi multi-pozzetto può essere utilizzato per raccogliere dati su qualsiasi fenotipo che può essere misurato al microscopio standard a campo chiaro su piastre di Petri - durata della vita, durata della salute, movimento non stimolato / stimolato, dimensioni e forma del corpo, geometria del movimento - con la capacità aggiuntiva di tracciare tali metriche per i singoli vermi nel tempo. Come notato nell'introduzione, ci sono altri metodi per acquisire i dati individuali sull'intera durata della vita. I dispositivi microfluidici28 o piastre multipozzetto29 offrono la capacità di seguire la storia della vita dei singoli animali, ma solo coltivando i vermi in mezzi liquidi. Un ambiente liquido può alterare il trascrittoma dei vermi 10,11,30 rispetto ai mezzi solidi e induce distinti cambiamenti fisiologici e comportamentali, tra cui il nuoto episodico 31, l'aumento del dispendio energetico 10,32 e l'elevato stress ossidativo 10. Il grado in cui la durata della vita e altre metriche relative all'invecchiamento sano possono essere confrontate direttamente tra mezzi liquidi e solidi non è chiaro. I dispositivi multipozzetto per colture solide consentono il tracciamento di singoli worm in un ambiente paragonabile alla coltura di gruppo standard su piastre di Petri. La struttura curva della parete del dispositivo consente l'imaging dei vermi ovunque all'interno del pozzo, rendendo questi dispositivi compatibili, in linea di principio, con strumenti più sofisticati per l'analisi di singoli worm, come Worm Tracker33.
La capacità di monitorare i singoli animali nel corso di un esperimento su un dispositivo multi-pozzetto è accompagnata da diverse limitazioni. In primo luogo, anche con un protocollo ottimizzato, questi dispositivi richiedono più tempo per essere impostati per animale rispetto alla coltura standard su piastre di Petri, fornendo così dati su singolo animale al costo della dimensione complessiva del campione. Tuttavia, i vermi sono anche isolati in pozzi individualizzati, rimuovendo alcune delle complicazioni associate alla misurazione automatizzata della durata della vita, come il rilevamento automatico di singoli animali che smettono di muoversi mentre si toccano l'un l'altro. L'automazione recupera più che il tempo perso per la configurazione più complessa e offre l'opportunità di uno screening più elevato13,18. In secondo luogo, le condizioni sperimentali che i vermi non amano più del fossato di solfato di rame, come forti agenti che inducono stress (ad esempio, paraquat) o restrizioni dietetiche, porteranno i vermi a fuggire dai pozzi e nel fossato. In terzo luogo, mentre i dispositivi PDMS consentono la microscopia in campo chiaro e in campo scuro, il materiale PDMS tende ad avere una fluorescenza di fondo sia elevata che irregolare, quest'ultima probabilmente derivante da polvere o altre microparticelle che vengono incorporate nel PDMS durante lo stampaggio, il che limita la loro applicazione nella microscopia fluorescente. Infine, lo scolorimento osservato nel PDMS per i dispositivi riutilizzati nel corso di più esperimenti e la riduzione associata della durata della vita e l'aumento della fuga suggeriscono che i componenti dei media e altre sostanze chimiche aggiunte penetrano nel PDMS nel tempo. Il grado in cui questo può influenzare i fenotipi di invecchiamento o i trattamenti farmacologici è attualmente in fase di studio. Come accennato in precedenza, esiste un metodo alternativo per una coltura a singolo verme che è simile ai dispositivi multi-pozzetto PDMS, ma utilizza invece microvassoi disponibili in commercio per coltivare animali isolati16. Questi microvassoi sono realizzati in polistirolo, evitando il potenziale problema dei componenti dei supporti di sanguisuga, e hanno uno sfondo di fluorescenza coerente, consentendo l'imaging diretto in vivo della fluorescenza direttamente sulla piastra. I pozzetti dei microvassoi sono anche circondati da acido palmitico al posto del solfato di rame utilizzato nel protocollo qui descritto, che è più avversivo e riduce la frazione di vermi che lasciano i loro pozzi, anche nel caso di agenti che inducono stress e restrizioni dietetiche. Questi vantaggi sono realizzati al costo di una minore efficienza di confezionamento dei pozzi, poiché i microvassoi consentono di coltivare un massimo di 96 vermi in un singolo vassoio rispetto alla capacità di 240 vite senza fine dei dispositivi PDMS. Le specifiche del risultato desiderato di un esperimento influenzeranno quale di questi sistemi dovrebbe essere utilizzato.
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Disclosures
Gli autori affermano di non avere alcun conflitto di interessi da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH R35GM133588 a G.L.S., un premio catalizzatore della National Academy of Medicine degli Stati Uniti a G.L.S., lo State of Arizona Technology and Research Initiative Fund amministrato dall'Arizona Board of Regents e la Ellison Medical Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
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