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Biology

मल्टी-वेल उपकरणों में ठोस मीडिया पर पृथक केनोरहाब्डिस एलिगेंस की दीर्घकालिक संस्कृति और निगरानी

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

यहां प्रस्तुत माइक्रोफैब्रिकेटेड मल्टी-वेल उपकरणों में ठोस मीडिया पर पृथक व्यक्तिगत नेमाटोड के संवर्धन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है। यह दृष्टिकोण व्यक्तिगत जानवरों को उम्र बढ़ने और स्वास्थ्य से संबंधित विभिन्न प्रकार के फेनोटाइप्स के लिए अपने पूरे जीवन में निगरानी करने की अनुमति देता है, जिसमें गतिविधि, शरीर का आकार और आकार, आंदोलन ज्यामिति और अस्तित्व शामिल हैं।

Abstract

नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस अपनी सरल और सस्ती संस्कृति तकनीकों, तेजी से प्रजनन चक्र (~ 3 दिन), छोटे जीवनकाल (~ 3 सप्ताह), और आनुवंशिक हेरफेर और आणविक विश्लेषण के लिए कई उपलब्ध उपकरणों के कारण उम्र बढ़ने के अनुसंधान में उपयोग की जाने वाली सबसे आम मॉडल प्रणालियों में से एक है। एलिगेंस में उम्र बढ़ने के अध्ययन के संचालन के लिए सबसे आम दृष्टिकोण, जिसमें उत्तरजीविता विश्लेषण शामिल है, में पेट्री प्लेटों में ठोस नेमाटोड विकास मीडिया (एनजीएम) पर एक साथ दसियों से सैकड़ों जानवरों की आबादी का संवर्धन शामिल है। जबकि यह दृष्टिकोण जानवरों की आबादी पर डेटा इकट्ठा करता है, अधिकांश प्रोटोकॉल समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों को ट्रैक नहीं करते हैं। यहां प्रस्तुत माइक्रोफैब्रिकेटेड पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) उपकरणों पर व्यक्तिगत जानवरों के दीर्घकालिक संवर्धन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है जिसे वोरमोटल कहा जाता है। प्रत्येक उपकरण एनजीएम युक्त छोटे कुओं में 240 जानवरों को सुसंस्कृत करने की अनुमति देता है, प्रत्येक कुएं को कॉपर सल्फेट युक्त खाई द्वारा अलग किया जाता है जो जानवरों को भागने से रोकता है। मूल वोरमोटल विवरण के आधार पर, यह पेपर सामान्य तकनीकी जटिलताओं के विवरण और समस्या निवारण के लिए सलाह के साथ, प्रत्येक डिवाइस को ढालने, तैयार करने और पॉप्युलेट करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल के भीतर छोटी मात्रा वाले एनजीएम के लगातार लोडिंग के लिए तकनीकें, एनजीएम और बैक्टीरियल भोजन दोनों का लगातार सूखना, औषधीय हस्तक्षेप देने के विकल्प, पीडीएमएस उपकरणों का पुन: उपयोग करने के लिए निर्देश और व्यावहारिक सीमाएं, और कम आर्द्रता वाले वातावरण में भी निर्जलीकरण को कम करने के लिए सुझाव हैं। यह तकनीक पेट्री प्लेटों में ठोस मीडिया पर समूह संस्कृति के लिए मानक तकनीक के समान वातावरण में उत्तेजित गतिविधि, अनियंत्रित गतिविधि, शरीर के आकार, आंदोलन ज्यामिति, स्वास्थ्य और अस्तित्व सहित विभिन्न शारीरिक मापदंडों की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति देती है। स्वचालित माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने पर यह विधि उच्च-थ्रूपुट डेटा संग्रह के साथ संगत है। अंत में, इस तकनीक की सीमाओं पर चर्चा की जाती है, साथ ही इस दृष्टिकोण की तुलना हाल ही में विकसित विधि से की जाती है जो ठोस मीडिया पर पृथक नेमाटोड को कल्चर करने के लिए माइक्रोट्रे का उपयोग करती है।

Introduction

केनोरहाब्डिस एलिगेंस का उपयोग आमतौर पर उम्र बढ़ने के अध्ययन में किया जाता है क्योंकि उनकी छोटी पीढ़ी का समय (लगभग 3 दिन), छोटा जीवनकाल (लगभग 3 सप्ताह), प्रयोगशाला में खेती में आसानी, स्तनधारियों के साथ आणविक प्रक्रियाओं और मार्गों के विकासवादी संरक्षण की उच्च डिग्री और आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों की व्यापक उपलब्धता। उम्र बढ़ने के अध्ययन के संदर्भ में, सी एलिगेंस जीवित जानवरों में देर से जीवन फेनोटाइप के विश्लेषण के लिए दीर्घायु डेटा और वृद्ध आबादी की तेजी से पीढ़ी की अनुमति देते हैं। कृमि उम्र बढ़ने के अध्ययन के संचालन के लिए विशिष्ट दृष्टिकोण में 6 सेमी पेट्रीप्लेटों 1 में ठोस आगर नेमाटोड विकास मीडिया (एनजीएम) पर 20 से 70 जानवरों के समूहों में बनाए गए कीड़े की आबादी के जीवनकाल को मैन्युअल रूप से मापना शामिल है। आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी का उपयोग करने से आबादी भर में अलग-अलग जानवरों में जीवनकाल या पार-अनुभागीय फेनोटाइप ्स के माप की अनुमति मिलती है, लेकिन यह विधि समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों की विशेषताओं की निगरानी को रोकती है। यह दृष्टिकोण श्रम-गहन भी है, इस प्रकार परीक्षण की जा सकने वाली आबादी के आकार को सीमित करता है।

सीमित संख्या में संस्कृति विधियां हैं जो अपने पूरे जीवनकाल में व्यक्तिगत सी एलिगेंस की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति देती हैं, और प्रत्येक के फायदे और नुकसान का एक अलग सेट है। वर्मफार्म2, नेमालाइफ3, और "व्यवहार" चिप4 सहित माइक्रोफ्लुइडिक्स डिवाइस, अन्य 5,6,7 के बीच, समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों की निगरानी की अनुमति देते हैं। मल्टी-वेल प्लेटों का उपयोग करके तरल संस्कृति में कीड़े का संवर्धन इसी तरह समय 8,9 के साथ व्यक्तिगत जानवरों या सी एलिगेंस की छोटी आबादी की निगरानी की अनुमति देता है। तरल वातावरण पेट्री प्लेटों में ठोस मीडिया पर सामान्य संस्कृति वातावरण से एक अलग पर्यावरणीय संदर्भ का प्रतिनिधित्व करता है, जो पशु शरीर विज्ञान के पहलुओं को बदल सकता है जो उम्र बढ़ने के लिए प्रासंगिक हैं, जिसमें वसा सामग्री और तनाव-प्रतिक्रिया जीन10,11 की अभिव्यक्ति शामिल है। उम्र बढ़ने सी एलिगेंस पर एकत्र किए गए अधिकांश डेटा के लिए इन अध्ययनों की सीधे तुलना करने की क्षमता संभावित महत्वपूर्ण पर्यावरणीय चर में अंतर से सीमित है। वर्म कोरल12 एक ऐसा दृष्टिकोण है जो व्यक्तिगत जानवरों को एक ऐसे वातावरण में रखने के लिए विकसित किया गया है जो विशिष्ट ठोस मीडिया संस्कृति को अधिक बारीकी से दोहराता है। वर्म कोरल में हाइड्रोगेल का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रत्येक जानवर के लिए एक सील कक्ष होता है, जिससे पृथक जानवरों की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति मिलती है। यह विधि शरीर के आकार और गतिविधि जैसे रूपात्मक डेटा रिकॉर्ड करने के लिए मानक ब्राइटफील्ड इमेजिंग का उपयोग करती है। हालांकि, जानवरों को भ्रूण के रूप में हाइड्रोगेल वातावरण में रखा जाता है, जहां वे अपने पूरे जीवनकाल में अबाधित रहते हैं। इसके लिए सशर्त बाँझ उत्परिवर्ती या ट्रांसजेनिक आनुवंशिक पृष्ठभूमि के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो आनुवंशिक स्क्रीनिंग की क्षमता दोनों को सीमित करता है, क्योंकि प्रत्येक उपन्यास उत्परिवर्तन या ट्रांसजीन को सशर्त बाँझपन और दवा स्क्रीनिंग की क्षमता के साथ पृष्ठभूमि में पार करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि उपचार केवल भ्रूण के रूप में जानवरों पर एक बार लागू किया जा सकता है।

फेंग-येन प्रयोगशाला द्वारा विकसित एक वैकल्पिक विधि एक माइक्रोफैब्रिकेटेड पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) डिवाइस के अलग-अलग कुओं में ठोस मीडिया पर कीड़े की खेती की अनुमति देती है जिसे वोरमोटल13,14 कहा जाता है। प्रत्येक उपकरण को एक एकल-कुएं की ट्रे में रखा जाता है (यानी, 96-वेल प्लेट के समान आयामों के साथ) और इसमें 240 कुएं होते हैं जो कीड़े को कुओं के बीच यात्रा करने से रोकने के लिए एक प्रतिकूल समाधान से भरे खाई से अलग होते हैं। प्रत्येक कुआं अपने जीवनकाल की अवधि के लिए एक एकल कीड़ा रख सकता है। डिवाइस पानी को अवशोषित करने वाले पॉलीक्रिलामाइड जेल छर्रों ("पानी के क्रिस्टल" के रूप में संदर्भित) से घिरा हुआ है, और आर्द्रता को बनाए रखने और मीडिया के निर्जलीकरण को कम करने के लिए ट्रे को पैराफिल्म प्रयोगशाला फिल्म के साथ सील किया जाता है। यह प्रणाली व्यक्तिगत जानवरों के लिए स्वास्थ्य काल और जीवनकाल डेटा एकत्र करने की अनुमति देती है, जबकि ठोस मीडिया का उपयोग प्रकाशित सी एलिगेंस जीवनकाल अध्ययनों के विशाल बहुमत में जानवरों द्वारा अनुभव किए गए पर्यावरण को बेहतर ढंग से पुन: प्रस्तुत करता है, इस प्रकार अधिक प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है। हाल ही में, पॉलीस्टाइनिन माइक्रोट्रे का उपयोग करके एक समान तकनीक विकसित की गई है जो मूल रूप से पीडीएमएस डिवाइस16 के स्थान पर माइक्रोसाइटोटॉक्सिसिटीपरख 15 के लिए उपयोग की जाती थी। माइक्रोट्रे विधि ठोस मीडिया पर संवर्धित कीड़े के लिए व्यक्तिगत डेटा के संग्रह की अनुमति देती है और इसमें उन स्थितियों के तहत कीड़े रखने की क्षमता में सुधार होता है जो आम तौर पर पलायन (जैसे, तनाव या आहार प्रतिबंध) का कारण बनते हैं, व्यापार-बंद के साथ कि प्रत्येक माइक्रोट्रे में केवल 96 जानवर हो सकते हैं, जबकि यहां उपयोग किए जाने वाले मल्टी-वेल डिवाइस में 240जानवर हो सकते हैं।

यहां प्रस्तुत मल्टी-वेल डिवाइस तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो प्लेट-टू-प्लेट स्थिरता और समानांतर में कई उपकरणों की तैयारी के लिए अनुकूलित है। इस प्रोटोकॉल को फेंग-येन प्रयोगशाला13 से मूल प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था। विशेष रूप से, संदूषण को कम करने, ठोस मीडिया और जीवाणु खाद्य स्रोत दोनों के लगातार सूखने का अनुकूलन करने और आरएनएआई और दवाओं को वितरित करने के लिए तकनीकों के लिए विवरण हैं। इस प्रणाली का उपयोग व्यक्तिगत स्वास्थ्य, जीवनकाल और अन्य फेनोटाइप, जैसे शरीर के आकार और आकार को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। ये मल्टी-वेल डिवाइस जीवनकाल को मापने के लिए मौजूदा उच्च-थ्रूपुट सिस्टम के साथ संगत हैं, जो पारंपरिक जीवनकाल प्रयोगों में शामिल अधिकांश मैनुअल श्रम को हटा सकते हैं और पैमाने पर व्यक्तिगत सी एलिगेंस में स्वचालित, प्रत्यक्ष दीर्घायु माप और स्वास्थ्य ट्रैकिंग का अवसर प्रदान कर सकते हैं।

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Protocol

1. स्टॉक समाधान और मीडिया की तैयारी

नोट: मल्टी-वेल उपकरणों की तैयारी शुरू करने से पहले, निम्नलिखित स्टॉक समाधान और मीडिया तैयार करें।

  1. नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) और कम-पिघल एनजीएम (एलएमएनजीएम) के लिए स्टॉक समाधान:
    1. 1 एम के 2 एचपीओ4 तैयार करें: 1 एल बोतल में 174.18 ग्राम के2एचपीओ4 जोड़ें, और इसे बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ 1 एल तक भरें। 30 मिनट के लिए आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) और कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें।
    2. 1 एम केपीआई, पीएच 6.0 तैयार करें: 1 एल बोतल में 136.09 ग्राम केएच2एचपीओ4 जोड़ें, और इसे बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ 1 एल तक भरें। 1 एम के2एचपीओ4 से पीएच 6.0 के साथ टाइटरेट। 30 मिनट के लिए आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) और आरटी पर स्टोर करें।
    3. 1 एम सीएसीएल 2 तैयार करें: 500 एमएल की बोतल में 73.5 ग्राम सीएसीएल2 जोड़ें, और इसे बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ 500 एमएल तक भरें। 30 मिनट के लिए आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) और आरटी पर स्टोर करें।
    4. 1 एम एमजीएसओ 4 तैयार करें: 500 एमएल की बोतल में 123.25 ग्राम एमजीएसओ4 जोड़ें, और इसे बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ 500 एमएल तक भरें। 30 मिनट के लिए आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) और आरटी पर स्टोर करें।
    5. एमएल कोलेस्ट्रॉल तैयार करें: 500 एमएल एम्बर बोतल में 2.5 ग्राम कोलेस्ट्रॉल, 100% इथेनॉल के 275 एमएल और 25 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी को मिलाएं। आरटी पर स्टोर करें।
    6. 50 एमएम फ्लोक्सुरिडीन तैयार करें: 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 0.1231 ग्राम फ्लोक्सुरिडीन और 10 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी मिलाएं। 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 0.22 μm फ़िल्टर के साथ इसे फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें। 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में 1 एमएल एलिकोट करें, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. 50 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन तैयार करें: 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 500 मिलीग्राम कार्बेनिसिलिन को 10 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ मिलाएं। 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 0.22 μm फ़िल्टर के साथ इसे फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें। 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में 1 एमएल एलिकोट करें, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. 1 एमएम आइसोप्रोपिल बी-डी-1-थियोगैलेक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) तैयार करें: 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 2.38 ग्राम आईपीटीजी को 10 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ मिलाएं। 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 0.22 μm फ़िल्टर के साथ इसे फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें। 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में 1 एमएल एलिकोट करें, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन तैयार करें: 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 1 ग्राम एम्पीसिलीन को 10 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ मिलाएं। 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 0.22 μm फ़िल्टर के साथ इसे फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें। 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में 1 एमएल एलिकोट करें, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सामान्य सी एलिगेंस रखरखाव के लिए नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) तैयार करना।
    1. 50 प्लेटें बनाने के लिए, 1 एल फ्लास्क में, 10 ग्राम बैक्टो एगर, 1.5 ग्राम एनएसीएल, 1.25 ग्राम बैक्टो पेप्टोन और 486 एमएल अल्ट्राप्योर पानी मिलाएं। बाँझ होने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए एक तरल चक्र (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) पर आटोक्लेव।
    2. आटोक्लेव के बाद, मीडिया के 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने के बाद, 1 एम केपीआई के 12.5 एमएल, 1 एम एमजीएसओ4 के 500 μL, 1 M CaCl2 के 500 μL, और 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल के 500 μL जोड़ें।
    3. एक बाँझ तकनीक का उपयोग करके, प्रत्येक 60 मिमी प्लेट (कुल 50) में 10 मिलीलीटर मीडिया डालें। मीडिया के जमने के बाद (डालने के कम से कम 30 मिनट बाद), पिपेट 300 μL बैक्टीरियल कल्चर (चरण 4 और चरण 10 के अनुसार तैयार) जिसे प्लेट के केंद्र में रातोंरात उगाया गया है। प्लेट को बेंच पर छोड़ दें, जिससे बैक्टीरिया कल्चर सूख जाए और मोटा हो जाए (1-2 दिन)। प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. कम-पिघल नेमाटोड विकास मीडिया (एलएमएनजीएम) पूर्व-मिश्रण तैयार करें:
    1. 500 एमएल फ्लास्क में, 4 ग्राम कम-पिघला हुआ अगारोस, 0.5 ग्राम बैक्टो पेप्टोन और 195 एमएल अल्ट्राप्योर पानी मिलाएं। बाँझ होने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए एक तरल चक्र (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) पर आटोक्लेव।
    2. जबकि मीडिया अभी भी पिघला हुआ है, बाँझ ग्लास टेस्ट ट्यूबों में 10 एमएल एलिकोट वितरित करें। एलएमएनजीएम पूर्व-मिश्रण को संरक्षित करने और निर्जलीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक टेस्ट ट्यूब को पैराफिल्म के साथ सील करें। मीडिया जम जाएगा और उपयोग से पहले आरटी में ~ 2 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. 142.8 mM NaCl तैयार करें: 250 मिलीलीटर की बोतल में, 0.8345 ग्राम NaCl और 100 mL बाँझ विआयनीकृत पानी मिलाएं। 30 मिनट के लिए आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) और आरटी पर स्टोर करें।
  5. डिटर्जेंट समाधान तैयार करें: 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 3 मिलीलीटर ट्वीन 20 और 7 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी मिलाएं। अच्छी तरह से मिलाएं, 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 0.22 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें, और RT पर स्टोर करें।
  6. कॉपर सल्फेट समाधान तैयार करें: एक बाँझ 50 एमएल बोतल में, 20 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी, 0.5 ग्राम क्यूएसओ4, और 100 μL डिटर्जेंट समाधान (चरण 1.5 में तैयार) मिलाएं। तब तक मिलाएं जब तक कि CuSO4 घुल न जाए। आरटी पर स्टोर करें।
  7. पानी को अवशोषित करने वाले पॉलीक्रिलामाइड क्रिस्टल तैयार करें: एक आटोक्लेव-सुरक्षित निचोड़ बोतल में, 150 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी और 1 ग्राम टाइप एस सुपर शोषक बहुलक को मिलाएं। बोतल को कई बार घुमाकर धीरे से मिलाएं। कम से कम 20 मिनट के लिए तरल चक्र (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) पर आटोक्लेव, और आरटी में स्टोर करें।
  8. लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) तैयार करें: 1 एल या बड़े बीकर में, 20 ग्राम एलबी पाउडर को 1 एल विआयनीकृत पानी के साथ मिलाएं। दो 500 एमएल बीकर में एलिकोट। 30 मिनट के लिए आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी), और आरटी पर स्टोर करें
  9. लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) अगर प्लेटें तैयार करें:
    1. 1 एल फ्लास्क में, 10 ग्राम एलबी पाउडर, 7.5 ग्राम बैक्टो आगर और 500 एमएल विआयनीकृत पानी मिलाएं। 30 मिनट के लिए एक तरल चक्र (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी) पर आटोक्लेव।
    2. यदि वांछित हो, तो वैकल्पिक एंटीबायोटिक्स जोड़ें (पोस्ट-आटोक्लेव, मीडिया के 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने के बाद): 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलिन के 500 μL। एक बाँझ तकनीक का उपयोग करके, प्रत्येक 100 मिमी प्लेट (कुल 25) में 20 मिलीलीटर मीडिया डालें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. 3 डी मल्टी-वेल डिवाइस मोल्ड प्रिंट करना

नोट: प्रत्येक डिवाइस को कस्टम 3 डी-मुद्रित मोल्ड का उपयोग करके पीडीएमएस से ढाला जाता है। एक एकल मोल्ड आवश्यकतानुसार कई उपकरणों का उत्पादन कर सकता है; हालांकि, यदि एक ही समय में कई उपकरणों को तैयार करने का प्रयास किया जाता है, तो प्रत्येक डिवाइस को समानांतर में बनाने के लिए एक 3 डी-मुद्रित मोल्ड की आवश्यकता होती है।

  1. एसटीएल फ़ाइल डाउनलोड करें ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
  2. मोल्ड को उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी प्रिंटर के साथ मुद्रित करें।
    नोट: प्रिंटर का रिज़ॉल्यूशन लगातार अच्छी तरह से और खाई की मात्रा की अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च होना चाहिए। सुझाया गया प्रिंटर रिज़ॉल्यूशन ~ 40 μm का न्यूनतम XY रिज़ॉल्यूशन और 28 μm का एक परत रिज़ॉल्यूशन है। 3 डी प्रिंटर द्वारा उपयोग की जाने वाली सामग्री समान रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि कई सामग्री प्रकार पीडीएमएस को ठीक करने से रोकेंगे। अनुभव से, वेरो ब्लैक प्रिंट सामग्री का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन पॉलीजेट प्रिंटर (रिज़ॉल्यूशन: एक्स-अक्ष = 600 डीपीआई, वाई-अक्ष = 600 डीपीआई, जेड-अक्ष = 1,600 डीपीआई) द्वारा निर्मित मोल्ड लगातार काम करते हैं। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मोल्डों की 3 डी प्रिंटिंग आउटसोर्स की गई थी (मुद्रण विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है)।

3. मल्टी-वेल डिवाइस की तैयारी

नोट: यह खंड वर्णन करता है कि PDMS मल्टी-वेल डिवाइस बनाने के लिए 3D-मुद्रित मोल्ड का उपयोग कैसे किया जाता है।

  1. प्रीहीटिंग की अनुमति देने के लिए इलाज ओवन को 55 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. एक बैच में तैयार किए जाने वाले उपकरणों की संख्या निर्धारित करें। प्रत्येक उपकरण के लिए, एक डिस्पोजेबल स्पैटुला का उपयोग करके एक बड़े, डिस्पोजेबल वजन नाव (या इसी तरह के डिस्पोजेबल कंटेनर) में 60 ग्राम पीडीएमएस बेस और 6 ग्राम इलाज एजेंट मिलाएं।
  3. बुलबुले को हटाने के लिए पीडीएमएस मिश्रण को -0.08 एमपीए पर 30 मिनट के लिए वैक्यूम चैंबर में रखें।
  4. पीडीएमएस मिश्रण को प्रत्येक 3 डी-मुद्रित मोल्ड में डालें। मोल्ड को पूरी तरह से भरें, पीडीएमएस मिश्रण मोल्ड के शीर्ष से थोड़ा ऊपर फैला हुआ है। स्पिल के मामले में मोल्ड को फिर से भरने के लिए अतिरिक्त पीडीएमएस मिश्रण रखें।
  5. डालने की प्रक्रिया के दौरान बनाए गए किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए भरे हुए मोल्ड और किसी भी अतिरिक्त पीडीएमएस मिश्रण को -0.08 एमपीए पर 25 मिनट के लिए वैक्यूम कक्ष में रखें।
  6. भरे हुए मोल्ड को वैक्यूम कक्ष से हटा दें, और किसी भी शेष बुलबुले को डिस्पोजेबल स्पैटुला के साथ पॉप करें। कुओं से दूर मोल्ड के किनारे पर किसी भी दिखाई देने वाले मलबे या शेष बुलबुले को ब्रश करने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें। कोई भी शेष मलबे या बुलबुले संभावित रूप से बाद के चरणों में इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  7. सुनिश्चित करें कि मोल्ड पूरी तरह से पीडीएमएस मिश्रण से भरा है; वैक्यूम कक्ष में या स्थानांतरण के दौरान मिश्रण के एक छोटे से हिस्से का बाहर फैलना आम है। अतिरिक्त पीडीएमएस मिश्रण का उपयोग करके रिफिल करें जिसे चरण 3.5 में डिगैस किया गया था। इससे बुलबुले नहीं बनने चाहिए, लेकिन यदि कोई बनता है, तो उन्हें धीरे से स्पैटुला के साथ मोल्ड के किनारे पर ब्रश किया जा सकता है।
  8. पीडीएमएस से भरे मोल्ड के शीर्ष पर एक फ्लैट ऐक्रेलिक शीट रखें पहले एक किनारे को रखकर और धीरे-धीरे दूसरे को नीचे करें जब तक कि ऐक्रेलिक मोल्ड के शीर्ष पर सपाट न बैठ जाए, किनारे के ऊपर फैले किसी भी पीडीएमएस मिश्रण को विस्थापित कर दे। यदि ऐक्रेलिक शीट रखते समय बुलबुले बनते हैं, तो धीरे-धीरे ऐक्रेलिक को हटा दें, यदि आवश्यक हो तो पीडीएमएस मिश्रण के साथ मोल्ड को फिर से भरें, और ऐक्रेलिक प्लेसमेंट को पुनरारंभ करें। ऐक्रेलिक शीट मोल्ड डिवाइस के लिए एक फ्लैट बॉटम बनाएगी और यह सुनिश्चित करेगी कि सभी कुएं आधार के सापेक्ष समान स्तर पर हैं।
  9. ऐक्रेलिक के शीर्ष पर 2.5 पाउंड वजन रखें। कई मोल्ड, प्रत्येक में एक अलग ऐक्रेलिक शीट होती है, जिसे ढेर किया जा सकता है। भारित मोल्डों को ओवन में रखें, और उन्हें रात भर 55 डिग्री सेल्सियस पर ठीक होने दें।
  10. अगले दिन, ओवन से वजन और मोल्ड हटा दें।
  11. सील को तोड़ने के लिए ऐक्रेलिक और ठीक पीडीएमएस के बीच एक रेजर ब्लेड को ध्यान से काम करें। मोल्ड के शीर्ष से ऐक्रेलिक को सावधानीपूर्वक हटा दें। पीडीएमएस इस बिंदु से निर्धारित किया जाएगा, और ऐक्रेलिक को हटाने में कुछ बल लग सकता है।
  12. रेजर या धातु स्पैटुला का उपयोग करके, मोल्ड से ठीक किए गए पीडीएमएस के किनारों को सावधानीपूर्वक ढीला करें। इस स्तर पर पीडीएमएस को फाड़ना आसान है; पीडीएमएस डिवाइस को बरकरार रखने के लिए किनारे के चारों ओर धीरे-धीरे और धीरे से काम करें।
    नोट: ताजा मुद्रित मोल्ड पहले तीन उपयोगों के लिए विशेष रूप से चिपचिपे होते हैं, और पीडीएमएस डिवाइस को हटाने की कोशिश करते समय अक्सर आँसू बहाते हैं। अधिक उपयोग के साथ, मोल्ड से ठीक किए गए पीडीएमएस को निकालना आसान हो जाता है।
  13. डिवाइस को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें, और इसे आटोक्लेव टेप के साथ सील करें। 121 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 15 मिनट के लिए सूखे चक्र पर आटोक्लेव, 15 पीसिग को निष्फल करने के लिए। ऑटोक्लेविंग के बाद, लपेटे गए उपकरणों को बेंच पर स्टोर करें, और आवश्यकतानुसार उनका उपयोग करें।

4. बैक्टीरिया को लकीर ें खींचना

नोट: बैक्टीरिया तैयार करना शुरू करें जो मल्टी-वेल डिवाइस पर होने के दौरान कीड़े के खाद्य स्रोत के रूप में उपयोग किया जाएगा। सबसे आम बैक्टीरिया एस्चेरिचिया कोलाई स्ट्रेन ओपी 50 (या आरएनएआई प्रयोगों के लिए स्ट्रेन एचटी 115) है। डिवाइस में कीड़े जोड़ने से कम से कम 2 दिन पहले इस चरण को पूरा करें।

  1. बैक्टीरिया को एक ताजा एलबी प्लेट पर रखें। सुनिश्चित करें कि किसी भी तनाव-विशिष्ट चयनात्मक योजक (जैसे, बैक्टीरिया को एम्पीसिलीन प्रतिरोध प्रदान करने वाले प्लास्मिड का चयन करने के लिए एम्पीसिलिन) एलबी प्लेटों में शामिल हैं।
  2. कॉलोनियों को बढ़ने की अनुमति देने के लिए प्लेट को रात भर (~ 18 घंटे) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

5. मीडिया लोडिंग के लिए मल्टी-वेल डिवाइस की तैयारी

नोट: डिवाइस बनाने वाली सिलिकॉन पीडीएमएस सामग्री की सतह हाइड्रोफोबिक है, जो क्रमशः एनजीएम और कॉपर सल्फेट से भरने से छोटी मात्रा वाले कुओं और प्रतिकूल खाई को रोकती है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, एक ऑक्सीजन प्लाज्मा का उपयोग अस्थायी रूप से डिवाइस के सतह गुणों को हाइड्रोफिलिक होने के लिए संशोधित करने के लिए किया जाता है, जिससे कुओं और खाई को सीमित समय की खिड़की (~ 2 घंटे तक) के भीतर भरने की अनुमति मिलती है। यह खंड प्लाज्मा-सफाई प्रक्रिया को पूरा करने के लिए चरणों को बताता है। बैक्टीरिया के साथ डिवाइस को अच्छी तरह से स्पॉट करने से कम से कम 1 दिन पहले इस चरण को पूरा करें, क्योंकि प्लाज्मा क्लीन के प्रभाव स्पॉटिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं। अनुभाग 5-7 के समय को देखते हुए, प्रति तकनीशियन इन चरणों के लिए व्यावहारिक सीमा समानांतर में तीन डिवाइस है।

  1. अनुभाग 6 की तैयारी में एक सूखे मोती स्नान इनक्यूबेटर को 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. चूंकि एक मल्टी-वेल डिवाइस के कुओं को भरने के लिए आवश्यक कुल मीडिया वॉल्यूम पेट्री प्लेटों की तुलना में छोटा है, एनजीएम का एक बड़ा बैच तैयार करें, और इसे परीक्षण ट्यूबों में एलिकोट करें (चरण 1.3 देखें)।
    नोट: यह समय से पहले किया जा सकता है, क्योंकि मीडिया के ट्यूबों को ~ 2 सप्ताह के लिए बेंच पर संग्रहीत किया जा सकता है। यदि मीडिया तैयार किया गया है और ट्यूबों में अलाइकोट किया गया है, तो चरण 5.3 पर आगे बढ़ें।
  3. दस्ताने पहनते समय, एक आटोक्लेव मल्टी-वेल डिवाइस को अनरैप करें; किसी भी कुएं को छूने से बचें। डिवाइस के ऊपरी-दाएं कोने में एक छोटी सी नॉच काटें ताकि यह इंगित किया जा सके कि इसका कितनी बार उपयोग / पुन: उपयोग किया गया है (प्रत्येक डिवाइस को साफ करने और पुन: उपयोग करने के निर्देशों और सिफारिशों के लिए नीचे अनुभाग 15 देखें)।
  4. प्लाज्मा क्लीनर में तीन बिना लपेटे हुए उपकरणों को रखें, जिसमें कुएं ऊपर की ओर हों। प्लाज्मा क्लीनर चलाएं।
    नोट: निम्नलिखित विस्तृत निर्देश प्लाज्मा कैच पीई -50 प्लाज्मा क्लीनर के लिए हैं। विशिष्ट चरणों और सेटिंग्स को अनुकूलित करने और संभवतः अन्य प्लाज्मा क्लीनर के लिए फिर से अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
    1. जांचें कि प्लाज्मा क्लीनर पावर स्तर 75% पर सेट है।
    2. सुनिश्चित करें कि वेंट और अलगाव वाल्व दोनों बंद स्थिति में हैं।
    3. ऑक्सीजन टैंक पर मुख्य वाल्व खोलें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि नियामक दबाव 15 psig और 20 psig के बीच गिर न जाए, और फिर अलगाव वाल्व को ON स्थिति में बदल दें।
    4. वैक्यूम पंप और प्लाज्मा क्लीनर चालू करें।
    5. प्लाज्मा क्लीनर (प्रथम उपयोग) पर निम्न सेटिंग्स दर्ज करें, या सत्यापित करें कि पहले प्रोग्राम की गई सेटिंग्स सही हैं:
      प्लाज्मा समय: 3:00 मिनट
      वैक्यूम सेट पॉइंट: 149.5 mTorr
      वायुमंडलीय वेंट: 45 एस
      शुद्ध वेंट: 5 सेकंड
      गैस स्थिर: 15 s
      वैक्यूम अलार्म: 3:00 मिनट
      ऑटो साइकिल-ऑफ: ऑन
    6. आदेश मेनू पर जाने के लिए Enter दबाएँ. सेटअप मेनू का चयन करने के लिए दाएँ तीर कुंजी का उपयोग करें, और उसके बाद Enter दबाएँ। प्रत्येक वर्तमान सेटिंग की पुष्टि करने के लिए Enter दबाकर सभी सेटिंग्स के माध्यम से स्क्रॉल करें और फिर अगली सेटिंग पर जाने के लिए दाहिना तीर दबाएं।
    7. अप एरो और फिर बाएं तीर दबाकर कमांड मेनू पर लौटें।
    8. आदेश मेनू स्क्रीन पर, Enter दबाएँ। Enter दबाकर आदेश प्लाज्मा का चयन करें. सिस्टम निम्नलिखित चरणों के माध्यम से चक्र करेगा:
      प्लाज्मा पंपडाउन
      गैस स्थिर: इस चरण के दौरान, प्लाज्मा क्लीनर पर गैस 1 नॉब को समायोजित करें जब तक कि प्रवाह मीटर 10 सीसी / मिनट पर न हो।
      प्लाज्मा का समय
      शुद्ध पंपडाउन
      प्लाज्मा चक्र पूरा हो गया
      चैंबर वेंट
      नोट: इस प्रक्रिया को पूरा करने में लगभग 5-10 मिनट का समय लगना चाहिए। जब सभी चरण पूरे हो जाते हैं, तो कमांड मेनू फिर से स्क्रीन पर प्रदर्शित होता है। यदि प्लाज्मा पंपडाउन चरण के दौरान, दबाव पर्याप्त कम नहीं होता है, तो प्लाज्मा क्लीनर अगले चरण में आगे नहीं बढ़ेगा, और स्क्रीन एक त्रुटि संदेश प्रदर्शित करेगी। यदि ऐसा होता है, तो वैक्यूम पंप तेल की जांच करें। यदि तेल का स्तर कम है या तेल बादल / गंदा है, तो तेल बदलने से वैक्यूम दबाव आवश्यक स्तर तक पहुंच सकता है।
    9. ऑक्सीजन टैंक पर मुख्य वाल्व बंद करें।
    10. बहुत धीरे-धीरे, वेंट वाल्व को ऑन स्थिति में घुमाएं, और ऑक्सीजन टैंक के नियामक दबाव को शून्य पर लौटने की अनुमति दें।
    11. अलगाव वाल्व को बंद स्थिति में चालू करें।
    12. वैक्यूम पंप और प्लाज्मा क्लीनर को बंद कर दें।
      नोट: प्लाज्मा क्लीनर द्वारा मल्टी-वेल डिवाइस का हाइड्रोफिलिक सतह संशोधन अस्थायी है और समय के साथ उत्तरोत्तर कम प्रभावी हो जाता है (लगभग 2 घंटे तक)। जितनी जल्दी हो सके अनुभाग 6 और धारा 7 के माध्यम से आगे बढ़ें।

6. एलएमएनजीएम के साथ कुओं को भरना

नोट: एक सूखा मोती स्नान इनक्यूबेटर चालू होना चाहिए और चरण 5.1 से पहले से गर्म किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि स्नान 90 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है।

  1. ट्रे के अंदर 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करके और इसे टास्क वाइप के साथ सूखकर प्रति डिवाइस एक एकल-अच्छी तरह से पॉलीस्टाइनिन ट्रे को स्टरलाइज़ करें।
  2. प्रत्येक डिवाइस को प्लाज्मा क्लीनर से एक हाथ से निकालें, और इसे एक साफ ट्रे में रखें।
  3. 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के बाद बीड बाथ इनक्यूबेटर में 25 एमएल डिस्पोजेबल पिपेट बेसिन रखें।
  4. भरने के लिए प्रति डिवाइस ठोस एलएमएनजीएम पूर्व-मिश्रण की एक ट्यूब इकट्ठा करें (चरण 1.3 देखें)।
  5. एलएमएनजीएम पूर्व-मिश्रण परीक्षण ट्यूबों को 200 एमएल ग्लास बीकर में रखें, और कैप और पैराफिल्म को हटा दें। ~ 20 सेकंड के लिए माइक्रोवेव करें जब तक कि मीडिया डालने के लिए पर्याप्त रूप से पिघल न जाए (इस स्तर पर कुछ ठोस मीडिया की उपस्थिति ठीक है)।
  6. पिघले हुए एलएमएनजीएम प्री-मिश्रण को कई परीक्षण ट्यूबों से एक और बाँझ 200 एमएल बीकर में मिलाएं। कुल 40 सेकंड तक पहुंचने के लिए अतिरिक्त 20 सेकंड के लिए माइक्रोवेविंग जारी रखें। यदि एलएमएनजीएम प्री-मिश्रण उबलने लगता है, तो माइक्रोवेव बंद कर दें, और जारी रखने से पहले एलएमएनजीएम प्री-मिश्रण को व्यवस्थित होने दें।
  7. माइक्रोवेव से पिघला हुआ एलएमएनजीएम पूर्व-मिश्रण निकालें, और इसे ~ 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    नोट: इस स्तर पर, मीडिया ~ 5 मिनट के बाद ठंडा और पुन: ठोस हो जाएगा। चरण 6.8 और चरण 6.9 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  8. lmNGM पूर्व-मिश्रण के प्रत्येक 10 mL के लिए, निम्नलिखित जोड़ें (क्रम में): 1 M KPi का 250 μL, 1 M MgSO4 का 10 μL, 1 M CaCl2 का 10 μL, और 5 mg/mL कोलेस्ट्रॉल का 10 μL।
    1. डिवाइस पर वयस्कों की निगरानी करते समय अंडे सेने को रोकने के लिए, 50 एमएम फ्लोक्सुरिडीन के 10 μL जोड़ें।
    2. आरएनएआई प्लास्मिड का चयन करने के लिए और आरएनए की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, 50 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन के 5 μL और 1 mM IPTG के 12 μL जोड़ें।
      नोट: प्रयोग के डिजाइन के आधार पर एंटीबायोटिक्स या अन्य एडिटिव्स को बदला जा सकता है। इस स्तर पर परीक्षण यौगिकों / दवाओं को मीडिया में भी जोड़ा जा सकता है।
  9. मोती स्नान में 25 एमएल बेसिन में पिघला हुआ एलएमएनजीएम डालें।
  10. 200 μL मल्टीचैनल रिपीटर पिपेट का उपयोग कर डिवाइस को lmNGM के साथ भरें।
    1. रिपीटर को 14 μL के एलिकोट को वितरित करने के लिए सेट करें (200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके 14 μL को 14 बार तक वितरित किया जा सकता है)।
    2. पांच पिपेट युक्तियों को माउंट करें। डिवाइस के कुओं में 384-वेल प्लेट के समान अंतर है। मानक मल्टीचैनल पिपेट को इस तरह से स्थान दिया जाता है कि उपयोगकर्ता एक पंक्ति / कॉलम में हर दूसरे कुएं में पिपेट कर सकता है।
    3. पिघले हुए एलएमएनजीएम के साथ युक्तियों को लोड करें। पहले 14 μL को lmNGM युक्त बेसिन में वापस वितरित करें।
    4. तेजी से लेकिन सावधानी से आगे बढ़ते हुए, 14 μL को आंतरिक कुओं (चित्र 1B में सफेद) में डालें, जो चित्र 1B में "x" के साथ चिह्नित लोगों से शुरू होता है और प्लेट के पार दाईं ओर और फिर नीचे की ओर बढ़ता है, जिससे कुल 12 बार (60 कुएं) निकलते हैं।
    5. शेष एलएमएनजीएम को बेसिन में वापस वितरित करें, क्योंकि अंतिम एलिकोट आमतौर पर 14 μL से कम होता है।
    6. चरण 6.10.3-6.10.5 को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी आंतरिक कुएं भर न जाएं।
    7. चरण 6.10.3-6.10.5 को दोहराएं, लेकिन आंतरिक कुओं के बजाय, कुओं की सबसे बाहरी अंगूठी (चित्र 1 बी में ग्रे) भरें, चित्र 1 बी में "+" के साथ चिह्नित कुओं से शुरू करें और प्लेट के बाहरी किनारे के चारों ओर घूमें।
      नोट: जल्दी से काम करें ताकि मीडिया पिपेट युक्तियों में ठोस न हो। किसी भी एलएमएनजीएम को खाई में फेंकने से बचें। बाहरी कुएं अधिक तेज़ी से सूखते हैं। एलएमएनजीएम का अतिरिक्त 1 μL अंतिम सूखे कुएं को आंतरिक कुओं के समान सुखाने के समय में एक स्तर की सतह रखने की अनुमति देता है।
  11. गुणवत्ता नियंत्रण चरण के रूप में, उन खामियों की पहचान करने के लिए प्रत्येक कुएं की जांच करें जो इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं, जिनमें कुएं शामिल हैं जो कम भरे हुए हैं (एलएमएनजीएम सतह कुएं के किनारे के नीचे धंस गई है), ओवरफिल (एलएमएनजीएम सतह में एक गुंबददार शीर्ष है), और बुलबुले या मलबे होते हैं।
  12. एक छोटे प्लैटिनम वायर पिक या वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ असंतोषजनक कुओं से ठोस एलएमएनजीएम को हटा दें। ताजा पिघले हुए एलएमएनजीएम के साथ खाली कुओं को फिर से भरें। इसके अलावा, एक छोटे प्लैटिनम वायर पिक या वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ खाई में बहने वाले किसी भी मीडिया को हटा दें।

7. खाई में कॉपर सल्फेट जोड़ना

नोट: इस उपकरण के कुएं एक निरंतर खाई से घिरे हुए हैं। यहां, खाई को कॉपर सल्फेट से भरा जाता है, जो एक विकर्षक के रूप में कार्य करता है और कीड़े को अपने कुओं से भागने से रोकता है।

  1. 200 μL पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कोने में डिवाइस की खाई में 200 μL कॉपर सल्फेट समाधान (चरण 1.6 देखें) वितरित करें, 2x प्रति कोने। यह कॉपर सल्फेट को पूरे खाई के माध्यम से बहने के लिए पर्याप्त मात्रा में होना चाहिए। सावधान रहें कि किसी भी बिंदु पर खाई को ओवरफिल न करें; कॉपर सल्फेट को कुओं की ऊपरी सतह को नहीं छूना चाहिए।
  2. यदि कॉपर सल्फेट पूरी खाई के माध्यम से आसानी से प्रवाहित नहीं होता है, तो तनाव को तोड़ने में मदद करने के लिए एक छोटे प्लैटिनम तार पिक का उपयोग करें और कॉपर सल्फेट को खाई के माध्यम से खींचें।
  3. कॉपर सल्फेट के खाई की संपूर्णता के माध्यम से बहने के बाद, 200 μL पिपेट या वैक्यूम के साथ आकांक्षा का उपयोग करके खाई से जितना संभव हो उतना कॉपर सल्फेट निकालें। पीछे छोड़ा गया अवशेष कीड़े को उनके कुओं को छोड़ने से रोकने के लिए पर्याप्त होगा। कॉपर सल्फेट घोल से भरी खाई को छोड़ने से कॉपर सल्फेट कुओं में फैलने का खतरा होता है, जिससे कीड़े भाग जाते हैं।

8. आटोक्लेव पानी के क्रिस्टल जोड़ना

नोट: प्लेट के भीतर आर्द्रता बनाए रखने और एलएमएनजीएम के निर्जलीकरण को रोकने के लिए, प्रत्येक उपकरण संतृप्त पानी को अवशोषित करने वाले पॉलीक्रिलामाइड क्रिस्टल से घिरा हुआ है।

  1. पानी के क्रिस्टल तैयार करें (चरण 1.7 देखें)।
  2. एक निचोड़ बोतल का उपयोग करके, डिवाइस और ट्रे की दीवारों के बीच रिक्त स्थान में पानी के क्रिस्टल जोड़ें। ट्रे ढक्कन बंद करें, और पैराफिल्म के एक टुकड़े के साथ सभी चार पक्षों को लपेटें। प्लेट को पूरी तरह से सील करने के लिए पैराफिल्म के दो अतिरिक्त टुकड़े जोड़ें।
    नोट: पानी के क्रिस्टल को बीकर में तैयार किया जा सकता है और एक निष्फल स्पैटुला के साथ ट्रे में खींचा जा सकता है। हालांकि, यह प्रक्रिया में समय जोड़ता है और उस समय को बढ़ाता है जब प्रत्येक ट्रे खुली होती है और संभावित दूषित पदार्थों के संपर्क में आती है।
  3. अगले दिन तक बेंच पर सील डिवाइस छोड़ दें जब बैक्टीरिया स्पॉट होने के लिए तैयार हों। सुनिश्चित करें कि उपकरणों को एलएमएनजीएम जोड़े जाने के बाद कुओं के साथ संग्रहीत किया जाता है।

9. कीड़े की आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी की तैयारी।

नोट: निम्नलिखित चरणों में कीड़े की एक सिंक्रनाइज़ आबादी उत्पन्न होती है जो चौथे लार्वा चरण (एल 4) में मल्टी-वेल डिवाइस में जोड़ने के लिए तैयार हैं। हालांकि, विकास के विभिन्न चरणों में कीड़े भी जोड़े जा सकते हैं। यदि एल 4 वांछित हैं तो डिवाइस में कीड़े जोड़ने से 2 दिन पहले यह चरण पूरा किया जाना चाहिए। वांछित जीवन चरण के लिए सिंक्रनाइज़ेशन का समय समायोजित करें।

  1. लगातार उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए, मानक एनजीएम प्लेटों पर सी एलिगेंस बनाए रखें (अच्छी तरह से खिलाए गए परिस्थितियों में 20 डिग्री सेल्सियस पर चरण 1.2 देखें)।
  2. मानक विधियों के माध्यम से स्टॉक प्लेट से जानवरों की सिंक्रनाइज़ आबादी प्राप्त करें, उदाहरण के लिए, ब्लीचिंग17 या समयबद्ध अंडा बिछाने1।
  3. बैक्टीरिया के साथ देखे जाने वाले एनजीएम प्लेट में पृथक अंडे जोड़ें। अंडे इस प्लेट पर निकलेंगे और कीड़े जंगली प्रकार के जानवरों के लिए 2 दिनों में एल 4 लार्वा चरण तक पहुंच जाएंगे।

10. बैक्टीरियल कल्चर को इंजेक्ट करना

नोट: बैक्टीरिया का उपयोग सी एलिगेंस के लिए प्राथमिक खाद्य स्रोत के रूप में किया जाता है, आमतौर पर ई कोलाई उपभेद ओपी 50 या एचटी 115। बैक्टीरिया 10 गुना केंद्रित होते हैं, जिन्हें तैयार संस्कृति की मात्रा में हिसाब दिया जाना चाहिए। डिवाइस को स्पॉट करने से एक दिन पहले एक बैक्टीरियल कल्चर तैयार करें।

  1. चरण 4 में तैयार एलबी प्लेट से, एक एकल कॉलोनी चुनें, और प्रति डिवाइस 12 मिलीलीटर बाँझ एलबी को देखा जा सके। उपयोग किए जा रहे बैक्टीरिया तनाव के लिए यदि आवश्यक हो तो चयनात्मक एजेंटों को शामिल करें।
  2. ~ 250 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर (~ 18 घंटे) बैक्टीरिया कल्चर विकसित करें।

11. कुओं को केंद्रित बैक्टीरिया के साथ स्पॉट करना

नोट: प्रत्येक कुएं में केंद्रित बैक्टीरिया की एक छोटी मात्रा जोड़ी जाती है, जो डिवाइस पर अपने पूरे जीवनकाल के लिए कीड़े को खिलाने के लिए पर्याप्त है। कुओं में कीड़े जोड़ने से पहले बैक्टीरिया कल्चर को सूखने की आवश्यकता होती है। चूंकि प्रत्येक कुएं में मीडिया की मात्रा बैक्टीरिया की मात्रा (5 μL) के सापेक्ष छोटी (14-15 μL) होती है, इसलिए बैक्टीरिया मीडिया की रासायनिक सामग्री कुएं के रासायनिक वातावरण को प्रभावित कर सकती है। इसके लिए, बैक्टीरिया को हाइपोस्मोटिक तनाव से बचते हुए क्षीण एलबी को हटाने के लिए नमक के पानी में केंद्रित और पुन: निलंबित किया जाता है। एलएमएनजीएम नुस्खा में कोई नमक नहीं जोड़ा जाता है (चरण 1.3-1.4 देखें) क्योंकि यह इस स्तर पर जोड़ा जाता है।

  1. धारा 10 में वर्णित बैक्टीरिया को रात भर बढ़ने के बाद, बैक्टीरियल कल्चर 10x पर ध्यान केंद्रित करें। 20 मिनट के लिए ~ 3,400 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके बैक्टीरिया को पेलेट करें, सुपरनैटेंट का निपटान करें, और 142.8 mM NaCl की मूल संस्कृति मात्रा के 1/10 में गोली को फिर से निलंबित करें (चरण 1.4 देखें)। उदाहरण के लिए, एक 240-वेल डिवाइस को खोजने के लिए, 12 एमएल कल्चर को स्पिन करें और 142.8 एमएम एनएसीएल के 1.2 एमएल में फिर से निलंबित करें।
    नोट: परीक्षण यौगिकों / दवाओं को स्पॉट करने से पहले पुन: निलंबित जीवाणु संस्कृति में जोड़ा जा सकता है।
  2. दोहराए गए पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक को केंद्रित बैक्टीरिया के 5 μL के साथ अच्छी तरह से स्पॉट करें। एलएमएनजीएम सतह के साथ सीधे संपर्क से बचें, क्योंकि पिपेट टिप एलएमएनजीएम को छेद सकता है और कीड़े को कुएं की सतह के नीचे रहने की अनुमति दे सकता है। सावधान रहें कि बैक्टीरिया को खाई में फैलने न दें क्योंकि कीड़े इसकी ओर आकर्षित होंगे और खाई में भाग जाएंगे।
  3. ट्रे के ढक्कन हटाने के साथ धब्बेदार बैक्टीरिया को सुखाएं। यह कदम अच्छी तरह से पर्यावरण की दीर्घकालिक अखंडता के लिए महत्वपूर्ण है, और धब्बेदार उपकरणों को सूखने के कई तरीके हैं। जो भी विधि का उपयोग किया जाता है, सुनिश्चित करें कि डिवाइस एक बाँझ वातावरण में रहता है, क्योंकि बैक्टीरिया सूखने के दौरान इसे बिना ढके बैठने की आवश्यकता होती है। बढ़े हुए वायु प्रवाह से सुखाने का समय बहुत कम हो जाता है। सुखाने का कार्य नीचे दिए गए चरणों में वर्णित के रूप में किया जा सकता है:
    1. डिवाइस को एक साफ, सील कंटेनर में खुला छोड़ दें, जैसे कि एक प्लास्टिक बिन जिसे 10% ब्लीच के साथ साफ किया गया है, इसके बाद 70% इथेनॉल। सुखाने की इस विधि में कई घंटे लग सकते हैं।
    2. उपकरणों को एक बाँझ लामिनर प्रवाह हुड (नीचे दी गई पसंदीदा विधि के समान) में रखें।
    3. एक कस्टम-निर्मित "सुखाने वाले बॉक्स" (इस अध्ययन में अपनाई गई अनुकूलित विधि) का उपयोग करके उपकरणों को सुखाएं, जिसे कंप्यूटर केस पंखे और एचईपीए फिल्टर का उपयोग करके न्यूनतम लागत पर बनाया जा सकता है ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
      नोट: उपयोग की जाने वाली विधि के बावजूद, सुखाने के चरण को स्थानीय वातावरण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। अक्सर निगरानी करें कि कुएं कितनी जल्दी सूख रहे हैं जब तक कि विशिष्ट सुखाने के समय की पहचान नहीं की जाती है। कम आर्द्रता वाले वातावरण में, सुखाने वाले बॉक्स के उपयोग से ~ 30-40 मिनट का सुखाने का समय होता है। प्लेटों को बहुत सूखने न दें, क्योंकि कुओं में मीडिया सिकुड़ जाएगा और डूब जाएगा। डिवाइस को सूखने से निकालना बेहतर है, जबकि कुछ कुएं अभी भी गीले हैं, बजाय इसके कि इसे लंबे समय तक सूखने दिया जाए और संभावित रूप से बड़ी संख्या में कुओं को अधिक सुखाया जाए।
  4. पानी के क्रिस्टल की जाँच करें। यदि ट्रे में अधिकांश पानी के क्रिस्टल सूख गए हैं और सुखाने की प्रक्रिया के दौरान मात्रा खो गए हैं, तो ट्रे में और अधिक जोड़ें।
  5. बैक्टीरिया सूखने के बाद, कीड़े को तुरंत जोड़ें (धारा 12) या बाद में उपयोग करने के लिए ट्रे को सील करें। सील करने के लिए, ट्रे ढक्कन बंद करें, और पैराफिल्म के एक टुकड़े के साथ सभी चार पक्षों को लपेटें। कुल तीन पैराफिल्म परतों के लिए दो बार दोहराएं। ट्रे को पूरी तरह से लपेटने के बाद, कीड़े जोड़ने से पहले डिवाइस को कमरे के तापमान पर 4 दिनों तक बेंच पर छोड़ा जा सकता है (धारा 12)।

12. मल्टी-वेल डिवाइस में कीड़े जोड़ना

  1. खंड 9 में तैयार कीड़े की प्लेटों से जानवरों को स्थानांतरित करने के लिए प्लैटिनम पिक का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में मैन्युअल रूप से एक कीड़ा जोड़ें। केवल उन कीड़े को चुनें जो वांछित जीवन चरण और उम्र में हैं।
    नोट: डिवाइस में कीड़े जोड़ने के लिए 1 घंटे से अधिक समय लेने से एलएमएनजीएम निर्जलीकरण हो सकता है, इसलिए कीड़े को जितनी जल्दी हो सके जोड़ा जाना चाहिए। डिवाइस के कुओं में जोड़ने से पहले एक समय में कई कीड़े (20+) चुनना गति बढ़ाने में मदद कर सकता है।

13. दीर्घकालिक उपयोग के लिए डिवाइस की तैयारी को पूरा करना

नोट: ये चरण सुनिश्चित करते हैं कि प्रयोग की अवधि के लिए डिवाइस के कुएं हाइड्रेटेड रहें।

  1. पानी के क्रिस्टल की जांच करें। सुनिश्चित करें कि पानी के क्रिस्टल डिवाइस के शीर्ष के साथ स्तर पर हैं लेकिन उस पर ओवरफ्लो नहीं हो रहे हैं। यदि आवश्यक हो तो ट्रे में अतिरिक्त पानी के क्रिस्टल जोड़ें।
  2. ट्रे ढक्कन के अंदर तैयार डिटर्जेंट समाधान (चरण 1.5 देखें) की एक बूंद जोड़ें, और डिटर्जेंट समाधान सूखने तक टास्क वाइप के साथ रगड़ें। यह डिवाइस को ट्रे के अंदर सील करने के बाद ढक्कन पर फॉगिंग को रोकता है ताकि कीड़े स्पष्ट रूप से दिखाई दें।
  3. ट्रे को एक विशिष्ट तकनीक का उपयोग करके पैराफिल्म के तीन टुकड़ों के साथ लपेटें जो पैराफिल्म सील की दीर्घकालिक अखंडता को बढ़ावा देता है।
    1. पैराफिल्म के एक टुकड़े को थोड़ा फैलाएं ताकि यह ट्रे के केवल दो किनारों को कवर करे। अन्य दो पक्षों को कवर करने के लिए पैराफिल्म के दूसरे टुकड़े के साथ इसे दोहराएं।
    2. पैराफिल्म की पहली परत के शीर्ष पर स्तरित, पैराफिल्म का एक अंतिम टुकड़ा लें, इसे पूरी तरह से फैलाएं, और सभी चार पक्षों को लपेटें। यदि ठीक से सील किया जाता है, तो डिवाइस कुओं को ~ 2 महीने तक हाइड्रेटेड रहना चाहिए।
      नोट: पैराफिल्म अखंडता की निगरानी हर 1-2 सप्ताह में की जानी चाहिए, और यदि टूट जाए तो पैराफिल्म को बदल दिया जाना चाहिए।
  4. 70% इथेनॉल के साथ गीले टास्क वाइप का उपयोग करके ट्रे के शीर्ष से किसी भी फिंगरप्रिंट को हटा दें।

14. डेटा का संग्रह

नोट: इस अध्ययन का उद्देश्य संस्कृति पद्धति का वर्णन करना है। एक बार आबाद होने के बाद, मल्टी-वेल डिवाइस विभिन्न प्रकार के फेनोटाइप ्स की अनुदैर्ध्य निगरानी के साथ संगत होते हैं। यहां, कई सबसे आम मापदंडों को मापने के लिए बुनियादी मार्गदर्शन प्रदान किया गया है।

  1. जीवनकाल: प्लेट को टैप करके या कीड़े को हर 1-3 दिनों में एक उज्ज्वल नीली रोशनी में उजागर करके जीवनकाल की निगरानी करें। यदि कोई आंदोलन नहीं देखा जाता है तो मृत के रूप में स्कोर करें। ये मल्टी-वेल डिवाइस जीवनकाल13,18 का अनुमान लगाने के लिए स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण पाइपलाइनों के साथ भी संगत हैं।
  2. गतिविधि: डिवाइस कुओं में जानवरों की स्थिर छवियां या वीडियो लेकर और यात्रा की गई दूरी, गति या आंदोलन के अन्य मैट्रिक्स का आकलन करके जीवन भर व्यक्तिगत जानवरों की गतिविधि की निगरानी करें। डिवाइस गतिविधि13,18 का अनुमान लगाने के लिए स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण पाइपलाइनों के साथ भी संगत हैं।
  3. शरीर का आकार और आकार: डिवाइस कुओं में जानवरों की स्थिर छवियां लेकर और मानक इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके दृश्य मापदंडों को निर्धारित करके शरीर के आकार और आकार में परिवर्तन की निगरानी करें। सिद्धांत रूप में, यह संस्कृति विधि कृमि शरीर के आकार 19,20,21 के अधिक परिष्कृत मूल्यांकन के लिए मौजूदा सॉफ्टवेयर के साथ संगत होनी चाहिए।

15. उपकरणों का पुन: उपयोग करना

नोट: एक प्रयोग पूरा होने के बाद, मल्टी-वेल उपकरणों को तीन बार तक साफ और पुन: उपयोग किया जा सकता है। अतिरिक्त पुन: उपयोग कृमि फेनोटाइप को प्रभावित करना शुरू कर देता है, संभवतः पीडीएमएस सामग्री की दीवारों में बनने वाले मीडिया या बैक्टीरिया से रसायनों के कारण।

  1. पैराफिल्म को छोड़ दें, और डिवाइस को ट्रे से हटा दें। डिवाइस के ऊपरी-दाएं कोने पर दिए गए नॉच की जांच करें, जो इंगित करता है कि इसका उपयोग कितनी बार किया गया है। यदि इसे तीन बार उपयोग किया गया है, तो डिवाइस को छोड़ दें। यदि इसे तीन बार से कम उपयोग किया गया है, तो इसे साफ करें और पुन: उपयोग करें।
    नोट: ट्रे पॉलीस्टाइनिन से बने होते हैं और सीधे एलएमएनजीएम, बैक्टीरिया या मीडिया के किसी भी योजक के संपर्क में नहीं होते हैं। जब तक वे दृष्टि से स्पष्ट रहते हैं, तब तक उन्हें कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  2. ट्रे से किसी भी शेष पानी के क्रिस्टल को धो लें। ट्रे के अंदर 10% ब्लीच घोल के साथ स्प्रे करें, और इसे 10 मिनट तक बैठने दें। विआयनीकृत पानी से कुल्ला करें और पानी के धब्बे से बचने के लिए तुरंत सुखाएं।
  3. कुओं से मीडिया को साफ करना शुरू करने के लिए डिवाइस को बहते पानी के नीचे रखें। कुएं से मीडिया को ढीला करने में मदद करने के लिए धीरे से पानी के नीचे डिवाइस को मोड़ें और मोड़ें, लेकिन इतनी दूर न झुकें कि डिवाइस आंसू बहाए। 200 μL पिपेट टिप के साथ कुओं में फंसे किसी भी शेष मीडिया को चुनें।
  4. एक 2 एल बीकर को विआयनीकृत पानी से भरे हुए स्टिर बार ~ 3/4 के साथ भरें, और एक गर्म प्लेट पर उबाल लें।
  5. उबलते पानी में एक या दो मल्टी-वेल डिवाइस और एक हलचल बार जोड़ें। पानी में उपकरणों को धीरे से उत्तेजित करने के लिए चुंबकीय सरगर्मी को कम गति (~ 200 आरपीएम) पर चालू करें। डिवाइस को 10 मिनट तक उबलने दें।
  6. धातु चिमटी के साथ पानी से उपकरणों को निकालें, और उन्हें निकालने के लिए पेपर तौलिए पर अच्छी तरह से रखें। उपकरणों को रात भर कम से कम सूखने दें।
  7. जब डिवाइस पूरी तरह से सूख जाते हैं, तो उन्हें पन्नी में लपेटें, और उन्हें आटोक्लेव टेप के साथ सील करें। आटोक्लेव टेप पर लिखें कि डिवाइस का कितनी बार उपयोग किया गया है। 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सूखे चक्र पर आटोक्लेव को निष्फल करने के लिए। डिवाइस अब पुन: उपयोग के लिए तैयार हैं।

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Representative Results

वोरमोटल संस्कृति प्रणाली का उपयोग विभिन्न प्रकार के डेटा को इकट्ठा करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें जीवनकाल, स्वास्थ्य और गतिविधि शामिल है। प्रकाशित अध्ययनों ने जीवनकाल और स्वास्थ्यकाल 13,14, जिज्ञासा और नींद 22,23,24 और व्यवहार 25 का अध्ययन करने के लिए बहु-अच्छी तरह से उपकरणों का उपयोग किया है। जीवनकाल को मैन्युअल रूप से या छवियों के संग्रह और डाउनस्ट्रीम इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से स्कोर किया जा सकता है। पूर्व दृष्टिकोण में, कीड़े को हर 1-3 दिनों में एक उत्तेजना (जैसे, प्लेट को टैप करना या नीली रोशनी के संपर्क में) के बाद मैन्युअल रूप से देखा जा सकता है और पेट्री प्लेट्स1 पर मानक विधियों के समान कोई आंदोलन नहीं देखा जाता है तो मृत के रूप में स्कोर किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण समान है, सिवाय इसके कि उत्तेजना लागू होने के बाद ली गई छवियों के बीच फ्रेम-टू-फ्रेम अंतर की तुलना करके कृमि आंदोलन निर्धारित किया जा सकता है। यह एक अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है कि आंदोलन उस समय बिंदु पर व्यक्तिगत जानवरों के गतिविधि स्तर दोनों पर जानकारी प्रदान करता है और एक मीट्रिक प्रदान करता है जिसके द्वारा जीवनकाल (जैसे, आंदोलन की समाप्ति) और स्वास्थ्य काल (कई परिभाषाएं प्रस्तावित की गई हैं) निर्धारित की जा सकती हैं। छवियों का उपयोग शरीर के आकार, शरीर के आकार और शरीर की मुद्रा जैसे अतिरिक्त शारीरिक मापदंडों को निकालने के लिए किया जा सकता है।

सिस्टम की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, हमने जीन डीएएफ -2 द्वारा एन्कोड किए गए इंसुलिन रिसेप्टर और व्यक्तिगत जानवरों के लिए जीवनकाल, स्वास्थ्य और दैनिक गतिविधि के संदर्भ में डीएएफ -16 द्वारा एन्कोड किए गए डाउनस्ट्रीम एफओएक्सओ परिवार प्रतिलेखन कारक के बीच शास्त्रीय एपिस्टैटिक संबंध की जांच की। वाइल्ड-टाइप (स्ट्रेन एन 2) और डीएएफ -16 (एमयू 68) लॉस-ऑफ-फंक्शन (स्ट्रेन सीएफ 1038) सी एलिगेंस ने ई कोलाई (स्ट्रेन एचटी 115) को या तो नियंत्रण (खाली वेक्टर) व्यक्त किया। ईवी) या डीएएफ -2 आरएनएआई फीडिंग संरचनाओं को मल्टी-वेल उपकरणों में सुसंस्कृत किया गया था, और प्रत्येक जानवर को जीवनकाल (चित्रा 2 ए), स्वास्थ्य काल (चित्रा 2 बी), और दैनिक गतिविधि (चित्रा 2 सी) के लिए निगरानी की गई थी। गतिविधि की निगरानी 2 मिनट के लिए हर 5 सेकंड में स्थिर छवियों की एक श्रृंखला लेकर की जाती थी, जिसमें कीड़े को गतिविधि को प्रोत्साहित करने के लिए 1 मिनट पर 5 सेकंड के लिए उज्ज्वल नीली रोशनी के संपर्क में लाया जाता था (चुरगिन एट अल .13 के अनुसार)। प्रत्येक जानवर के लिए दैनिक गतिविधि का अनुमान कुओं और छवियों में पृष्ठभूमि को सामान्य करके, प्रत्येक छवि में कृमि क्षेत्र की पहचान करके और आसन्न छवियों के बीच क्षेत्र में परिवर्तन की गणना करके लगाया गया था। जीवनकाल को उस उम्र के रूप में परिभाषित किया गया था जिस पर प्रत्येक कीड़े के लिए गतिविधि आखिरी बार देखी गई थी, और स्वास्थ्य काल को उस उम्र के रूप में परिभाषित किया गया था जिस पर एक कीड़ा अब पूरे शरीर की लंबाई को स्थानांतरित नहीं कर सकता था। जैसा कि कई पिछले अध्ययनों (जैसे, केनियन एट अल.26, मर्फी एट अल.27) से अपेक्षित है, डीएएफ -16 (एमयू 86) उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप कम जीवनकाल हुआ और डीएएफ -2 (चित्रा 2 ए) के आरएनएआई वध से जीवनकाल विस्तार को रोका गया। स्वास्थ्य अवधि के लिए एक समान पैटर्न देखा गया था (चित्रा 2 बी)। मल्टी-वेल डिवाइस कल्चर सिस्टम का उपयोग करने के लाभ के रूप में, पूरे जीवन में व्यक्तिगत जानवरों को ट्रैक करने की क्षमता आबादी में प्रत्येक मापा फेनोटाइप में व्यक्तिगत भिन्नता का विस्तृत विश्लेषण करने की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, अलग-अलग जानवरों में जीवनकाल और स्वास्थ्य में भिन्नता की तुलना या तो पूर्ण (चित्रा 2 डी) शब्दों में या कुल जीवनकाल के एक अंश के रूप में की जा सकती है (चित्रा 2 ई)। प्रारंभिक जीवन फेनोटाइप्स की तुलना आबादी भर में अलग-अलग जानवरों में जीवनकाल सहित देर से जीवन फेनोटाइप ्स से की जा सकती है। उदाहरण के लिए, जीवनकाल में प्रत्येक व्यक्तिगत जानवर के लिए संचयी गतिविधि (यानी, व्यक्तिगत गतिविधि के लिए वक्र [एयूसी] के तहत क्षेत्र) मापा गया सभी स्थितियों में जीवन के 5 वें दिन तक संचयी जीवनकाल (चित्रा 2 जी) की तुलना में जीवनकाल (चित्रा 2 एफ) के साथ बेहतर सहसंबद्ध है। हम इस बात पर जोर देते हैं कि इस काम का उद्देश्य समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों को ट्रैक करने के लिए बहु-अच्छी तरह से पर्यावरण के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है, न कि डिवाइस का उपयोग करके एक विशिष्ट फेनोटाइप को मापने के लिए। चित्रा 2 में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम फेनोटाइप का सिर्फ एक उदाहरण प्रदान करते हैं जिन्हें इस प्रणाली में मापा जा सकता है। एक बार निर्माण के बाद, बहु-अच्छी तरह से पर्यावरण ठोस मीडिया पर मुक्त-रेंगने वाले कीड़े के फेनोटाइप को मापने के लिए तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोफैब्रिकेटेड मल्टी-वेल उपकरणों का योजनाबद्ध । (ए) व्यक्तिगत सी एलिगेंस को ठोस कम-पिघलने वाले नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एलएमएनजीएम) एग्रोस पैड पर संवर्धित किया जाता है जो अलग-अलग कुओं में बैक्टीरिया के भोजन के साथ बीजित होते हैं। कुओं के बीच की जगह को एक प्रतिकूल रसायन (कॉपर सल्फेट) के साथ लेपित किया जाता है ताकि इसके कुएं के भीतर प्रत्येक कीड़े को अलग किया जा सके। प्रत्येक डिवाइस को सिंगल-वेल ट्रे के अंदर सुरक्षित किया जाता है। आर्द्रता को बनाए रखने के लिए ट्रे की परिधि पानी के क्रिस्टल से भरी हुई है। ऑक्सीजन विनिमय की अनुमति देने के लिए ट्रे को पैराफिल्म के साथ सील किया जाता है। BioRender.com के साथ बनाई गई छवि। (बी) कुओं को लोड करने के लिए सुझाए गए आदेश को दर्शाते हुए मल्टी-वेल डिवाइस का अवलोकन। आंतरिक कुओं (सफेद) को एलएमएनजीएम के 14 μL प्राप्त होते हैं। बाहरी कुओं (ग्रे) को एलएमएनजीएम के 15 μL प्राप्त होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मल्टी-वेल उपकरणों का उपयोग करके व्यक्तिगत जानवरों में आबादी में मापा फेनोटाइप का सहसंबंध। सभी पैनल जानवरों के चार समूहों की तुलना करते हुए एक ही प्रयोग से डेटा प्रदान करते हैं: जंगली प्रकार (एन 2) जानवर खाली वेक्टर ईवी (आरएनएआई) (एन = 138) के अधीन हैं, जंगली प्रकार के जानवर डीएएफ -2 (आरएनएआई) (एन = 151) के अधीन हैं, डीएएफ -16 (एमयू 86) ईवी (आरएनएआई) (एन = 123) के अधीन जानवर, और डीएएफ -16 (एमयू 86) जानवर डीएएफ -2 (आरएनएआई) (एन = 13) के अधीन हैं। (ए) डीएएफ -2 (आरएनएआई) से जीवनकाल विस्तार डीएएफ -16 (एमयू 86) शून्य उत्परिवर्तन द्वारा अवरुद्ध है। लॉग-रैंक टेस्ट (आर में सर्विफ फ़ंक्शन) द्वारा निर्धारित समूहों के बीच जोड़ीवार महत्व। (बी) यहां परिभाषित स्वास्थ्य-अवधि-उस दिन के रूप में परिभाषित किया गया है जिस दिन एक जानवर डीएएफ -2 (आरएनएआई) से पूर्ण शरीर की लंबाई-विस्तार को स्थानांतरित नहीं कर सकता है, डीएएफ -16 (एमयू 86) शून्य उत्परिवर्तन द्वारा अवरुद्ध है। लॉग-रैंक टेस्ट (आर में सर्विफ फ़ंक्शन) द्वारा निर्धारित समूहों के बीच जोड़ीवार महत्व। (सी) जीवनकाल में गतिविधि का 3 दिन का रोलिंग माध्य डीएएफ -16 (एमयू 86) और डीएएफ -2 (आरएनएआई) दोनों से कम हो जाता है। समूहों के बीच अलग-अलग जानवरों के लिए जीवनकाल में गतिविधि के लिए वक्र के नीचे के क्षेत्र की तुलना करने के लिए मैन-व्हिटनी यू परीक्षण द्वारा गणना की गई महत्व। (डी) पूर्ण मूल्यों के रूप में प्रत्येक आबादी के लिए स्वास्थ्य काल और जीवनकाल (माध्य ± मानक त्रुटि का औसत)। (ई) प्रत्येक आबादी के लिए स्वास्थ्य काल और जीवनकाल प्रत्येक समूह के भीतर कुल जीवनकाल के लिए सामान्यीकृत है (औसत ± मानक त्रुटि का औसत)। (एफ) अलग-अलग जानवरों के लिए जीवनकाल (जीवनकाल में वक्र [एयूसी] के तहत क्षेत्र) में संचयी गतिविधि जीवनकाल के साथ बेहतर संबंध रखती है (जी) जीवनकाल में किसी भी विशिष्ट दिन में व्यक्तिगत जानवरों के लिए गतिविधि (दिन 8 पर गतिविधि सहसंबंध, उस बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर औसत गतिविधि अधिकतम होती है, दिखाया जाता है), जैसा कि रैखिक प्रतिगमन (आर में एलएम फ़ंक्शन) द्वारा गणना की जाती है। n.s. = महत्वपूर्ण नहीं, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. प्रत्येक पैनल के भीतर की गई तुलना के लिए बोनफेरोनी विधि का उपयोग करके सभी पी-मानों को कई तुलनाओं के लिए समायोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: 3 डी मल्टी-वेल डिवाइस मोल्ड मुद्रित करने के लिए एसटीएल फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

WorMotel प्रणाली समय के साथ सैकड़ों पृथक C. एलिगेंस के लिए व्यक्तिगत डेटा एकत्र करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। विकास ता्मक गतिशीलता, लोकोमोटर व्यवहार और उम्र बढ़ने में अनुप्रयोगों के लिए मल्टी-वेल उपकरणों का उपयोग करने वाले पहले के अध्ययनों के बाद, इस काम का लक्ष्य उच्च-थ्रूपुट तरीके से गतिविधि, स्वास्थ्य और जीवनकाल की दीर्घकालिक निगरानी के लिए मल्टी-वेल उपकरणों की तैयारी को अनुकूलित करना था। यह काम मल्टी-वेल डिवाइस तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो मूल प्रोटोकॉल13 से कई चरणों को अनुकूलित करता है, उन प्रमुख बिंदुओं पर प्रकाश डालता है जो तकनीकी कठिनाइयों को पेश कर सकते हैं, और प्लेटों और अन्य सामग्रियों के पुन: उपयोग के बारे में चर्चा प्रदान करते हैं।

स्केलिंग के प्रयोजनों के लिए- एक प्रयोगशाला के रूप में जो वर्तमान में एक विशिष्ट सप्ताह में 10 से 20 उपकरणों के बीच तैयार करता है- एक शीर्ष विचार यह था कि क्या उपकरणों का पुन: उपयोग किया जा सकता है और यदि हां, तो किस डिग्री तक। पेट्री प्लेटों पर पारंपरिक संस्कृति के संचालन के सापेक्ष पीडीएमएस उपकरणों को तैयार करने में समय और धन दोनों के संदर्भ में उच्च लागत है, लेकिन पीडीएमएस या सिस्टम के अन्य घटकों का पुन: उपयोग करके इन उच्च लागतों को कम किया जा सकता है। कई पुन: उपयोगों के साथ, पीडीएमएस ने एक पीला रंग विकसित करना शुरू कर दिया, संभवतः एलएमएनजीएम मीडिया या बैक्टीरिया से यौगिकों के संचय को दर्शाता है। इन प्लेटों पर सुसंस्कृत जानवरों ने भागने और कम जीवनकाल की उच्च दर भी प्रदर्शित की। दर्जनों प्रयोगों के आधार पर, इन पीडीएमएस उपकरणों के पुन: उपयोग के लिए तीन उपयोग इष्टतम हैं, जिससे उम्र से संबंधित फेनोटाइप ्स को पीडीएमएस गिरावट से औसत दर्जे के प्रभाव के बिना मूल्यांकन किया जा सकता है, जबकि नए उपकरणों की संख्या को कम करने की आवश्यकता होती है जिन्हें ढालने की आवश्यकता होती है (इस प्रकार लागत पर बचत)। हमने आगे पुष्टि की कि उनके पहले, दूसरे और तीसरे उपयोग पर उपकरणों पर उगाए गए प्रयोग-मिलान वाले जानवरों ने उत्तरजीविता वक्रों का उत्पादन किया जो लगभग अप्रभेद्य थे और सांख्यिकीय रूप से अलग नहीं थे (डेटा नहीं दिखाया गया)। उपकरणों को रखने के लिए उपयोग की जाने वाली ट्रे पॉलीस्टाइनिन से बनी होती है और यदि वे खरोंच या अन्य निशानों से मुक्त रहते हैं तो उन्हें अनिश्चित काल तक साफ और पुन: उपयोग किया जा सकता है जो कीड़े को देखने में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

~ 2 सप्ताह से अधिक समय तक चलने वाले अनुप्रयोगों के लिए मल्टी-वेल डिवाइस तैयार करने के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती पर्यावरणीय बैक्टीरिया और कवक द्वारा प्लेट संदूषण की रोकथाम है। संदूषण को रोकने के लिए कई कदम हैं जिन पर नसबंदी महत्वपूर्ण है। इनमें उपयोग से पहले सभी उपकरणों को ऑटोक्लेव करना, पुन: उपयोग के लिए लक्षित उपकरणों को उबालना, आर्द्रता बनाए रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले अवशोषक पानी के क्रिस्टल को ऑटोक्लेव करना, ट्रे को साफ करना जिसमें उपयोग से पहले ब्लीच और इथेनॉल दोनों के साथ डिवाइस होते हैं, और डिटर्जेंट समाधान को फ़िल्टर करना शामिल है जो फॉगिंग को रोकने और कॉपर सल्फेट समाधान में जोड़ने के लिए ट्रे के ढक्कन पर लगाया जाता है। इन परिवर्तनों में से प्रत्येक को लागू करने से विशेष रूप से संदूषण की घटनाओं में कमी आई, जिससे सील किए गए उपकरणों को जीवनकाल में अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए लगातार उपयोग किया जा सकता है, यहां तक कि समर्थक-दीर्घायु स्थितियों (जैसे, डीएएफ -2 के नॉकआउट) के तहत भी जिन्हें >45 दिनों के लिए निगरानी की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में दीर्घकालिक अनुप्रयोगों के लिए मूल प्रोटोकॉल में दो संशोधन शामिल हैं जो लगातार अच्छी तरह से सुखाने और निर्जलीकरण को रोकने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। सबसे पहले, पानी के क्रिस्टल की क्षमता बढ़ाने के लिए डिवाइस की समग्र गहराई को 2 मिमी तक बढ़ाया गया था। लंबे प्रयोगों में, विशेष रूप से कम आर्द्रता वाले वातावरण में, ट्रे में बहुत कम पानी के क्रिस्टल ने एलएमएनजीएम के निर्जलीकरण का कारण बना। अधिक पानी के क्रिस्टल के साथ, डिवाइस के किनारे के साथ कुओं में जोड़े गए अगारोस की मात्रा में वृद्धि करना आवश्यक था। ये कुएं कुएं लोड (धारा 6) के बाद पहले सूखते थे और सिकुड़ जाते थे। अंदर के कुओं पर 14 μL Agarose का उपयोग करना कुओं को पूरी तरह से भरने के लिए पर्याप्त मात्रा थी, बिना गुंबददार शीर्ष बनाए जो कुओं को अधिक भरने के परिणामस्वरूप होता है। बाहरी कुओं में 15 μL Agarose जोड़ने से पर्याप्त मात्रा मिली कि, जब कुएं सूखने लगे, तो वे आंतरिक कुओं में जोड़े गए 14 μL के बराबर स्तर तक सिकुड़ गए।

मूल प्रोटोकॉल से सबसे बड़े विचलन में से एक उस क्रम को उलटना था जिसमें उपयोगकर्ता एलएमएनजीएम (धारा 6) और कॉपर सल्फेट (धारा 7) को लोड करता है। मूल रूप से, कॉपर सल्फेट को पहले खाई में जोड़ा गया था, इसके बाद एलएमएनजीएम13 के साथ कुओं को भर दिया गया था। यह देखा गया कि प्लाज्मा की सफाई के बाद जल्द से जल्द एलएमएनजीएम के साथ कुओं को भरने से कुएं की दीवारों पर एलएमएनजीएम के पालन में सुधार हुआ। प्लाज्मा की सफाई के बाद बहुत लंबे समय तक इंतजार करने के परिणामस्वरूप बुलबुले और गुंबददार शीर्ष के साथ कुएं बन गए, जो कीड़े को देखने में हस्तक्षेप कर सकते हैं। कॉपर सल्फेट को जोड़ने पर कुओं को भरने को प्राथमिकता देना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब सुसंगत, उच्च गुणवत्ता वाले एलएमएनजीएम सतहों को सुनिश्चित करने के लिए एक ही समय में कई उपकरण तैयार किए जाते हैं। कुओं को भरने का एक नकारात्मक पक्ष यह है कि प्लाज्मा क्लीनर द्वारा उत्पादित हाइड्रोफिलिक सतह संशोधन तब तक काफी खराब हो जाएगा जब तक उपयोगकर्ता कॉपर सल्फेट जोड़ने के लिए आगे बढ़ता है। कॉपर सल्फेट खाई के माध्यम से आसानी से प्रवाहित नहीं होता है जब सतह कम हाइड्रोफिलिक हो जाती है, इस प्रकार पूर्ण कवरेज प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। एक सर्फेक्टेंट के रूप में कार्य करने के लिए कॉपर सल्फेट समाधान में डिटर्जेंट जोड़ने से खाई के माध्यम से समाधान के प्रवाह में सुधार होता है। प्लैटिनम वायर पिक का उपयोग किसी भी बिंदु पर तनाव को तोड़कर खाई के माध्यम से कॉपर सल्फेट को धीरे से मार्गदर्शन करने के लिए भी किया जा सकता है जहां कॉपर सल्फेट को बहने में कठिनाई हो रही है। इसके अलावा, यदि कॉपर सल्फेट समाधान को खाई में छोड़ दिया गया था, तो यह आसानी से कुओं में फैल जाएगा और ट्रे को झुकाते समय एलएमएनजीएम सतह को दूषित कर देगा। लोडिंग प्रक्रिया की प्रकृति तांबे को कुओं के उप-समूह को दूषित करने से रोकने के लिए डिवाइस को पर्याप्त रूप से स्तर पर रखना लगभग असंभव बनाती है। इसके लिए, कॉपर सल्फेट समाधान को खाई (चरण 7.3) से हटा दिया जाता है, और पीछे छोड़ा गया अवशिष्ट तांबा सल्फेट अधिकांश कीड़े को भागने से रोकने के लिए पर्याप्त है। एक प्रतिकूल बाधा के रूप में कॉपर सल्फेट के उपयोग पर अंतिम नोट के रूप में, कुछ विकर्षक जीवनकाल सहित उम्र से जुड़े फेनोटाइप को प्रभावित कर सकते हैं। इन मल्टी-वेल उपकरणों में कॉपर सल्फेट के उपयोग की जांच चुरगिन एट अल .13 द्वारा की गई थी और पाया गया कि जीवनकाल या विकास पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं है।

प्रोटोकॉल के अन्य मामूली अपडेट पीडीएमएस तैयार करने के लिए उठाए गए कदमों में सुधार पर ध्यान केंद्रित करते हैं। पीडीएमएस बेस और इलाज एजेंट को मिलाने के बाद एक अतिरिक्त डिगैसिंग कदम जोड़ा गया था, क्योंकि यह एक ऐसी प्रक्रिया है जो कई बुलबुले उत्पन्न करती है। मिश्रण को डिवाइस मोल्ड्स में जोड़ने से पहले अधिकांश बुलबुले को हटाने से दूसरे डिगैसिंग चरण के बाद शेष बुलबुले कम हो जाते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि डिवाइस का निचला हिस्सा पूरी तरह से सपाट है और यहां तक कि, एक विशेषता जो पूरे प्लेट इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है, भरे हुए मोल्ड के शीर्ष पर ग्लास या ऐक्रेलिक का एक टुकड़ा रखा गया था। यह कदम आवश्यक नहीं है- हालांकि अभी भी उपयोगी है- उन अनुप्रयोगों के लिए जो एक समय में केवल एक अच्छी तरह से जांच करते हैं, क्योंकि उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से प्रत्येक कुएं के लिए फ़ोकस समायोजित कर सकता है। अंत में, उच्च तापमान (55 डिग्री सेल्सियस) पर पीडीएमएस का इलाज उस स्थान पर आवश्यक था जहां प्रोटोकॉल के इस संस्करण को अनुकूलित किया गया था (टक्सन, एरिज़ोना, यूएसए), मूल प्रोटोकॉल (फिलाडेल्फिया, पेंसिल्वेनिया, यूएसए में अनुकूलित) द्वारा इंगित 40 डिग्री सेल्सियस के विपरीत। इससे पता चलता है कि स्थानों (जैसे जलवायु या सटीक अभिकर्मकों और उपयोग किए जाने वाले उपकरणों) के बीच अंतर प्रोटोकॉल में विशिष्ट चरणों को प्रभावित कर सकता है, जैसे कि इलाज का तापमान या सुखाने की तकनीक, और इन्हें प्रत्येक साइट पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, पर्यावरणीय आर्द्रता स्पॉटिंग के बाद प्लेटों के लिए सुखाने के समय को निर्धारित करने में एक बड़ी भूमिका निभाती है, और यह स्थानों या मौसमों के बीच बहुत भिन्न हो सकती है।

सिद्धांत रूप में, इस मल्टी-वेल डिवाइस सिस्टम का उपयोग किसी भी फेनोटाइप पर डेटा एकत्र करने के लिए किया जा सकता है जिसे पेट्री प्लेटों पर मानक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत मापा जा सकता है- जीवनकाल, स्वास्थ्य, उत्तेजित / उत्तेजित आंदोलन, शरीर का आकार और आकार, आंदोलन ज्यामिति- समय के साथ व्यक्तिगत कीड़े के लिए उन मैट्रिक्स को ट्रैक करने की अतिरिक्त क्षमता के साथ। जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, व्यक्तिगत पूरे जीवनकाल डेटा प्राप्त करने के लिए अन्य तरीके हैं। माइक्रोफ्लुइडिक्स डिवाइस28 या मल्टी-वेल प्लेट्स29 व्यक्तिगत जानवरों के जीवन इतिहास का पालन करने की क्षमता प्रदान करते हैं, लेकिन केवल तरल मीडिया में कीड़े का संवर्धन करके। एक तरल वातावरण ठोस मीडिया के सापेक्ष कीड़े के प्रतिलेख 10,11,30 को बदल सकता है और अलग-अलग शारीरिक और व्यवहार परिवर्तनों को प्रेरित करता है, जिसमें एपिसोडिक तैराकी 31, ऊर्जा व्ययमें वृद्धि 10,32 और ऊंचा ऑक्सीडेटिव तनाव 10 शामिल हैं। स्वस्थ उम्र बढ़ने से संबंधित जीवनकाल और अन्य मैट्रिक्स की तुलना सीधे तरल और ठोस मीडिया के बीच की जा सकती है, यह स्पष्ट नहीं है। सॉलिड कल्चर मल्टी-वेल डिवाइस एक ऐसे वातावरण में एकल कृमि ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं जो पेट्री प्लेटों पर मानक समूह संस्कृति के बराबर है। डिवाइस की दीवार की घुमावदार संरचना कुएं के अंदर कहीं भी कीड़े की इमेजिंग की अनुमति देती है, जिससे इन उपकरणों को सिद्धांत रूप में, एकल-कृमि विश्लेषण के लिए अधिक परिष्कृत उपकरणों के साथ संगत बनाया जाता है, जैसे कि वर्म ट्रैकर33।

एक मल्टी-वेल डिवाइस पर एक प्रयोग के दौरान व्यक्तिगत जानवरों की निगरानी करने की क्षमता कई सीमाओं के साथ है। सबसे पहले, यहां तक कि एक अनुकूलित प्रोटोकॉल के साथ, इन उपकरणों को पेट्री प्लेटों पर मानक संस्कृति की तुलना में प्रति जानवर स्थापित करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है, इस प्रकार समग्र नमूना आकार की लागत पर एकल-पशु डेटा प्रदान किया जाता है। हालांकि, कीड़े को व्यक्तिगत कुओं से भी अलग किया जाता है, स्वचालित जीवनकाल माप से जुड़ी कुछ जटिलताओं को दूर किया जाता है, जैसे कि स्वचालित रूप से व्यक्तिगत जानवरों का पता लगाना जो एक दूसरे को छूते समय चलना बंद कर देते हैं। स्वचालन अधिक जटिल सेटअप में खोए गए समय को पुनः प्राप्त करता है और अधिक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग13,18 का अवसर प्रदान करता है। दूसरा, प्रयोगात्मक स्थितियां जो कीड़े कॉपर सल्फेट खाई से अधिक नापसंद करते हैं, जैसे कि मजबूत तनाव-उत्प्रेरण एजेंट (जैसे, पैराक्वाट) या आहार प्रतिबंध, कीड़े को कुओं से और खाई में भागने का कारण बनेंगे। तीसरा, जबकि पीडीएमएस डिवाइस ब्राइटफील्ड और डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी की अनुमति देते हैं, पीडीएमएस सामग्री में उच्च और असमान पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दोनों होती है, बाद में मोल्डिंग के दौरान पीडीएमएस में एम्बेडेड होने वाली धूल या अन्य माइक्रोपार्टिकल्स के परिणामस्वरूप होने की संभावना होती है, जो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में उनके आवेदन को सीमित करता है। अंत में, कई प्रयोगों में पुन: उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के लिए पीडीएमएस में देखे गए मलिनकिरण और जीवनकाल में संबंधित कमी और पलायन में वृद्धि से पता चलता है कि मीडिया घटक और अन्य अतिरिक्त रसायन समय के साथ पीडीएमएस में चले जाते हैं। यह उम्र बढ़ने के फेनोटाइप या दवा उपचार को किस हद तक प्रभावित कर सकता है, वर्तमान में इसका पता लगाया जा रहा है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एकल-कृमि संस्कृति के लिए एक वैकल्पिक विधि है जो पीडीएमएस मल्टी-वेल उपकरणों के समान है, लेकिन इसके बजाय अलग-थलगजानवरों को कल्चर करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोट्रे का उपयोग करती है। ये माइक्रोट्रे पॉलीस्टाइनिन से बने होते हैं, लीचिंग मीडिया घटकों के संभावित मुद्दे से बचते हैं, और लगातार प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि होती है, जिससे प्लेट पर सीधे विवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग की अनुमति मिलती है। माइक्रोट्रे कुएं यहां वर्णित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कॉपर सल्फेट के स्थान पर पामिटिक एसिड से भी घिरे हुए हैं, जो अधिक प्रतिकूल है और तनाव-उत्प्रेरण एजेंटों और आहार प्रतिबंध के मामले में भी अपने कुओं को छोड़ने वाले कीड़े के अंश को कम करता है। इन लाभों को कुओं की कम पैकिंग दक्षता की कीमत पर महसूस किया जाता है, क्योंकि माइक्रोट्रे पीडीएमएस उपकरणों की 240 कृमि क्षमता के विपरीत एक ट्रे में अधिकतम 96 कीड़े को सुसंस्कृत करने की अनुमति देते हैं। एक प्रयोग के वांछित परिणाम की विशिष्टताएं प्रभावित करेंगी कि इनमें से किस प्रणाली का उपयोग किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों का कहना है कि उनके पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच आर 35 जीएम 133588 द्वारा जीएलएस को समर्थित किया गया था, जीएलएस को यूनाइटेड स्टेट्स नेशनल एकेडमी ऑफ मेडिसिन कैटेलिस्ट अवार्ड, एरिज़ोना बोर्ड ऑफ रीजेंट्स और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन द्वारा प्रशासित एरिज़ोना टेक्नोलॉजी एंड रिसर्च इनिशिएटिव फंड राज्य द्वारा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

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References

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