Summary
Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo de nematoides individuais isolados em meios sólidos em dispositivos microfabricados de múltiplos poços. Essa abordagem permite que animais individuais sejam monitorados ao longo de suas vidas para uma variedade de fenótipos relacionados ao envelhecimento e à saúde, incluindo atividade, tamanho e forma corporal, geometria do movimento e sobrevivência.
Abstract
O nematoide Caenorhabditis elegans está entre os sistemas modelo mais comuns usados na pesquisa do envelhecimento devido às suas técnicas de cultura simples e baratas, ciclo de reprodução rápido (~3 dias), curta vida útil (~3 semanas) e inúmeras ferramentas disponíveis para manipulação genética e análise molecular. A abordagem mais comum para a realização de estudos de envelhecimento em C. elegans, incluindo análise de sobrevivência, envolve o cultivo de populações de dezenas a centenas de animais em conjunto em meios de crescimento de nematoides sólidos (NGM) em placas de Petri. Embora essa abordagem reúna dados sobre uma população de animais, a maioria dos protocolos não rastreia animais individuais ao longo do tempo. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo a longo prazo de animais individuais em dispositivos microfabricados de polidimetilsiloxano (PDMS) chamados WorMotels. Cada dispositivo permite que até 240 animais sejam cultivados em pequenos poços contendo NGM, com cada poço isolado por um fosso contendo sulfato de cobre que impede a fuga dos animais. Com base na descrição original do WorMotel, este documento fornece um protocolo detalhado para moldar, preparar e preencher cada dispositivo, com descrições de complicações técnicas comuns e conselhos para solução de problemas. Dentro desse protocolo estão técnicas para o carregamento consistente de NGM de pequeno volume, a secagem consistente tanto da NGM quanto do alimento bacteriano, opções para a realização de intervenções farmacológicas, instruções e limitações práticas para a reutilização de dispositivos PDMS e dicas para minimizar a dessecação, mesmo em ambientes de baixa umidade. Essa técnica permite o monitoramento longitudinal de vários parâmetros fisiológicos, incluindo atividade estimulada, atividade não estimulada, tamanho corporal, geometria do movimento, tempo de saúde e sobrevivência, em um ambiente semelhante à técnica padrão para cultura de grupo em meios sólidos em placas de Petri. Este método é compatível com a coleta de dados de alto rendimento quando usado em conjunto com software de microscopia e análise automatizados. Finalmente, as limitações desta técnica são discutidas, bem como uma comparação desta abordagem com um método recentemente desenvolvido que utiliza microbandejas para cultura de nematoides isolados em meio sólido.
Introduction
Caenorhabditis elegans são comumente usados em estudos de envelhecimento devido ao seu curto tempo de geração (aproximadamente 3 dias), curta expectativa de vida (aproximadamente 3 semanas), facilidade de cultivo em laboratório, alto grau de conservação evolutiva de processos moleculares e vias com mamíferos, e ampla disponibilidade de técnicas de manipulação genética. No contexto dos estudos de envelhecimento, C. elegans permite a geração rápida de dados de longevidade e populações envelhecidas para a análise de fenótipos tardios em animais vivos. A abordagem típica para a realização de estudos de envelhecimento de vermes envolve a medição manual da vida útil de uma população de vermes mantida em grupos de 20 a 70 animais em meios de crescimento de nematoides em ágar sólido (NGM) em placas de Petri de 6 cm1. O uso de populações sincronizadas com a idade permite a medição da expectativa de vida ou fenótipos transversais em animais individuais em toda a população, mas esse método impede o monitoramento das características de animais individuais ao longo do tempo. Essa abordagem também é trabalhosa, restringindo o tamanho da população que pode ser testada.
Há um número limitado de métodos de cultura que permitem o monitoramento longitudinal de C. elegans individuais ao longo de sua vida útil, e cada um tem um conjunto distinto de vantagens e desvantagens. Dispositivos microfluídicos, incluindo WormFarm2, NemaLife3, chipde "comportamento" 4, entre outros 5,6,7, permitem o monitoramento de animais individuais ao longo do tempo. O cultivo de vermes em cultura líquida utilizando placas de poços múltiplos permite o monitoramento de animais individuais ou de pequenas populações de C. elegans ao longo do tempo 8,9. O ambiente líquido representa um contexto ambiental distinto do ambiente comum de cultura em meio sólido em placas de Petri, o que pode alterar aspectos da fisiologia animal relevantes para o envelhecimento, incluindo o conteúdo de gordura e a expressão de genes de resposta ao estresse10,11. A capacidade de comparar diretamente esses estudos com a maioria dos dados coletados sobre envelhecimento de C. elegans é limitada por diferenças em variáveis ambientais potencialmente importantes. O Worm Corral12 é uma abordagem desenvolvida para abrigar animais individuais em um ambiente que replica mais de perto a cultura típica de mídia sólida. O Curral de Vermes contém uma câmara selada para cada animal em uma lâmina de microscópio utilizando hidrogel, permitindo o monitoramento longitudinal dos animais isolados. Esse método usa imagens de campo claro padrão para registrar dados morfológicos, como tamanho e atividade corporal. No entanto, os animais são colocados no ambiente de hidrogel como embriões, onde permanecem intactos durante toda a sua vida. Isso requer o uso de fundos genéticos mutantes ou transgênicos condicionalmente estéreis, o que limita tanto a capacidade de triagem genética, já que cada nova mutação ou transgene precisa ser cruzado em um fundo com esterilidade condicional, quanto a capacidade de triagem de drogas, já que os tratamentos só podem ser aplicados uma vez aos animais como embriões.
Um método alternativo desenvolvido pelo laboratório Fang-Yen permite o cultivo de vermes em meio sólido em poços individuais de um dispositivo microfabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) denominado WorMotel13,14. Cada dispositivo é colocado em uma bandeja de poço único (ou seja, com as mesmas dimensões de uma placa de 96 poços) e tem 240 poços separados por um fosso preenchido com uma solução aversiva para evitar que os vermes viajem entre poços. Cada poço pode abrigar um único verme durante toda a sua vida útil. O dispositivo é cercado por pastilhas de gel de poliacrilamida absorvedoras de água (conhecidas como "cristais de água"), e a bandeja é selada com filme de laboratório Parafilm para manter a umidade e minimizar a dessecação do meio. Esse sistema permite que dados de saúde e expectativa de vida sejam coletados para animais individuais, enquanto o uso de meios sólidos recapitula melhor o ambiente experimentado pelos animais na grande maioria dos estudos publicados sobre a expectativa de vida de C. elegans, permitindo comparações mais diretas. Recentemente, uma técnica semelhante foi desenvolvida utilizando microbandejas de poliestireno que foram originalmente usadas para ensaios de microcitotoxicidade15 no lugar do dispositivo PDMS16. O método da microbandeja permite a coleta de dados individualizados para vermes cultivados em meio sólido e melhorou a capacidade de conter vermes em condições que normalmente causariam fuga (por exemplo, estressores ou restrição alimentar), com a compensação de que cada microbandeja pode conter apenas 96 animais16, enquanto o dispositivo multipoço utilizado aqui pode conter até 240 animais.
Apresentamos aqui um protocolo detalhado para a preparação de dispositivos multipoços que é otimizado para consistência placa a placa e a preparação de vários dispositivos em paralelo. Esse protocolo foi adaptado do protocolo original do laboratório Fang-Yen13. Especificamente, há descrições de técnicas para minimizar a contaminação, otimizar a secagem consistente do meio sólido e da fonte de alimento bacteriano e entregar RNAi e medicamentos. Esse sistema pode ser usado para rastrear a saúde individual, a expectativa de vida e outros fenótipos, como tamanho e forma do corpo. Esses dispositivos de vários poços são compatíveis com sistemas de alto rendimento existentes para medir a vida útil, o que pode remover grande parte do trabalho manual envolvido em experimentos tradicionais de vida útil e fornecer a oportunidade de medição de longevidade direta e automatizada e rastreamento de saúde em C. elegans individuais em escala.
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Protocol
1. Preparação de soluções e suportes de stock
NOTA: Antes de iniciar a preparação dos dispositivos multipoços, prepare as seguintes soluções de estoque e mídias.
- Soluções estoque para meios de crescimento de nematoides (NGM) e NGM de baixa fusão (lmNGM):
- Prepare 1 M K 2 HPO4: Adicione 174,18 g de K2HPO4 aum frasco de 1 L e encha-o até 1 L com água deionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) por 30 min, e armazenar em temperatura ambiente (TR).
- Prepare 1 M KPi, pH 6,0: Adicione 136,09 g de KH2HPO4 a um frasco de 1 L e encha-o até 1 L com água deionizada estéril. Titular com 1 M K2HPO4 a pH 6,0. Autoclave (121 °C, 15 psig) por 30 min, e armazenar em RT.
- Preparar 1 M CaCl 2: Adicionar 73,5 g de CaCl2 a um frasco de 500 mL e enchê-lo até 500 mL com água deionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) por 30 min, e armazenar em RT.
- Preparar 1 M de MgSO 4: Adicionar 123,25 g de MgSO4 a um frasco de 500 mL e enchê-lo até 500 mL com água deionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) por 30 min, e armazenar em RT.
- Preparar 5 mg/mL de colesterol: Combinar 2,5 g de colesterol, 275 mL de etanol 100% e 25 mL de água deionizada estéril em um frasco âmbar de 500 mL. Loja na RT.
- Preparar floxuridina 50 mM: Combinar 0,1231 g de floxuridina e 10 mL de água deionizada estéril em um tubo cônico de 15 mL. Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,22 μm usando uma seringa de 10 mL. Aliquota 1 mL cada em 10 tubos de microcentrífuga e armazene-os a -20 °C.
- Preparar 50 mg/mL de carbenicilina: Em um tubo cônico de 15 mL, combinar 500 mg de carbenicilina com 10 mL de água deionizada estéril. Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,22 μm usando uma seringa de 10 mL. Aliquota 1 mL cada em 10 tubos de microcentrífuga e armazene-os a -20 °C.
- Preparar 1 mM de isopropil ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG): Em um tubo cônico de 15 mL, combinar 2,38 g de IPTG com 10 mL de água deionizada estéril. Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,22 μm usando uma seringa de 10 mL. Aliquota 1 mL cada em 10 tubos de microcentrífuga e armazene-os a -20 °C.
- Preparar 100 mg/mL de ampicilina: Em um tubo cônico de 15 mL, combinar 1 g de ampicilina com 10 mL de água deionizada estéril. Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,22 μm usando uma seringa de 10 mL. Aliquota 1 mL cada em 10 tubos de microcentrífuga e armazene-os a -20 °C.
- Preparação de meios de crescimento de nematoides (NGM) para manutenção geral de C. elegans
- Para fazer 50 placas, em um frasco de 1 L, misture 10 g de ágar Bacto, 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptona Bacto e 486 mL de água ultrapura. Autoclave em ciclo líquido (121 °C, 15 psig) por pelo menos 30 min para esterilizar.
- Após a autoclave, após o resfriamento do meio a 55 °C, adicionar 12,5 mL de 1 M KPi, 500 μL de 1 M MgSO4, 500 μL de CaCl1 M 2 e 500 μL de 5 mg/mL de colesterol.
- Usando uma técnica estéril, despeje 10 mL de meio em cada placa de 60 mm (50 no total). Após a solidificação do meio (pelo menos 30 minutos após o derramamento), pipetar 300 μL de cultura bacteriana (preparada de acordo com as etapas 4 e 10) que foi cultivada durante a noite no centro da placa. Deixe a placa no banco, permitindo que a cultura bacteriana seque e cresça mais espessa (1-2 dias). Conservar as placas a 4 °C.
- Preparar a pré-mistura do meio de crescimento de nematódeo de baixo teor de fusão (lmNGM):
- Num balão de 500 ml, combinar 4 g de agarose de baixo derretimento, 0,5 g de Bacto Peptone e 195 ml de água ultrapura. Autoclave em ciclo líquido (121 °C, 15 psig) por pelo menos 30 min para esterilizar.
- Enquanto o meio ainda estiver derretido, distribuir alíquotas de 10 mL em tubos de ensaio de vidro estéril. Selar cada tubo de ensaio com Parafilm seguido de uma tampa de tubo de ensaio para preservar a pré-mistura de lmNGM e evitar a dessecação. A mídia irá solidificar e pode ser armazenada por ~2 semanas no RT antes do uso.
- Preparar NaCl 142,8 mM: Em um frasco de 250 mL, combinar 0,8345 g de NaCl e 100 mL de água deionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) por 30 min, e armazenar em RT.
- Preparar solução de detergente: Num tubo cónico de 15 ml, combinar 3 ml de Tween 20 e 7 ml de água desionizada estéril. Misturar bem, filtrar-esterilizar com um filtro de 0,22 μm usando uma seringa de 10 mL e armazenar em RT.
- Preparar solução de sulfato de cobre: Num frasco estéril de 50 ml, combinar 20 ml de água deionizada estéril, 0,5 g de CuSO4 e 100 μL de solução detergente (preparada no passo 1.5). Misture até dissolver o CuSO4 . Loja na RT.
- Prepare cristais de poliacrilamida absorvedores de água: Em um frasco de squeeze seguro para autoclave, combine 150 mL de água deionizada e 1 g de polímero superabsorvente Tipo S. Misture delicadamente, invertendo o frasco várias vezes. Autoclave em ciclo líquido (121 °C, 15 psig) por pelo menos 20 min, e armazenar em RT.
- Preparar caldo de lisogenia (LB): Em um copo de 1 L ou maior, misture 20 g de pó de LB com 1 L de água deionizada. Alíquota em dois copos de 500 mL. Autoclave (121 °C, 15 psig) por 30 min, e armazenar em RT
- Preparar placas de ágar caldo de lisogenia (LB):
- Num balão de 1 L, juntar 10 g de LB em pó, 7,5 g de Agar Bacto e 500 ml de água deionizada. Autoclave em ciclo líquido (121 °C, 15 psig) por 30 min.
- Se desejar, adicionar antibióticos opcionais (pós-autoclave, após resfriamento do meio a 55 °C): 500 μL de 100 mg/mL de ampicilina. Usando uma técnica estéril, despeje 20 mL de meio em cada placa de 100 mm (25 no total) e armazene a 4 °C.
2. Imprimindo o molde do dispositivo multi-poço 3D
NOTA: Cada dispositivo é moldado a partir do PDMS usando um molde personalizado impresso em 3D. Um único molde pode produzir quantos dispositivos forem necessários; no entanto, se tentar preparar vários dispositivos ao mesmo tempo, um molde impresso em 3D é necessário para que cada dispositivo seja feito em paralelo.
- Faça o download do arquivo STL (consulte Arquivo Suplementar 1).
- Imprima o molde com uma impressora 3D de alta resolução.
NOTA: A resolução da impressora deve ser suficientemente alta para permitir volumes consistentes de poço e fosso. A resolução de impressora sugerida é uma resolução XY mínima de ~40 μm e uma resolução de camada de 28 μm. O material usado pela impressora 3D é igualmente importante, pois muitos tipos de materiais impedirão a cura do PDMS. Por experiência, moldes produzidos por impressoras PolyJet de alta resolução (resolução: eixo X = 600 dpi, eixo Y = 600 dpi, eixo Z = 1.600 dpi) usando o material de impressão Vero Black funcionam de forma consistente. A impressão 3D dos moldes utilizados neste estudo foi terceirizada (detalhes da impressão podem ser encontrados na Tabela de Materiais).
3. Preparação do dispositivo multipoço
NOTA: Esta seção descreve como o molde impresso em 3D é usado para criar o dispositivo de vários poços PDMS.
- Ajuste o forno de cura a 55 °C para permitir o pré-aquecimento.
- Determine o número de dispositivos a serem preparados em um lote. Para cada dispositivo, misture 60 g de base PDMS e 6 g de agente de cura em um barco de pesagem grande e descartável (ou recipiente descartável similar) usando uma espátula descartável.
- Coloque a mistura de PDMS em uma câmara de vácuo por 30 min a -0,08 MPa para remover bolhas.
- Despeje a mistura de PDMS em cada molde impresso em 3D. Encha o molde completamente, com a mistura de PDMS estendendo-se ligeiramente acima da parte superior do molde. Mantenha o excesso de mistura de PDMS para reabastecer o molde em caso de derramamentos.
- Coloque o molde preenchido e qualquer mistura extra de PDMS na câmara de vácuo por 25 minutos a −0,08 MPa para remover quaisquer bolhas criadas durante o processo de derramamento.
- Remova o molde preenchido da câmara de vácuo e estoure as bolhas restantes com uma espátula descartável. Use a espátula para escovar quaisquer detritos visíveis ou bolhas remanescentes na borda do molde longe dos poços. Quaisquer detritos ou bolhas remanescentes podem potencialmente interferir com a imagem nas etapas posteriores.
- Garantir que o molde seja preenchido completamente com a mistura de PDMS; É comum que uma pequena porção da mistura se derrame enquanto estiver na câmara de vácuo ou durante a transferência. Reabastecer utilizando a mistura extra de PDMS que foi desgaseificada no passo 3.5. Isso não deve criar bolhas, mas se alguma se formar, elas podem ser suavemente escovadas para o lado do molde com a espátula.
- Coloque uma folha de acrílico plana sobre o molde preenchido com PDMS, primeiro colocando uma borda e baixando lentamente a outra até que o acrílico fique plano em cima do molde, deslocando qualquer mistura de PDMS que se estenda acima da borda. Se bolhas se formarem durante a colocação da folha de acrílico, remova lentamente o acrílico, encha novamente o molde com a mistura de PDMS, se necessário, e reinicie a colocação de acrílico. A chapa de acrílico formará um fundo plano para o dispositivo moldado e garantirá que todos os poços estejam no mesmo nível em relação à base.
- Coloque um peso de 2,5 lb em cima do acrílico. Vários moldes, cada um com uma folha de acrílico separada, podem ser empilhados. Coloque as formas pesadas no forno e deixe-as curar a 55 °C durante a noite.
- No dia seguinte, retire os pesos e as formas do forno.
- Trabalhe cuidadosamente uma lâmina de barbear entre o acrílico e o PDMS curado para quebrar o selo. Retire cuidadosamente o acrílico da parte superior do molde. O PDMS já terá definido a essa altura, e retirar o acrílico pode levar alguma força.
- Usando uma navalha ou uma espátula de metal, solte cuidadosamente as laterais do PDMS curado do molde. É fácil rasgar o PDMS nesta fase; trabalhe lenta e suavemente ao redor da borda para remover o dispositivo PDMS intacto.
NOTA: Os moldes recém-impressos são particularmente pegajosos para os três primeiros usos, e o PDMS geralmente rasga ao tentar remover o dispositivo. Com mais usos, fica mais fácil remover o PDMS curado do molde. - Embrulhe o dispositivo em papel alumínio e sele com fita autoclave. Autoclave em ciclo seco por pelo menos 15 min a 121 °C, 15 psig para esterilizar. Após a autoclavagem, guarde os dispositivos embrulhados na bancada e use-os conforme necessário.
4. Estancar as bactérias
NOTA: Comece a preparar as bactérias que serão usadas como fonte de alimento dos vermes enquanto eles estiverem no dispositivo multi-poço. A bactéria mais comum é a cepa OP50 de Escherichia coli (ou cepa HT115 para experimentos de RNAi). Conclua esta etapa pelo menos 2 dias antes de adicionar os worms ao dispositivo.
- Coloque as bactérias em um prato LB fresco. Certifique-se de que quaisquer aditivos seletivos específicos da cepa (por exemplo, ampicilina para selecionar um plasmídeo que confira resistência à ampicilina às bactérias) sejam incluídos nas placas LB.
- Incubar a placa a 37 °C durante a noite (~18 h) para permitir que as colônias cresçam.
5. Preparação do dispositivo multipoço para carregamento de mídia
OBS: A superfície do material de silicone PDMS que compõe o dispositivo é hidrofóbica, o que impede que os poços de pequeno volume e fossos aversivos sejam preenchidos com NGM e sulfato de cobre, respectivamente. Para contornar esse problema, um plasma de oxigênio é usado para modificar temporariamente as propriedades de superfície do dispositivo para ser hidrofílico, permitindo que os poços e fosso sejam preenchidos dentro de uma janela de tempo limitada (até ~2 h). Esta seção apresenta as etapas para concluir o processo de limpeza do plasma. Conclua esta etapa pelo menos 1 dia antes de detectar os poços do dispositivo com bactérias, pois os efeitos persistentes da limpeza do plasma podem interferir na mancha. Dada a temporização das seções 5-7, o limite prático para essas etapas por técnico é de três dispositivos em paralelo.
- Pré-aqueça uma incubadora de banho de contas secas a 90 °C em preparação para a secção 6.
- Como o volume total de meios necessários para encher os poços de um dispositivo de vários poços é pequeno em comparação com o das placas de Petri, prepare um grande lote de NGM e coloque-o em tubos de ensaio (ver passo 1.3).
NOTA: Isso pode ser feito com antecedência, pois os tubos de mídia podem ser armazenados na bancada por ~2 semanas. Se o suporte tiver sido preparado e aliquotado em tubos, avance para o passo 5.3. - Enquanto estiver usando luvas, desembrulhe um dispositivo multipoço autoclavado; Evite tocar em qualquer um dos poços. Corte um pequeno entalhe no canto superior direito do dispositivo para indicar quantas vezes foi utilizado/reutilizado (ver secção 15 abaixo para instruções e recomendações para limpar e reutilizar cada dispositivo).
- Coloque até três dispositivos desembrulhados no limpador de plasma com os poços voltados para cima. Execute o limpador de plasma.
NOTA: As seguintes instruções detalhadas são para o limpador de plasma Plasma Etch PE-50. As etapas e configurações específicas precisam ser adaptadas e, possivelmente, reotimizadas para outros limpadores de plasma.- Verifique se o nível de energia do limpador de plasma está definido como 75%.
- Certifique-se de que as válvulas de ventilação e isolamento estejam ambas na posição OFF .
- Abra a válvula principal no tanque de oxigênio. Aguarde até que a pressão do regulador caia para entre 15 psig e 20 psig e, em seguida, gire a válvula de isolamento para a posição ON .
- Ligue a bomba de vácuo e o limpador de plasma.
- Insira as seguintes configurações no limpador de plasma (primeiro uso) ou verifique se as configurações programadas anteriormente estão corretas:
Tempo de Plasma: 3:00 min
Ponto de ajuste de vácuo: 149,5 mTorr
Ventilação atmosférica: 45 s
Ventilação de expurgo: 5 s
Estabilizador de gás: 15 s
Alarme de vácuo: 3:00 min
Auto Cycle-Off: LIGADO - Pressione Enter para ir para o menu de comandos. Use a tecla Seta para a direita para selecionar Menu de instalação e pressione Enter. Percorra todas as configurações pressionando Enter para confirmar cada configuração atual e, em seguida, a Seta para a direita para ir para a próxima configuração.
- Retorne ao menu de comandos pressionando a seta para cima e, em seguida, a seta para a esquerda.
- Na tela Menu de comandos , pressione Enter. Selecione Comandos PLASMA pressionando Enter. O sistema passará pelas seguintes fases:
Bombeamento de Plasma
Estabilizador de gás: Durante esta fase, ajuste o botão Gás 1 no limpador de plasma até que o medidor de fluxo esteja a 10 cc/min.
Tempo de Plasma
Purge Pumpdown
Ciclo de Plasma Completo
Ventilação da Câmara
Observação : esse processo deve levar aproximadamente 5-10 min para ser concluído. Quando todas as fases estiverem concluídas, o Menu de Comandos será exibido na tela novamente. Se durante a fase de bombeamento de plasma, a pressão não ficar baixa o suficiente, o limpador de plasma não prosseguirá para a próxima fase e a tela exibirá uma mensagem de erro. Se isso acontecer, verifique o óleo da bomba de vácuo. Se os níveis de óleo estiverem baixos ou o óleo estiver turvo/sujo, a troca do óleo pode permitir que a pressão de vácuo atinja o nível necessário. - Desligue a válvula principal do tanque de oxigênio.
- Muito lentamente, gire a válvula de ventilação para a posição ON e permita que a pressão do regulador do tanque de oxigênio volte a zero.
- Gire a válvula de isolamento para a posição OFF .
- Desligue a bomba de vácuo e o limpador de plasma.
NOTA: A modificação da superfície hidrofílica do dispositivo multipoço pelo limpador de plasma é temporária e torna-se progressivamente menos eficaz ao longo do tempo (até cerca de 2 h). Prossiga através da secção 6 e da secção 7 o mais rapidamente possível.
6. Enchimento dos poços com lmNGM
NOTA: Uma incubadora de banho de contas secas deve estar ligada e pré-aquecida a partir do passo 5.1. Certifique-se de que o banho atingiu 90 °C.
- Esterilize uma bandeja de poliestireno de poço único por dispositivo, borrifando o interior da bandeja com etanol 70% e limpando-a com um lenço de limpeza.
- Retire cada dispositivo do limpador de plasma com uma mão enluvada e coloque-o em uma bandeja limpa.
- Colocar uma cuba de pipeta descartável de 25 mL na incubadora de banho de contas após aquecê-la a 90 °C.
- Juntar um tubo de pré-mistura de lmNGM solidificado por dispositivo a encher (ver passo 1.3).
- Coloque os tubos de ensaio de pré-mistura de lmNGM em um copo de vidro de 200 mL e remova as tampas e o Parafilm. Leve ao micro-ondas por ~20 s até que a mídia derreta o suficiente para derramar (a presença de algum meio sólido é boa nesta fase).
- Combinar a pré-mistura de lmNGM fundido de vários tubos de ensaio em outro copo estéril de 200 mL. Continue microondulando por mais 20 s para atingir um total de 40 s. Se a pré-mistura de lmNGM começar a ferver, pare o micro-ondas e deixe a pré-mistura de lmNGM assentar antes de continuar.
- Retire a pré-mistura de lmNGM derretida do micro-ondas e deixe esfriar até ~60 °C.
NOTA: Nesta fase, a mídia irá resfriar e ressolidificar após ~5 min. Prossiga imediatamente para as etapas 6.8 e 6.9. - Para cada 10 mL de pré-mistura de lmNGM, adicionar o seguinte (em ordem): 250 μL de 1 M KPi, 10 μL de 1 M MgSO4, 10 μL de 1 M CaCl2 e 10 μL de 5 mg/mL de colesterol.
- Para evitar a eclosão dos ovos ao monitorar adultos no dispositivo, adicione 10 μL de floxuridina 50 mM.
- Para selecionar um plasmídeo RNAi e induzir a expressão do RNA, adicione 5 μL de 50 mg/mL de carbenicilina e 12 μL de 1 mM IPTG.
NOTA: Os antibióticos ou outros aditivos podem ser alterados dependendo do desenho do experimento. Compostos de teste/medicamentos também podem ser adicionados à mídia nesta fase.
- Despeje o lmNGM fundido na bacia de 25 mL no banho de contas.
- Encha os poços do dispositivo com lmNGM usando uma pipeta repetidora multicanal de 200 μL.
- Ajuste o repetidor para dispensar alíquotas de 14 μL (14 μL podem ser dispensados até 14 vezes se usar uma ponteira de pipeta de 200 μL).
- Monte cinco pontas de pipeta. Os poços do dispositivo têm o mesmo espaçamento de uma placa de 384 poços. As pipetas multicanal padrão são espaçadas de tal forma que o usuário pode pipetar em todos os outros poços em uma linha/coluna.
- Carregue as pontas com lmNGM fundido. Distribua os primeiros 14 μL de volta para a bacia contendo lmNGM.
- Movendo-se rapidamente, mas cuidadosamente, distribua 14 μL nos poços internos (branco na Figura 1B), começando com aqueles marcados com um "x" na Figura 1B e movendo-se através da placa para a direita e depois para baixo, dispensando um total de 12 vezes (60 poços).
- Distribua o lmNGM restante de volta para a bacia, pois a alíquota final é tipicamente inferior a 14 μL.
- Repita os passos 6.10.3-6.10.5 até que todos os poços internos tenham sido preenchidos.
- Em seguida, ajuste o repetidor para dispensar alíquotas de 15 μL. Repita os passos 6.10.3-6.10.5, mas em vez dos poços internos, preencha o anel mais externo dos poços (cinza na Figura 1B), começando com os poços marcados com "+" na Figura 1B e movendo-se ao redor da borda externa da placa.
NOTA: Trabalhe rapidamente para que a mídia não se solidifique nas pontas da pipeta. Evite derramar qualquer lmNGM no fosso. Os poços externos tendem a secar mais rapidamente. O 1 μL extra de lmNGM permite que o poço final seco tenha uma superfície nivelada no mesmo tempo de secagem que os poços internos.
- Como etapa de controle de qualidade, examine cada poço para identificar aqueles com falhas que podem interferir na imagem, incluindo poços que estão subcheios (a superfície lmNGM está afundada abaixo da borda do poço), supercheios (a superfície lmNGM tem um topo abobadado) e contêm bolhas ou detritos.
- Remova o lmNGM solidificado dos poços insatisfatórios com um coletor curto de fio de platina ou aspirador a vácuo. Reabasteça os poços vazios com lmNGM fresco derretido. Além disso, remova qualquer meio que transbordou para o fosso com um coletor de fio de platina curto ou aspirador a vácuo.
7. Adição de sulfato de cobre ao fosso
NOTA: Os poços deste dispositivo estão rodeados por um fosso contínuo. Aqui, o fosso é preenchido com sulfato de cobre, que atua como repelente e impede que os vermes fujam de seus poços.
- Usando uma pipeta de 200 μL, distribua 200 μL de solução de sulfato de cobre (ver passo 1.6) no fosso do dispositivo em cada canto, 2x por canto. Este deve ser um volume grande o suficiente para que o sulfato de cobre flua através de todo o fosso. Cuidado para não encher demais o fosso em nenhum momento; O sulfato de cobre não deve tocar a superfície superior dos poços.
- Se o sulfato de cobre não fluir facilmente através de todo o fosso, use uma picareta de fio de platina curta para ajudar a quebrar a tensão e arrastar o sulfato de cobre através do fosso.
- Depois que o sulfato de cobre tiver fluído através de todo o fosso, remova o máximo possível de sulfato de cobre do fosso usando uma pipeta de 200 μL ou aspiração com vácuo. O resíduo deixado para trás será suficiente para impedir que as minhocas deixem seus poços. Deixar o fosso cheio de solução de sulfato de cobre corre o risco de o sulfato de cobre derramar nos poços, o que causaria a fuga de vermes.
8. Adição de cristais de água autoclavados
NOTA: Para manter a umidade dentro da placa e evitar a dessecação do lmNGM, cada dispositivo é cercado por cristais saturados de poliacrilamida absorvedores de água.
- Prepare os cristais de água (ver passo 1.7).
- Usando uma garrafa de squeeze, adicione os cristais de água nos espaços entre o dispositivo e as paredes da bandeja. Feche a tampa da bandeja e envolva os quatro lados com um pedaço de Parafilm. Adicione dois pedaços adicionais de Parafilm para selar completamente a placa.
NOTA: Os cristais de água podem ser preparados em um copo e colhidos na bandeja com uma espátula esterilizada. No entanto, isso adiciona tempo ao procedimento e aumenta o tempo que cada bandeja fica aberta e exposta a potenciais contaminantes. - Deixe o dispositivo selado na bancada até o dia seguinte, quando as bactérias estiverem prontas para serem detectadas. Certifique-se de que os dispositivos sejam armazenados com os poços virados para cima após a adição do lmNGM.
9. Preparação de uma população de vermes sincronizada com a idade
NOTA: As etapas a seguir produzem uma população sincronizada de vermes que estão prontos para adicionar ao dispositivo de vários poços no quarto estágio larval (L4). No entanto, vermes em diferentes estágios de desenvolvimento também podem ser adicionados. Esta etapa deve ser concluída 2 dias antes de adicionar os worms ao dispositivo, se L4s forem desejados. Ajuste o tempo de sincronização para o estágio de vida desejado.
- Para estudos de envelhecimento consistentes, manter C. elegans em placas NGM padrão (ver passo 1.2 a 20 °C em condições bem alimentadas).
- Obter uma população sincronizada de animais a partir de uma placa de estoque através de métodos padrão, por exemplo, branqueamento17 ou postura cronometrada de ovos1.
- Adicione ovos isolados a uma placa de NGM manchada com bactérias. Os ovos eclodirão nesta placa, e os vermes atingirão o estágio larval L4 em 2 dias para animais selvagens.
10. Inoculação da cultura bacteriana
NOTA: As bactérias são usadas como fonte primária de alimento para C. elegans, mais comumente cepas de E. coli OP50 ou HT115. As bactérias concentram-se 10 vezes, o que deve ser contabilizado no volume da cultura preparada. Prepare uma cultura bacteriana no dia anterior à detecção do dispositivo.
- A partir da placa LB preparada na etapa 4, escolher uma única colônia e inocular 12 mL de LB estéril por dispositivo a ser detectado. Incluir agentes seletivos, se necessário, para a cepa bacteriana que está sendo usada.
- Cultivar a cultura bacteriana durante a noite (~18 h) em uma incubadora de 37 °C com agitação a ~250 rpm.
11. Detectar os poços com bactérias concentradas
NOTA: Um pequeno volume de bactérias concentradas é adicionado a cada poço, o que é suficiente para alimentar os vermes por toda a sua vida útil no dispositivo. A cultura bacteriana precisa ser seca antes que os vermes possam ser adicionados aos poços. Como o volume do meio em cada poço é pequeno (14-15 μL) em relação ao volume de bactérias adicionadas (5 μL), o conteúdo químico do meio bacteriano pode afetar o ambiente químico do poço. Para explicar isso, as bactérias são concentradas e ressuspensas em água salgada para remover o LB esgotado, evitando o estresse hipoosmótico. Não há sal adicionado à receita de lmNGM (veja as etapas 1.3-1.4) como ele é adicionado nesta fase.
- Depois de crescer as bactérias durante a noite, conforme descrito na secção 10, concentrar a cultura bacteriana 10x. Pellet as bactérias centrifugando a ~3.400 x g por 20 min, eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1/10 do volume de cultura original de 142,8 mM NaCl (ver passo 1.4). Por exemplo, para detectar um dispositivo de 240 poços, gire 12 mL de cultura e ressuspenda em 1,2 mL de NaCl 142,8 mM.
NOTA: Compostos/fármacos de teste podem ser adicionados à cultura bacteriana ressuspensa antes da detecção. - Usando uma pipeta de repetição, identifique cada poço com 5 μL das bactérias concentradas. Evite o contato direto com a superfície do lmNGM, pois a ponta da pipeta pode perfurar o lmNGM e permitir que o verme se enterre abaixo da superfície do poço. Tenha cuidado para não deixar as bactérias se derramarem no fosso, porque os vermes serão atraídos por ele e fugirão para o fosso.
- Seque as bactérias manchadas com as tampas da bandeja removidas. Esta etapa é importante para a integridade a longo prazo do ambiente do poço, e há uma variedade de maneiras de secar os dispositivos manchados. Seja qual for o método utilizado, certifique-se de que o dispositivo permaneça em um ambiente estéril, pois precisa ficar descoberto enquanto as bactérias secam. O aumento do fluxo de ar reduz consideravelmente o tempo de secagem. A secagem pode ser realizada conforme descrito nas etapas abaixo:
- Deixe o dispositivo descoberto em um recipiente limpo e lacrado, como uma lixeira plástica que tenha sido limpa com 10% de água sanitária, seguida de etanol 70%. Este método de secagem pode levar várias horas.
- Coloque os dispositivos descobertos em uma capela de fluxo laminar estéril (semelhante ao método preferido abaixo).
- Secar os dispositivos usando uma "caixa de secagem" personalizada (o método otimizado seguido neste estudo), que pode ser construída a um custo mínimo usando ventiladores de gabinete de computador e filtros HEPA (consulte o Arquivo Suplementar 1).
NOTA: Independentemente do método utilizado, a etapa de secagem deve ser otimizada para o ambiente local. Monitore frequentemente a rapidez com que os poços estão secando até que o tempo típico de secagem tenha sido identificado. Em um ambiente de baixa umidade, o uso de uma caixa de secagem resulta em um tempo de secagem de ~30-40 min. Não deixe as placas ficarem muito secas, pois o meio nos poços vai encolher e afundar. É melhor remover o dispositivo da secagem enquanto alguns poços ainda estão molhados do que deixá-lo secar por mais tempo e potencialmente secar demais um grande número de poços.
- Verifique os cristais de água. Se a maioria dos cristais de água na bandeja secou e perdeu volume durante o processo de secagem, adicione mais à bandeja.
- Depois que as bactérias estiverem secas, adicione os vermes imediatamente (seção 12) ou sele a bandeja para usar mais tarde. Para selar, feche a tampa da bandeja e envolva os quatro lados com uma única peça de Parafilm. Repita duas vezes para um total de três camadas de Parafilme. Depois de envolver a bandeja completamente, o dispositivo pode ser deixado na bancada à temperatura ambiente por até 4 dias antes de adicionar os vermes (seção 12).
12. Adicionando worms ao dispositivo de vários poços
- Adicionar manualmente um verme por poço a cada poço utilizando uma picareta de platina para transferir os animais das placas de vermes preparadas na secção 9. Só pegue vermes que estão na fase de vida e idade desejadas.
NOTA: Levar mais de 1 h para adicionar os worms ao dispositivo pode resultar em dessecação lmNGM, portanto, os worms devem ser adicionados o mais rápido possível. Escolher vários worms (20+) de cada vez antes de adicioná-los aos poços do dispositivo pode ajudar a aumentar a velocidade.
13. Finalizar a preparação do dispositivo para uso a longo prazo
NOTA: Essas etapas garantem que os poços do dispositivo permaneçam hidratados durante o experimento.
- Examine os cristais de água. Certifique-se de que os cristais de água estejam nivelados com a parte superior do dispositivo, mas não transbordem para ele. Adicione cristais de água adicionais à bandeja, se necessário.
- Adicione uma gota de solução de detergente preparada (ver passo 1.5) ao interior da tampa da bandeja e esfregue com um toalhete de tarefa até que a solução de detergente tenha secado. Isso evita o embaçamento na tampa depois que o dispositivo é selado dentro da bandeja para que os vermes fiquem claramente visíveis.
- Embrulhe a bandeja com três pedaços de Parafilm usando uma técnica específica que promove a integridade a longo prazo do selo Parafilm.
- Estique levemente um pedaço de Parafilm de tal forma que cubra apenas dois lados da bandeja. Repita isso com um segundo pedaço de Parafilm para cobrir os outros dois lados.
- Em camadas sobre a primeira camada de Parafilm, pegue um pedaço final de Parafilm, estique-o completamente e envolva todos os quatro lados. Se devidamente vedado, os poços do dispositivo devem permanecer hidratados por ~2 meses.
NOTA: A integridade do Parafilm deve ser monitorada a cada 1-2 semanas, e o Parafilm deve ser substituído se quebrado.
- Remova todas as impressões digitais da parte superior da bandeja usando uma limpeza de tarefa molhada com etanol 70%.
14. Coleta dos dados
OBS: O objetivo deste estudo é descrever a metodologia de cultura. Uma vez preenchidos, os dispositivos multipoços são compatíveis com o monitoramento longitudinal de uma variedade de fenótipos. Aqui, orientações básicas para medir vários dos parâmetros mais comuns são fornecidas.
- Tempo de vida: Monitore a vida útil tocando na placa ou expondo os vermes a uma luz azul brilhante a cada 1-3 dias. Escore como morto se nenhum movimento for observado. Esses dispositivos multipoços também são compatíveis com tubulações automatizadas de imagem e análise para estimar a vida útil13,18.
- Atividade: Monitore a atividade de animais individuais ao longo da vida, tirando imagens estáticas ou vídeos dos animais nos poços do dispositivo e avaliando a distância percorrida, velocidade ou outras métricas de movimento. Os dispositivos também são compatíveis com pipelines automatizados de imagem e análise para estimar a atividade13,18.
- Tamanho e forma do corpo: Monitore as mudanças no tamanho e na forma do corpo tirando imagens estáticas dos animais nos poços do dispositivo e quantificando os parâmetros visuais usando técnicas de imagem padrão. Em princípio, esse método de cultura deve ser compatível com os softwares existentes para uma avaliação mais sofisticada da forma do corpo do verme19,20,21.
15. Reutilização dos dispositivos
NOTA: Após a conclusão de um experimento, os dispositivos de vários poços podem ser limpos e reutilizados até três vezes. A reutilização adicional começa a impactar os fenótipos do verme, possivelmente causados por produtos químicos do meio ou bactérias que se acumulam nas paredes do material PDMS.
- Descarte o Parafilm e remova o dispositivo da bandeja. Verifique os entalhes no canto superior direito do dispositivo, que indicam quantas vezes ele foi usado. Se tiver sido usado três vezes, descarte o dispositivo. Se tiver sido usado menos de três vezes, limpe-o e reutilize-o.
NOTA: As bandejas são feitas de poliestireno e não estão diretamente em contato com o lmNGM, bactérias ou quaisquer aditivos para o meio. Eles podem ser reutilizados muitas vezes, desde que permaneçam visualmente claros. - Enxágue os cristais de água restantes da bandeja. Borrife o interior da bandeja com solução de água sanitária a 10% e deixe descansar por 10 min. Enxágue com água deionizada e seque imediatamente para evitar manchas de água.
- Segure o dispositivo em água corrente para começar a limpar o meio para fora dos poços. Dobre e torça suavemente o dispositivo sob a água para ajudar a soltar a mídia dos poços, mas não dobre tanto que o dispositivo rasgue. Escolha qualquer meio restante preso em poços com uma ponta de pipeta de 200 μL.
- Encha um copo de 2 L com uma barra de agitação ~3/4 cheia com água deionizada e deixe ferver em uma placa quente.
- Adicione um ou dois dispositivos de poços múltiplos e uma barra de agitação à água fervente. Ligue a agitação magnética a uma velocidade baixa (~200 rpm) para agitar suavemente os dispositivos na água. Deixe os dispositivos ferverem por 10 min.
- Retire os dispositivos da água com pinças de metal e coloque-os bem virados para baixo em papel toalha para escorrer. Deixe os dispositivos secarem no mínimo durante a noite.
- Quando os dispositivos estiverem completamente secos, envolva-os em papel alumínio e selei-os com fita autoclave. Escreva na fita de autoclave o número de vezes que o dispositivo foi usado. Autoclave em ciclo seco por 15 min a 121 °C para esterilizar. Os dispositivos agora estão prontos para reutilização.
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Representative Results
O sistema de cultura WorMotel pode ser usado para reunir uma variedade de dados, incluindo sobre tempo de vida, saúde e atividade. Estudos publicados têm utilizado dispositivos multipoços para estudar a expectativa de vida e a expectativa de vida13,14, a quiescência e o sono 22,23,24 e o comportamento 25. A vida útil pode ser pontuada manualmente ou através de uma coleção de imagens e análise de imagens a jusante. Na primeira abordagem, os vermes podem ser observados manualmente após um estímulo (por exemplo, bater na placa ou exposição à luz azul) a cada 1-3 dias e pontuados como mortos se nenhum movimento for observado, semelhante aos métodos padrão em placas de Petri1. A última abordagem é semelhante, exceto que o movimento do verme pode ser determinado comparando-se as diferenças quadro-a-quadro entre as imagens tiradas após a aplicação do estímulo. Isso fornece um benefício adicional na medida em que o movimento fornece informações sobre o nível de atividade de animais individuais naquele ponto de tempo e fornece uma métrica pela qual a expectativa de vida (por exemplo, cessação do movimento) e a expectativa de saúde (várias definições foram propostas) podem ser determinadas. As imagens podem ainda ser usadas para extrair parâmetros fisiológicos adicionais, como tamanho corporal, forma corporal e postura corporal.
Para demonstrar a capacidade do sistema, examinamos a relação epistática clássica entre o receptor de insulina, codificado pelo gene daf-2, e o fator de transcrição da família FOXO a jusante codificado por daf-16 no contexto da expectativa de vida, saúde e atividade diária para animais individuais. Perda de função selvagem (cepa N2) e daf-16(mu68) (cepa CF1038) C. elegans alimentados com E. coli (cepa HT115) expressando qualquer controle (vetor vazio; EV) ou construções de alimentação de RNAi daf-2 foram cultivadas em dispositivos multipoços, e cada animal foi monitorado quanto à expectativa de vida (Figura 2A), tempo de saúde (Figura 2B) e atividade diária (Figura 2C). A atividade foi monitorada diariamente por meio de uma série de imagens estáticas a cada 5 s por 2 min, com os vermes sendo expostos à luz azul brilhante por 5 s a 1 min para estimular a atividade (conforme Churgin et al.13). A atividade diária de cada animal foi estimada normalizando o fundo através de poços e imagens, identificando a área do verme em cada imagem e calculando a mudança de área entre as imagens adjacentes. A expectativa de vida foi definida como a idade em que a atividade foi observada pela última vez para cada verme, e a expectativa de vida foi definida como a idade em que um verme não podia mais se mover por todo o corpo. Como esperado de vários estudos anteriores (por exemplo, Kenyon et al.26, Murphy et al.27), a mutação daf-16(mu86) resultou em vida curta e impediu a extensão da vida útil a partir do knockdown do RNAi do daf-2 (Figura 2A). Padrão semelhante foi observado para a saúdespan (Figura 2B). Como vantagem do uso de sistemas de cultura de dispositivos multipoços, a capacidade de rastrear animais individuais ao longo da vida permite uma análise detalhada da variação individual em cada fenótipo medido ao longo da população. Por exemplo, a variação na expectativa de vida e na expectativa de saúde entre animais individuais pode ser comparada em termos absolutos (Figura 2D) ou como uma fração da expectativa de vida total (Figura 2E). Os fenótipos do início da vida podem ainda ser comparados aos fenótipos do final da vida, incluindo o tempo de vida, em animais individuais em uma população. Por exemplo, a atividade cumulativa para cada animal individual ao longo da vida (ou seja, a área sob a curva [AUC] para atividade individual) correlacionou-se melhor com a expectativa de vida (Figura 2F) do que a expectativa de vida acumulada até o 5º dia de vida (Figura 2G) em todas as condições medidas. Enfatizamos que o objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado para a construção do ambiente multipoço para rastrear animais individuais ao longo do tempo, e não para medir um fenótipo específico usando o dispositivo. Os resultados representativos apresentados na Figura 2 fornecem apenas um exemplo dos fenótipos que podem ser medidos nesse sistema. Uma vez construído, o ambiente multipoço é compatível com uma ampla gama de técnicas para medir os fenótipos de vermes de rastreamento livre em meios sólidos.
Figura 1: Esquema dos dispositivos multipoços microfabricados . (A) C. elegans individuais são cultivadas em meio sólido de baixo derretimento do nematoide (lmNGM) em almofadas de agarose semeadas com alimento bacteriano em poços individuais. O espaço entre os poços é revestido com um produto químico aversivo (sulfato de cobre) para isolar cada verme dentro de seu poço. Cada dispositivo é fixado dentro de uma bandeja de poço único. O perímetro da bandeja é preenchido com cristais de água para manter a umidade. A bandeja é selada com Parafilm para permitir a troca de oxigênio. Imagem criada com BioRender.com. (B) Visão geral do dispositivo multipoços indicando a ordem sugerida para o carregamento dos poços. Os poços internos (brancos) recebem 14 μL de lmNGM. Os poços externos (cinza) recebem 15 μL de lmNGM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Correlação dos fenótipos medidos entre populações em animais individuais usando dispositivos de poços múltiplos. Todos os painéis fornecem dados de um mesmo experimento comparando quatro grupos de animais: animais selvagens (N2) sujeitos ao vetor vazio EV(RNAi) (N = 138), animais selvagens sujeitos a daf-2(RNAi) (N = 151), animais daf-16(mu86) sujeitos a EV(RNAi) (N = 123) e animais daf-16(mu86) sujeitos a daf-2(RNAi ) (N = 135). (A) A extensão da vida útil do daf-2(RNAi) é bloqueada pela mutação nula daf-16(mu86). Significância pareada entre os grupos determinada pelo teste log-rank (função survdiff em R). (B) O período de saúde definido aqui como o dia em que um animal não pode mais mover uma extensão de comprimento de corpo inteiro de daf-2(RNAi) é bloqueado pela mutação nula daf-16(mu86). Significância pareada entre os grupos determinada pelo teste log-rank (função survdiff em R). (C) A média contínua de atividade de 3 dias ao longo da vida útil é reduzida tanto por daf-16(mu86) quanto por daf-2(RNAi). Significância calculada pelo teste U de Mann-Whitney para comparar a área sob a curva de atividade ao longo da vida para animais individuais entre os grupos. (D) Tempo de vida e tempo de vida para cada população em valores absolutos (média ± erro padrão da média). (E) Tempo de saúde e expectativa de vida de cada população normalizados para o tempo total de vida dentro de cada grupo (média ± erro padrão da média). (F) A atividade cumulativa ao longo da vida útil (área sob a curva [AUC] ao longo da vida) para animais individuais correlaciona-se melhor com a expectativa de vida do que (G) a atividade para animais individuais em qualquer dia específico ao longo da vida (a correlação de atividade no dia 8, representando o ponto em que a atividade média é maximizada, é mostrada), conforme calculada por regressão linear (função lm em R). n.s. = não significante, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Todos os valores de p foram ajustados para comparações múltiplas usando o método de Bonferroni para comparações feitas dentro de cada painel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Arquivo STL para imprimir o molde de dispositivo multi-poço 3D Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O sistema WorMotel é uma ferramenta poderosa para coletar dados individualizados para centenas de C. elegans isolados ao longo do tempo. Seguindo os estudos anteriores usando dispositivos multipoços para aplicações em quiescência de desenvolvimento, comportamento locomotor e envelhecimento, o objetivo deste trabalho foi otimizar a preparação de dispositivos multipoços para o monitoramento de longo prazo da atividade, saúde e vida útil de uma maneira de maior rendimento. Este trabalho fornece um protocolo detalhado para a preparação de dispositivos multipoços que otimiza muitas das etapas do protocolo original13, destaca pontos-chave que podem apresentar dificuldades técnicas e fornece uma discussão sobre a reutilização de placas e outros materiais.
Para fins de dimensionamento - como um laboratório que atualmente prepara entre 10 e 20 dispositivos em uma semana típica - uma consideração principal foi se os dispositivos poderiam ser reutilizados e, em caso afirmativo, em que grau. Há um custo mais alto em termos de tempo e dinheiro na preparação de dispositivos PDMS em relação à realização de cultura tradicional em placas de Petri, mas esses custos mais altos podem ser reduzidos com a reutilização do PDMS ou de outros componentes do sistema. Com muitos reusos, o PDMS começou a desenvolver uma coloração amarela, provavelmente refletindo o acúmulo de compostos do meio lmNGM ou bactérias. Os animais cultivados nessas placas também apresentaram maior taxa de fuga e menor expectativa de vida. Com base em dezenas de experimentos, três usos são ideais para a reutilização desses dispositivos PDMS, permitindo que fenótipos relacionados à idade sejam avaliados sem um impacto mensurável da degradação do PDMS, reduzindo o número de novos dispositivos que precisam ser moldados (economizando assim em custos). Confirmamos ainda que animais experimentais pareados crescidos em dispositivos em seu primeiro, segundo e terceiro uso produziram curvas de sobrevivência quase indistinguíveis e não estatisticamente diferentes (dados não mostrados). As bandejas usadas para conter os dispositivos são feitas de poliestireno e podem ser limpas e reutilizadas indefinidamente se permanecerem livres de arranhões ou outras marcas que possam interferir na visualização dos vermes.
Um desafio fundamental para a preparação de dispositivos multipoços para aplicações que duram mais de ~2 semanas é a prevenção da contaminação de placas por bactérias e fungos ambientais. Existem várias etapas em que a esterilização é fundamental para evitar a contaminação. Estes incluem autoclavar todos os dispositivos antes do uso, ferver os dispositivos destinados à reutilização, autoclavar os cristais de água absorvente usados para manter a umidade, limpar as bandejas que contêm os dispositivos com água sanitária e etanol antes do uso e filtrar a solução de detergente que é aplicada na tampa da bandeja para evitar embaçamento e adicionada à solução de sulfato de cobre. A implementação de cada uma dessas mudanças reduziu notavelmente os eventos de contaminação, permitindo que os dispositivos selados sejam consistentemente usados para monitoramento longitudinal durante toda a vida útil, mesmo sob condições pró-longevidade (por exemplo, nocaute do daf-2) que exigem monitoramento por >45 dias. O protocolo descrito aqui inclui duas modificações ao protocolo original para aplicações de longo prazo projetadas para manter a secagem consistente dos poços e evitar a dessecação. Primeiro, a profundidade total do dispositivo foi aumentada em 2 mm para aumentar a capacidade de cristais de água. Durante longos experimentos, particularmente em um ambiente de baixa umidade, poucos cristais de água na bandeja levaram à dessecação do lmNGM. Junto com mais cristais de água, foi necessário aumentar o volume de agarose que foi adicionado aos poços ao longo da borda do dispositivo. Esses poços tenderam a secar primeiro após o carregamento do poço (seção 6) e encolher. O uso de 14 μL de agarose nos poços internos foi volume suficiente para encher completamente os poços sem criar o topo abobadado que resulta do enchimento excessivo dos poços. A adição de 15 μL de agarose aos poços externos forneceu volume suficiente para que, quando os poços começassem a secar, eles encolhessem para um nível comparável aos 14 μL adicionados nos poços internos.
Um dos maiores desvios em relação ao protocolo original foi inverter a ordem em que o usuário carrega o lmNGM (seção 6) e o sulfato de cobre (seção 7). Originalmente, o sulfato de cobre foi adicionado ao fosso primeiro, seguido pelo enchimento dos poços com lmNGM13. Observou-se que o preenchimento dos poços com lmNGM o mais rápido possível após a limpeza com plasma melhorou a aderência do lmNGM às paredes dos poços. Esperar muito tempo após a limpeza do plasma resultou em poços com bolhas e tampos abobadados, o que pode interferir na visualização dos vermes. Priorizar o enchimento dos poços em vez da adição do sulfato de cobre é particularmente importante ao preparar vários dispositivos ao mesmo tempo para garantir superfícies lmNGM consistentes e de alta qualidade. Uma desvantagem de encher os poços primeiro é que a modificação da superfície hidrofílica produzida pelo limpador de plasma terá se desgastado visivelmente no momento em que o usuário passar a adicionar o sulfato de cobre. O sulfato de cobre não flui facilmente através do fosso quando a superfície se torna menos hidrofílica, tornando desafiador alcançar a cobertura completa. A adição de detergente à solução de sulfato de cobre para atuar como tensoativo melhora o fluxo da solução através do fosso. Uma picareta de fio de platina também pode ser usada para guiar suavemente o sulfato de cobre através do fosso, quebrando a tensão em quaisquer pontos onde o sulfato de cobre esteja tendo dificuldade em fluir. Além disso, se a solução de sulfato de cobre fosse deixada no fosso, ela facilmente se derramaria nos poços e contaminaria a superfície do lmNGM ao inclinar a bandeja. A natureza do processo de carregamento torna quase impossível manter o dispositivo suficientemente nivelado para evitar que o cobre contamine um subconjunto dos poços. Para explicar isso, a solução de sulfato de cobre é removida do fosso (etapa 7.3), e o sulfato de cobre residual deixado para trás é suficiente para impedir a maioria dos vermes de fugir. Como nota final sobre o uso do sulfato de cobre como barreira aversiva, alguns repelentes podem afetar fenótipos associados à idade, incluindo o tempo de vida. O uso de sulfato de cobre nesses dispositivos multipoços foi examinado por Churgin et al.13 e não teve impacto detectável na vida útil ou no desenvolvimento.
Outras pequenas atualizações do protocolo se concentram em melhorar as etapas tomadas para preparar o PDMS. Uma etapa extra de desgaseificação após a mistura da base PDMS e do agente de cura foi adicionada, pois este é um processo que gera muitas bolhas. A remoção da maioria das bolhas antes de adicionar a mistura aos moldes do dispositivo minimiza as bolhas remanescentes após a segunda etapa de desgaseificação. Para garantir que a parte inferior do dispositivo seja totalmente plana e uniforme, uma característica importante para a imagem de placa inteira, um pedaço de vidro ou acrílico foi colocado na parte superior do molde preenchido. Esta etapa não é essencial - embora ainda útil - para aplicativos que examinam apenas um poço de cada vez, pois o usuário pode ajustar manualmente o foco para cada poço. Finalmente, a cura do PDMS em temperatura mais elevada (55 °C) foi necessária no local onde esta versão do protocolo foi otimizada (Tucson, Arizona, EUA), em contraste com os 40 °C indicados pelo protocolo original (otimizado na Filadélfia, Pensilvânia, EUA). Isso sugere que diferenças entre locais (como o clima ou os reagentes precisos e equipamentos utilizados) podem afetar as etapas específicas do protocolo, como a temperatura de cura ou as técnicas de secagem, e que estas podem precisar ser otimizadas em cada local. Por exemplo, a umidade ambiental desempenha um grande papel na determinação do tempo de secagem das placas após a mancha, e isso pode variar muito entre locais ou estações.
Em princípio, este sistema de dispositivo de vários poços pode ser usado para coletar dados sobre qualquer fenótipo que possa ser medido sob microscopia de campo claro padrão em placas de Petri - tempo de vida, saúde, movimento não estimulado/estimulado, tamanho e forma do corpo, geometria do movimento - com a capacidade adicional de rastrear essas métricas para vermes individuais ao longo do tempo. Como observado na introdução, existem outros métodos para adquirir dados individuais de toda a vida útil. Os dispositivos microfluídicos28 ou placas multipoços29 oferecem a capacidade de acompanhar a história de vida de animais individuais, mas apenas cultivando os vermes em meio líquido. Um ambiente líquido pode alterar o transcriptoma dos vermes 10,11,30 em relação ao meio sólido e induzir distintas mudanças fisiológicas e comportamentais, incluindo natação episódica 31, aumento do gasto energético 10,32 e elevado estresse oxidativo 10. O grau em que a expectativa de vida e outras métricas relacionadas ao envelhecimento saudável podem ser diretamente comparadas entre meios líquidos e sólidos não está claro. Dispositivos de vários poços de cultura sólida permitem o rastreamento de worms únicos em um ambiente comparável à cultura de grupo padrão em placas de Petri. A estrutura curva da parede do dispositivo permite a obtenção de imagens de vermes em qualquer lugar dentro do poço, tornando esses dispositivos compatíveis, em princípio, com ferramentas mais sofisticadas para análise de worm único, como o Worm Tracker33.
A capacidade de monitorar animais individuais ao longo de um experimento em um dispositivo de vários poços é acompanhada por várias limitações. Em primeiro lugar, mesmo com um protocolo otimizado, esses dispositivos requerem mais tempo para serem configurados por animal do que a cultura padrão em placas de Petri, fornecendo dados de um único animal ao custo do tamanho total da amostra. No entanto, os vermes também são isolados em poços individualizados, removendo algumas das complicações associadas à medição automatizada da vida útil, como a detecção automática de animais individuais que param de se mover enquanto tocam uns nos outros. A automação mais do que recupera o tempo perdido para a configuração mais complexa e oferece a oportunidade de uma triagem de alto rendimento13,18. Em segundo lugar, condições experimentais que os vermes não gostam mais do que o fosso de sulfato de cobre, como fortes agentes indutores de estresse (por exemplo, paraquat) ou restrição alimentar, levarão os vermes a fugir dos poços e para o fosso. Terceiro, enquanto os dispositivos PDMS permitem microscopia de campo claro e campo escuro, o material PDMS tende a ter fluorescência de fundo alta e desigual, esta última provavelmente resultante de poeira ou outras micropartículas que se tornam incorporadas no PDMS durante a moldagem, o que limita sua aplicação em microscopia fluorescente. Finalmente, a descoloração observada no PDMS para dispositivos reutilizados ao longo de vários experimentos e a redução associada na vida útil e aumento na fuga sugere que os componentes do meio e outros produtos químicos adicionados leech no PDMS ao longo do tempo. O grau em que isso pode afetar fenótipos de envelhecimento ou tratamentos medicamentosos está sendo explorado atualmente. Como mencionado anteriormente, existe um método alternativo para uma cultura de worm único que é semelhante aos dispositivos multipoços PDMS, mas em vez disso usa microbandejas comercialmente disponíveis para cultivar animais isolados16. Essas microbandejas são feitas de poliestireno, evitando o problema potencial de componentes do meio de sanguessuga, e têm fundo de fluorescência consistente, permitindo imagens diretas de fluorescência in vivo diretamente na placa. Os poços de microbandeja também são cercados por ácido palmítico no lugar do sulfato de cobre utilizado no protocolo aqui descrito, que é mais aversivo e reduz a fração de vermes que saem de seus poços, mesmo no caso de agentes indutores de estresse e restrição alimentar. Esses benefícios são percebidos ao custo de menor eficiência de empacotamento dos poços, pois as microbandejas permitem que um máximo de 96 worms sejam cultivados em uma única bandeja, em contraste com a capacidade de 240 worms dos dispositivos PDMS. As especificidades do resultado desejado de um experimento influenciarão quais desses sistemas devem ser utilizados.
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Disclosures
Os autores afirmam não ter conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIH R35GM133588 para G.L.S., um Prêmio Catalisador da Academia Nacional de Medicina dos Estados Unidos para G.L.S., o Fundo de Iniciativa de Tecnologia e Pesquisa do Estado do Arizona administrado pelo Conselho de Regentes do Arizona e a Fundação Médica Ellison.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
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