Summary
Этот метод описывает анализ седиментации in vitro на основе лектина для количественной оценки сродства связывания глюканфосфатазы и амилопектина. Этот анализ совместного седиментации надежен для измерения связывания субстрата глюканфосфатазы и может применяться к различным солюбилизированным глюкановым субстратам.
Abstract
Глюканфосфатазы принадлежат к более крупному семейству фосфатаз двойной специфичности (DSP), которые дефосфорилируют субстраты глюканов, такие как гликоген у животных и крахмал у растений. Кристаллические структуры глюканфосфатазы с модельными глюкановыми субстратами показывают отчетливые интерфейсы связывания глюканов, состоящие из DSP и углеводсвязывающих доменов. Однако количественные измерения взаимодействия глюкан-глюканфосфатазы с физиологически значимыми субстратами имеют основополагающее значение для биологического понимания семейства ферментов глюканфосфатазы и регуляции энергетического обмена. В этой рукописи сообщается об анализе седиментации in vitro на основе конканавалина А (ConA), предназначенном для определения аффинности связывания субстрата глюканфосфатаз с различными глюкановыми субстратами. В качестве доказательства концепции была определена константа диссоциации (KD) глюканфосфатазы Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) и амилопектина. Характеристика мутантов SEX4 и других членов семейства ферментов глюканфосфатазы еще раз демонстрирует полезность этого анализа для оценки дифференциального связывания белок-углеводных взаимодействий. Эти данные демонстрируют пригодность этого анализа для характеристики широкого спектра белков, взаимодействующих с крахмалом и гликогеном.
Introduction
Глюканфосфатазы являются членами функционально разнообразного подсемейства фосфатаз двойной специфичности (DSP) в суперсемействе белковой тирозинфосфатазы (PTP)1. Они были обнаружены в большинстве форм жизни, включая широко расходящиеся фотосинтезирующие организмы, людей, позвоночных и некоторых беспозвоночных и простейших 2,3,4. Растения содержат три известные глюканфосфатазы: избыток крахмала4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) и Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Растения, в которых отсутствует глюканфосфатаза, демонстрируют пониженные скорости преходящей деградации крахмала и накопления крахмала в листьях 8,9. Лафорин является членом-основателем семейства глюканфосфатаз, которые дефосфорилируют гликоген у позвоночных и человека 3,10. Мутации лафорина приводят к нейродегенеративной болезни Лафора, фатальной аутосомно-рецессивной форме эпилепсии11. Глюканфосфатазы необходимы для метаболизма гликогена и крахмала и стали важными ферментами для модуляции содержания крахмала в растениях и лечения нейродегенеративной болезни Лафора12,13. Недавние рентгеновские кристаллографические исследования глюканфосфатаз с модельными глюкановыми субстратами пролили свет на связывание субстрата и каталитический механизм дефосфорилирования глюкана14,15,16,17. Однако нынешнее понимание того, как глюканфосфатазы связываются со своими физиологическими субстратами, является неполным.
Крахмал представляет собой нерастворимый полимер глюкозы, состоящий из 80-90% амилопектина и 10-20% амилозы18. Субстратами для растительных глюканфосфатаз являются фосфорилированные молекулы углеводов, такие как гранулы гликогена и крахмала. Фосфорилированные остатки глюкозила присутствуют в соотношении 1:600 фосфат к глюкозильному остатку. Интересно, что фосфаты присутствуют только на молекулах амилопектина19. Основная растительная глюканфосфатаза SEX4 действует на гранулы крахмала, дефосфорилируя молекулы амилопектина. Рентгеновская кристаллическая структура SEX4 в сочетании с структурно-ориентированными исследованиями мутагенеза продемонстрировала уникальную специфичность субстрата SEX4 для различных положений в структуре глюкана15. Недавно мы показали, что биологически значимая активность SEX4 может наблюдаться только при воздействии на его солюбилизированные амилопектиновые субстраты20. Однако понимание взаимодействий глюкан-SEX4 оказалось трудным из-за структурной сложности субстрата, более широкой специфики связывания и низкого сродства связывания между белком и его субстратами. Эти проблемы препятствовали возможности использования методов, обычно используемых в белково-лигандных взаимодействиях, таких как изотермическая титрационная калориметрия (ITC), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и анализы на основе иммуноферментного анализа (ИФА).
Интересно, что большая часть нашего понимания углеводно-белковых взаимодействий пришла из изучения лектинов. Конканавалин А (ConA) представляет собой семейство белков лектина бобовых, первоначально извлеченных из бобов. ConA связывает углеводы с высокой специфичностью, что выгодно для его использования в нацеливании и доставке лекарств. Широко изучено связывание ConA с различными субстратами, содержащими невосстанавливающие α-D-маннозил и α-D-глюкозил19,20. Коммерчески доступные гранулы сефарозы, связанные с ConA, обычно используются для очистки гликопротеинов и гликолипидов21. ConA связывается с этими глюканами через гидроксильные группы C3, C4 и C6 остатков глюкозы. Шарики ConA-сефарозы также успешно использовались для измерения связывания взаимодействия гликоген-белок и крахмал-белок22,23. В этом исследовании мы использовали шарики ConA-сефарозы для разработки анализа связывания для измерения специфичности связывания взаимодействия глюканфосфатазы и амилопектина.
Ранее для оценки способности связывания субстрата глюканфосфатазы использовался седиментационный анализна основе ConA 14,20,24. В этом исследовании та же стратегия была использована для разработки нового метода определения аффинности связывания глюкан-глюканфосфатазы и углеводных взаимодействий. Этот метод также имеет преимущество для исследования различных солюбилизированных углеводно-белковых взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление шариков ConA-Sepharose
- Сделайте 250 мл связывающего буфера, содержащего 67 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl2 и0,2 мМ CaCl2. Отрегулируйте рН с помощью 1 М раствора NaOH.
- Пипетка 250 мкл суспензии шариков ConA-сефарозы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугировать содержимое при 10 000 x g в течение 30 с при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: 250 мкл шариков ConA-сефарозы в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл необходимо для каждой концентрации амилопектина, используемой для анализа. - Добавьте 750 мкл связывающего буфера в каждую пробирку, содержащую 250 мкл шариков ConA-сефарозы. Центрифугируют пробирки при 10 000 x g в течение 1 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 2 раза, чтобы убедиться, что шарики должным образом промыты и уравновешены связующим буфером.
2. Приготовление растворов амилопектина
- Сделайте бульон из 10 мг/мл картофельного амилопектина. Амилопектин нерастворим в воде и может растворяться при нагревании. Для растворения добавьте 0,1 г картофельного амилопектина в 10 мл дистиллированной воды. Нагрейте суспензию на водяной бане при температуре 80 °C в течение 1 ч или до тех пор, пока раствор не перестанет мутнеть.
- Дайте раствору вернуться к комнатной температуре (RT) с повторным встряхиванием, чтобы избежать комкования.
- Спиртощелочная обработка является альтернативным методом растворения субстратов амилопектина. Чтобы растворить с помощью этого метода, выполните следующие действия.
- Суспендировать 0,5 г субстрата амилопектина в 5 мл 20% этанола и 5 мл 2 М NaOH. Энергично перемешивайте содержимое в течение 15-20 минут при РТ.
- Затем добавьте 10 мл воды и отрегулируйте рН раствора до 6,5, добавив 2 М HCl. Доведите объем полученного раствора до 50 мл дистиллированной водой, чтобы получить 10 мг/мл раствора амилопектина.
- Разбавьте 10 мг / мл раствора солюбилизированного амилопектина, чтобы получить серию из 2 мл разбавленных растворов амилопектина. Например, выполняют половинные разведения 10 мг / мл для получения ряда концентраций амилопектина (5 мг / мл, 2,5 мг / мл, 1,25 мг / мл, 0,625 мг / мл, 0,3125 мг / мл, 0,156 мг / мл, 0,078 мг / мл, 0,039 мг / мл, 0,019 мг / мл и 0 мг / мл).
3. Получение ConA-сефарозы: шарики амилопектина
- Добавьте 250 мкл каждого разбавленного раствора амилопектина в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 250 мкл шариков ConA-сефарозы, предварительно уравновешенных в связывающем буфере. Хорошо перемешайте содержимое. Пометьте пробирки соответствующей концентрацией амилопектина.
- Инкубировать содержимое на вращающемся колесе при температуре 4 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 20 минут не происходит никаких изменений в комплексе ConA-сефароза: амилопектин. 30-минутное время инкубации было выбрано путем изменения времени инкубации от 10 минут до 1 часа, чтобы обеспечить достижение равновесия. - Центрифугируют пробирки при 10 000 x g в течение 1 мин. Соберите надосадочную жидкость в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с новой маркировкой. Сохраните эти надосадочные фракции для проведения анализа D-глюкозы12 (кислотный гидролиз амилопектина с последующим УФ-определением глюкозы с помощью ферментативного анализа). Этот шаг необходим для того, чтобы убедиться, что весь амилопектин связан с шариками.
- Добавьте 750 мкл связывающего буфера в шарики ConA-сефарозы: амилопектина. Центрифугируют пробирки при 10 000 x g в течение 1 мин. Откажитесь от надосадочной жидкости, чтобы удалить все несвязанные молекулы амилопектина.
- Повторите шаг 3.4, чтобы обеспечить достаточную стирку. Каждая пробирка теперь содержит шарики ConA-сефарозы, связанные с различными количествами субстратов амилопектина.
4. Инкубация SEX4 с ConA-сефарозой: шариками амилопектина
- Смешайте 250 мкл шариков ConA-сефарозы: амилопектина со 100 мкл связывающего буфера, который включает 10 мкг белка SEX4, 10 мМ дитиотреитол (DTT) и 10 мкМ коктейль ингибитора протеазы (PIC). Обратите внимание, что общий объем в каждой пробирке составляет 350 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейль ингибитора протеазы добавляется в качестве меры предосторожности, чтобы избежать ненужной деградации SEX4. Это необязательный шаг. В этом анализе используется рекомбинантный белок Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4). Очищенный белок содержит N-концевую гистидиновую метку, необходимую для обнаружения белка посредством хемилюминесценции. Подробная информация об очистке глюканфосфатазы описана в предыдущих публикациях14,20,24. - Инкубируйте белок и суспензию шариков ConA-сефарозы: амилопектина при 4 ° C в течение 45 минут при осторожном вращении.
ПРИМЕЧАНИЕ: 45-минутное время инкубации выбрано для обеспечения равновесия для комплекса. - Центрифугируют пробирки при 10 000 x g в течение 1 мин. Пипеткой 50 мкл надосадочной жидкости осторожно с помощью геля загружают наконечник в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 20 мкл 4x красителя SDS-PAGE и 10 мкл воды в каждую пробирку, содержащую 50 мкл собранных надосадочных фракций. Нагрейте образцы до 95 °C в течение 10 минут. Сохраните эти примеры для запуска гелей SDS-PAGE. Убедитесь, что 10 новых пробирок с надписью «надосадочная жидкость (S)» имеют соответствующие концентрации субстрата.
- Добавьте 750 мкл связывающего буфера в шарики ConA-сефарозы: амилопектин: SEX4, чтобы удалить любой несвязанный белок из шариков. Центрифугируют пробирки при 10 000 x g в течение 1 мин. Повторите этот шаг еще раз, чтобы обеспечить правильную стирку. Откажитесь от надосадочной жидкости.
- Добавьте 20 мкл 4-кратного красителя SDS-PAGE и 80 мкл дистиллированной воды в пробирки, содержащие промытые шарики ConA-Sepharose:amilopectin:SEX4. Нагрейте образцы при 95 °C в течение 10 мин и центрифугу при 10 000 x g в течение 1 мин.
- Выбросьте гранулы и сохраните надосадочную жидкость для запуска гелей SDS-PAGE. Пипеткой 80 мкл надосадочной жидкости в новые пробирки и пометьте их как «гранулы (P)».
5. Запуск гелей SDS-PAGE
- Загрузите 40 мкл образцов несвязанного белка (изготовленных на этапе 2.3, помеченных S) в 4%-12% сборные полиакриламидные гелевые лунки от самой низкой концентрации субстрата до самой высокой, но оставьте первую полосу свободной для загрузки маркера молекулярной массы белка. Используйте второй гель для загрузки 10 связанных образцов белка, полученных на шаге 2.5 (помеченных как P).
- Добавьте свежеприготовленный 1x рабочий буфер SDS-PAGE в обе камеры аппарата. Запускайте гель при напряжении 150 В в течение 35 мин или до тех пор, пока передняя часть красителя не достигнет дна геля.
- Извлеките прогонный гель из аппарата и снимите прокладки и стеклянные пластины. Используйте отделенный гель для проведения анализа вестерн-блоттинга.
6. Вестерн-блоттинг для хемилюминесцентного детектирования14,15
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод может быть легко изменен / адаптирован в зависимости от западного оборудования для блоттинга, которое пользователи имеют в своих лабораториях.
- Сделайте 1 л буфера для переноса, содержащего 5,8 г трис-основания, 2,9 г глицина, 0,37 г SDS и 200 мл метанола.
- Перенесите разделенные по размеру белки из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану. Кратко соберите губки, фильтровальную бумагу, гель и нитроцеллюлозную мембрану в соответствии с западным протоколом переноса14,15. Работает при напряжении 70 В в течение 1 ч.
- Для предотвращения неспецифического связывания с белками инкубируют нитроцеллюлозную мембрану, содержащую белковый раствор 1%-5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) или молочного белка, в 50 мл буфера TBST (20 мМ Tris [pH 7,5], 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20) в течение 1 ч. Промойте мембрану 3 раза, используя буфер TBST, чтобы удалить несвязанный блокирующий раствор.
- Инкубируйте мембрану с антителом, связанным с пероксидазой хрена (HRP), специфичным для белка, меченного His, в течение 1 часа. Промойте мембрану 3 раза в буфере TBST, чтобы удалить все несвязанные антитела. Используйте разведение антител к TBST в соотношении 1:2000 для оптимальной воспроизводимости и чувствительности.
- Антитело, связанное с ферментом HRP, специфически связывается с гистидиновой меткой белка SEX4, что дает полосу в присутствии хемилюминесцентных реагентов. Для цифровой визуализации сделайте раствор из равных частей растворов хемилюминесцентной подложки (по 750 мкл каждый) в пробирке объемом 1,5 мл. Инкубируют мембрану не менее 5 мин в растворе.
- Поместите мембранный белок стороной вниз на сканер блоттинга и запустите программное обеспечение для сбора данных для количественного определения белка как в гранулах, так и в надосадочной фракциях.
7. Анализ данных
- Выполняйте количественные измерения сигнала с помощью программного обеспечения для сбора данных с помощью сканера блоттинга. Нормализуйте все количественные измерения в надосадочной и гранулированной фракциях к общему белковому нагруженному.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение позволяет количественно оценить интенсивность каждой белковой полосы в надосадочной и гранулированной фракциях. - В эксперименте по насыщению связывания постройте график процентного соотношения связанного с белком по сравнению с концентрацией амилопектина. Подгоните данные под Y = Bmax x X/(K D + X), используя программное обеспечение для анализа данных для расчета KD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Bmax - максимальное специфическое связывание, ось Y - процент связанного белка, а ось X - концентрация амилопектина.
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса седиментации ConA-сефарозы . (A) Приготовление шариков ConA-сефарозы. (B) Инкубация с субстратом амилопектина. (C) Инкубация с белком SEX4. (D) Разделение связанных и несвязанных белковых фракций путем центрифугирования. (E) Разделение белка с помощью SDS-PAGE. (F) Вестерн-блоттинг-анализ. (G) Хемилюминесцентное обнаружение белка SEX4 с меткой His. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одной из ключевых особенностей семейства белков глюканфосфатазы является их способность связываться с глюкановыми субстратами. Во-первых, связывающая способность SEX4 с шариками ConA-сефарозы: амилопектина была проанализирована с использованием SDS-PAGE (рис. 2A). Бычий сывороточный альбумин (BSA) служил отрицательным контролем для обнаружения любого неспецифического связывания белков с шариками ConA-сефарозы: амилопектина. Анализ белков SDS-PAGE показал наличие белка SEX4 во фракции гранул и BSA в надосадочной фракции. W278A, известный мутант SEX4 со значительно сниженной способностью связывания глюканов, также был включен в анализ. Мутант W278A появился в надосадочной фракции, что указывает на полезность и специфичность этого анализа для обнаружения глюкан-связывающей способности белков SEX4. В то время как SDS-PAGE визуализировал белки SEX4, были опасения по поводу чувствительности и использования малых глюканфосфатаз; Например, лектиновый белок ConA потенциально может мешать обнаружению небольших белков, таких как LSF2. Чтобы проверить, может ли этот метод обнаружить только глюканфосфатазы, было проведено вестерн-блоттинг с использованием антитела, специфичного к N-концевой гистидиновой метке. Действительно, наблюдалось значительное увеличение обнаружения SEX4, и метод специфичен для обнаружения глюканфосфатаз с N-концевой гистидиновой меткой (рис. 2B). Количественное измерение экспериментов по взаимодействию лигандов и белков требует проведения необходимого контроля для установления соответствующих концентраций лигандов и белков. Таким образом, затем был протестирован анализ совместного осаждения при трех различных концентрациях SEX4 (рис. 2C-E). В то время как 2 мкг SEX4 достаточно для визуализации с помощью хемилюминесцентного детектирования, использование 5 или 10 мкг SEX4 позволяет более точно обнаружить частичное связывание. Также было протестировано связывание SEX4 с различными концентрациями амилопектина (0,5 мг / мл, 1,0 мг / мл и 5 мг / мл). Эти результаты также указывают на повышенное связывание SEX4 с повышенной концентрацией амилопектина с насыщенным связыванием при 5 мг / мл амилопектина.
Для определения аффинности связывания амилопектина и белка дикого типа SEX4 инкубировали 10 мкг SEX4 с амилопектином (до 5 мг/мл) и определяли связывание при каждой концентрации (рис. 3А). Подгонка процентных данных, связанных с белками, к специфической модели связывания с одним сайтом далаKD 1,03 ± 0,23 мг / мл (рис. 3B). Кристаллическая структура белка дикого типа SEX4 отсутствует; вместо этого кристаллическая структура каталитически неактивного мутанта SEX4 C198S обнаруживает интерфейс связывания SEX4, состоящий из доменов DSP и углеводсвязывающей молекулы (CBM). Было определено, что аффинность связывания SEX4 C198S и взаимодействия амилопектина имеетKD 0,11 ± 0,05 мг / мл для мутантных белков C198S; в ~ 10 раз увеличил аффинность связывания по сравнению с белком дикого типа SEX4. Хотя точный механизм повышенного связывания C198S не понятен, интересно увидеть, как одноточечная мутация SEX4 приводит к значительному увеличению способности связывания глюканов.
Затем была оценена применимость этого метода для измерения связывания лафорина, LSF2, кукурузы (Zea mays) SEX4 и картофеля (Solanum tuberosum) SEX4 с амилопектином картофеля. Используя представленный здесь протокол, результаты показали, что лафорин, LSF2 и SEX4 из агрономически важных культур также дифференцированно связываются с амилопектином, что предполагает различные механизмы связывания для каждого белка (рис. 4A, B). В совокупности эти результаты показали успешную разработку метода определения субстратного связывания глюканфосфатазы с амилопектиновыми субстратами.
Рисунок 2: Визуализация фракций гранул (P) и надосадочной жидкости (S) SEX4 и оптимизация параметров анализа. (A) Визуализация 5 мкг белка SEX4 (34 кДа) в гранулах и надосадочных фракциях с использованием окрашивания SDS-PAGE и Coomassie. Белковые полосы при 25 кДа и ниже предназначены для белка ConA, прикрепленного к гранулам сефарозы. (B) Визуализация белков SEX4 в гранулах и надосадочных фракциях с помощью западного анализа. 5 мкг белка SEX4 было обнаружено с помощью антитела, разработанного для гистидиновой метки. (С-Е) Западный анализ проводился с использованием различных количеств белка SEX4 (2 мкг, 5 мкг и 10 мкг) и концентраций амилопектина (0,5 мг / мл, 1,0 мг / мл и 5,0 мг / мл). Для всех экспериментов использовали объем 250 мкл шариков и время инкубации 30 мин, чтобы обеспечить равновесное связывание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественный анализ седиментации in vitro. (A) Репрезентативные данные о надсадочном истощении и постепенном увеличении сигнала гранул белка дикого типа SEX4 по мере увеличения концентрации амилопектина с 0 мг/мл до 5 мг/мл. (B) Процент белка SEX4 дикого типа, связанного с различными количествами амилопектина, иммобилизованного на шариках ConA-сефарозы. Гранулы гранулировали при 10 000 x g в течение 1 мин, и как надосадочные белки, так и белки гранул были разделены SDS-PAGE, обнаружены западным анализом и количественно определены для измерения процентной границы. Данные представляют собой среднюю ± SD трех реплик. (C) Репрезентативные данные об истощении надосадочной жидкости и постепенном увеличении сигнала гранул белка SEX4 C198S по мере увеличения концентрации амилопектина с 0 мг/мл до 5 мг/мл. (D) Процент белка SEX4 C198S, связанного с различными количествами амилопектина, иммобилизованного на шариках ConA-сефарозы. Гранулы гранулировали при 10 000 x g в течение 1 мин, и как надосадочные белки, так и белки гранул были разделены SDS-PAGE, обнаружены западным анализом и количественно определены для измерения процентной границы. Данные представляют собой среднюю ± SD трех реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Субстратное связывание ортологов SEX4, лафорина, LSF2 с солюбилизированным амилопектином . (A) Репрезентативное связывание каждого белка с 5 мг / мл амилопектина, иммобилизованного в шариках ConA-сефарозы. (B) Процент связанного белка был рассчитан с использованием нормализованных сигналов хемилюминесценции, полученных для трех независимых экспериментов. Данные представляют собой среднее ± SD трех реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование демонстрирует успешную разработку нового седиментационного анализа in vitro , который позволяет определить аффинность связывания взаимодействий глюкан-глюканфосфатазы. В дизайне анализа используется специфическое связывание лектина ConA с глюканами через гидроксильные остатки глюкозы для косвенного захвата солюбилизированных углеводных субстратов на гранулах сефарозы. Это позволяет разделять связанные и несвязанные белковые фракции с помощью центрифугирования и определять аффинность связывания солюбилизированных глюкановых субстратов и глюканфосфатаз. Было обнаружено, что все протестированные глюканфосфатазы специфически связываются с амилопектином, при этом не обнаруживается связывание с шариками ConA-сефарозы в отсутствие амилопектина.
Эксперимент был проведен для измерения аффинности связывания с небольшим фиксированным количеством белка SEX4 и диапазоном концентраций амилопектина, прикрепленных к шарикам ConA-сефарозы. Избыток шариков ConA-сефарозы использовался для обеспечения связывания с шариками самой высокой концентрации амилопектина. Полное связывание амилопектина было проверено с помощью анализа глюкозы. Протокол, представленный в рукописи, использует количественное седиментирование для разделения связанных и несвязанных белковых фракций, а также гель-электрофорез и вестерн-анализ для измерения количества SEX4 в надосадочной жидкости по сравнению с количеством, связанным с шариками ConA-сефарозы: амилопектина. Количественное определение фракции гранул требует минимальной промывки, чтобы не нарушить равновесие связывания. Чтобы избежать недооценки фракции гранул, вместо того, чтобы исследовать гранулы, достаточно измерить концентрацию свободного SEX4 в надосадочной жидкости и вычислить разницу связанного комплекса SEX4:амилопектин.
Описанный здесь анализ седиментации in vitro определил дифференциальное сродство связывания белка дикого типа SEX4. Интересно, что определенное сродство связывания белка дикого типа SEX4 с использованием разработанного анализа седиментации in vitro находится в более высоком диапазоне сообщаемого значения, определенного с помощью анализа сдвига геля25. Анализ связывания должен быть чувствительным к более низким концентрациям субстрата и простым, тогда как анализ сдвига геля требует изготовления отдельных нативных гелей в присутствии различных количеств глюкановых субстратов. Этот трудоемкий метод ограничивает количество концентраций, которые могут быть протестированы, и ограниченный диапазон концентраций субстрата может быть протестирован. Вместо этого подготовка образцов выполняется быстро и надежно с помощью нашего анализа седиментации in vitro . Сравнение белка дикого типа SEX4 и мутанта SEX4 C198S показывает десятикратную разницу в аффинности связывания. В связи с этим данный анализ чувствителен для количественного и качественного определения связывания мутантных белков SEX4.
Белково-углеводные взаимодействия жизненно важны для многих важных биологических процессов, включая катализ, клеточную сигнализацию и распознавание. Они также привлекают все большее внимание из-за их важной роли в фармацевтической и пищевой промышленности. Рентгеновская кристаллография широко используется для получения белковых структур на атомном уровне. Однако структурная гетерогенность и гибкость углеводных субстратов затрудняют получение белковых структур, связанных с углеводами. В последнее время крио-ЭМ и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) также используются для определения структур углеводсвязывающих белков26. Несмотря на многочисленные достижения в области структурных методов с высоким разрешением, получение структур углеводно-белковых комплексов является сложной задачей. В результате экспериментально решено лишь ограниченное число белково-углеводных комплексных структур. Кроме того, кристаллические структуры дают только снимок белка при определенной конформации, а не динамическую природу связывания субстрата. В качестве альтернативы для измерения белково-углеводных взаимодействий используются несколько биофизических методов, включая изотермическую титрационную калориметрию (ITC) и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). Однако эти методы также не лишены ограничений. Одной из основных проблем при определении белково-углеводных взаимодействий является их относительно слабое взаимодействие по сравнению с другими белок-лигандными взаимодействиями. Взаимодействия в диапазоне от высокого микромолярного до низкого микромолярного диапазона значительно снижают удобство использования ITC и SPR. Косвенные методы, такие как анализы сдвига геля и вытягивания, привлекли значительное внимание для определения взаимодействий, которые трудно оценить другими методами25. Таким образом, этот анализ связывания является широко применимым подходом для чувствительных измерений белковых и растворимых углеводных взаимодействий.
Гликоген и крахмал являются основными молекулами хранения углеводов, состоящими из разветвленных полимеров глюкозы. Структура ветвления, гибкость и наличие различных микродоменов в крахмале и гликогене требуют, чтобы взаимодействующие белки принимали уникальные механизмы связывания субстрата. Большая часть понимания механизмов распознавания субстрата SEX4 пришла из рентгеновских кристаллографических исследований в сочетании со структурно-ориентированным мутагенезом. Чтобы дефосфорилировать крахмал, SEX4 должен взаимодействовать со значительно различающимися микродоменами гранулы крахмала, чтобы найти фосфаты для позиционного дефосфорилирования. Экспериментально по-прежнему сложно определить сродство связывания глюканфосфатаз, учитывая слабые взаимодействия между белком и глюканами, а также структурную гибкость и гетерогенность углеводов. В этой рукописи представлен метод определения сродства связывания глюканфосфатазно-углеводных взаимодействий с использованием анализа седиментации in vitro на основе конканавалина А (ConA). Глюканфосфатазы используют различные механизмы для связывания, локализации и дефосфорилирования углеводов. Ранее ITC использовался для измерения аффинности связывания лафорина и линейных олигосахаридных цепей. Однако ни одно исследование не выявило сродства связывания глюканфосфатаз с их физиологическими субстратами с помощью прямых методов, таких как ITC и SPR. Чтобы лучше понять полезность этого анализа для определения связывания субстрата глюканфосфатаз, было оценено связывание лафорина, LSF2 и SEX4 с амилопектином. Будущие исследования могут быть проведены для экспериментального определения сродства связывания всех глюканфосфатаз и их физиологически значимых глюкановых субстратов. Одним из важнейших этапов метода является определение оптимального времени инкубации и диапазона концентраций субстрата для анализа. Каждая глюканфосфатаза по-разному связывается с субстратом, и метод оптимизирован для SEX4. Важно провести первоначальные эксперименты по оптимизации, чтобы выяснить эти параметры. Еще одним ограничением является использование белка, меченного гистидином, для анализа. Однако, если антитела присутствуют к исследуемому белку, метод может быть легко оптимизирован для любого белка, взаимодействующего с глюканом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано премией Национального научного фонда MCB-2012074. Авторы благодарят доктора Крейга В. Вандера Кооя из Университета Флориды за ценные дискуссии и поддержку. Авторы также благодарят доктора Мэтью С. Джентри с факультета биохимии и молекулярной биологии Университета Флориды за его поддержку. Мы хотели бы поблагодарить доктора Сару Лагалвар, председателя программы неврологии колледжа Скидмор, за то, что она позволила нам использовать сканер блоттинга LICOR C-digit для визуализации вестерн-блоттинга.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
References
- Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
- Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
- Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
- Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
- Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
- Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
- Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
- Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
- Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
- Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
- Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
- Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
- Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
- Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
- Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
- Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
- Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
- Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
- Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
- Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
- Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
- Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
- Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
- Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).
