Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64700
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Skidmore College
* These authors contributed equally

Summary

تصف هذه الطريقة مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على الليكتين لتحديد تقارب الارتباط بين فوسفاتيز الجلوكان والأميلوبكتين. يمكن الاعتماد على اختبار الترسيب المشترك هذا لقياس ارتباط ركيزة الجلوكان الفوسفاتيز ويمكن تطبيقه على ركائز الجلوكان المختلفة القابلة للذوبان.

Abstract

تنتمي فوسفاتاز الجلوكان إلى عائلة أكبر من الفوسفاتاز ثنائية الخصوصية (DSP) التي تزيل الفسفور ركائز الجلوكان ، مثل الجليكوجين في الحيوانات والنشا في النباتات. تكشف الهياكل البلورية لفوسفاتيز الجلوكان مع ركائز الجلوكان النموذجية عن واجهات ربط جلوكان مميزة مصنوعة من DSP ومجالات ربط الكربوهيدرات. ومع ذلك ، فإن القياسات الكمية لتفاعلات الفوسفاتيز الجلوكان - الجلوكان مع الركائز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أساسية للفهم البيولوجي لعائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان وتنظيم استقلاب الطاقة. تشير هذه المخطوطة إلى اختبار ترسيب في المختبر قائم على Concanavalin A (ConA) مصمم للكشف عن تقارب ربط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان ضد ركائز الجلوكان المختلفة. كدليل على المفهوم ، تم تحديد ثابت التفكك (KD) لفوسفاتيز الجلوكان أرابيدوبسيس ثاليانا النشا الزائد 4 (SEX4) والأميلوبكتين. يوضح توصيف طفرات SEX4 والأعضاء الآخرين في عائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان فائدة هذا الفحص لتقييم الارتباط التفاضلي للتفاعلات بين البروتين والكربوهيدرات. توضح هذه البيانات مدى ملاءمة هذا الفحص لتوصيف مجموعة واسعة من البروتينات المتفاعلة مع النشا والجليكوجين.

Introduction

فوسفاتاز الجلوكان هي أعضاء في فصيلة فرعية متنوعة وظيفيا من الفوسفاتاز ثنائي الخصوصية (DSPs) داخل عائلة بروتين التيروزين الفوسفاتيز (PTP)1. تم العثور عليها في معظم أشكال الحياة ، بما في ذلك الكائنات الحية الضوئية المتباينة على نطاق واسع ، والبشر ، والفقاريات ، وبعض اللافقاريات والطلائعيات2،3،4. تحتوي النباتات على ثلاثة فوسفاتاز جلوكان معروفة: النشا الزائد 4 (SEX4) ، مثل الجنس four1 (LSF1) ، ومثل الجنس four2 (LSF2) 5،6،7. تظهر النباتات التي تفتقر إلى فوسفاتاز الجلوكان معدلات منخفضة من تدهور النشا المؤقت وتراكم النشا في الأوراق 8,9. لافورين هو العضو المؤسس لعائلة الفوسفاتيز الجلوكان التي تزيل الفسفوريلات الجليكوجين في الفقاريات والبشر 3,10. تؤدي طفرات اللافورين إلى مرض لافورا التنكسي العصبي ، وهو شكل صبغي جسدي متنحي قاتل من الصرع11. فوسفاتاز الجلوكان ضرورية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين والنشا وقد ظهرت كإنزيمات مهمة لتعديل محتوى النشا في النباتات وعلاج مرض لافورا التنكسي العصبي12,13. ألقت دراسات علم البلورات بالأشعة السينية الحديثة على فوسفاتاز الجلوكان مع ركائز الجلوكان النموذجية الضوء على ارتباط الركيزة والآلية التحفيزية لإزالة فسفرة الجلوكان14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن الفهم الحالي لكيفية ارتباط فوسفاتاز الجلوكان بركائزها الفسيولوجية غير مكتمل.

النشا عبارة عن بوليمر غير قابل للذوبان من الجلوكوز مصنوع من 80٪ -90٪ أميلوبكتين و 10٪ -20٪ أميلوز18. ركائز فوسفاتاز الجلوكان النباتية هي جزيئات الكربوهيدرات المفسفرة ، مثل حبيبات الجليكوجين والنشا. توجد بقايا الجلوكوزيل المفسفرة عند نسبة 1: 600 فوسفات: بقايا الجلوكوزيل. ومن المثير للاهتمام أن الفوسفات موجود فقط على جزيئات الأميلوبكتين19. يعمل النبات الرئيسي جلوكان فوسفاتيز SEX4 على حبيبات النشا لإزالة الفسفرة من جزيئات الأميلوبكتين. أظهرت البنية البلورية للأشعة السينية ل SEX4 جنبا إلى جنب مع دراسات الطفرات الموجهة بالهيكل خصائص الركيزة الفريدة ل SEX4 لمواقع مختلفة داخل بنية جلوكان15. لقد أظهرنا مؤخرا أنه لا يمكن ملاحظة النشاط ذي الصلة بيولوجيا ل SEX4 إلا عند العمل على ركائز الأميلوبكتين القابلة للذوبان20. ومع ذلك ، فقد ثبت أن فهم تفاعلات glucan-SEX4 أمر صعب بسبب التعقيد الهيكلي للركيزة ، وخصائص الربط الأوسع ، والصلات المنخفضة بين البروتين وركائزه. وقد أعاقت هذه القضايا القدرة على استخدام الأساليب المستخدمة بشكل شائع في تفاعلات البروتين والليجند، مثل قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC)، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والمقايسات القائمة على مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

ومن المثير للاهتمام أن الكثير من فهمنا للتفاعلات بين الكربوهيدرات والبروتين قد جاء من دراسة المحاضرات. Concanavalin A (ConA) هي عائلة ليكتين من البقوليات من البروتينات المستخرجة أصلا من حبة جاك. يربط ConA الكربوهيدرات بخصوصية عالية ، وهو أمر مفيد لاستخدامه في تطبيقات استهداف الأدوية وتسليمها. تمت دراسة ارتباط ConA بمجموعة متنوعة من الركائز التي تحتوي على α-D-mannosyl غير المختزل و α-D-glucosyl على نطاق واسع19,20. تستخدم حبات السيفاروز المرتبطة ب ConA المتاحة تجاريا بشكل شائع لتنقية البروتينات السكرية والجليكوليبيدات21. يرتبط ConA بهذه الجلوكان عبر مجموعات هيدروكسيل C3 و C4 و C6 من بقايا الجلوكوز. كما تم استخدام حبات ConA-Sepharose بنجاح لقياس ارتباط تفاعلات بروتين الجليكوجين والنشاوالبروتين 22,23. في هذه الدراسة ، استخدمنا حبات ConA-Sepharose لتطوير مقايسة ملزمة لقياس خصائص الارتباط لتفاعلات الجلوكان فوسفاتيز والأميلوبكتين.

في السابق ، تم استخدام مقايسة الترسيب القائمة على ConA لتقييم قدرة ربط ركيزة الفوسفاتيزالجلوكان 14،20،24. في هذه الدراسة ، تم استخدام نفس الاستراتيجية لتطوير طريقة جديدة لتحديد تقارب الارتباط بين الفوسفاتيز الجلوكان وتفاعلات الكربوهيدرات. هذه الطريقة لها أيضا ميزة للتحقيق في مختلف تفاعلات الكربوهيدرات والبروتين القابلة للذوبان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد حبات ConA-Sepharose

  1. اصنع 250 مل من مخزن مؤقت ملزم يحتوي على 67 مللي مول HEPES (درجة الحموضة 7.5) و 10 مللي مول MgCl 2 و 0.2 مللي مول CaCl2. اضبط الأس الهيدروجيني باستخدام محلول 1 M NaOH.
  2. ماصة 250 ميكرولتر من تعليق حبة ConA-Sepharose في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي محتويات في 10000 × غرام لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى 250 ميكرولتر من حبات ConA-Sepharose في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لكل تركيز أميلوبكتين يستخدم في الفحص.
  3. أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى كل أنبوب يحتوي على 250 ميكرولتر من حبات ConA-Sepharose. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. إزالة الطاف. كرر هذه الخطوة 2x للتأكد من غسل الخرزات بشكل مناسب وتوازنها مع المخزن المؤقت للربط.

2. إعداد حلول الأميلوبكتين

  1. اصنع محلول مرق من 10 مجم / مل من أميلوبكتين البطاطس. الأميلوبكتين غير قابل للذوبان في الماء ويمكن إذابته بالحرارة. للذوبان ، أضف 0.1 غرام من أميلوبكتين البطاطس إلى 10 مل من الماء المقطر. سخني المعلق في حمام مائي على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو حتى يختفي المحلول من الغيوم.
  2. اسمح للمحلول بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، مع الدوامة المتكررة لتجنب التكتل.
  3. العلاج القلوي للكحول هو طريقة بديلة لإذابة ركائز الأميلوبكتين. للذوبان باستخدام هذه الطريقة ، اتبع الخطوات أدناه.
    1. تعليق 0.5 غرام من الركيزة أميلوبكتين في 5 مل من الإيثانول 20 ٪ و 5 مل من 2 M هيدروكسيد الصوديوم. حرك المحتويات بقوة لمدة 15-20 دقيقة في RT.
    2. بعد ذلك ، أضف 10 مل من الماء ، واضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 6.5 بإضافة 2 M HCl. ارفع حجم المحلول الناتج إلى 50 مل بالماء المقطر لعمل محلول أميلوبكتين 10 مجم / مل.
  4. قم بتخفيف محلول الأميلوبكتين المذاب 10 مجم / مل لعمل سلسلة من 2 مل من محاليل الأميلوبكتين المخففة. على سبيل المثال ، قم بإجراء تخفيفات نصف 10 مجم / مل لإعداد سلسلة من تركيزات الأميلوبكتين (5 مجم / مل ، 2.5 مجم / مل ، 1.25 مجم / مل ، 0.625 مجم / مل ، 0.3125 مجم / مل ، 0.156 مجم / مل ، 0.078 مجم / مل ، 0.039 مجم / مل ، 0.019 مجم / مل ، و 0 مجم / مل).

3. إعداد ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين

  1. أضف 250 ميكرولتر من كل محلول أميلوبكتين مخفف إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل تحتوي على 250 ميكرولتر من حبات ConA-Sepharose المتوازنة مسبقا في مخزن مؤقت ملزم. خلط المحتويات جيدا. قم بتسمية الأنابيب بتركيز الأميلوبكتين المقابل.
  2. احتضان المحتويات على عجلة دوارة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: لا يوجد أي تغيير في ConA-Sepharose: مركب مرتبط بالأميلوبكتين بمرور الوقت بعد 20 دقيقة. تم اختيار وقت الحضانة البالغ 30 دقيقة من خلال أوقات حضانة متفاوتة من 10 دقائق إلى 1 ساعة لضمان الوصول إلى التوازن.
  3. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة. اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل تم تسميته حديثا. احفظ هذه الأجزاء الطافية لإجراء مقايسة الجلوكوزD 12 (التحلل المائي الحمضي للأميلوبكتين متبوعا بتحديد الجلوكوز بالأشعة فوق البنفسجية عن طريق الفحص الأنزيمي). هذه الخطوة ضرورية لضمان ارتباط كل الأميلوبكتين بالخرز.
  4. أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة. تخلص من المادة الطافية لإزالة أي جزيئات أميلوبكتين غير مرتبطة.
  5. كرر الخطوة 3.4 لضمان الغسيل الكافي. يحتوي كل أنبوب الآن على حبات ConA-Sepharose مرتبطة بكميات متفاوتة من ركائز الأميلوبكتين.

4. احتضان SEX4 مع ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين

  1. امزج 250 ميكرولتر من ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط الذي يتضمن 10 ميكروغرام من بروتين SEX4 ، و 10 مللي مول ديثيوثريتول (DTT) ، و 10 ميكرومتر كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (PIC). لاحظ أن الحجم الكلي في كل أنبوب هو 350 ميكرولتر.
    ملاحظة: يضاف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني كخطوة احترازية لتجنب أي تدهور غير ضروري ل SEX4. هذه خطوة اختيارية. في هذا الفحص ، يتم استخدام البروتين المؤتلف Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4). يحتوي البروتين المنقى على علامة الهستيدين N-terminal اللازمة للكشف عن البروتين عن طريق التلألؤ الكيميائي. تم وصف معلومات مفصلة عن تنقية الفوسفاتيز الجلوكان في المنشورات السابقة14،20،24.
  2. احتضان البروتين و ConA-Sepharose: تعليق حبة الأميلوبكتين عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة مع دوران لطيف.
    ملاحظة: يتم اختيار وقت الحضانة البالغ 45 دقيقة لضمان الوصول إلى التوازن للمجمع.
  3. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة. ماصة 50 ميكرولتر من المادة الطافية بعناية باستخدام طرف تحميل هلام في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. أضف 20 ميكرولتر من صبغة SDS-PAGE 4x و 10 ميكرولتر من الماء إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من الكسور الطافية التي تم جمعها. سخني العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حفظ هذه العينات لتشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE. تأكد من أن 10 أنابيب جديدة تحمل علامة "طافية (S)" تحتوي على تركيزات الركيزة المقابلة.
  4. أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين: SEX4 لإزالة أي بروتين غير منضم من الخرزات. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرة أخرى لضمان الغسيل المناسب. تخلص من المادة الطافية.
  5. أضف 20 ميكرولتر من صبغة 4x SDS-PAGE و 80 ميكرولتر من الماء المقطر في الأنابيب التي تحتوي على ConA-Sepharose المغسول: أميلوبكتين: حبات SEX4. تسخين العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وأجهزة الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة.
  6. تخلص من الحبيبات واحفظ المادة الطافية لتشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE. ماصة 80 ميكرولتر من المادة الطافية في أنابيب جديدة وتسميتها "بيليه (P)".

5. تشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE

  1. قم بتحميل 40 ميكرولتر من عينات البروتين غير المنضمة (المصنوعة في الخطوة 2.3 ، المسمى S) في آبار جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب بنسبة 4٪ -12٪ من أدنى تركيز للركيزة إلى أعلى تركيز ، ولكن احتفظ بالممر الأول خاليا لتحميل علامة الوزن الجزيئي للبروتين. استخدم هلاما ثانيا لتحميل 10 عينات بروتين مرتبطة مصنوعة في الخطوة 2.5 (المسمى P).
  2. أضف مخزن مؤقت تشغيل 1x SDS-PAGE معد حديثا إلى غرفتي الجهاز. قم بتشغيل الجل على حرارة 150 فولت لمدة 35 دقيقة أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل.
  3. قم بإزالة جل التشغيل من الجهاز وإزالة الفواصل والألواح الزجاجية. استخدم الجل المنفصل لإجراء تحليل اللطخة الغربية.

6. النشاف الغربي للكشف عن التلألؤ الكيميائي14,15

ملاحظة: يمكن تعديل / تكييف هذه الطريقة بسهولة اعتمادا على معدات النشاف الغربية التي يمتلكها المستخدمون في مختبراتهم.

  1. اصنع 1 لتر من المخزن المؤقت للنقل يحتوي على 5.8 جم من قاعدة Tris ، و 2.9 جم من الجلايسين ، و 0.37 جم من SDS ، و 200 مل من الميثانول.
  2. نقل البروتينات المفصولة الحجم من هلام بولي أكريلاميد إلى غشاء النيتروسليلوز. قم بتجميع الإسفنج وأوراق الترشيح والهلام وغشاء النيتروسليلوز لفترة وجيزة وفقا لبروتوكول النقل الغربي14،15. تشغيل في 70 فولت لمدة 1 ساعة.
  3. لمنع ارتباط البروتين غير النوعي ، احتضان غشاء النيتروسليلوز الذي يحتوي على محلول البروتين من 1٪ -5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) أو بروتين الحليب في 50 مل من المخزن المؤقت TBST (20 mM Tris [pH 7.5] ، 150 mM NaCl ، 0.1٪ Tween 20) لمدة 1 ساعة. اغسل الغشاء 3x باستخدام المخزن المؤقت TBST لإزالة أي محلول حظر غير منضم.
  4. احتضان الغشاء بجسم مضاد مرتبط ببيروكسيديز الفجل (HRP) خاص بالبروتين الموسوم به لمدة 1 ساعة. اغسل الغشاء 3x في المخزن المؤقت TBST لإزالة أي أجسام مضادة غير منضمة. استخدم تخفيفا بنسبة 1: 2000 من الجسم المضاد ل TBST للحصول على التكاثر والحساسية المثلى.
  5. يرتبط الجسم المضاد المرتبط بإنزيم HRP على وجه التحديد بعلامة الهستيدين لبروتين SEX4 ، والتي تنتج شريطا في وجود كواشف التلألؤ الكيميائي. للتصوير الرقمي ، اصنع محلولا لأجزاء متساوية من محاليل الركيزة الكيميائية (750 ميكرولتر لكل منهما) في أنبوب سعة 1.5 مل. احتضان الغشاء لمدة 5 دقائق على الأقل في المحلول.
  6. ضع جانب البروتين الغشائي لأسفل على ماسح اللطخة وقم بتشغيل برنامج الاستحواذ لتحديد كمية البروتين في كل من الكسور الحبيبية والطافية.

7. تحليل البيانات

  1. قم بإجراء قياسات الإشارة الكمية باستخدام برنامج الاستحواذ مع ماسح اللطخة. تطبيع جميع القياسات الكمية في الأجزاء الطافية والحبيبات إلى إجمالي البروتين المحمل.
    ملاحظة: يسمح البرنامج بتحديد شدة كل شريط بروتين في كسور الطافية والحبيبات.
  2. في تجربة الربط المشبع، ارسم النسبة المئوية لتركيز البروتين المرتبط مقابل تركيز الأميلوبكتين. قم بملاءمة البيانات مع Y = Bmax x X / (K D + X) ، باستخدام برنامج تحليل البيانات لحساب KD.
    ملاحظة: Bmax هو الحد الأقصى للربط المحدد ، والمحور Y هو النسبة المئوية للبروتين المرتبط ، والمحور X هو تركيز الأميلوبكتين.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل مقايسة ترسيب ConA-Sepharose . (أ) تحضير حبات ConA-Sepharose. ب: الحضانة مع ركيزة الأميلوبكتين. ج: الحضانة ببروتين SEX4. د: فصل أجزاء البروتين المربوطة وغير المرتبطة عن طريق الطرد المركزي. (ه) فصل البروتين من خلال SDS-PAGE. (و) تحليل اللطخة الغربية. (ز) الكشف عن التلألؤ الكيميائي لبروتين SEX4 الموسوم به. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

واحدة من السمات الرئيسية لعائلة بروتينات الفوسفاتيز الجلوكان هي قدرتها على الارتباط بركائز الجلوكان. أولا ، تم تحليل قدرة ربط SEX4 ب ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين باستخدام SDS-PAGE (الشكل 2A). كان ألبومين مصل الأبقار (BSA) بمثابة عنصر تحكم سلبي للكشف عن أي ارتباط غير محدد للبروتينات بخرز ConA-Sepharose: الأميلوبكتين. أظهر تحليل SDS-PAGE للبروتينات وجود بروتين SEX4 في جزء الحبيبات و BSA في الجزء الطافي. كما تم تضمين W278A ، وهو متحولة SEX4 معروفة مع قدرة ربط جلوكان منخفضة بشكل كبير ، في الفحص. ظهر متحولة W278A في الجزء الطافي ، مما يشير إلى فائدة وخصوصية هذا الفحص للكشف عن قدرة ربط الجلوكان لبروتينات SEX4. بينما تصور SDS-PAGE بروتينات SEX4 ، كان هناك قلق بشأن حساسية واستخدام فوسفاتاز الجلوكان الصغيرة. على سبيل المثال ، يمكن أن يتداخل بروتين ConA lectin مع اكتشاف البروتينات الصغيرة مثل LSF2. لاختبار ما إذا كانت هذه الطريقة يمكن أن تكتشف فقط فوسفاتاز الجلوكان ، تم إجراء لطخة غربية باستخدام جسم مضاد خاص بعلامة الهستيدين N-terminal. في الواقع ، كانت هناك زيادة كبيرة في الكشف عن SEX4 ، والطريقة محددة للكشف عن فوسفاتاز الجلوكان بعلامة الهستيدين N-terminal (الشكل 2B). يتطلب القياس الكمي لتجارب تفاعل البروتين الليجند إجراء ضوابط أساسية لتحديد تركيزات الرباط والبروتين المناسبة. لذلك ، تم اختبار مقايسة الترسيب المشترك بعد ذلك بثلاثة تركيزات مختلفة من SEX4 (الشكل 2C-E). في حين أن 2 ميكروغرام من SEX4 كافية للتصور عن طريق الكشف عن التلألؤ الكيميائي ، فإن استخدام 5 أو 10 ميكروغرام من SEX4 يسمح باكتشاف أكثر دقة للربط الجزئي. كما تم اختبار ارتباط SEX4 ضد تركيزات الأميلوبكتين المتفاوتة (0.5 مجم / مل ، 1.0 مجم / مل ، و 5 مجم / مل). تشير هذه النتائج أيضا إلى زيادة ارتباط SEX4 مع زيادة تركيز الأميلوبكتين ، مع الارتباط المشبع عند 5 مجم / مل من الأميلوبكتين.

لتحديد تقارب الارتباط للأميلوبكتين والبروتين البري SEX4 ، تم تحضين 10 ميكروغرام من SEX4 مع الأميلوبكتين (حتى 5 ملغ / مل) ، وتم تحديد الارتباط عند كل تركيز (الشكل 3 أ). أعطى ملاءمة البيانات المرتبطة بالبروتين في المائة لنموذج الربط المحدد في موقع واحد KD من 1.03 ± 0.23 مجم / مل (الشكل 3 ب). لا يوجد هيكل بلوري متاح للبروتين البري SEX4. بدلا من ذلك ، يكشف التركيب البلوري لمتحولة SEX4 C198S غير النشطة تحفيزيا عن واجهة الربط ل SEX4 ، المصنوعة من مجالات DSP وجزيء ربط الكربوهيدرات (CBM). تم تحديد تقارب الارتباط لتفاعل SEX4 C198S والأميلوبكتين ليكون KD من 0.11 ± 0.05 ملغ / مل للبروتينات الطافرة C198S. أ ~ 10 مرات زيادة تقارب الربط مقارنة بالبروتين من النوع البري SEX4. في حين أن الآلية الدقيقة لزيادة الارتباط ل C198S غير مفهومة ، فمن المثير للاهتمام أن نرى كيف تؤدي طفرة أحادية النقطة في SEX4 إلى زيادة كبيرة في قدرة ربط الجلوكان.

بعد ذلك ، تم تقييم قابلية تطبيق هذه الطريقة لقياس ارتباط اللافورين ، LSF2 ، الذرة (Zea mays) SEX4 ، والبطاطس (Solanum tuberosum) SEX4 ضد أميلوبكتين البطاطس. باستخدام البروتوكول المقدم هنا ، أظهرت النتائج أن laforin و LSF2 و SEX4 من المحاصيل المهمة زراعيا ترتبط أيضا بشكل تفاضلي بالأميلوكتين ، مما يشير إلى آليات ربط مختلفة لكل بروتين (الشكل 4 أ ، ب). بشكل جماعي ، كشفت هذه النتائج عن تطوير طريقة ناجحة لتحديد ارتباط الركيزة من فوسفاتيز الجلوكان مع ركائز الأميلوبكتين.

Figure 2
الشكل 2: تصور كسور الحبيبات (P) والأجزاء الطافية (S) SEX4 وتحسين معلمات الفحص. (أ) تصور 5 ميكروغرام من بروتين SEX4 (34 كيلو دالتون) في الحبيبات والكسور الطافية باستخدام تلطيخ SDS-PAGE و Coomassie. نطاقات البروتين عند 25 كيلو دالتون وأقل مخصصة لبروتين ConA المرتبط بخرز السيفاروز. (ب) تصور بروتينات SEX4 في الحبيبات والكسور الطافية من خلال التحليل الغربي. تم الكشف عن 5 ميكروغرام من بروتين SEX4 عبر جسم مضاد تم تطويره لعلامة الهستيدين. (جيم - ه) تم إجراء التحليل الغربي باستخدام كميات متفاوتة من بروتين SEX4 (2 ميكروغرام ، 5 ميكروغرام ، و 10 ميكروغرام) وتركيزات الأميلوبكتين (0.5 ملغ / مل ، 1.0 ملغ / مل ، و 5.0 ملغ / مل). تم استخدام حجم 250 ميكرولتر من الخرز ووقت حضانة مدته 30 دقيقة لجميع التجارب لضمان ربط التوازن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مقايسة الترسيب الكمي في المختبر. (أ) بيانات تمثيلية لاستنفاد المواد الطافية والزيادة التدريجية في إشارة الحبيبات لبروتين SEX4 البري حيث زاد تركيز الأميلوبكتين من 0 ملغم / مل إلى 5 ملغم / مل. (ب) النسبة المئوية للبروتين البري SEX4 المرتبط بكميات متفاوتة من الأميلوبكتين المتجمد على حبات ConA-Sepharose. تم تكوير الخرزات عند 10000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتم فصل كل من البروتينات الطافية والحبيبات بواسطة SDS-PAGE ، وتم اكتشافها بواسطة التحليل الغربي ، وقياسها لقياس النسبة المئوية المقيدة. تمثل البيانات متوسط ± SD لثلاث نسخ متماثلة. (ج) بيانات تمثيلية لاستنفاد المواد الطافية والزيادة التدريجية في إشارة الحبيبات لبروتين SEX4 C198S حيث زاد تركيز الأميلوبكتين من 0 ملغم / مل إلى 5 ملغم / مل. (د) النسبة المئوية لبروتين SEX4 C198S المرتبط بكميات متفاوتة من الأميلوبكتين المتجمد على حبات ConA-Sepharose. تم تكوير الخرزات عند 10000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتم فصل كل من البروتينات الطافية والحبيبات بواسطة SDS-PAGE ، وتم اكتشافها بواسطة التحليل الغربي ، وقياسها لقياس النسبة المئوية المقيدة. تمثل البيانات متوسط ± SD لثلاث نسخ متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ربط الركيزة من تقويم SEX4 ، لافورين ، LSF2 ضد الأميلوبكتين القابل للذوبان . (أ) الربط التمثيلي لكل بروتين يحتوي على 5 ملغم/مل من الأميلوبكتين يجمد في حبات ConA-Sepharose. (ب) حسبت النسبة المئوية للبروتين المرتبط باستخدام إشارات التلألؤ الكيميائي الطبيعية التي تم الحصول عليها لثلاث تجارب مستقلة. تمثل البيانات متوسط ± SD لثلاث نسخ متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه الدراسة التطور الناجح لمقايسة ترسيب جديدة في المختبر تسمح بتحديد تقارب الارتباط لتفاعلات الفوسفاتيز الجلوكان والجلوكان. يستفيد تصميم الفحص من الارتباط المحدد لليكتين كونا بالجلوكان عبر بقايا هيدروكسيل الجلوكوز لالتقاط ركائز الكربوهيدرات القابلة للذوبان بشكل غير مباشر على حبات السيفاروز. وهذا يسمح بفصل كسور البروتين المرتبطة وغير المنضمة عن طريق الطرد المركزي وتحديد تقارب الربط لركائز الجلوكان القابلة للذوبان وفوسفاتاز الجلوكان. تم العثور على جميع فوسفاتاز الجلوكان التي تم اختبارها لترتبط على وجه التحديد بالأميلوبكتين ، مع عدم وجود ارتباط يمكن اكتشافه بخرز ConA-Sepharose في غياب الأميلوبكتين.

أجريت التجربة لقياس تقارب الارتباط بكمية صغيرة وثابتة من بروتين SEX4 ومجموعة من تركيزات الأميلوبكتين المرتبطة بخرز ConA-Sepharose. تم استخدام فائض من حبات ConA-Sepharose لضمان أعلى تركيز للأميلوبكتين المرتبط بالخرز. تم اختبار الارتباط الكامل للأميلوبكتين عن طريق فحص الجلوكوز. يستخدم البروتوكول المقدم في المخطوطة الترسيب الكمي لفصل أجزاء البروتين المرتبطة وغير المنضمة ، بالإضافة إلى الرحلان الكهربائي الهلامي والتحليل الغربي لقياس كمية SEX4 في المادة الطافية مقارنة بالكمية المرتبطة ب ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين. يتطلب تحديد جزء الحبيبات الحد الأدنى من الغسيل حتى لا يزعج توازن الربط. لتجنب أي تقليل من شأن جزء الحبيبات ، بدلا من فحص الحبيبات ، يكفي قياس تركيز SEX4 الحر في المادة الطافية وحساب الفرق في مركب SEX4: amylopectin المرتبط.

حدد اختبار الترسيب في المختبر الموصوف هنا تقارب الارتباط التفاضلي للبروتين من النوع البري SEX4. ومن المثير للاهتمام ، أن تقارب الارتباط المحدد للبروتين البري SEX4 باستخدام مقايسة الترسيب المختبرية المطورة تقع ضمن النطاق الأعلى للقيمة المبلغ عنها المحددة باستخدام مقايسة إزاحة الهلام25. يجب أن يكون اختبار الربط حساسا لتركيزات الركيزة المنخفضة ومباشرا ، في حين أن مقايسة إزاحة الهلام تتطلب صنع مواد هلامية أصلية فردية في وجود كميات متفاوتة من ركائز الجلوكان. تحد هذه الطريقة التي تستغرق وقتا طويلا من عدد التركيزات التي يمكن اختبارها ، ويمكن اختبار نطاق تركيز محدود للركيزة. بدلا من ذلك ، يكون تحضير العينة سريعا وموثوقا به من خلال مقايسة الترسيب في المختبر . تكشف مقارنة البروتين البري SEX4 وطفرة SEX4 C198S عن اختلاف تقارب ملزم بعشرة أضعاف. في هذا الصدد ، فإن هذا الفحص حساس لتحديد ارتباط البروتينات الطافرة SEX4 كميا ونوعيا.

تعد تفاعلات البروتين والكربوهيدرات حيوية للعديد من العمليات البيولوجية المهمة ، بما في ذلك التحفيز وإشارات الخلية والتعرف. كما أنها تكتسب اهتماما متزايدا بسبب أدوارها المهمة في الصناعات الدوائية والغذائية. يستخدم علم البلورات بالأشعة السينية على نطاق واسع للحصول على هياكل البروتين على المستوى الذري. ومع ذلك ، فإن عدم التجانس الهيكلي والمرونة لركائز الكربوهيدرات تجعل من الصعب الحصول على هياكل البروتين المرتبطة بالكربوهيدرات. كما تم استخدام التحليل الطيفي بالتبريد EM والرنين المغناطيسي النووي (NMR) مؤخرا لتحديد هياكل البروتينات المرتبطة بالكربوهيدرات26. على الرغم من التطورات العديدة في التقنيات الهيكلية عالية الدقة ، من الصعب الحصول على هياكل مجمعات الكربوهيدرات والبروتين. نتيجة لذلك ، تم حل عدد محدود فقط من الهياكل المعقدة للبروتين والكربوهيدرات تجريبيا. علاوة على ذلك ، توفر الهياكل البلورية فقط لقطة للبروتين عند شكل معين ، وليس الطبيعة الديناميكية لربط الركيزة. بدلا من ذلك ، يتم استخدام العديد من التقنيات الفيزيائية الحيوية ، بما في ذلك قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) ورنين البلازمون السطحي (SPR) ، لقياس تفاعلات البروتين والكربوهيدرات27. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لا تخلو من القيود. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في تحديد تفاعلات البروتين والكربوهيدرات في تفاعلاتها الضعيفة نسبيا مقارنة بتفاعلات البروتين والليجند الأخرى. تقلل التفاعلات داخل نطاق الميكرومولار العالي إلى النطاق المنخفض من قابلية استخدام ITC و SPR بشكل كبير. اكتسبت الطرق غير المباشرة ، مثل إزاحة الهلام ومقايسات السحب ، اهتماما كبيرا لتحديد التفاعلات التي يصعب تقييمها بطرق أخرى25. لذلك ، فإن اختبار الربط هذا هو نهج قابل للتطبيق على نطاق واسع للقياسات الحساسة للبروتين وتفاعلات الكربوهيدرات القابلة للذوبان.

الجليكوجين والنشا هما جزيئان رئيسيان لتخزين الكربوهيدرات مصنوعان من بوليمرات متفرعة من الجلوكوز. يتطلب نمط التفرع والمرونة ووجود مجالات دقيقة مختلفة داخل النشا والجليكوجين بروتينات متفاعلة لاعتماد آليات ربط الركيزة الفريدة. لقد جاء الكثير من الفهم لآليات التعرف على الركيزة في SEX4 من دراسات البلورات بالأشعة السينية إلى جانب الطفرات الموجهة بالهيكل. لإزالة نشا الفسفرة ، يجب أن يتفاعل SEX4 مع مجالات دقيقة مختلفة بشكل كبير من حبيبات النشا لتحديد موقع الفوسفات لإزالة الفسفرة الخاصة بالموضع. من الناحية التجريبية ، لا يزال من الصعب تحديد الصلات الملزمة لفوسفاتاز الجلوكان ، نظرا للتفاعلات الضعيفة بين البروتين والجلوكان والمرونة الهيكلية وعدم تجانس الكربوهيدرات. تقدم هذه المخطوطة طريقة لتحديد الصلات الملزمة لتفاعلات الفوسفاتيز والكربوهيدرات الجلوكان باستخدام مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على Concanavalin A (ConA). تستخدم فوسفاتاز الجلوكان آليات مميزة لربط الكربوهيدرات وتحديد موقعها وإزالة الفسفرة. في السابق ، تم استخدام ITC لقياس تقارب الارتباط لسلاسل اللافورين وقليل السكاريد الخطي. ومع ذلك ، لم تكشف أي دراسة عن الصلات الملزمة لفوسفاتاز الجلوكان مع ركائزها الفسيولوجية عبر تقنيات مباشرة مثل ITC و SPR. لفهم فائدة هذا الفحص بشكل أفضل لتحديد ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان ، تم تقييم ارتباط laforin و LSF2 و SEX4 ضد الأميلوبكتين. يمكن إجراء دراسات مستقبلية لتحديد تقارب الارتباط لجميع فوسفاتاز الجلوكان وركائز الجلوكان ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة للطريقة في تحديد أوقات الحضانة المثلى ونطاق تركيز الركيزة للفحص. يرتبط كل فوسفاتيز جلوكان بشكل مختلف مع الركيزة ، ويتم تحسين الطريقة ل SEX4. من المهم إجراء تجارب التحسين الأولية لمعرفة هذه المعلمات. أحد القيود الأخرى هو استخدام البروتين الموسوم بالهستيدين للفحص. ومع ذلك ، إذا كانت الأجسام المضادة موجودة لبروتين الدراسة ، فيمكن تحسين الطريقة بسهولة لأي بروتين متفاعل مع الجلوكان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل جائزة المؤسسة الوطنية للعلوم MCB-2012074. يشكر المؤلفون الدكتور كريج دبليو فاندر كوي من قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فلوريدا على المناقشات والدعم القيمين. كما يشكر المؤلفون الدكتور ماثيو س. جينتري من قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فلوريدا على دعمه. نود أن نشكر الدكتورة سارة لاجالوار ، رئيسة برنامج علم الأعصاب في كلية سكيدمور ، على السماح لنا باستخدام ماسح اللطخة LICOR C-digit لتصوير البقع الغربية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP Therm Fisher Scientific MA1-21315-HRP
Biorad gel electrophoresis and Western blot kit Biorad  1703930
Calcium chloride Sigma-Aldrich 208291
C-Digit blot scanner LICOR 3600-00 Blot scanner
Complete protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836170001
Concanavalin A-sepharose beads Sigma-Aldrich C9017 This product contains  in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol 
Centrifuge Eppendorf  5425R
Glycine Fisher Scientific BP381-5
GraphPad Prism 8.0 software GraphPad  Version 8.0 Data analysis software 
HEPES Sigma-Aldrich H8651
Image Studio LICOR 3600-501 Acquisition Software
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2670
Methanol Fisher Scientific A452SK-4
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific PI28312
Potato amylopectin Sigma-Aldrich A8515
Precast SDSPAGE Gels Genscript M00653S
Tris base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Fisher Scientific MP1TWEEN201
Westernsure premium chemiluminescence substrate  LI-COR  926-95000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
  2. Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
  3. Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
  4. Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
  5. Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
  6. Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
  7. Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
  8. Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
  9. Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
  10. Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
  11. Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
  12. Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
  13. Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
  14. Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
  15. Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
  16. Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
  17. Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
  18. Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
  19. Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
  20. Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
  21. Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
  22. Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
  23. Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
  24. Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
  25. Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
  26. Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
  27. Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).

Tags

التراجع، العدد 190،
مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolpaw, E. M., Frenett, M. L., Mak,… More

Wolpaw, E. M., Frenett, M. L., Mak, C. A., Zwanger, S. M., Raththagala, M. Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases. J. Vis. Exp. (190), e64700, doi:10.3791/64700 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter