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Biochemistry

ग्लूकन फॉस्फेटेस के सब्सट्रेट बाइंडिंग को मापने के लिए कॉनकानावेलिन ए-आधारित अवसादन परख

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64700
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Skidmore College
* These authors contributed equally

Summary

यह विधि ग्लूकन फॉस्फेट और एमाइलोपेक्टिन के बाध्यकारी संबंध को निर्धारित करने के लिए एक लेक्टिन-आधारित इन विट्रो अवसादन परख का वर्णन करती है। यह सह-अवसादन परख ग्लूकन फॉस्फेट सब्सट्रेट बाइंडिंग को मापने के लिए विश्वसनीय है और इसे विभिन्न घुलनशील ग्लूकेन सब्सट्रेट्स पर लागू किया जा सकता है।

Abstract

ग्लूकन फॉस्फेटेस दोहरी विशिष्टता फॉस्फेटेस (डीएसपी) के बड़े परिवार से संबंधित हैं जो जानवरों में ग्लाइकोजन और पौधों में स्टार्च जैसे ग्लूकेन सब्सट्रेट्स को डीफॉस्फोराइलेट करते हैं। मॉडल ग्लूकन सब्सट्रेट्स के साथ ग्लूकन फॉस्फेट की क्रिस्टल संरचनाएं डीएसपी और कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग डोमेन से बने अलग-अलग ग्लूकेन-बाइंडिंग इंटरफेस को प्रकट करती हैं। हालांकि, शारीरिक रूप से प्रासंगिक सब्सट्रेट्स के साथ ग्लूकन-ग्लूकन फॉस्फेट इंटरैक्शन के मात्रात्मक माप एंजाइमों के ग्लूकन फॉस्फेट परिवार की जैविक समझ और ऊर्जा चयापचय के विनियमन के लिए मौलिक हैं। यह पांडुलिपि एक कॉनकानावेलिन ए (कोना) आधारित इन विट्रो अवसादन परख की रिपोर्ट करती है जिसे विभिन्न ग्लूकेन सब्सट्रेट्स के खिलाफ ग्लूकेन फॉस्फेटेस के सब्सट्रेट बाइंडिंग संबंध का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, ग्लूकेन फॉस्फेट एराबिडोप्सिस थैलियाना स्टार्च एक्स्ट्रा 4 (सेक्स 4) और एमाइलोपेक्टिन के पृथक्करण स्थिरांक (केडी) को निर्धारित किया गया था। सेक्स 4 उत्परिवर्ती और एंजाइमों के ग्लूकन फॉस्फेट परिवार के अन्य सदस्यों का लक्षण वर्णन प्रोटीन-कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन के अंतर बंधन का आकलन करने के लिए इस परख की उपयोगिता को दर्शाता है। ये डेटा स्टार्च और ग्लाइकोजन इंटरैक्शन प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला को चिह्नित करने के लिए इस परख की उपयुक्तता प्रदर्शित करते हैं।

Introduction

ग्लूकन फॉस्फेटेस प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फेटेस (पीटीपी) सुपरफैमिली1 के भीतर दोहरी विशिष्टता फॉस्फेटेस (डीएसपी) के कार्यात्मक रूप से विविध उपपरिवार के सदस्य हैं। वे अधिकांश जीवन रूपों में पाए गए हैं, जिनमें व्यापक रूप से भिन्न प्रकाश संश्लेषक जीव, मनुष्य, कशेरुक, और कुछ अकशेरुकी और प्रोटिस्ट 2,3,4 शामिल हैं। पौधों में तीन ज्ञात ग्लूकन फॉस्फेटेस होते हैं: स्टार्च अतिरिक्त 4 (सेक्स 4), जैसे सेक्स फोर 1 (एलएसएफ 1), और लाइक सेक्स फोर2 (एलएसएफ 2) 5,6,7। जिन पौधों में ग्लूकन फॉस्फेटेस की कमी होती है,वे पत्तियों में क्षणभंगुर स्टार्च क्षरण और स्टार्च के संचय की दर में कमी प्रदर्शित करते हैं। लाफोरिन ग्लूकन फॉस्फेट परिवार का संस्थापक सदस्य है जो कशेरुक और मनुष्यों में ग्लाइकोजन को डीफॉस्फोराइलेट करता है 3,10. लाफोरिन के उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप न्यूरोडीजेनेरेटिव लाफोरा रोग होता है, जो मिर्गी का एक घातक ऑटोसोमल रिसेसिव रूपहै। ग्लाइकोजन और स्टार्च चयापचय के लिए ग्लूकन फॉस्फेटेस आवश्यक हैं और पौधों में स्टार्च सामग्री को संशोधित करने और न्यूरोडीजेनेरेटिव लाफोरा रोग12,13 के इलाज के लिए महत्वपूर्ण एंजाइमों के रूप में उभरे हैं। मॉडल ग्लूकन सब्सट्रेट्स के साथ ग्लूकन फॉस्फेटेस पर हाल के एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अध्ययनों ने सब्सट्रेट बाइंडिंग और ग्लूकन डीफॉस्फोराइलेशन14,15,16,17 के उत्प्रेरक तंत्र पर प्रकाश डाला है। हालांकि, ग्लूकन फॉस्फेटेस अपने शारीरिक सब्सट्रेट्स से कैसे जुड़ते हैं, इसकी वर्तमान समझ अधूरी है।

स्टार्च ग्लूकोज का एक अघुलनशील बहुलक है जो 80% -90% एमाइलोपेक्टिन और 10% -20% एमाइलोज18 से बना है। प्लांट ग्लूकन फॉस्फेटेस के लिए सब्सट्रेटफॉस्फोराइलेटेड कार्बोहाइड्रेट अणु होते हैं, जैसे ग्लाइकोजन और स्टार्च ग्रैन्यूल। फॉस्फोराइलेटेड ग्लूकोसिल अवशेष 1: 600 फॉस्फेट: ग्लूकोसिल अवशेष अनुपात में मौजूद हैं। दिलचस्प बात यह है कि फॉस्फेट केवल एमाइलोपेक्टिन अणुओं19 पर मौजूद हैं। मुख्य पौधे ग्लूकन फॉस्फेट सेक्स 4 स्टार्च ग्रेन्युल पर एमाइलोपेक्टिन अणुओं को डीफॉस्फोराइलेट करने के लिए कार्य करता है। संरचना-निर्देशित म्यूटेनेसिस अध्ययनों के साथ संयुक्त सेक्स 4 की एक्स-रे क्रिस्टल संरचना ने ग्लूकन संरचना15 के भीतर विभिन्न पदों के लिए सेक्स 4 की अनूठी सब्सट्रेट विशिष्टताओं का प्रदर्शन किया है। हमने हाल ही में दिखाया है कि सेक्स 4 की जैविक रूप से प्रासंगिक गतिविधि केवल तभी देखी जा सकती है जब इसके घुलनशील एमाइलोपेक्टिन सब्सट्रेट्स20 पर कार्य किया जाता है। हालांकि, सब्सट्रेट की संरचनात्मक जटिलता, व्यापक बाध्यकारी विशिष्टताओं और प्रोटीन और उसके सब्सट्रेट्स के बीच कम बाध्यकारी समानताओं के कारण ग्लूकन-सेक्स 4 इंटरैक्शन को समझना मुश्किल साबित हुआ है। इन मुद्दों ने आमतौर पर प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन में उपयोग की जाने वाली विधियों का उपयोग करने की क्षमता में बाधा डाली है, जैसे कि इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी), परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा)-आधारित परख।

दिलचस्प बात यह है कि कार्बोहाइड्रेट-प्रोटीन इंटरैक्शन की हमारी अधिकांश समझ लेक्टिन का अध्ययन करने से आई है। कॉनकानावेलिन ए (कोना) मूल रूप से जैक बीन से निकाले गए प्रोटीन का एक फलियां लेक्टिन परिवार है। कोना उच्च विशिष्टता के साथ कार्बोहाइड्रेट को बांधता है, जो दवा लक्ष्यीकरण और वितरण अनुप्रयोगों में इसके उपयोग के लिए फायदेमंद है। नॉनरिड्यूसिंग α-डी-मैनोसिल और α-डी-ग्लूकोसिल युक्त विभिन्न प्रकार के सब्सट्रेट्स के लिए कोना के बंधन का बड़े पैमानेपर अध्ययन किया गया है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोना-बाउंड सेफ्राइस मोती आमतौर पर ग्लाइकोप्रोटीन और ग्लाइकोलिपिड्स21 को शुद्ध करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। कोना ग्लूकोज अवशेषों के सी 3, सी 4 और सी 6 हाइड्रॉक्सिल समूहों के माध्यम से इन ग्लूकेन को बांधता है। कोना-सेफ्राइस मोतियों का उपयोग ग्लाइकोजन-प्रोटीन और स्टार्च-प्रोटीन इंटरैक्शन22,23 के बंधन को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इस अध्ययन में, हमने ग्लूकेन फॉस्फेट-एमाइलोपेक्टिन इंटरैक्शन की बाध्यकारी विशिष्टताओं को मापने के लिए एक बाध्यकारी परख विकसित करने के लिए कोना-सेफ्रॉस बीड्स का उपयोग किया।

इससे पहले, एक कोना-आधारित अवसादन परख को ग्लूकन फॉस्फेट सब्सट्रेट बाइंडिंग क्षमता 14,20,24 का आकलन करने के लिए नियोजित किया गया था। इस अध्ययन में, ग्लूकन-ग्लूकन फॉस्फेट और कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन के बाध्यकारी संबंध को निर्धारित करने के लिए एक नई विधि विकसित करने के लिए एक ही रणनीति का उपयोग किया गया था। इस विधि में विभिन्न घुलनशील कार्बोहाइड्रेट-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए एक फायदा भी है।

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Protocol

1. कोना-सेफ्राइस मोतियों की तैयारी

  1. 67 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl 2, और0.2 mM CaCl2 युक्त बाइंडिंग बफर का 250 mL बनाएं। 1 M NaOH समाधान का उपयोग करके पीएच समायोजित करें।
  2. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोना-सेफ्राइस बीड सस्पेंशन के पिपेट 250 μL। सामग्री को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    नोट: परख के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोना-सेफ्रासेस मोतियों के 250 μL की आवश्यकता होती है।
  3. प्रत्येक ट्यूब में बाइंडिंग बफर के 750 μL जोड़ें जिसमें 250 μL कोना-सेफ्राइस मोती हों। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें। यह सुनिश्चित करने के लिए इस चरण 2x को दोहराएं कि मोतियों को उचित रूप से धोया जाता है और बाइंडिंग बफर के साथ बराबर किया जाता है।

2. एमाइलोपेक्टिन समाधान की तैयारी

  1. 10 मिलीग्राम / एमएल आलू एमाइलोपेक्टिन का स्टॉक समाधान बनाएं। एमाइलोपेक्टिन पानी-अघुलनशील है और गर्मी से घुलनशील हो सकता है। घुलनशील करने के लिए, 10 मिलीलीटर आसुत जल में 0.1 ग्राम आलू एमाइलोपेक्टिन जोड़ें। निलंबन को 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में गर्म करें या जब तक कि घोल अब बादल न हो।
  2. झुरमुट से बचने के लिए बार-बार भंवर के साथ समाधान को कमरे के तापमान (आरटी) पर लौटने की अनुमति दें।
  3. अल्कोहल-क्षारीय उपचार एमाइलोपेक्टिन सब्सट्रेट्स को घुलनशील करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। इस विधि का उपयोग करके घुलनशील करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. 20% इथेनॉल के 5 एमएल और 2 एम एनएओएच के 5 एमएल में 0.5 ग्राम एमाइलोपेक्टिन सब्सट्रेट को निलंबित करें। आरटी पर 15-20 मिनट के लिए सामग्री को जोर से हिलाएं।
    2. इसके बाद, 10 मिलीलीटर पानी डालें, और 2 एम एचसीएल जोड़कर घोल के पीएच को 6.5 में समायोजित करें। परिणामी घोल की मात्रा को आसुत जल के साथ 50 एमएल तक लाएं ताकि 10 मिलीग्राम / एमएल एमाइलोपेक्टिन घोल बनाया जा सके।
  4. 10 मिलीग्राम / एमएल घुलनशील एमाइलोपेक्टिन समाधान को पतला एमाइलोपेक्टिन समाधान की 2 मिलीलीटर की एक श्रृंखला बनाने के लिए पतला करें। उदाहरण के लिए, एमाइलोपेक्टिन सांद्रता (5 मिलीग्राम / एमएल, 2.5 मिलीग्राम / एमएल, 1.25 मिलीग्राम / एमएल, 0.625 मिलीग्राम / एमएल, 0.3125 मिलीग्राम / एमएल, 0.156 मिलीग्राम / एमएल, 0.078 मिलीग्राम / एमएल, 0.039 मिलीग्राम / एमएल, 0.019 मिलीग्राम / एमएल, और 0 मिलीग्राम / एमएल) की एक श्रृंखला तैयार करने के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल का आधा कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।

3. कोना-सेफ्रॉस की तैयारी: एमाइलोपेक्टिन मोती

  1. प्रत्येक पतला एमाइलोपेक्टिन समाधान के 250 μL को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में जोड़ें, जिसमें 250 μL कोना-सेफ्राइज़ मोती होते हैं जो बाइंडिंग बफर में पूर्व-समतुल्य होते हैं। सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं। ट्यूबों को संबंधित एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता के साथ लेबल करें।
  2. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घूमने वाले पहिये पर सामग्री को इनक्यूबेट करें।
    नोट: 20 मिनट के बाद समय के साथ कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन बाउंड कॉम्प्लेक्स में कोई बदलाव नहीं होता है। संतुलन सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट इनक्यूबेशन समय को 10 मिनट से 1 घंटे तक इनक्यूबेशन बार अलग-अलग चुना गया था।
  3. 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक नए लेबल वाले 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें। डी-ग्लूकोज परख12 (एंजाइमेटिक परख के माध्यम से ग्लूकोज के यूवी निर्धारण के बाद एमाइलोपेक्टिन के एसिड हाइड्रोलिसिस के बाद एसिड हाइड्रोलिसिस) करने के लिए इन सुपरनैटेंट अंशों को सहेजें। यह कदम यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि सभी एमाइलोपेक्टिन मोतियों से बंधे हैं।
  4. कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन मोतियों में बाइंडिंग बफर के 750 μL जोड़ें। 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। किसी भी अनबाउंड एमाइलोपेक्टिन अणुओं को हटाने के लिए सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
  5. पर्याप्त धुलाई सुनिश्चित करने के लिए चरण 3.4 दोहराएं। प्रत्येक ट्यूब में अब कोना-सेफ्राइस मोती होते हैं जो अलग-अलग मात्रा में एमाइलोपेक्टिन सब्सट्रेट्स से बंधे होते हैं।

4. कोना-सेफ्रासेस के साथ सेक्स 4 को इंजेक्ट करना: एमाइलोपेक्टिन मोती।

  1. कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन मोतियों के 250 μL को बाइंडिंग बफर के 100 μL के साथ मिलाएं जिसमें 10 μg SEX4 प्रोटीन, 10 mM dithiothreitol (DTT), और 10 μM प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (PIC) शामिल हैं। ध्यान दें कि प्रत्येक ट्यूब में कुल मात्रा 350 μL है।
    नोट: किसी भी अनावश्यक सेक्स 4 गिरावट से बचने के लिए एक एहतियाती कदम के रूप में एक प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल जोड़ा जाता है। यह एक वैकल्पिक कदम है। इस परख में रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन एराबिडोप्सिस थैलियाना सेक्स 4 (एटीसेक्स 4) का इस्तेमाल किया जाता है। शुद्ध प्रोटीन में एक एन-टर्मिनल हिस्टिडाइन टैग होता है जो केमिल्यूमिनेसेंस के माध्यम से प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक होता है। ग्लूकन फॉस्फेट शुद्धिकरण पर विस्तृत जानकारी पिछले प्रकाशनों 14,20,24 में वर्णित है।
  2. प्रोटीन और कोना-सेफ्रासेस को इनक्यूबेट करें: एमाइलोपेक्टिन बीड सस्पेंशन 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रोटेशन के साथ।
    नोट: 45 मिनट इनक्यूबेशन समय को यह सुनिश्चित करने के लिए चुना जाता है कि परिसर के लिए संतुलन तक पहुंच गया है।
  3. 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जेल लोडिंग टिप का उपयोग करके सुपरनैटेंट के पिपेट 50 μL। एकत्रित सतह पर तैरनेवाले अंशों के 50 μL वाले प्रत्येक ट्यूब में 4x SDS-PAGE डाई के 20 μL और 10 μL पानी जोड़ें। नमूने को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। SDS-PAGE जैल चलाने के लिए इन नमूनों को सहेजें। सुनिश्चित करें कि "सुपरनैटेंट (एस)" लेबल वाले 10 नए ट्यूबों में संबंधित सब्सट्रेट सांद्रता है।
  4. मोतियों से किसी भी अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन: सेक्स 4 मोती में बाइंडिंग बफर के 750 μL जोड़ें। 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। उचित धुलाई सुनिश्चित करने के लिए इस चरण को एक और बार दोहराएं। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  5. धुले हुए कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन: सेक्स 4 मोती युक्त ट्यूबों में 4x SDS-PAGE डाई के 20 μL और आसुत जल के 80 μL जोड़ें। नमूने को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. गोली को छोड़ दें और एसडीएस-पेज जैल चलाने के लिए सतह पर तैरनेवाला को सहेजें। सतह पर तैरने वाले के पिपेट 80 μL को नई ट्यूबों में बदलें और उन्हें "गोली (पी)" के रूप में लेबल करें।

5. एसडीएस-पेज जैल चलाना

  1. अनबाउंड प्रोटीन नमूनों के 40 μL (चरण 2.3 में बनाए गए, लेबल एस में बनाए गए) को 4% -12% प्रीकास्ट पॉलीक्रिलामाइड जेल कुओं में सबसे कम सब्सट्रेट एकाग्रता से उच्चतम तक लोड करें, लेकिन प्रोटीन आणविक भार मार्कर को लोड करने के लिए पहली लेन को मुक्त रखें। चरण 2.5 (पी के रूप में लेबल) में बनाए गए 10 बाध्य प्रोटीन नमूने लोड करने के लिए दूसरे जेल का उपयोग करें।
  2. उपकरण के दोनों कक्षों में ताजा तैयार 1x SDS-PAGE रनिंग बफर जोड़ें। जेल को 35 मिनट के लिए 150 वोल्ट पर चलाएं या जब तक डाई फ्रंट जेल के नीचे तक न पहुंच जाए।
  3. उपकरण से रन जेल निकालें और स्पेसर और ग्लास प्लेटों को हटा दें। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण चलाने के लिए अलग जेल का उपयोग करें।

6. केमिलुमिनेसेंस का पता लगाने के लिए पश्चिमी सोख्ता14,15।

नोट: इस विधि को पश्चिमी सोख्ता उपकरण के आधार पर आसानी से संशोधित / अनुकूलित किया जा सकता है जो उपयोगकर्ताओं के पास उनकी प्रयोगशालाओं में है।

  1. 1 एल ट्रांसफर बफर बनाएं जिसमें 5.8 ग्राम ट्रिस बेस, 2.9 ग्राम ग्लाइसिन, 0.37 ग्राम एसडीएस और 200 एमएल मेथनॉल हो।
  2. पॉलीक्रिलामाइड जेल से आकार-अलग प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करें। पश्चिमी स्थानांतरण प्रोटोकॉल14,15 के अनुसार स्पंज, फिल्टर पेपर, जेल और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को संक्षेप में इकट्ठा करें। 1 घंटे के लिए 70 V पर दौड़ें।
  3. निरर्थक प्रोटीन बाइंडिंग को रोकने के लिए, नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को 1% -5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) या दूध प्रोटीन के प्रोटीन समाधान वाले 50 मिलीलीटर टीबीएसटी बफर (20 एमएम ट्रिस [पीएच 7.5], 150 एमएम एनएसीएल, 0.1% ट्वीन 20) में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। किसी भी अनबाउंड ब्लॉकिंग समाधान को हटाने के लिए टीबीएसटी बफर का उपयोग करके झिल्ली 3 x को धो लें।
  4. झिल्ली को हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) से जुड़े एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें जो 1 घंटे के लिए हिस-टैग किए गए प्रोटीन के लिए विशिष्ट है। किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाने के लिए टीबीएसटी बफर में झिल्ली 3 x को धो लें। इष्टतम प्रजनन क्षमता और संवेदनशीलता के लिए टीबीएसटी के लिए एंटीबॉडी के 1: 2,000 कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
  5. एचआरपी एंजाइम-लिंक्ड एंटीबॉडी विशेष रूप से सेक्स 4 प्रोटीन के हिस्टिडाइन टैग को बांधता है, जो केमिलुमिनेसेंस अभिकर्मकों की उपस्थिति में एक बैंड पैदा करता है। डिजिटल इमेजिंग के लिए, 1.5 एमएल ट्यूब में केमिल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट समाधान (750 μL प्रत्येक) के बराबर भागों का समाधान बनाएं। घोल में कम से कम 5 मिनट के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  6. ब्लॉट स्कैनर पर झिल्ली प्रोटीन साइड को नीचे रखें और पेलेट और सुपरनैटेंट अंशों दोनों में प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चलाएं।

7. डेटा विश्लेषण

  1. ब्लॉट स्कैनर के साथ अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक सिग्नल माप करें। कुल प्रोटीन लोड किए गए सुपरनैटेंट और पेलेट अंशों में सभी मात्रात्मक मापों को सामान्य करें।
    नोट: सॉफ्टवेयर सतह पर तैरनेवाला और गोली अंशों में प्रत्येक प्रोटीन बैंड की तीव्रता को निर्धारित करने की अनुमति देता है।
  2. संतृप्त बाध्यकारी प्रयोग में, प्रोटीन-बाध्य बनाम एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता के प्रतिशत को प्लॉट करें। K D की गणना करने के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा को Y = Bmax x X / (KD + X) में फिट करें।
    नोट: बीमैक्स अधिकतम विशिष्ट बंधन है, वाई-अक्ष प्रोटीन बाध्य का प्रतिशत है, और एक्स-अक्ष एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता है।

Figure 1
चित्रा 1: कोना-सेफ्राइस अवसादन परख वर्कफ़्लो का अवलोकन। (ए) कोना-सेफ्राइस मोतियों की तैयारी। (बी) एमाइलोपेक्टिन सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेशन। (सी) सेक्स 4 प्रोटीन के साथ इनक्यूबेशन। (डी) सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से बाध्य और अनबाउंड प्रोटीन अंशों का पृथक्करण। (ङ) एसडीएस-पेज के माध्यम से प्रोटीन का पृथक्करण। (एफ) पश्चिमी-धब्बा विश्लेषण। (जी) हिज-टैग किए गए सेक्स 4 प्रोटीन का केमिल्यूमिनेसेंस डिटेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

प्रोटीन के ग्लूकन फॉस्फेट परिवार की प्रमुख विशेषताओं में से एक ग्लूकन सब्सट्रेट्स को बांधने की उनकी क्षमता है। सबसे पहले, सेक्स 4 से कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन मोतियों की बाध्यकारी क्षमता का विश्लेषण एसडीएस-पेज (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके किया गया था। बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) ने कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन मोतियों के लिए प्रोटीन के किसी भी गैर-विशिष्ट बंधन का पता लगाने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। प्रोटीन के एसडीएस-पेज विश्लेषण ने पेलेट अंश में सेक्स 4 प्रोटीन और सुपरनैटेंट अंश में बीएसए की उपस्थिति दिखाई। W278A, एक ज्ञात SEX4 उत्परिवर्ती जिसमें ग्लूकन बाइंडिंग क्षमता काफी कम हो गई है, को भी परख में शामिल किया गया था। W278A उत्परिवर्ती सतह पर तैरनेवाला अंश में दिखाई दिया, जो SEX4 प्रोटीन की ग्लूकन बाइंडिंग क्षमता का पता लगाने के लिए इस परख की उपयोगिता और विशिष्टता को दर्शाता है। जबकि एसडीएस-पेज ने सेक्स 4 प्रोटीन की कल्पना की, छोटे ग्लूकन फॉस्फेटेस की संवेदनशीलता और उपयोग के बारे में चिंता थी; उदाहरण के लिए, कोना लेक्टिन प्रोटीन संभावित रूप से एलएसएफ 2 जैसे छोटे प्रोटीन का पता लगाने में हस्तक्षेप कर सकता है। यह जांचने के लिए कि क्या यह विधि केवल ग्लूकन फॉस्फेटेस का पता लगा सकती है, एन-टर्मिनल हिस्टिडाइन टैग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके एक पश्चिमी धब्बा किया गया था। दरअसल, सेक्स 4 का पता लगाने में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी, और विधि एन-टर्मिनल हिस्टिडाइन टैग (चित्रा 2 बी) के साथ ग्लूकन फॉस्फेटेस का पता लगाने के लिए विशिष्ट है। लिगैंड-प्रोटीन इंटरैक्शन प्रयोगों के मात्रात्मक माप के लिए उपयुक्त लिगैंड और प्रोटीन सांद्रता स्थापित करने के लिए आवश्यक नियंत्रण करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, सह-अवसादन परख का परीक्षण तीन अलग-अलग सेक्स 4 सांद्रता (चित्रा 2 सी-ई) पर किया गया था। जबकि SEX4 का 2 μg केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन के माध्यम से कल्पना करने के लिए पर्याप्त है, SEX4 के 5 या 10 μg का उपयोग करने से आंशिक बाइंडिंग का अधिक सटीक पता लगाने की अनुमति मिलती है। अलग-अलग एमाइलोपेक्टिन सांद्रता (0.5 मिलीग्राम / एमएल, 1.0 मिलीग्राम / एमएल, और 5 मिलीग्राम / एमएल) के खिलाफ सेक्स 4 बाइंडिंग का भी परीक्षण किया गया था। ये परिणाम एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता में वृद्धि के साथ सेक्स 4 बाइंडिंग में वृद्धि का भी संकेत देते हैं, जिसमें एमाइलोपेक्टिन के 5 मिलीग्राम / एमएल पर संतृप्त बंधन होता है।

एमाइलोपेक्टिन और सेक्स 4 जंगली प्रकार के प्रोटीन के बाध्यकारी संबंध को निर्धारित करने के लिए, सेक्स 4 के 10 μg को एमाइलोपेक्टिन (5 मिलीग्राम / एमएल तक) के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और प्रत्येक एकाग्रता पर बंधन निर्धारित किया गया था (चित्रा 3 ए)। विशिष्ट, एक-साइट बाइंडिंग मॉडल के लिए प्रतिशत प्रोटीन-बाध्य डेटा की फिटिंग ने 1.03 ± 0.23 मिलीग्राम / एमएल काकेडी दिया (चित्रा 3 बी)। सेक्स 4 जंगली प्रकार के प्रोटीन की कोई क्रिस्टल संरचना उपलब्ध नहीं है; इसके बजाय, उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय SEX4 C198S उत्परिवर्ती की क्रिस्टल संरचना डीएसपी और कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग अणु (CBM) डोमेन से बने SEX4 के बाध्यकारी इंटरफ़ेस को प्रकट करती है। सेक्स 4 सी 198 एस और एमाइलोपेक्टिन इंटरैक्शन के बाध्यकारी संबंध को सी 198 एस उत्परिवर्ती प्रोटीन के लिए 0.11 ± 0.05 मिलीग्राम / एमएल काकेडी निर्धारित किया गया था; सेक्स 4 जंगली प्रकार के प्रोटीन की तुलना में ~ 10 गुना बाध्यकारी संबंध में वृद्धि हुई। जबकि C198S के बढ़े हुए बंधन का सटीक तंत्र समझ में नहीं आता है, यह देखना दिलचस्प है कि SEX4 के एकल-बिंदु उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप ग्लूकन बाइंडिंग क्षमता में उल्लेखनीय वृद्धि कैसे होती है।

इसके बाद, आलू एमाइलोपेक्टिन के खिलाफ लाफोरिन, एलएसएफ 2, मकई (ज़ेया मेस) सेक्स 4, और आलू (सोलनम ट्यूबरोसम) सेक्स 4 के बंधन को मापने के लिए इस विधि की प्रयोज्यता का मूल्यांकन किया गया था। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, परिणामों से पता चला है कि कृषि संबंधी रूप से महत्वपूर्ण फसलों से लाफोरिन, एलएसएफ 2 और सेक्स 4 भी अलग-अलग एमाइलोपेक्टिन से जुड़ते हैं, जो प्रत्येक प्रोटीन के लिए अलग-अलग बाध्यकारी तंत्र का सुझाव देते हैं (चित्रा 4 ए, बी)। सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों ने एमाइलोपेक्टिन सब्सट्रेट्स के साथ ग्लूकन फॉस्फेट के सब्सट्रेट बाइंडिंग के निर्धारण के लिए एक सफल विधि विकास का खुलासा किया।

Figure 2
चित्रा 2: पेलेट (पी) और सुपरनैटेंट (एस) सेक्स 4 अंशों का विज़ुअलाइज़ेशन और परख मापदंडों का अनुकूलन। (ए) एसडीएस-पेज और कूमासी स्टेनिंग का उपयोग करके पेलेट और सुपरनैटेंट अंशों में सेक्स 4 प्रोटीन (34 केडीए) के 5 μg का विज़ुअलाइज़ेशन। 25 केडीए और उससे नीचे के प्रोटीन बैंड सेफ्राइस मोतियों से जुड़े कोना प्रोटीन के लिए हैं। (बी) पश्चिमी विश्लेषण के माध्यम से गोली और सतह पर तैरनेवाले अंशों में सेक्स 4 प्रोटीन का विज़ुअलाइज़ेशन। हिस्टिडाइन टैग के लिए विकसित एंटीबॉडी के माध्यम से सेक्स 4 प्रोटीन के 5 μg का पता लगाया गया था। (C-E) पश्चिमी विश्लेषण SEX4 प्रोटीन (2 μg, 5 μg, और 10 μg) और एमाइलोपेक्टिन सांद्रता (0.5 mg / mL, 1.0 mg / mL, और 5.0 mg / mL) की अलग-अलग मात्रा का उपयोग करके किया गया था। संतुलन बंधन सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रयोगों के लिए 250 μL मोतियों की मात्रा और 30 मिनट का इनक्यूबेशन समय उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मात्रात्मक इन विट्रो अवसादन परख । (ए) सतह पर तैरनेवाला की कमी और सेक्स 4 जंगली प्रकार के प्रोटीन के पेलेट सिग्नल की क्रमिक वृद्धि का प्रतिनिधि डेटा क्योंकि एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता 0 मिलीग्राम / एमएल से बढ़कर 5 मिलीग्राम / एमएल हो गई। (बी) कोना-सेफ्रास मोतियों पर एमाइलोपेक्टिन की अलग-अलग मात्रा के खिलाफ बंधे सेक्स 4 जंगली-प्रकार के प्रोटीन का प्रतिशत। मोतियों को 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर गोली मारी गई थी, और सतह पर तैरनेवाला और गोली प्रोटीन दोनों को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था, पश्चिमी विश्लेषण द्वारा पता लगाया गया था, और प्रतिशत बाध्य को मापने के लिए मात्रा निर्धारित की गई थी। डेटा तीन प्रतिकृतियों के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है। (ग) सतह पर तैरनेवाला अवक्षय और एमाइलोपेक्टिन सांद्रता के रूप में सेक्स 4 सी198एस प्रोटीन के पेलेट सिग्नल की क्रमिक वृद्धि के प्रतिनिधि आंकड़े 0 मिग्रा/एमएल से बढ़कर 5 मिग्रा/एमएल हो गए हैं। (डी) कोना-सेफ्रासेस मोतियों पर एमाइलोपेक्टिन की अलग-अलग मात्रा के खिलाफ बंधे सेक्स 4 सी 198 एस प्रोटीन का प्रतिशत। मोतियों को 1 मिनट के लिए 10,000 x g पर गोली मारी गई थी, और सतह पर तैरनेवाला और गोली प्रोटीन दोनों को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था, पश्चिमी विश्लेषण द्वारा पता लगाया गया था, और प्रतिशत बाध्य को मापने के लिए मात्रा निर्धारित की गई थी। डेटा तीन प्रतिकृतियों के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: घुलनशील एमाइलोपेक्टिन के खिलाफ सेक्स 4 ऑर्थोलॉग्स, लैफोरिन, एलएसएफ 2 का सब्सट्रेट बाइंडिंग। (ए) कोना-सेफ्रासेस मोतियों में 5 मिलीग्राम / एमएल एमाइलोपेक्टिन के साथ प्रत्येक प्रोटीन का प्रतिनिधि बंधन स्थिर होता है। (बी) बाध्य प्रोटीन के प्रतिशत की गणना तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए प्राप्त सामान्यीकृत केमिल्यूमिनेसेंस संकेतों का उपयोग करके की गई थी। डेटा तीन प्रतिकृतियों के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह अध्ययन एक नए इन विट्रो अवसादन परख के सफल विकास को दर्शाता है जो ग्लूकन-ग्लूकन फॉस्फेट इंटरैक्शन के बाध्यकारी संबंध के निर्धारण की अनुमति देता है। परख डिजाइन ग्लूकोज के हाइड्रॉक्सिल अवशेषों के माध्यम से ग्लूकेन के लिए लेक्टिन कोना के विशिष्ट बंधन का लाभ उठाता है ताकि अप्रत्यक्ष रूप से सेफ्राइस मोतियों पर घुलनशील कार्बोहाइड्रेट सब्सट्रेट ्स को पकड़ा जा सके। यह सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से बाध्य और अनबाउंड प्रोटीन अंशों को अलग करने और घुलनशील ग्लूकन सब्सट्रेट्स और ग्लूकन फॉस्फेटेस के बाध्यकारी संबंध के निर्धारण की अनुमति देता है। परीक्षण किए गए सभी ग्लूकन फॉस्फेटेस को विशेष रूप से एमाइलोपेक्टिन से बांधने के लिए पाया गया था, जिसमें एमाइलोपेक्टिन की अनुपस्थिति में कोना-सेफ्राइस मोतियों के लिए कोई पता लगाने योग्य बंधन नहीं था।

प्रयोग सेक्स 4 प्रोटीन की एक छोटी, निश्चित मात्रा और कोना-सेफ्राइस मोतियों से जुड़े एमाइलोपेक्टिन सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ बाध्यकारी संबंध को मापने के लिए किया गया था। मोतियों के लिए उच्चतम एमाइलोपेक्टिन एकाग्रता बंधन सुनिश्चित करने के लिए कोना-सेफ्रॉस मोतियों की अधिकता का उपयोग किया गया था। ग्लूकोज परख के माध्यम से एमाइलोपेक्टिन के पूर्ण बंधन का परीक्षण किया गया था। पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल बाउंड और अनबाउंड प्रोटीन अंशों को अलग करने के लिए मात्रात्मक अवसादन का उपयोग करता है, साथ ही जेल वैद्युतकणसंचलन और पश्चिमी विश्लेषण का उपयोग करता है ताकि कोना-सेफ्रासे: एमाइलोपेक्टिन मोतियों से बंधी मात्रा की तुलना में सुपरनैटेंट में सेक्स 4 की मात्रा को मापा जा सके। पैलेट अंश को निर्धारित करने के लिए बाध्यकारी संतुलन को परेशान नहीं करने के लिए न्यूनतम धोने की आवश्यकता होती है। गोली की जांच करने के बजाय, पेलेट अंश के किसी भी कम आकलन से बचने के लिए, सतह पर तैरनेवाला में मुक्त सेक्स 4 की एकाग्रता को मापना और बाध्य सेक्स 4: एमाइलोपेक्टिन कॉम्प्लेक्स के अंतर की गणना करना पर्याप्त है।

यहां वर्णित इन विट्रो अवसादन परख ने सेक्स 4 जंगली प्रकार के प्रोटीन के अंतर बाध्यकारी संबंध को निर्धारित किया। दिलचस्प बात यह है कि विकसित इन विट्रो अवसादन परख का उपयोग करके सेक्स 4 जंगली-प्रकार के प्रोटीन का निर्धारित बाध्यकारी संबंध जेल शिफ्ट परख25 के साथ निर्धारित रिपोर्ट किए गए मूल्य की उच्च सीमा के भीतर आता है। बाध्यकारी परख कम सब्सट्रेट सांद्रता के प्रति संवेदनशील और सीधी होनी चाहिए, जबकि जेल शिफ्ट परख को ग्लूकेन सब्सट्रेट्स की अलग-अलग मात्रा की उपस्थिति में व्यक्तिगत देशी जैल बनाने की आवश्यकता होती है। यह समय लेने वाली विधि उन सांद्रता की संख्या को सीमित करती है जिनका परीक्षण किया जा सकता है, और एक सीमित सब्सट्रेट एकाग्रता सीमा का परीक्षण किया जा सकता है। इसके बजाय, नमूना तैयारी हमारे इन विट्रो अवसादन परख के साथ तेज और विश्वसनीय है। सेक्स 4 जंगली प्रकार के प्रोटीन और सेक्स 4 सी 198 एस उत्परिवर्ती की तुलना करने से दस गुना बाध्यकारी आत्मीयता अंतर का पता चलता है। इस संबंध में, यह परख मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से सेक्स 4 उत्परिवर्ती प्रोटीन के बंधन को निर्धारित करने के लिए संवेदनशील है।

प्रोटीन-कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, जिसमें उत्प्रेरण, सेल सिग्नलिंग और मान्यता शामिल है। वे दवा और खाद्य उद्योगों में अपनी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण भी ध्यान आकर्षित कर रहे हैं। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का व्यापक रूप से परमाणु स्तर पर प्रोटीन संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, कार्बोहाइड्रेट सब्सट्रेट्स की संरचनात्मक विषमता और लचीलापन कार्बोहाइड्रेट-बाध्य प्रोटीन संरचनाओं को प्राप्त करना कठिन बनाता है। हाल ही में क्रायो-ईएम और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी को भी कार्बोहाइड्रेट-बाध्यकारी प्रोटीन26 की संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक तकनीकों में कई प्रगति के बावजूद, कार्बोहाइड्रेट-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। नतीजतन, केवल सीमित संख्या में प्रोटीन-कार्बोहाइड्रेट जटिल संरचनाओं को प्रयोगात्मक रूप से हल किया गया है। इसके अलावा, क्रिस्टल संरचनाएं केवल एक निश्चित रचना पर एक प्रोटीन का स्नैपशॉट प्रदान करती हैं, न कि सब्सट्रेट बाइंडिंग की गतिशील प्रकृति। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन-कार्बोहाइड्रेटइंटरैक्शन को मापने के लिए आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) और सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) सहित कई बायोफिज़िकल तकनीकों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, ये विधियां भी सीमाओं के बिना नहीं हैं। प्रोटीन-कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन को निर्धारित करने में एक मुख्य चुनौती अन्य प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन की तुलना में उनकी अपेक्षाकृत कमजोर बातचीत है। उच्च माइक्रोमोलर से निम्न माइक्रोमोलर रेंज की सीमा के भीतर इंटरैक्शन आईटीसी और एसपीआर की प्रयोज्यता को काफी कम कर देता है। अप्रत्यक्ष तरीकों, जैसे कि जेल शिफ्ट और पुल-डाउन परख, ने इंटरैक्शन को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है जोअन्य तरीकों से आकलन करना मुश्किल है। इसलिए, यह बाध्यकारी परख प्रोटीन और घुलनशील कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन के संवेदनशील माप के लिए एक व्यापक रूप से लागू दृष्टिकोण है।

ग्लाइकोजन और स्टार्च ग्लूकोज के शाखित पॉलिमर से बने प्रमुख कार्बोहाइड्रेट भंडारण अणु हैं। स्टार्च और ग्लाइकोजन के भीतर शाखाओं के पैटर्न, लचीलेपन और विभिन्न माइक्रोडोमेन की उपस्थिति को अद्वितीय सब्सट्रेट बाइंडिंग तंत्र को अपनाने के लिए प्रोटीन की बातचीत की आवश्यकता होती है। सेक्स 4 के सब्सट्रेट मान्यता तंत्र की बहुत समझ एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफिक अध्ययनों से आई है जो संरचना-निर्देशित म्यूटेनेसिस के साथ युग्मित है। स्टार्च को डीफॉस्फोराइलेट करने के लिए, सेक्स4 को स्थिति-विशिष्ट डीफॉस्फोराइलेशन के लिए फॉस्फेट का पता लगाने के लिए स्टार्च ग्रेन्युल के काफी अलग-अलग माइक्रोडोमेन के साथ बातचीत करनी चाहिए। प्रयोगात्मक रूप से, प्रोटीन और ग्लूकन के बीच कमजोर बातचीत और कार्बोहाइड्रेट के संरचनात्मक लचीलेपन और विषमता को देखते हुए, ग्लूकन फॉस्फेटेस की बाध्यकारी समानताओं को निर्धारित करना एक चुनौती बनी हुई है। यह पांडुलिपि एक कॉनकानावेलिन ए (कोना) आधारित इन विट्रो अवसादन परख का उपयोग करके ग्लूकेन फॉस्फेट-कार्बोहाइड्रेट इंटरैक्शन के बाध्यकारी संबंधों को निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करती है। ग्लूकन फॉस्फेटेस कार्बोहाइड्रेट को बांधने, पता लगाने और डिफॉस्फोराइलेट करने के लिए अलग-अलग तंत्र ों को नियोजित करते हैं। इससे पहले, आईटीसी को लाफोरिन और रैखिक ऑलिगोसेकेराइड श्रृंखलाओं के बाध्यकारी संबंध को मापने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, किसी भी अध्ययन ने आईटीसी और एसपीआर जैसी प्रत्यक्ष तकनीकों के माध्यम से अपने शारीरिक सब्सट्रेट्स के साथ ग्लूकन फॉस्फेटेस के बाध्यकारी संबंधों का खुलासा नहीं किया है। ग्लूकेन फॉस्फेटेस के सब्सट्रेट बाइंडिंग को निर्धारित करने के लिए इस परख की उपयोगिता को बेहतर ढंग से समझने के लिए, एमाइलोपेक्टिन के खिलाफ लाफोरिन, एलएसएफ 2 और सेक्स 4 के बंधन का मूल्यांकन किया गया था। भविष्य के अध्ययन प्रयोगात्मक रूप से सभी ग्लूकन फॉस्फेटेस और उनके शारीरिक रूप से प्रासंगिक ग्लूकन सब्सट्रेट्स के बाध्यकारी संबंध को निर्धारित करने के लिए किए जा सकते हैं। विधि के महत्वपूर्ण चरणों में से एक परख के लिए इष्टतम इनक्यूबेशन समय और सब्सट्रेट एकाग्रता सीमा निर्धारित करना है। प्रत्येक ग्लूकन फॉस्फेट सब्सट्रेट के साथ अलग-अलग बांधता है, और विधि को सेक्स 4 के लिए अनुकूलित किया जाता है। इन मापदंडों का पता लगाने के लिए प्रारंभिक अनुकूलन प्रयोगों को पूरा करना महत्वपूर्ण है। एक अन्य सीमा परख के लिए हिस्टिडाइन टैग प्रोटीन का उपयोग है। हालांकि, यदि अध्ययन प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी मौजूद हैं, तो विधि को किसी भी ग्लूकन-इंटरैक्शन प्रोटीन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पुरस्कार एमसीबी -2012074 द्वारा समर्थित किया गया था। क्रेग डब्ल्यू वेंडर कूई फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान विभाग के मूल्यवान चर्चा ओं और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। लेखक ों ने अपने समर्थन के लिए फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान विभाग के डॉ मैथ्यू एस जेंट्री को भी धन्यवाद दिया। हम स्किडमोर कॉलेज न्यूरोसाइंस प्रोग्राम के अध्यक्ष डॉ सारा लागलवार को धन्यवाद देना चाहते हैं, जिन्होंने हमें पश्चिमी ब्लॉट इमेजिंग के लिए एलआईसीओआर सी-डिजिट ब्लॉट स्कैनर का उपयोग करने की अनुमति दी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP Therm Fisher Scientific MA1-21315-HRP
Biorad gel electrophoresis and Western blot kit Biorad  1703930
Calcium chloride Sigma-Aldrich 208291
C-Digit blot scanner LICOR 3600-00 Blot scanner
Complete protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836170001
Concanavalin A-sepharose beads Sigma-Aldrich C9017 This product contains  in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol 
Centrifuge Eppendorf  5425R
Glycine Fisher Scientific BP381-5
GraphPad Prism 8.0 software GraphPad  Version 8.0 Data analysis software 
HEPES Sigma-Aldrich H8651
Image Studio LICOR 3600-501 Acquisition Software
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2670
Methanol Fisher Scientific A452SK-4
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific PI28312
Potato amylopectin Sigma-Aldrich A8515
Precast SDSPAGE Gels Genscript M00653S
Tris base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Fisher Scientific MP1TWEEN201
Westernsure premium chemiluminescence substrate  LI-COR  926-95000

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References

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ग्लूकन फॉस्फेटेस के सब्सट्रेट बाइंडिंग को मापने के लिए कॉनकानावेलिन ए-आधारित अवसादन परख
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Wolpaw, E. M., Frenett, M. L., Mak, C. A., Zwanger, S. M., Raththagala, M. Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases. J. Vis. Exp. (190), e64700, doi:10.3791/64700 (2022).

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