Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64700
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Skidmore College
* These authors contributed equally

Summary

שיטה זו מתארת בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת לקטין כדי לכמת את זיקת הקישור של פוספטאז גלוקן ועמילופקטין. בדיקת שקיעה משותפת זו אמינה למדידת קשירת מצע גלוקן פוספטאז וניתן ליישם אותה על מצעים גלוקניים מסיסים שונים.

Abstract

פוספטזות גלוקניות שייכות למשפחה הגדולה יותר של פוספטזות בעלות סגוליות כפולה (DSP) אשר מנטרלות מצעי גלוקן, כגון גליקוגן בבעלי חיים ועמילן בצמחים. המבנים הגבישיים של פוספטאז גלוקן עם מצעי גלוקן מודל חושפים ממשקים קושרי גלוקן נפרדים העשויים מתחומי DSP וקשירת פחמימות. עם זאת, מדידות כמותיות של אינטראקציות גלוקן-גלוקן פוספטאז עם מצעים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הן בסיסיות להבנה הביולוגית של משפחת האנזימים גלוקן פוספטאז ולוויסות חילוף החומרים של אנרגיה. כתב יד זה מדווח על בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת Concanavalin A (ConA) שנועדה לזהות את זיקת קשירת המצע של פוספטזות גלוקניות כנגד מצעים גלוקניים שונים. כהוכחת היתכנות, נקבע קבוע הדיסוציאציה (KD) של גלוקן פוספטאז Arabidopsis thaliana עמילן עודף4 (SEX4) ועמילופקטין נקבע. האפיון של מוטנטים SEX4 וחברים אחרים במשפחת האנזימים גלוקן פוספטאז מדגים עוד יותר את התועלת של בדיקה זו כדי להעריך את הקישור הדיפרנציאלי של אינטראקציות חלבון-פחמימות. נתונים אלה מדגימים את התאמתו של מחקר זה לאפיון מגוון רחב של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם עמילן וגליקוגן.

Introduction

פוספטזות גלוקניות שייכות לתת-משפחה מגוונת מבחינה תפקודית של פוספטזות ספציפיות כפולה (DSPs) בתוך משפחת העל של החלבון טירוזין פוספטאז (PTP)1. הם נמצאו ברוב צורות החיים, כולל אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים מאוד, בני אדם, בעלי חוליות, וכמה חסרי חוליות ופרוטיסטים 2,3,4. צמחים מכילים שלושה פוספטזים גלוקניים ידועים: עודפי עמילן4 (SEX4), כמו מין ארבע1 (LSF1), וכמו מין ארבע2 (LSF2)5,6,7. צמחים חסרי פוספטאז גלוקני מציגים שיעורים מופחתים של פירוק עמילן חולף והצטברות של עמילן בעלים 8,9. Laforin הוא החבר המייסד של משפחת phosphatase גלוקן כי dephosphorylates גליקוגן בחולייתנים ובני אדם 3,10. המוטציות של לאפורין גורמות למחלת לפורה נוירודגנרטיבית, צורה אוטוזומלית רצסיבית קטלנית של אפילפסיה11. פוספטזות גלוקן נחוצות למטבוליזם של גליקוגן ועמילן, והתגלו כאנזימים חשובים לוויסות תכולת העמילן בצמחים ולטיפול במחלת לפורה ניוונית12,13. מחקרי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן שנערכו לאחרונה על פוספטזות גלוקניות עם מצעי גלוקן מודל שפכו אור על קשירת המצע והמנגנון הקטליטי של זרחן גלוקני14,15,16,17. עם זאת, ההבנה הנוכחית של האופן שבו פוספטזים גלוקניים נקשרים למצעים הפיזיולוגיים שלהם אינה שלמה.

עמילן הוא פולימר בלתי מסיס של גלוקוז העשוי מ-80%-90% עמילופקטין ו-10%-20% עמילוז18. המצע לפוספטזות גלוקן צמחיות הוא מולקולות פחמימות זרחניות, כגון גרגרי גליקוגן ועמילן. שאריות הגלוקוזיל הזרחניות נמצאות ביחס שאריות פוספט:גלוקוזיל של 1:600. מעניין, פוספטים נמצאים רק על מולקולות עמילופקטין19. הצמח העיקרי גלוקן phosphatase SEX4 פועל על גרגיר עמילן כדי dephosphorylate עמילופקטין מולקולות. המבנה הגבישי של קרני רנטגן של SEX4 בשילוב עם מחקרי מוטגנזה מונחי מבנה הדגימו את ייחודיות המצע הייחודי של SEX4 עבור מיקומים שונים בתוך מבנה גלוקן15. לאחרונה הראינו כי ניתן לצפות בפעילות הרלוונטית ביולוגית של SEX4 רק כאשר פועלים על מצעי העמילופקטין המסיסים שלו20. עם זאת, הבנת אינטראקציות גלוקן-SEX4 הוכחה כקשה בשל המורכבות המבנית של המצע, ספציפיות קישור רחבה יותר וזיקות קישור נמוכות בין החלבון למצעים שלו. בעיות אלה פגעו ביכולת להשתמש בשיטות הנפוצות באינטראקציות חלבון-ליגנד, כגון קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC), ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ובדיקות מבוססות אנזימים מקושרים לאימונוסורבנט (ELISA).

באופן מעניין, חלק גדול מההבנה שלנו של אינטראקציות בין פחמימות לחלבונים הגיע ממחקר של לקטינים. Concanavalin A (ConA) היא משפחת קטניות לקטין של חלבונים שהופקו במקור משעועית הג'ק. ConA קושר פחמימות עם ספציפיות גבוהה, וזה יתרון לשימוש בו ביישומי מיקוד סמים ומשלוח. הקישור של ConA למגוון מצעים המכילים α-D-מנוסיל ו-α-D-גלוקוזיל לא מפחיתים נחקר בהרחבה19,20. חרוזי ספרוז הקשורים ל- ConA זמינים באופן מסחרי משמשים בדרך כלל לטיהור גליקופרוטאינים וגליקוליפידים21. ConA נקשר לגלוקנים אלה באמצעות קבוצות הידרוקסיל C3, C4 ו-C6 של שאריות הגלוקוז. חרוזי ConA-Sepharose שימשו בהצלחה גם למדידת הקישור של אינטראקציות גליקוגן-חלבון ועמילן-חלבון22,23. במחקר זה השתמשנו בחרוזי ConA-Sepharose כדי לפתח בדיקת קישור למדידת תכונות הקישור של אינטראקציות גלוקן פוספטאז-עמילופקטין.

בעבר, נעשה שימוש בבדיקת שיקוע מבוססת ConA כדי להעריך את יכולת הקישור של מצע גלוקן פוספטאז 14,20,24. במחקר זה, אותה אסטרטגיה שימשה לפיתוח שיטה חדשנית לקביעת הזיקה הקושרת של אינטראקציות גלוקן-גלוקן פוספטאז ופחמימות. לשיטה זו יש גם יתרון בחקירת אינטראקציות שונות של פחמימות-חלבונים מסיסים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חרוזי ConA-Sepharose

  1. צור 250 מ"ל של מאגר מחייב המכיל 67 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 ו- 0.2 mM CaCl2. כוונן את רמת החומציות באמצעות תמיסת 1 M NaOH.
  2. פיפטה 250 μL של תרחיף חרוזי ConA-Sepharose לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את התוכן ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
    הערה: 250 μL של חרוזי ConA-Sepharose בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל נדרש עבור כל ריכוז עמילופקטין המשמש לבדיקה.
  3. הוסף 750 μL של חיץ הקישור לכל צינור המכיל 250 μL של חרוזי ConA-Sepharose. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant. חזור על שלב זה 2x כדי לוודא שהחרוזים נשטפים כראוי ומאוזנים עם מאגר הקשירה.

2. הכנת פתרונות עמילופקטין

  1. הפוך פתרון מלאי של 10 מ"ג / מ"ל עמילופקטין תפוחי אדמה. עמילופקטין אינו מסיס במים וניתן להמיס אותו בחום. כדי להמיס, להוסיף 0.1 גרם של עמילופקטין תפוחי אדמה ל 10 מ"ל של מים מזוקקים. מחממים את התרחיף באמבט מים ב 80 מעלות צלזיוס למשך שעה או עד שהפתרון כבר לא מעונן.
  2. אפשרו לתמיסה לחזור לטמפרטורת החדר (RT), עם מערבולות חוזרות ונשנות כדי למנוע היווצרות גושים.
  3. טיפול אלכוהול-אלקליין הוא שיטה חלופית למסיסים מצעי עמילופקטין. כדי להמיס בשיטה זו, בצע את השלבים הבאים.
    1. להשהות 0.5 גרם של מצע עמילופקטין ב 5 מ"ל של 20% אתנול ו 5 מ"ל של 2 M NaOH. ערבבו את התוכן במרץ במשך 15-20 דקות ב-RT.
    2. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל מים, והתאם את ה- pH של התמיסה ל -6.5 על ידי הוספת 2 M HCl. העלה את נפח התמיסה המתקבלת ל -50 מ"ל עם מים מזוקקים כדי ליצור תמיסת עמילופקטין 10 מ"ג / מ"ל.
  4. לדלל את תמיסת עמילופקטין מסיס 10 מ"ג / מ"ל כדי ליצור סדרה של 2 מ"ל של תמיסות עמילופקטין מדולל. לדוגמה, בצע חצי דילול של 10 מ"ג/מ"ל להכנת סדרה של ריכוזי עמילופקטין (5 מ"ג/מ"ל, 2.5 מ"ג/מ"ל, 1.25 מ"ג/מ"ל, 0.625 מ"ג/מ"ל, 0.3125 מ"ג/מ"ל, 0.156 מ"ג/מ"ל, 0.078 מ"ג/מ"ל, 0.039 מ"ג/מ"ל, 0.019 מ"ג/מ"ל ו-0 מ"ג/מ"ל).

3. הכנת ConA-Sepharose: חרוזי עמילופקטין

  1. הוסף 250 μL של כל תמיסת עמילופקטין מדוללת לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל המכילות 250 μL של חרוזי ConA-Sepharose שקולים מראש במאגר קשירה. מערבבים היטב את התכולה. תייגו את הצינורות עם ריכוז העמילופקטין המתאים.
  2. יש לדגור על התכולה על גלגל מסתובב בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.
    הערה: אין שינוי בקומפלקס ConA-Sepharose:עמילופקטין לאורך זמן לאחר 20 דקות. זמן הדגירה של 30 דקות נבחר על ידי זמני דגירה משתנים מ-10 דקות עד שעה כדי להבטיח הגעה לשיווי משקל.
  3. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקה. אספו את הסופרנאטנט בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. שמור שברים סופרנטנטיים אלה כדי לבצע בדיקת גלוקוז D12 (הידרוליזה חומצית של עמילופקטין ואחריה קביעת UV של גלוקוז באמצעות בדיקה אנזימטית). שלב זה נחוץ כדי להבטיח שכל העמילופקטין קשור לחרוזים.
  4. הוסף 750 μL של חיץ קשירה לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקה. השליכו את הסופרנאטנט כדי להסיר מולקולות עמילופקטין לא קשורות.
  5. חזור על שלב 3.4 כדי להבטיח שטיפה מספקת. כל צינור מכיל כעת חרוזי ConA-Sepharose הקשורים לכמויות משתנות של מצעי עמילופקטין.

4. דגירה SEX4 עם ConA-Sepharose:חרוזי עמילופקטין

  1. ערבבו 250 μL של ConA-Sepharose:חרוזי עמילופקטין עם 100 μL של מאגר הקישור הכולל 10 מיקרוגרם של חלבון SEX4, 10 mM dithiothreitol (DTT), וקוקטייל מעכב פרוטאז 10 μM (PIC). שים לב שהנפח הכולל בכל צינור הוא 350 μL.
    הערה: קוקטייל מעכב פרוטאז מתווסף כאמצעי זהירות כדי למנוע השפלה מיותרת של SEX4. זהו צעד אופציונלי. בבדיקה זו, חלבון רקומביננטי Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4) משמש. החלבון המטוהר מכיל תג היסטידין N-terminal הדרוש לזיהוי החלבון באמצעות כימילומינסנציה. מידע מפורט על טיהור פוספטאז גלוקן מתואר בפרסומים קודמים14,20,24.
  2. לדגור על החלבון ו- ConA-Sepharose:תרחיף חרוזי עמילופקטין ב 4 ° C למשך 45 דקות עם סיבוב עדין.
    הערה: זמן הדגירה של 45 דקות נבחר כדי להבטיח הגעה לשיווי משקל עבור המתחם.
  3. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקה. פיפטה 50 μL של supernatant בזהירות באמצעות קצה העמסת ג'ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. הוסף 20 μL של צבע 4x SDS-PAGE ו 10 μL של מים לכל צינור המכיל 50 μL של שברים supernatant שנאספו. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות. שמור דוגמאות אלה להפעלת ג'לים SDS-PAGE. ודא של-10 צינורות חדשים המסומנים כ"סופרנאטנט (S)" יש את ריכוזי המצע המתאימים.
  4. הוסף 750 μL של חיץ הקישור ל- ConA-Sepharose:amylopectin: SEX4 חרוזים כדי להסיר כל חלבון לא קשור מהחרוזים. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 1 דקה. חזור על שלב זה פעם נוספת כדי להבטיח כביסה נאותה. השליכו את הסופרנטנט.
  5. הוסף 20 μL של צבע 4x SDS-PAGE ו 80 μL של מים מזוקקים לתוך צינורות המכילים שטף ConA-Sepharose:amylopectin:SEX4 חרוזים. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות ואת הצנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 x g למשך דקה אחת.
  6. השליכו את הגלולה ושמרו את הסופרנאטנט להפעלת ג'ל SDS-PAGE. פיפטה 80 μL של supernatant לתוך צינורות חדשים ולתייג אותם כמו "גלולה (P)".

5. הפעלת ג'לים SDS-PAGE

  1. טען 40 μL של דגימות חלבון לא קשורות (שנעשו בשלב 2.3, מסומן S) לתוך בארות ג'ל פוליאקרילאמיד precast 4%-12% מריכוז המצע הנמוך ביותר לגבוה ביותר, אך שמור על הנתיב הראשון פנוי כדי לטעון את סמן המשקל המולקולרי של החלבון. השתמש בג'ל שני כדי לטעון 10 דגימות חלבון קשורות שנעשו בשלב 2.5 (מסומן כ- P).
  2. הוסף מאגר ריצה 1x SDS-PAGE טרי שהוכן לשני תאי המנגנון. יש להפעיל את הג'ל במתח של 150 וולט למשך 35 דקות או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
  3. מוציאים את ג'ל הריצה מהמכשיר ומסירים את הספייסרים וצלחות הזכוכית. השתמש בג'ל המופרד כדי לבצע ניתוח כתם מערבי.

6. כתם מערבי לזיהוי כימילומינסנציה14,15

הערה: ניתן לשנות/להתאים שיטה זו בקלות בהתאם לציוד ההדבקה המערבי שיש למשתמשים במעבדות שלהם.

  1. צור 1 ליטר של מאגר העברה המכיל 5.8 גרם בסיס טריס, 2.9 גרם גליצין, 0.37 גרם SDS ו-200 מ"ל מתנול.
  2. העבירו את החלבונים המופרדים בגודל מג'ל הפוליאקרילאמיד לקרום ניטרוצלולוז. הרכיבו בקצרה את הספוגים, ניירות הסינון, הג'ל וקרום הניטרוצלולוז על פי פרוטוקול העברה מערבי14,15. הפעל ב 70 V במשך 1 שעות.
  3. כדי למנוע קשירת חלבונים לא ספציפית, דגרו על קרום הניטרוצלולוז המכיל את תמיסת החלבון של אלבומין בסרום בקר (BSA) 1%-5% או חלבון חלב במאגר TBST של 50 מ"ל (20 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) למשך שעה אחת. שטפו את הממברנה 3x באמצעות מאגר TBST כדי להסיר כל פתרון חסימה לא מאוגד.
  4. יש לדגור על הממברנה עם נוגדן פרוקסידז (HRP) ספציפי לחלבון המתויג על ידי חזרת למשך שעה אחת. שטפו את הממברנה 3x במאגר TBST כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. יש להשתמש בדילול נוגדנים ביחס של 1:2,000 ל-TBST לשחזור ורגישות מיטביים.
  5. הנוגדן המקושר לאנזים HRP נקשר באופן ספציפי לתג ההיסטידין של חלבון SEX4, אשר מניב רצועה בנוכחות ריאגנטים כימילומינסננציים. עבור הדמיה דיגיטלית, לעשות פתרון של חלקים שווים של תמיסות מצע chemiluminescent (750 μL כל אחד) בצינור 1.5 מ"ל. לדגור על הממברנה לפחות 5 דקות בתמיסה.
  6. הניחו את חלבון הממברנה על סורק הכתם והריצו את תוכנת הרכישה כדי לכמת את החלבון הן בשבר הכדורי והן בשבר הסופרנאטנטי.

7. ניתוח נתונים

  1. בצע את מדידות האות הכמותיות באמצעות תוכנת הרכישה עם סורק הכתם. נרמלו את כל המדידות הכמותיות בשברי הסופרנאטנט והגלולה לסך החלבון הטעון.
    הערה: התוכנה מאפשרת לכמת את העוצמה של כל רצועת חלבון בשברים supernatant ו pellet.
  2. בניסוי הקישור הרווי, שרטט את אחוז ריכוז החלבון לעומת ריכוז העמילופקטין (amylopectin). התאם את הנתונים ל- Y = Bmax x X/(K D + X), באמצעות תוכנת ניתוח נתונים לחישוב KD.
    הערה: Bmax הוא הקישור הספציפי המקסימלי, ציר Y הוא אחוז החלבון הקשורים, ציר X הוא ריכוז העמילופקטין .

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה של בדיקת שיקוע ConA-Sepharose. (A) הכנת חרוזי ConA-Sepharose. (B) דגירה עם מצע עמילופקטין. (C) דגירה עם חלבון SEX4. (D) הפרדה של שברי חלבונים קשורים ולא קשורים באמצעות צנטריפוגה. (E) הפרדת חלבון באמצעות SDS-PAGE. (F) ניתוח כתם מערבי. (G) זיהוי כימילומינסנציה של חלבון SEX4 המתויג שלו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אחד המאפיינים העיקריים של משפחת החלבונים גלוקן פוספטאז הוא יכולתם להיקשר למצעים גלוקניים. ראשית, יכולת הקישור של SEX4 לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin נותחה באמצעות SDS-PAGE (איור 2A). אלבומין בסרום בקר (BSA) שימש כבקרה שלילית לזיהוי כל קשירה לא ספציפית של חלבונים לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin. ניתוח SDS-PAGE של חלבונים הראה נוכחות של חלבון SEX4 בחלק הכדורי ו- BSA בחלק הסופרנאטנטי. W278A, מוטנט SEX4 ידוע עם יכולת קשירה גלוקנית מופחתת משמעותית, נכלל גם הוא בבדיקה. מוטנט W278A הופיע בחלק הסופרנאטנטי, מה שמצביע על התועלת והספציפיות של בדיקה זו לגילוי יכולת הקישור הגלוקנית של חלבוני SEX4. בעוד SDS-PAGE דמיינו את חלבוני SEX4, היה חשש לגבי הרגישות והשימוש בפוספטזות גלוקניות קטנות; לדוגמה, חלבון הלקטין ConA עלול להפריע לאיתור חלבונים קטנים כגון LSF2. כדי לבדוק אם שיטה זו יכולה לזהות רק את הפוספטזות הגלוקניות, בוצע כתם מערבי באמצעות נוגדן ספציפי לתג היסטידין N-terminal. ואכן, חלה עלייה משמעותית בזיהוי SEX4, והשיטה ספציפית לגילוי פוספטזות גלוקניות עם תג היסטידין N-terminal (איור 2B). מדידה כמותית של ניסויי אינטראקציה בין ליגנד לחלבון דורשת ביצוע בקרות חיוניות לקביעת ריכוזי הליגנד והחלבון המתאימים. לכן, בדיקת השקיעה המשותפת נבדקה לאחר מכן בשלושה ריכוזי SEX4 שונים (איור 2C-E). בעוד ש-2 מיקרוגרם של SEX4 מספיקים להדמיה באמצעות זיהוי כימילומינסנציה, שימוש ב-5 או 10 מיקרוגרם של SEX4 מאפשר זיהוי מדויק יותר של הקשירה החלקית. כמו כן נבדק קשר SEX4 כנגד ריכוזי עמילופקטין משתנים (0.5 מ"ג/מ"ל, 1.0 מ"ג/מ"ל ו-5 מ"ג/מ"ל). תוצאות אלה מצביעות גם על קשירה מוגברת של SEX4 עם ריכוז עמילופקטין מוגבר, עם קשירה רוויה של 5 מ"ג/מ"ל עמילופקטין.

כדי לקבוע את זיקת הקישור של עמילופקטין וחלבון פראי מסוג SEX4, הודגר 10 מיקרוגרם של SEX4 עם עמילופקטין (עד 5 מ"ג/מ"ל), והקישור בכל ריכוז נקבע (איור 3A). התאמת הנתונים הקשורים לחלבון באחוזים למודל הקישור הספציפי של אתר אחד נתנה KD של 1.03 ± 0.23 מ"ג/מ"ל (איור 3B). אין מבנה גבישי זמין של חלבון מסוג בר SEX4; במקום זאת, המבנה הגבישי של מוטנט SEX4 C198S שאינו פעיל קטליטית חושף את ממשק הקישור של SEX4, העשוי מתחומי DSP ומולקולת קשירת פחמימות (CBM). זיקת הקישור של SEX4 C198S ואינטראקציית עמילופקטין נקבעה כבעלת KD של 0.11 ± 0.05 מ"ג/מ"ל עבור חלבונים מוטנטיים C198S; ~ פי 10 הגדיל את זיקה הקשירה בהשוואה לחלבון מסוג SEX4 פראי. בעוד שהמנגנון המדויק של הקשירה המוגברת של C198S אינו מובן, מסקרן לראות כיצד מוטציה חד-נקודתית של SEX4 גורמת לעלייה משמעותית ביכולת הקישור של גלוקן.

לאחר מכן, הוערכה הישימות של שיטה זו למדידת הקישור של לפורין, LSF2, תירס (Zea mays) SEX4, ותפוח אדמה (Solanum tuberosum) SEX4 כנגד עמילופקטין תפוחי אדמה. באמצעות הפרוטוקול שהוצג כאן, התוצאות הראו שלפורין, LSF2 ו-SEX4 מגידולים חשובים מבחינה אגרונומית נקשרים גם הם באופן דיפרנציאלי לעמילופקטין, מה שמרמז על מנגנוני קישור שונים לכל חלבון (איור 4A,B). יחד, ממצאים אלה חשפו פיתוח שיטה מוצלחת לקביעת קשירת המצע של פוספטאז גלוקן עם מצעי עמילופקטין.

Figure 2
איור 2: ויזואליזציה של שברי גלולה (P) וסופרנאטנט (S) SEX4 ואופטימיזציה של פרמטרי הבדיקה. (A) הדמיה של 5 מיקרוגרם של חלבון SEX4 (34 kDa) בשברים הכדוריים והסופרנאטנטיים באמצעות צביעת SDS-PAGE וקומאסי. רצועות החלבון ב 25 kDa ומטה הן עבור חלבון ConA המחובר חרוזי Sepharose. (B) הדמיה של חלבוני SEX4 בשברים הכדוריים והסופרנאטנטיים באמצעות אנליזה מערבית. 5 מיקרוגרם של חלבון SEX4 זוהה באמצעות נוגדן שפותח עבור תג היסטידין. (ג-ה) הניתוח המערבי נעשה תוך שימוש בכמויות משתנות של חלבון SEX4 (2 מיקרוגרם, 5 מק"ג ו-10 מק"ג) וריכוזי עמילופקטין (0.5 מ"ג/מ"ל, 1.0 מ"ג/מ"ל ו-5.0 מ"ג/מ"ל). נפח של 250 מיקרוליטר חרוזים וזמן דגירה של 30 דקות שימשו לכל הניסויים כדי להבטיח קשירת שיווי משקל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בדיקת שיקוע כמותית במבחנה. (A) נתונים מייצגים של דלדול סופרנאטנטי והעלייה ההדרגתית של אות הכדוריות של חלבון פראי מסוג SEX4 ככל שריכוז העמילופקטין עלה מ-0 מ"ג/מ"ל ל-5 מ"ג/מ"ל. (B) אחוז החלבון הפראי מסוג SEX4 הקשור כנגד כמויות משתנות של עמילופקטין המשותק על חרוזי ConA-Sepharose. החרוזים נפלטו במהירות של 10,000 x גרם במשך דקה אחת, והן חלבוני הסופרנאטנט והן חלבוני הגלולה הופרדו על ידי SDS-PAGE, זוהו על ידי אנליזה מערבית, וכומתו כדי למדוד את אחוז הקשירה. הנתונים מייצגים את ± SD הממוצע של שלושה עותקים משוכפלים. (C) נתונים מייצגים של דלדול סופרנאטנטי והעלייה ההדרגתית של אות הכדוריות של חלבון SEX4 C198S כאשר ריכוז העמילופקטין עלה מ-0 מ"ג/מ"ל ל-5 מ"ג/מ"ל. (D) אחוז חלבון SEX4 C198S הקשור כנגד כמויות משתנות של עמילופקטין המשותק על חרוזי ConA-Sepharose. החרוזים נפלטו במהירות של 10,000 x גרם במשך דקה אחת, והן חלבוני הסופרנאטנט והן חלבוני הגלולה הופרדו על ידי SDS-PAGE, זוהו על ידי אנליזה מערבית, וכומתו כדי למדוד את אחוז הקשירה. הנתונים מייצגים את ± SD הממוצע של שלושה עותקים משוכפלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קשירת מצע של אורתולוגים SEX4, לפורין, LSF2 כנגד עמילופקטין מסיס. (A) קשירה מייצגת של כל חלבון עם 5 מ"ג/מ"ל עמילופקטין משותק בחרוזי ConA-Sepharose. (B) אחוז החלבון הקשור חושב באמצעות אותות כימילומינסנציה מנורמלים שהתקבלו עבור שלושה ניסויים בלתי תלויים. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SD של שלושה עותקים משוכפלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה מדגים את הפיתוח המוצלח של בדיקת שיקוע חוץ גופית חדשנית המאפשרת לקבוע את הזיקה הקושרת של אינטראקציות פוספטאז גלוקן-גלוקן. תכנון הבדיקה מנצל את הקישור הספציפי של לקטין ConA לגלוקנים באמצעות שאריות הידרוקסיל של גלוקוז כדי ללכוד בעקיפין מצעי פחמימות מסיסים על חרוזי ספארוז. זה מאפשר הפרדה של שברי חלבון קשורים ולא קשורים באמצעות צנטריפוגה וקביעת זיקה קשירה של מצעי גלוקן מסיסים ופוספטזות גלוקן. כל הפוספטזות הגלוקניות שנבדקו נמצאו כקשורות באופן ספציפי לעמילופקטין, ללא קשירה ניתנת לזיהוי לחרוזי ConA-Sepharose בהיעדר עמילופקטין.

הניסוי בוצע כדי למדוד את זיקת הקישור עם כמות קטנה וקבועה של חלבון SEX4 וטווח של ריכוזי עמילופקטין המחוברים לחרוזי ConA-Sepharose. עודף של חרוזי ConA-Sepharose שימש כדי להבטיח את ריכוז העמילופקטין הגבוה ביותר שנקשר לחרוזים. הקישור המלא של עמילופקטין נבדק באמצעות בדיקת גלוקוז. הפרוטוקול המוצג בכתב היד משתמש בשיקוע כמותי כדי להפריד שברים חלבוניים קשורים ולא קשורים, כמו גם אלקטרופורזה בג'ל ואנליזה מערבית כדי למדוד את כמות SEX4 בסופרנאטנט בהשוואה לכמות הקשורה לחרוזי ConA-Sepharose:amylopectin. כימות שבר הכדוריות דורש שטיפה מינימלית כדי לא להפר את שיווי המשקל הקשירה. כדי להימנע מהערכת חסר של מקטע הכדורי, במקום לבחון את הכדורית, מדידת ריכוז SEX4 חופשי בסופרנאטנט וחישוב ההפרש של קומפלקס SEX4:עמילופקטין הכבול מספיקים.

בדיקת שיקוע החוץ גופית שתוארה כאן קבעה את זיקת הקישור הדיפרנציאלית של חלבון מסוג SEX4 פראי. באופן מעניין, זיקת הקישור שנקבעה של חלבון מסוג SEX4 פראי באמצעות בדיקת שיקוע חוץ גופית שפותחה נמצאת בטווח הגבוה יותר של הערך המדווח שנקבע בבדיקת הסטת ג'ל25. בדיקת הקישור צריכה להיות רגישה לריכוזי מצע נמוכים ופשוטים, בעוד שבדיקת הסטת הג'ל דורשת ייצור ג'לים מקומיים בודדים בנוכחות כמויות משתנות של מצעים גלוקניים. שיטה גוזלת זמן זו מגבילה את מספר הריכוזים שניתן לבדוק, וניתן לבדוק טווח ריכוז מצע מוגבל. במקום זאת, הכנת הדגימה מהירה ואמינה עם בדיקת שקיעת המבחנה שלנו. השוואת חלבון פראי מסוג SEX4 לבין מוטציה SEX4 C198S מגלה הבדל זיקה מחייב פי עשרה. בהקשר זה, בדיקה זו רגישה כדי לקבוע את הקישור של חלבונים מוטנטיים SEX4 מבחינה כמותית ואיכותית.

אינטראקציות חלבון-פחמימות חיוניות לתהליכים ביולוגיים חשובים רבים, כולל קטליזה, איתות תאי וזיהוי. הם גם זוכים לתשומת לב גוברת בשל תפקידיהם החשובים בתעשיות התרופות והמזון. קריסטלוגרפיה רנטגן נמצאת בשימוש נרחב כדי להשיג מבנים חלבוניים ברמה האטומית. עם זאת, ההטרוגניות המבנית והגמישות של מצעי פחמימות מקשות על השגת מבני חלבון הקשורים לפחמימות. לאחרונה נעשה שימוש גם בספקטרוסקופיית cryo-EM ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לקבוע את המבנים של חלבונים קושרי פחמימות26. למרות ההתקדמות הרבה בטכניקות מבניות ברזולוציה גבוהה, זה מאתגר להשיג מבנים של קומפלקסים פחמימות חלבון. כתוצאה מכך, רק מספר מוגבל של מבנים מורכבים חלבון-פחמימות נפתרו בניסוי. יתר על כן, מבנים גבישיים מספקים רק תמונת מצב של חלבון בקונפורמציה מסוימת, ולא את האופי הדינמי של קשירת המצע. לחלופין, מספר טכניקות ביופיזיקליות, כולל קלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC) ותהודה פלסמונית פני השטח (SPR), משמשות למדידת אינטראקציות חלבון-פחמימות27. עם זאת, שיטות אלה הן גם לא ללא מגבלות. אחד האתגרים העיקריים בקביעת אינטראקציות חלבון-פחמימות הוא האינטראקציות החלשות יחסית שלהם בהשוואה לאינטראקציות חלבון-ליגנד אחרות. האינטראקציות בטווח של טווח מיקרומולרי גבוה עד מיקרומולרי נמוך מפחיתות באופן משמעותי את השימושיות של ITC ו- SPR. שיטות עקיפות, כגון הסטת ג'ל ומבחני משיכה כלפי מטה, זכו לתשומת לב משמעותית לקביעת אינטראקציות שקשה להעריך בשיטות אחרות25. לכן, בדיקה מחייבת זו היא גישה ישימה באופן נרחב למדידות רגישות של אינטראקציות חלבונים ופחמימות מסיסות.

גליקוגן ועמילן הם מולקולות אחסון פחמימות עיקריות העשויות מפולימרים מסועפים של גלוקוז. תבנית ההסתעפות, הגמישות והנוכחות של מיקרו-דומיינים שונים בתוך העמילן והגליקוגן מחייבים חלבונים באינטראקציה לאמץ מנגנוני קישור ייחודיים של המצע. הבנה רבה של מנגנוני זיהוי המצע של SEX4 הגיעה ממחקרים קריסטלוגרפיים של קרני רנטגן בשילוב עם מוטגנזה מונחית מבנה. כדי לנטרל עמילן, SEX4 חייב לקיים אינטראקציה עם מיקרו-דומיינים שונים באופן משמעותי של גרגרי העמילן כדי לאתר פוספטים לדפוספורילציה ספציפית למיקום. מבחינה ניסויית, עדיין קשה לקבוע את זיקות הקישור של פוספטזות גלוקניות, בהתחשב באינטראקציות החלשות בין החלבון לבין הגלוקנים והגמישות המבנית וההטרוגניות של פחמימות. כתב יד זה מציג שיטה לקביעת זיקות קשירה של אינטראקציות גלוקן פוספטאז-פחמימות באמצעות Concanavalin A (ConA) המבוסס על שקיעת מבחנה . פוספטזות גלוקן משתמשות במנגנונים שונים כדי לקשור, לאתר ולנטרל פחמימות. בעבר, ITC שימש למדידת הזיקה המחייבת של שרשראות לפורין ואוליגוסכריד ליניארי. עם זאת, שום מחקר לא גילה את זיקות הקישור של פוספטזות גלוקניות עם המצע הפיזיולוגי שלהם באמצעות טכניקות ישירות כגון ITC ו- SPR. כדי להבין טוב יותר את התועלת של בדיקה זו לקביעת קשירת המצע של פוספטזות גלוקן, הוערכה קשירת לפורין, LSF2 ו- SEX4 כנגד עמילופקטין. מחקרים עתידיים יכולים להיעשות כדי לקבוע באופן ניסיוני את זיקת הקישור של כל פוספטזות גלוקן ואת המצע הגלוקני הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית שלהם. אחד השלבים הקריטיים של השיטה הוא לקבוע את זמני הדגירה האופטימליים ואת טווח ריכוז המצע לבדיקה. כל פוספטאז גלוקן נקשר באופן שונה עם המצע, והשיטה מותאמת ל-SEX4. חשוב לבצע ניסויי אופטימיזציה ראשוניים כדי להבין פרמטרים אלה. מגבלה נוספת היא השימוש בחלבון מתויג היסטידין עבור הבדיקה. עם זאת, אם קיימים נוגדנים לחלבון המחקר, השיטה יכולה להיות מותאמת בקלות לכל חלבון המקיים אינטראקציה עם גלוקן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי פרס הקרן הלאומית למדע MCB-2012074. המחברים מודים לד"ר קרייג וונדר קוי מהמחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת פלורידה על דיונים חשובים ותמיכה. המחברים מודים גם לד"ר מתיו ס. ג'נטרי מהמחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת פלורידה על תמיכתו. ברצוננו להודות לד"ר שרה לגלוואר, יו"ר התוכנית למדעי המוח במכללת סקידמור, שאפשרה לנו להשתמש בסורק הכתם בן הספרות C של LICOR עבור דימות כתמים מערביים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP Therm Fisher Scientific MA1-21315-HRP
Biorad gel electrophoresis and Western blot kit Biorad  1703930
Calcium chloride Sigma-Aldrich 208291
C-Digit blot scanner LICOR 3600-00 Blot scanner
Complete protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836170001
Concanavalin A-sepharose beads Sigma-Aldrich C9017 This product contains  in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol 
Centrifuge Eppendorf  5425R
Glycine Fisher Scientific BP381-5
GraphPad Prism 8.0 software GraphPad  Version 8.0 Data analysis software 
HEPES Sigma-Aldrich H8651
Image Studio LICOR 3600-501 Acquisition Software
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2670
Methanol Fisher Scientific A452SK-4
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific PI28312
Potato amylopectin Sigma-Aldrich A8515
Precast SDSPAGE Gels Genscript M00653S
Tris base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Fisher Scientific MP1TWEEN201
Westernsure premium chemiluminescence substrate  LI-COR  926-95000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
  2. Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
  3. Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
  4. Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
  5. Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
  6. Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
  7. Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
  8. Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
  9. Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
  10. Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
  11. Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
  12. Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
  13. Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
  14. Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
  15. Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
  16. Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
  17. Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
  18. Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
  19. Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
  20. Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
  21. Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
  22. Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
  23. Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
  24. Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
  25. Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
  26. Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
  27. Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).

Tags

פסילה גיליון 190
Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolpaw, E. M., Frenett, M. L., Mak,… More

Wolpaw, E. M., Frenett, M. L., Mak, C. A., Zwanger, S. M., Raththagala, M. Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases. J. Vis. Exp. (190), e64700, doi:10.3791/64700 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter